Αφηρημένο

Ιστορικό

Η μεθυλίωση των CpG νησίδων του γονιδιώματος DNA και τα κατάλοιπα λυσίνης των ιστονών Η3 και Η4 ουρές ρυθμίζει την μεταγραφή του γονιδίου. Η αναστολή της σύνθεσης πολυαμίνης με αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης antizyme-1 (OAZ) σε ανθρώπινο καρκίνο του στόματος κυτταρική σειρά είχε ως αποτέλεσμα συσσώρευση αποκαρβοξυλιωμένα

S- αδενοσυλμεθειονίνης

(dcSAM), το οποίο δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας των αντιδράσεων μεθυλίωσης. Εμείς αναμένεται ότι η συσσώρευση dcSAM αντιδράσεις διαταραγμένη μεθυλίωση και οδήγησε σε υπομεθυλίωση του DNA και των ιστονών ουρές γονιδιώματος.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Η παγκόσμια κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και λυσίνης γονιδίωμα των ιστονών Η3 και Η4 ουρές προσδιορίστηκαν με μεθυλίωση με ισοσχιζομερή μέθοδο (Miami) και κηλίδωση Western, αντίστοιχα, με την παρουσία ή απουσία της έκφρασης OAZ. Έκτοπη έκφραση OAZ μεσολάβηση υπομεθυλίωσης των CpG νησίδων του γονιδιώματος του DNA και των ιστονών H3 λυσίνη 9 διμεθυλίωση (H3K9me2). πρωτεϊνικό επίπεδο του DNA μεθυλοτρανσφεράση 3Β (DNMT3B) και ιστόνης H3K9me συγκεκριμένες μεθυλοτρανσφεράση G9a ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε OAZ επιμόλυνσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

προκαλείται από OAZ υπομεθυλίωση των CpG νησίδων της παγκόσμιας DNA γονιδιώματος και H3K9me2 από τα κάτω ρύθμιση DNMT3B και το επίπεδο της πρωτεΐνης G9a. Υπομεθυλίωση των CpG νησίδων του γονιδιώματος DNA και ιστόνης H3K9me2 είναι ένας ισχυρός μηχανισμός της επαγωγής των γονιδίων που σχετίζονται με την καταστολή του όγκου και το DNA διπλής επισκευή σπάσιμο κλώνου

Παράθεση:. Yamamoto D, Shima Κ, Matsuo Κ, Nishioka Τ, Chen CY, Χου Gf, et al. (2010) αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης Antizyme Προκαλεί υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA και της ιστόνης Η3 Λυσίνη 9 διμεθυλίωση (H3K9me2) στην ανθρώπινη στοματική Γραμμή Cancer Cell. PLoS ONE 5 (9): e12554. doi: 10.1371 /journal.pone.0012554

Επιμέλεια: Shuang-Yong Xu, New England Biolabs, Inc, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Μαΐου 2010? Αποδεκτές: 31 του Ιουλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 3 Σεπτεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Yamamoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου) Έρευνα Grant RO1-CA10044 για Takanori Tsuji. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αποκαρβοξυλάση ορνιθίνης (ODC? EC4.1.1.17) είναι η πρώτη και περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο κλειδί για τη βιοσύνθεση πολυαμίνης με κατάλυση από L-ορνιθίνης προς πουτρεσκίνη [1] και εμπλέκεται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση [2 ]. Αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης antizyme υποοικογένεια αποτελείται από τρία σχετιζόμενα μέλη antizyme και αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης antizyme-1 (OAZ) ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά και ταυτοποιήθηκε ως αποκαρβοξυλάση ορνιθίνης (ODC) ανασταλτικό μόριο διεγείροντας αποικοδόμηση της ODC πρωτεΐνη [3], [4]. OAZ είναι γνωστό ότι συνδέεται διάφορες πρωτεΐνες και διαμεσολαβούν την αποικοδόμηση ή την σταθεροποίηση των πρωτεϊνών-στόχων. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν ODC [5], antizyme αναστολέα [6], η κυκλίνη D1 [7], [8] και HPV16 Ε2 [9]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, η αναστολή της δραστικότητας ODC και την επακόλουθη σύνθεση πολυαμίνης με OAZ [10] ή χημική ένωση, α-διφθορομεθυλορνιθίνη (DFMO) [5] είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση της dcSAM. dcSAM χρησιμεύει ως δότης αμινοπροπυλ για σύνθεση πολυαμίνης αλλά δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας της δ-αδενοσυλμεθειονίνης, σχεδόν σε όλες τις αντιδράσεις μεθυλίωσης συμπεριλαμβανομένων DNA, RNA, λιπιδίων και πρωτεϊνών [5], [11]. Η έκτοπη έκφραση του OAZ σε χάμστερ καρκίνο του στόματος κυττάρων που επάγεται παγκόσμια υπομεθυλίωση, και μετενεργοποίησε τα γονίδια που σχετίζονται με την καταστολή του όγκου και επιθηλιακή διαφοροποίηση [10]. Στη συνέχεια, έχουμε προφίλ τα γονίδια επάγονται ή πάνω ρυθμισμένα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του στόματος με OAZ, και βρέθηκε επαγωγή των γονιδίων που σχετίζονται με DNA διπλής επισκευή σπάσιμο κλώνου με μη ομόλογο τελικών ενώνει μηχανισμός [10].

ODC είναι ένα ένζυμο κλειδί της σύνθεσης πολυαμίνης με κατάλυση από L-ορνιθίνης σε πουτρεσκίνη. OAZ είναι ένας ανασταλτικός μόριο ODC δραστηριότητας μεσολαβώντας υποβάθμιση της ODC πρωτεΐνης. SAM χρησιμεύει ως δότης μεθυλίου σε αντιδράσεις μεθυλίωσης καθώς και πρόδρομος της παραγωγής dcSAM. dcSAM είναι ένας δότης αμινοπροπυλ της βιοσύνθεσης πολυαμίνης, αλλά επίσης δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας της SAM σχεδόν σε όλες τις αντιδράσεις μεθυλίωσης. Η αναστολή της δραστικότητας ODC οδηγεί σε εξάντληση πολυαμίνης και συσσώρευση dcSAM, η οποία αναστέλλει τις αντιδράσεις μεθυλίωσης.

Η

DNA μεθυλίωση των CpG νησίδων και τροποποίηση ιστονών, ιδιαίτερα ακετυλίωση και μεθυλίωση υπολειμμάτων λυσίνης της ουρές των ιστονών είναι στενά συσχετίζονται να ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση. Η ακετυλίωση των ιστονών είναι γενικά συσχετίζεται με μεταγραφική ενεργοποίηση αλλά ιστόνης μεθυλίωση ρυθμίζει μεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή ανάλογα με τη θέση της λυσίνης μεθυλίωσης [12]. μεθυλίωση των ιστονών λυσίνη εμφανίζεται σε έξι κατάλοιπα λυσίνης της ουρές από ιστόνες Η3 (Κ4, Κ9, Κ27, Κ36, Κ79) και H4 (K20) [13], [14]. Κάθε ένα από αυτά λυσινών μπορεί να είναι μονο-, δι- ή τριμεθυλιωμένη [13]. Η μεθυλίωση του H3K4, H3K36 και H3K79 συσχετίζονται κυρίως με την μεταγραφική ενεργοποίηση, ενώ η μεθυλίωση του H3K9, H3K27 και H4K20 εμφανίζεται κυρίως σε σχέση με την μεταγραφική αποσιώπηση [15], [16]. Η σχέση αλληλεξάρτησης μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και των ιστονών μεθυλίωση είναι ένα από τα θέματα ενδιαφέροντος σε γονιδιακή ρύθμιση. H3K9 μεθυλίωση και μεθυλίωσης του DNA είναι στενά συνδέονται με ετεροχρωματίνη και μεταγραφικά κατασταλεί ευχρωματινικούς περιοχές. Καλλιέργεια αποδείξεις αποκάλυψε ότι κυτοσίνη μεθυλίωσης του DNA συνυπάρχει με κατασταλτικά H3K9 μεθυλίωση επειδή μεθυλοτρανσφεράσες DNA, πρωτεΐνες δέσμευσης μεθυλο-CpG (MECP2), και ετεροχρωματίνη protein1 (Θ1) προσλαμβάνουν H3K9 συγκεκριμένες μεθυλοτρανσφεράση να μεθυλίωση υπολείμματα ιστονών της λυσίνης [17] – [19]. Αυτός ο μηχανισμός αντιστρέφεται σε ορισμένα συστήματα [20]. H3K9 μεθυλίωση είναι ένα προαπαιτούμενο για τη μεθυλίωση του DNA [21] – [24]. Υποθέτουμε ότι η συσσώρευση των dcSAM από έκτοπη έκφραση OAZ οδηγεί σε υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA και τις ουρές των ιστονών και την υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA και τις ουρές των ιστονών ρυθμίζει ανοδικά ή διαενεργοποιεί τα γονίδια που εμπλέκονται στο DNA διπλό σκέλος επισκευή διάλειμμα. Τα γονιδιακά δεδομένα χρησιμεύουν ως βάση για να κατανοήσουν την αλληλεξάρτηση μεταξύ μεταγραφικού παράγοντα και μονοπάτια χρωματίνης βάση. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε και επαλήθευσε OAZ μεσολάβηση παγκόσμια υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA και των ιστονών Η3 και Η4 ουρές.

Αποτελέσματα

ODC δραστηριότητα

OAZ πρωτεΐνη προωθεί την υποβάθμιση της ορνιθίνης αποκαρβοξυλάση πρωτεΐνη (ODC) και μείωση της δραστικότητας του ενζύμου ODC. Για να εξεταστεί εάν OAZ πρωτεΐνη μεταγράφεται και μεταφράζεται από το επιμόλυνσης OAZ (UM1-ρΜΤ /CB6

+ HuFSAZ-wt) είναι μια βιολογικά ενεργή πρωτεΐνη, δοκιμασία δραστικότητας ενζύμου ODC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Η ODC δραστηριότητα στο μετεμβολιασμού OAZ με ZnSO

4 θεραπεία εμφάνισαν μειωμένη δραστηριότητα του ενζύμου ODC (1629.0 ± 61.7 /picomoles CO

2 ανά ώρα ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης) κατά 72,6% σε σύγκριση με εκείνη του mock φορέα επιμόλυνσης (UM- 1pMT /CB6

+) που έλαβαν θεραπεία με ZnSO

4 (5930.0 ± 110.7 /picomoles CO

2 ανά ώρα ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης) (p & lt? 0,05). Η ODC δραστηριότητα στο μορφομετατροπέα OAZ χωρίς ZnSO

4 θεραπεία μειώθηκε (4944,1 ± 414,6 /picomoles CO

2 ανά ώρα ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης) κατά 30,3% σε σύγκριση με εκείνη του mock φορέα επιμόλυνσης χωρίς ZnSO

4 μεταχείριση (7084,7 ± 284,1 /picomoles CO

2 ανά ώρα ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης) (Εικ. 2). Αυτό πιθανώς οφείλεται στη διαρροή της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από ίχνη του Ζη

2+ συμπληρωμένο στο μέσο καλλιέργειας. Η μείωση της ODC δραστηριότητας στην επιμόλυνσης OAZ επιβεβαίωσε ότι OAZ πρωτεΐνης που προκαλείται από ZnSO

4 θεραπεία ήταν βιολογικά λειτουργική πρωτεΐνη.

ODC δραστηριότητα (picomoles CO

2 ανά ώρα ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης) της γονικής UM1, η παρωδία φορέα επιμόλυνσης και OAZ επιμόλυνσης με και χωρίς ZnSO

4 θεραπεία μετρήθηκε. Τριπλούν ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε. Διορθωθεί ODC τιμές δραστηριότητα ελήφθησαν με αφαίρεση της τιμής για κενό. ODC δραστηριότητα OAZ επιμόλυνσης χωρίς ZnSO

4 θεραπείας κατεστάλη λόγω ποσό ίχνος ZnSO

4 σε μέσο καλλιέργειας που προκαλείται διαρροή της έκφρασης του γονιδίου OAZ.

Η

Η ενδοκυτταρική επίπεδο των πολυαμινών και των μεταβολιτών

αναμένεται ότι η μείωση της ενζυμικής δραστηριότητας ODC οδήγησε στην εξάντληση της πισίνας πολυαμίνης και την επακόλουθη μεταβολή του ενδοκυτταρικού επιπέδου των μεταβολιτών πολυαμίνης. Εμείς ποσοτικοποιηθεί ενδοκυτταρική ODC, πολυαμίνες και μεταβολίτες επίπεδο με ανάλυση HPLC όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Έκτοπη έκφραση OAZ κάτω-ρυθμίζονται επίπεδο πρωτεΐνης ODC από 51ng /10

6 κύτταρα σε 8,4 ng /10

6 κύτταρα. Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα πολυαμίνης μειώθηκαν δραματικά λόγω της καταστολής της ODC δραστηριότητας. επίπεδο Πουτρεσκίνη μειώθηκε από 9 ng /10

6 κύτταρα σε 1,3 ng /10

6 κύτταρα. επίπεδο σπερμιδίνη μειώθηκε από 15,1 ng /10

6 κύτταρα σε 0,2 ng /10

6 κύτταρα. επίπεδο σπερμίνη μειώθηκε από 72,8 ng /10

6 κύτταρα σε 1,0 ng /10

6 κύτταρα (Εικ. 3Α). S-αδενοσυλμεθειονίνης (SAM), η οποία είναι ένας δότης μεθυλίου για όλες τις αντιδράσεις μεθυλίωσης, ήταν αρκετά σταθερός μέσω των πειραμάτων. Η ενδοκυτταρική ποσό των SAM ήταν 17,8 ng /10

6 κύτταρα στο επιμόλυνσης OAZ και 14,3 ng /10

6 κύτταρα στην παρωδία φορέα επιμόλυνσης. Η ενδοκυτταρική επίπεδο dcSAM στον έλεγχο mock φορέα επιμόλυνσης ήταν 1,22 ng /10

6 κύτταρα αλλά αυξήθηκε δραστικά έως 87,9 ng /10

6 κύτταρα στο μορφομετατροπέα OAZ. Η ενδοκυτταρική επίπεδο του S-adenosylhomocystein (SAH) επίσης αυξήθηκε από 0,66 ng /10

6 κυττάρων σε 3,76 ng /10

6 κύτταρα (Σχ. 3Β).

πισίνα πολυαμίνη εξαντλημένο (Α ), αλλά dcSAM και SAH, τα οποία ήταν πιθανοί αναστολείς των αντιδράσεων μεθυλίωσης, αυξήθηκε (Β) στην μετεμβολιασμού OAZ κατεργάζεται με ZnSO

4. Κυτταρικό επίπεδο των SAM ήταν σταθερή μέσω των πειραμάτων (Β).

Η

κατάσταση μεθυλίωση του DNA γονιδιώματος

Όπως έχουμε ήδη δημοσιεύσει, έκτοπη έκφραση της OAZ στο χάμστερ κακοήθη προφορική κερατινοκύτταρα που προκαλείται παγκόσμια υπομεθυλίωση τόπων CCGG του DNA γονιδιώματος [10]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε κατά πόσο η ίδια υπομεθυλίωση προκλήθηκε από το ανθρώπινο OAZ σε ανθρώπινο καρκίνο του στόματος κυτταρική γραμμή. Το επίπεδο των μεθυλιωμένων κυτοσίνες σε θέσεις CCGG ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της ραδιενέργειας εντός των δύο μεγάλες κηλίδες, 5 ‘[

32Ρ] dCMP και 5′ [

32Ρ] dm

5CMP με απαρίθμηση υγρού σπινθηρισμού. Το αποτέλεσμα της ποσοτικοποίησης παρουσιάζεται στο Σχ. 4 ως ποσοστό του dm

5CMP. Η επιμόλυνσης OAZ με και χωρίς ZnSO

4 θεραπεία εμφάνισαν ότι 26,0% και το 40,6% των ακολουθιών CCGG ήταν μετουσιωμένο, αντίστοιχα. Τα γονικά κύτταρα UM1 με και χωρίς ZnSO

4 θεραπεία, και η πλαστή διάνυσμα μορφομετατροπέας με και χωρίς ZnSO

4 θεραπεία εμφάνισαν 48,7% και 50,2%, και 40,4% και 40,9% της εσωτερικής κυτοσίνη ήταν μεθυλιωμένα, αντίστοιχα. Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει έκτοπη έκφραση της OAZ συνδέεται με γονιδιώματος σε επίπεδο DNA απομεθυλίωση σε ανθρώπινο καρκίνο του στόματος κυτταρική γραμμή. Γονιδιωματικό DNA της επιμόλυνσης OAZ είναι περίπου 60% λιγότερο μεθυλιωμένης από εκείνη του mock φορέα επιμόλυνσης.

Παγκόσμιο επίπεδο μεθυλίωσης της 5′-μεθυλο-CMP (dm5’dCMP) και 5’dCMP στο γονιδίωμά DNA του γονικά κύτταρα UM1, ψευδο φορέα και OAZ επιμόλυνσης μετρήθηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμού.

32Ρ-επισημασμένο dm

5CMP και CMP παρήχθησαν από διάσπαση των αντίστοιχων ΟΝΑ γονιδιώματος με τα ένζυμα περιορισμού

Msp

Ι και ευαίσθητα μεθυλίωσης ισοσχιζομερές του

Ηρα

ΙΙ και ήταν χωρίζονται σε χρωματογραφία λεπτής στιβάδας.

Η

κατάσταση μεθυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 ουρές

κατάσταση μεθυλίωση των καταλοίπων λυσίνης των ιστονών Η3 και Η4 ουρές συνδέσμους προς σχηματισμό transactive ευχρωματίνη ή transrepressive ετεροχρωματίνης ανάλογα με την θέση μεθυλίωσης. Η εξάντληση της πισίνας πολυαμίνης με OAZ οδήγησε σε συσσώρευση dcSAM, το οποίο δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας της SAM σε αντιδράσεις μεθυλίωσης. Εμείς αναμενόμενη συσσώρευση dcSAM μεσολάβηση παγκόσμιας υπομεθυλίωση των καταλοίπων λυσίνης της ιστόνης Η3 και Η4 ουρές. Δεδομένου ότι η πρώτη προσέγγιση διαλογής για να διερευνήσει μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της συσσώρευσης των dcSAM και τις μεταβολές του παγκόσμιου κράτους ιστόνης μεθυλίωσης, αναλύσαμε τις παγκόσμιες αλλαγές στην κατάσταση μεθυλίωσης του histne Η3 και Η4 με western αποτύπωση. Δεκαέξι αντισώματα εναντίον μονο-, δι- και τρι-μεθυλίωσης ειδικών υπολειμμάτων λυσίνης των ιστονών Η3 και Η4 χρησιμοποιήθηκαν. Θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε μια σημαντική μείωση σε παγκόσμιο επίπεδο των ιστονών Η3 Lys-9 διμεθυλίωση (H3K9me2), H3K27me1, H3K27me2, μια H3K27me3 από 41,6, 14,3, 16,4 και 17,5% αντίστοιχα στο επιμόλυνσης OAZ (εικ. 5Α και Β). Η ένταση του σήματος της ιστόνης Η3 ήταν σταθερή μεταξύ όλων των δειγμάτων που φορτώνονται. Αντίθετα, άλλες δώδεκα αντισώματα για ιστόνες Η3 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K36me1, H3K36me2, H3K36me3, H3K79me2) και Η4 (H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) δεν παρουσιάζει καμία σημαντική διαφορά μεταξύ της επιμόλυνσης OAZ και την παρωδία διάνυσμα μορφομετατροπέα (Σχ. 5Α και Β). Δι-μεθυλίωση των ιστονών H3K9 είναι ένα σημάδι της συστατικής ετεροχρωματίνη και γονιδιακή καταστολή. Υπομεθυλίωση του H3K9me2 αντιπροσωπεύει μια αλλαγή της χρωματίνης κράτους από ετεροχρωματίνης να ευχρωματίνη, πράγμα που σημαίνει επίσης μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων αλλαγές από κατασταλτικό κράτος σε ενεργή κατάσταση. Αυτή η απομεθυλίωση H3K9me2 από OAZ εικάζει ενεργοποίηση των γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση [10] και το DNA διπλής επισκευή διάλειμμα σκέλος [25].

Σημαντικές υπομεθυλίωση του H3K9me2 παρουσιάστηκε στο επιμόλυνσης OAZ αντιμετωπίζονται με ZnSO

4 . κατάσταση μεθυλίωσης των άλλων καταλοίπων λυσίνης της ιστόνης Η3 και Η4 ουρές δεν μεταβλήθηκε. Ιστόνης Η3 και Η4 πρωτεΐνες (17 kDa και 10 kDa, αντίστοιχα) επίσης κηλιδώθηκε στο ίδιο μεμβράνης μετά την απογύμνωση να παρακολουθεί ίση ποσότητα πρωτεΐνης φόρτωσης σε κάθε λωρίδα. Δείχνουμε μόνο H3K9, H3K27 και H4K20 αποτελέσματα, επειδή η μεθυλίωση αυτών των ιστονών ουρές λειτουργεί ως μεταγραφικός καταστολέας (Α). Η αξία υποδηλώνουν την σχετική ένταση του μεθυλιωμένου πρωτεΐνης ιστόνης μπάντες των tranfectants OAZ με εκείνη των ψευδο-επιμολύνσεων φορέα αφού κανονικοποιούνται προς τις ζώνες PAN Η3 και Η4. Ένταση του ελέγχου (mock φορέα επιμόλυνσης χωρίς ZnSO

4 θεραπεία) θεωρήθηκε ως 100 και άλλα σήματα εκφράστηκαν ως σχετική τιμή (Β).

Η

επίπεδο έκφρασης της DNMTs και G9a

Θα εξεταστεί, πρώτον, αν OAZ μεταβληθεί το επίπεδο έκφρασης του mRNA της DNMTs και G9a από qRT-PCR. Συμβατική RT-PCR πραγματοποιήθηκε πριν από qRT-PCR για να επιβεβαιωθεί ότι το σύνολο έναυσμα ήταν σε θέση να ενισχύσει μόνο αμπλικόνιο. Επιβεβαιώσαμε αυτά τα εναύσματα PCR θα μπορούσαν να ενισχύσουν τραγανό μονή ζώνη μετά την αντίδραση 35 κύκλο PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Οι επόμενες αποτελέσματα qRT-PCR αποκάλυψε ότι η έκφραση OAZ ή ZnSO

4 θεραπεία δεν επηρέασε το επίπεδο έκφρασης των DNMT1, 3Α, 3Β και G9a mRNA (ρ & lt? 0,01) (Εικ. 6). OAZ μεσολάβηση παγκόσμια υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA και των ιστονών H3K9me2. DNMTs 1, 3Α, 3Β και /GLP συγκρότημα ιστόνης methyltrasferase G9a εμπλέκονται στη μεθυλίωση του γονιδιώματος DNA και ιστονών H3K9me2, αντίστοιχα. Υποθέσαμε ότι υπομεθυλίωση του ουρές των ιστονών ήταν ένας από πλειοτροπική στόχους dcSAM μεσολάβηση υπομεθυλίωση, και όλα τα μεθυλιωμένα λυσίνες ιστόνης ουρές ήσαν υπο-μεθυλιωμένα αλλά στην πραγματικότητα μόνο H3K9me2 ήταν υπο-μεθυλιωμένα. Αυτό το απρόσμενο αποτέλεσμα μας ώθησε να εξετάσει το επίπεδο πρωτεΐνης των DNMTs και G9a. Η μεθυλίωση του H3K9 θηλαστικού καταλύεται από G9a /GLP συγκρότημα ιστόνης μεθυλοτρανσφεράσης. Οι αναλύσεις στυπώματος Western αποκάλυψε το επίπεδο πρωτεΐνης DNMT3B (Εικ. 7) και G9a (Εικ. 8) ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω, αλλά το επίπεδο της πρωτεΐνης των DNMT1 και 3Α δεν μεταβλήθηκε στο μορφομετατροπέα OAZ. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι η παγκόσμια υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA και των ιστονών ουρές προκαλείται από όχι μόνο από μια πλειοτροπική επίδραση των dcSAM αλλά με ειδικό τρόπο εργάζεται για να hypomethylate γονιδίωμα DNA και ιστονών ουρές.

επίπεδο έκφρασης αυτών των mRNA δεν ήταν μεταβληθεί από OAZ. Το αποτέλεσμα PCR ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σήμα -β-ακτίνης. Σήματος του ελέγχου (mock φορέα επιμόλυνσης χωρίς ZnSO

4 θεραπεία) θεωρήθηκε ως 100 και άλλα σήματα εκφράστηκαν ως σχετική τιμή.

Η

Πυρηνικά εκχυλίσματα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-DNMTs αντισώματα. πρωτεϊνικό επίπεδο των DNMT1 (183 kDa) και Dnmt3a (101 kDa) ήταν σταθερή, αλλά το επίπεδο της πρωτεΐνης του DNMT3B (110 kDa) μειώθηκε σημαντικά στο επιμόλυνσης OAZ αντιμετωπίζονται με ZnSO

4. Οι Fain ζώνες εμφανίστηκε στην Dnmt3a και DNMT3B κηλίδες είναι ισομορφές Dnmt3a και 3Β. Oct-1 (89 kDa) χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση ίση ποσότητα πρωτεΐνης φόρτωσης σε κάθε λωρίδα.

Η

Πυρηνικά εκχυλίσματα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-G9a αντίσωμα. Έκφραση της πρωτεΐνης G9a (140 kDa) μειώθηκε στο επιμόλυνσης OAZ αντιμετωπίζονται με ZnSO

4.

Η

ενζυμική δραστηριότητα DNMT

Χρησιμοποιήσαμε πολύ (dI-dC) πολυ ( dI-dC) ως υπόστρωμα για τη δοκιμασία δραστικότητας ενζύμου DNMT. δραστικότητα του ενζύμου DNMT προσδιορίστηκε με μέτρηση της ενσωμάτωσης της σήμανσης στο πολυ (dI-dC) πολυ (dI-dC) υπόστρωμα. Methyl πολυ (dI-dC) πολυ (dI-dC) παραγωγή κατεστάλη από -65% στην μετεμβολιασμού OAZ με ZnSO

4 θεραπεία σε σύγκριση με εκείνες του μορφομετατροπέα ελέγχου και της επιμόλυνσης OAZ χωρίς ZnSO

4 θεραπεία ( Ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 9).. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι μειώθηκε DNMT3B πρωτεΐνη κατέστειλε το μέρος της συνολικής δραστηριότητας DNMT και αυτή η μειωμένη δραστηριότητα DNMT συσχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση των DNMT3B πρωτεΐνης με OAZ.

Σύνολο δοκιμασία δραστηριότητας DNMT εκτελέστηκε. δραστηριότητα DNMT μειώθηκε κατά -65% στο επιμόλυνσης OAZ αντιμετωπίζονται με ZnSO

4. Το αποτέλεσμα αυτό συσχετίζεται με το δυτικό αποτέλεσμα κηλίδα του DNMT3B.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναφέρει ότι η έκτοπη έκφραση OAZ σε χάμστερ προφορική καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε παγκόσμια υπομεθυλίωση του γονιδιώματος του DNA [10 ] και επαγόμενη ή επάνω ρυθμισμένη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με DNA διπλής έλικος επισκευή διάλειμμα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του στόματος [25]. Η ανώμαλη μεθυλίωση των CpG νησίδες εντός της περιοχής του υποκινητή αδρανοποιεί γονιδιακής μεταγραφής [26] – [28]. Ομοιοπολικές τροποποιήσεις ουρές των ιστονών παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στη μεταγραφή, αντιγραφή του DNA, την επισκευή του DNA και διακοπή συμπύκνωση χρωματίνης σε μίτωση [29]. Μεταξύ αυτών των τροποποιήσεων ιστονών, μεθυλίωση και ακετυλίωση της ιστόνης ουρές εμπλέκονται στην ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου [30], [31]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την παγκόσμια κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και λυσίνης γονιδιώματος από τις ουρές των ιστονών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του στόματος υπό την απουσία ή την παρουσία της έκφρασης OAZ. Η αναστολή της σύνθεσης πολυαμίνης με OAZ συσσωρευμένες αφύσικα υψηλό επίπεδο dcSAM, το οποίο δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας της

S- αδενοσυλμεθειονίνης

σχεδόν σε όλες τις αντιδράσεις μεθυλίωσης. Έχουμε προβλέψει συσσώρευση dcSAM που προκαλείται υπομεθυλίωσης των υπολειμμάτων κυστίνης των CpG νησίδων και αλλοιωμένη σήματα μεθυλίωση της λυσίνης της ουρές των ιστονών. κατάλοιπα κυτοσίνης των χώρων CCGG στο γονιδίωμα του DNA σε παγκόσμιο επίπεδο μεθυλιωμένος όπως αναμενόταν, αλλά μόνο H3K9me2 ήταν μεθυλιωμένος μεταξύ των methylable κατάλοιπα λυσίνης της ουρές των ιστονών. Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να εξεταστεί το επίπεδο της πρωτεΐνης του μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) και H3K9me2 ειδικά G9a μεθυλοτρανσφεράση. Τα αποτελέσματά μας στύπωμα western εμφάνισαν επίπεδο πρωτεΐνης DNMT3B και G9a ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στα επιμολυσμένα OAZ. Τα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA δημιουργεί και συντηρεί τον συντονισμό των μεθυλοτρανσφεράσες DNA, DNMT1, Dnmt3a και DNMT3B. DNMT1 επιδιώκει τη συντήρηση του προτύπου μεθυλίωσης μετά από την αντιγραφή του DNA, ενώ Dnmt3a και DNMT3B είναι κυρίως υπεύθυνη για την de novo μεθυλίωση [32] και τη συντήρηση της μεθυλίωσης σε ορισμένες περιοχές του DNA γονιδιώματος κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και της ανάπτυξης [33]. εξάντληση DNMT3B σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές επανενεργοποιηθεί γονιδιακής έκφρασης σε μεθυλίωση σιγήσει, αλλά δεν προκάλεσε παγκόσμιο ή juxtacentromeric δορυφορική απομεθυλίωση [34]. Εξάντληση των DNMT3B από OAZ θα μπορούσε να προωθήσει την ακολουθία-ειδική απομεθυλίωση DNA και που προκαλείται ή up-ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την επισκευή ρήξη του DNA, αλλά η συσσώρευση των dcSAM συνέβαλε επίσης τυχαία, παγκόσμια απομεθυλίωση DNA.

G9a ιστονών μεθυλοτρανσφεράση , η οποία μεθυλιώνει μοναδικά ιστόνης H3K9, είναι επίσης ένας σημαντικός παράγοντας της γονιδιακής σίγησης [35] και είναι ουσιώδης για πρώιμη εμβρυογένεση να ρυθμίζουν έκφραση αναπτυξιακών γονιδίων [36]. Η μεθυλίωση του H3K9me2 διαμεσολαβείται από G9a μεταβάλλει τη δομή της χρωματίνης από χαλαρή ευχρωματίνη σε συμπαγή ετεροχρωματίνη και καταστέλλει έναν αριθμό της γονιδιακής έκφρασης [36] – [38]. Η μεθυλίωση του H3K9 έχει γίνει γνωστό να συνδέσει με υπερμεθυλίωση προαγωγού CpG νησίδων σε καρκινικά κύτταρα [39], [40]. μεθυλίωση του DNA και H3K9 μεθυλίωση σφιχτά συνεργάζονται για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. H3K9 μεθυλίωση είναι ένα προαπαιτούμενο για μεθυλίωσης του DNA [21] – [23] και H3K9 μεθυλίωση απαιτείται για μεθυλίωσης του DNA [22], [23]. G9a μεσολάβηση DNA μεθυλίωση δεν απαιτεί την καταλυτική δραστικότητα του [41], υποδηλώνοντας ότι μπορεί να έχει επιπρόσθετες λειτουργίες στην κατεύθυνση μεθυλίωσης του DNA, όπως η πρόσληψη DNMTs [42]. G9a πρωτεΐνη δεσμεύεται με DNMT1 και οδηγεί σε ενισχυμένη DNA και ιστονών μεθυλίωση [43]. G9a πρωτεΐνη στρατολογεί επίσης και προσδένεται σε πρωτεΐνες Dnmt3a και DNMT3B μέσω πεδίο ανκυρίνης (ANK) του [44], και τους τοποθετεί στις θέσεις της αντιγραφής του DNA. H3K9me2 παίζει εξίσου σημαντικό ρόλο στην γονιδιακή σίγηση σε ευχρωματίνη και επακόλουθη de ηονο μεθυλίωση του DNA των γονιδίων εμβρυϊκών και βλαστικής γραμμής κατά τη διάρκεια της κανονικής ανάπτυξης [41], και είναι αναγκαία για τη διατήρηση της μεθυλίωσης του DNA στο ενδογενές ρετροτρανσποζόνια, εντυπωμένα τόπους, και άλλα γονίδια σε διαφοροποιημένα κύτταρα [45]. Li et al και Deng et al ανέφεραν αναστολή της παγκόσμιας μεθυλίωσης DNA γονιδίωμα με 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-CDR) μείωσε την πρωτεΐνη έκφραση του DNMT1 και DNMT3B [46], [47]. Wozniak et al ανέφεραν ότι η θεραπεία 5-Αζα-CdR μεθυλιωμένος παγκόσμια H3K9me2 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού με τα κάτω ρύθμιση επίπεδο πρωτεΐνης G9a [48]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το DNA απομεθυλίωση μπορεί να είναι ένα σήμα που κατευθύνει την απομεθυλίωση του H3K9 κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA.

Είναι ένα περίεργο αποτέλεσμα η συσσώρευση dcSAM δεν μετέβαλε κατάσταση μεθυλίωσης καταλοίπων λυσίνης της ουρές των ιστονών, εκτός από H3K9me2 επειδή αναστολή της μεθυλίωσης από dcSAM φαίνεται μια πλειοτροπική δράση. Μεταγραφικοί παράγοντες έχουν επίσης πλειοτροπική δράση αλλά η δραστηριότητά τους είναι στενά ρυθμίζεται από στοιχεία cis και trans-δρώντα για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ιστών, αναπτυξιακό stage-, και την ασθένεια-ειδικό τρόπο. Πιστεύουμε ότι η αναστολή της μεθυλίωσης από dcSAM δεν είναι πλειοτροπική τρόπο, αλλά αυτό ρυθμίζεται επίσης από πρόσθετα στοιχεία cis και tras δράσης που στοχεύουν σε συγκεκριμένα sites των γονιδίων και τις ουρές των ιστονών. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός που διέπουν την προς τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών DNMT3B και G9a από OAZ παραμένει άπιαστο. Προτείνουμε ένα ισχυρό μοριακό μηχανισμό που OAZ πρωτεΐνη, άμεσα ή έμμεσα συνδέονται προς DNMT3B ή /και πρωτεΐνες G9a και προωθεί την αποδόμησή τους. OAZ πρωτεΐνη έχει γίνει γνωστό να δεσμεύει διάφορες πρωτεΐνες και προωθεί την αποδόμησή τους [7] – [9], [49] – [51]. Το σημερινό αποτέλεσμα μας υπογραμμίζει την πολύπλοκη σχέση της ιστόνης μεθυλίωσης και ευαισθησία σε μεθυλίωσης του DNA. Αυτές οι ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την επιδιόρθωση του DNA [25] μπορεί να ενεργοποιηθεί με απομεθυλίωση των CpG νησίδων και H3K9me2 εντός των ρυθμιστικών περιοχών.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο τον καρκίνο του στόματος κυτταρική γραμμή, UM1 [52] και ο ψευδάργυρος που επάγεται από OAZ επιμόλυνσης (ρΜΤ /CB6

+ HuFSAZ-κβ) και η παρωδία φορέα επιμόλυνσης (UM1-ρΜΤ /CB6

+) καλλιεργήθηκαν ως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Η έκφραση του γονιδίου OAZ από το ρΜΤ /CB6

+ HuFSAZ-wt προκλήθηκε με 100 μΜ ZnSO

4 μεταχείριση και τα δείγματα πρωτεΐνης συλλέχθηκαν μετά από μία εβδομάδα ZnSO

4 θεραπεία.

ODC δραστηριότητα δοκιμασία

Για να ελέγξει εάν OAZ πρωτεΐνη που μεταφράζεται από τον επιμολυντή OAZ ήταν βιολογικά δραστική πρωτεΐνη στα κύτταρα U1, ODC ενζυματική δραστικότητα προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, το ODC δραστηριότητα ποσοτικοποιήθηκε η απελευθέρωση του [

14C] CO

2 κατά τη διάρκεια ODC καταλυόμενη μετατροπή της L-ορνιθίνης σε πουτρεσκίνη. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 50 μΐ του κυτταρολύματος που παρασκευάστηκε από την επιμόλυνσης OAZ και το ψευδο φορέα επιμόλυνσης με και χωρίς ZnSO

4 θεραπεία, 75 μΙ 100 mM γλυκυλο-γλυκίνης (ρΗ 7,2), 0,2 mM φωσφορική πυριδοξάλη, 4 mM διθειοθρεϊτόλη , 0.4 mM L-ορνιθίνη, και 0,25 μCi [

14C] Ε-ορνιθίνη. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν στους 37 ° C για 2 ώρες και τερματίζεται με θέρμανση στους 85 ° C για 5 λεπτά. [

14C] CO

2 παγιδεύτηκε με διηθητικό χαρτί Whatman 3-mm εντόπισε εξυπνάδα 10 μl 10% β /ο ΚΟΗ και ποσοτικά με απαριθμητή σπινθηρισμών. Εις τριπλούν προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν. δείγμα ελέγχου ήταν το κενό που περιέχει ρυθμιστικό λύσης στη θέση του υπερκειμένου. Διορθωθεί ODC τιμές δραστηριότητα ελήφθησαν αφαιρώντας τιμές για κενό και δήλωσε ως picomoles CO

2 ανά ώρα ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ανάλυση Ένας παράγοντας ANOVA.

HPLC ανάλυση

Η ενδοκυτταρική ποσότητα ODC, πολυαμίνες, SAM, dcSAM και SAH (S-adenosylhomecysteine) προσδιορίστηκε ποσοτικά με ανάλυση HPLC αντίστροφης φάσης . Τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου από το επιμόλυνσης OAZ και το ψευδο διάνυσμα transfectat με και χωρίς ZnSO

4 κατεργασία παρασκευάστηκαν σε 0.2 Μ υπερχλωρικό οξύ. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 13,000 Χ g για 10 λεπτά και τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε ανάλυση με HPLC αντίστροφης φάσης σε μία στήλη Supercosil LC-18-DB (4,6 χ 250 mm, 5 μm μέγεθος πόρου), εξισορροπημένη με 0,2% τριαιθυλαμίνη-φωσφορικό οξύ (ρΗ 4.0). Η έκλουση επιτεύχθηκε με 20 λεπτών γραμμική βαθμίδωση από 0-10% ακετονιτρίλιο. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε χρωματογραφικό διαχωρισμό. Τα πρότυπα για ODC, πολυαμίνες, SAM και υπαραχνοειδή αιμορραγία αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Το πρότυπο για dcSAM ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Keijiro Samejima του Πανεπιστημίου Josai στην Ιαπωνία.

ανάλυση στυπώματος Western του μεθυλ-ιστόνης ουρές

κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε ουρές των ιστονών επαληθεύθηκε με western αποτύπωση . Τα protin δείγματα για αναλύσεις Western Blot των ουρών των ιστονών παρασκευάστηκαν με άμεση προσθήκη 500 μΐ ρυθμιστικού SDS-Laemmli δείγματος του σε 100 χιλιοστά πλάκα καλλιέργειας και τα κύτταρα συλλέχθηκαν με διάλυση με ένα λαστιχένιο ξέστρο. Τα συλλεχθέντα κύτταρα έβρασαν για 15 λεπτά στο ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και φυγοκεντρήθηκε στα 16.000 Χ g για 30 λεπτά. Η ποσότητα πρωτεΐνης υπολογίστηκε από τον αριθμό των κυττάρων των αναπαραγόμενων καλλιέργειας. Οι εκχυλισμένες πρωτεΐνες που ισοδυναμεί με 1 × 10

5 – 5χ 10

5 κύτταρα φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε 15% SDS-PAGE πηκτή, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF, δεσμεύτηκαν με 5% γάλα σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ και καθάρισε με κάθε αντίσωμα στις συνιστώμενες αραίωση με κατασκευάζει. Τα σήματα αναπτύχθηκαν με του Pierce Supersignal® West Pico Χημειοφωταυγές υπόστρωμα και αυτόγραφα σε φιλμ. Για την εξάλειψη πιθανών τεχνούργημα που προκαλείται από τον ψευδάργυρο, επαναλάβαμε τα ίδια πειράματα χρησιμοποιώντας τις PCI-neo-hOAZ tarsnfectants (PCI-neo-hOAZ-UM1). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αγοράστηκαν από την Upstate Biotechnology. Τα αντισώματα και οι αριθμοί καταλόγου τους είναι? pan-ιστόνης Η3 (07-690), παν-ιστόνης Η4 (05-858), H3K4me1 (07-436), H3K4me2 (07-030), H3K4me3 (07-473), H3K9me1 (07-450), H3K9me2 ( 07-441), H3K9me3 (07-442), H3K27me1 (07-448), H3K27me2 (07-452), H3K27me3 (05-851), H3K36me1 (05-800), H3K36me2 (07-369), H3K36me3 (05 -801), H3K79me2 (05-835), H4K20me1 (05-735), H4K20me2 (07-367), H4K20me3 (07-463). Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν HRP-σημασμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (PerkinElmer, NEF822001EA) και HRP-σημασμένο κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (PerkinElmer, NEF812001EA). Η ένταση της κάθε ζώνης μετρήθηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό που παρέχεται από ImageJ ΝΙΗ (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία DNMTs και G9a

επίπεδο έκφρασης του DNMTs και G9a mRNAs ποσοτικοποιήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR). Ολικό RNA απομονώθηκε από το OAZ και τις εικονικές μορφομετατροπείς φορέα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol® (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι εκκινητές PCR σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας MacVector έκδοση 7.2 του λογισμικού με βάση τις αλληλουχίες cDNA που είχαν κατεβάσει από τη βάση δεδομένων NCBI. Οι qRT-PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα LightCycler με κιτ LightCycler FastStart DNA Δάσκαλος SYBR Green Ι. Ενίσχυση του cDNA δείγματος παρακολουθήθηκε με δεσμευτική η φθορίζουσα χρωστική DNA SYBR Green σε συνδυασμό με ένα σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ 5700. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση. Οι αλληλουχίες εκκινητή PCR, βέλτιστες θερμοκρασίες ανόπτησης, και τα μεγέθη αμπλικονίου παρατίθενται στον Πίνακα 1. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ανάλυση Ένας παράγοντας ANOVA.

Η

ανάλυση στυπώματος Western των πρωτεϊνών DNMTs και G9a

το πυρηνικό εκχύλισμα παρασκευάζεται από την OAZ και τις εικονικές επιμολύνσεις φορέα χρησιμοποιώντας NE-PER® πυρηνικής και κυτταροπλασματικά εκχύλισης Αντιδραστήρια (Thermo Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πενήντα μα του πυρηνικού εκχυλίσματος του κάθε δείγματος φορτώθηκε και διαχωρίστηκε σε 5% πήκτωμα SDS-PAGE και η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε πάνω σε μεμβράνη PVDF. Η μετέπειτα κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για αυτή τη μελέτη ήταν ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό DNMT1 (Abcam, ab19905, 1:500), ένα κουνέλι-πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού Dnmt3a (Abcam, ab23565, 1:200), ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ποντικού αντισώματος DNMT3B (Abcam, ab16049, 1:300) και ένα αντι-ανθρώπινο G9a πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού (Upstate Biotechnology, 07-551,1:1,000). Η ίση ποσότητα φόρτωσης δείγματος παρακολουθήθηκε και επιβεβαιώθηκε με Oct-1signal χρησιμοποιώντας ένα κουνελιού πολυκλωνικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Oct-1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-232, 1:1,000).

ένζυμο DNMT δοκιμασία

δραστικότητα του ενζύμου DNMT δράση προσδιορίστηκε με τη μέθοδο του Belinsky et al με μικρές τροποποιήσεις [53]. Κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε σε ρυθμιστικό λύσης με κατάψυξη-απόψυξη τρεις φορές και φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Κυτταρολύματος που περιείχαν 20 μg πρωτεΐνης (125 μΙ) αναμίχθηκε με 125 μΙ μίγματος αντίδρασης (20 mM Tris HCl, ρΗ = 7.4, 25% γλυκερόλη, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 μΟί [μεθυλ-3Η] -S-αδενοσυλ -ί-μεθειονίνη, 4 μg πολυ [δι-dC] πολυ [δι-dC], 25 μg BSA) και επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν και το DNA εκχυλίστηκε με φαινόλη: μέθοδο εκχύλισης chrolform. Το υδατικό διάλυμα συμπληρώθηκε με 0.1 Ν ΝαΟΗ και επωάζεται για 2 ώρες στους 50 ° C. Το μίγμα της αντίδρασης εξουδετερώθηκε με 1 Ν HCI. DNA καταβυθίστηκε με 20% TCA και παγιδεύεται στο φίλτρο G /C. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε με απαριθμητή σπινθηρισμού.