Αφηρημένο

Η ανίχνευση και θεραπεία του καρκίνου έχει προχωρήσει σημαντικά τις τελευταίες δεκαετίες, με σημαντικές βελτιώσεις στην κατανόηση των βασικών μοριακών και γενετικών βάση της νόσου. Παρά αυτές τις εξελίξεις, τις μεθοδολογίες διαλογής φαρμάκων έχουν παραμείνει ουσιαστικά αμετάβλητη από την εισαγωγή του

in vitro

οθόνη ανθρώπινη κυτταρική σειρά το 1990. Παρά το γεγονός ότι οι υπάρχουσες μέθοδοι παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τα συνολικά αποτελέσματα των ενώσεων στη βιωσιμότητα των κυττάρων, είναι περιορίζεται από τις μετρήσεις χύμα, μεγάλα μεγέθη δείγματος, και την ικανότητα έλλειψη για τη μέτρηση της κινητικής της διάδοσης σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων. Για να κατανοήσουμε πραγματικά τη φύση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και να αναπτυχθούν εξατομικευμένες ανοσοενισχυτικό θεραπειών, υπάρχει μία ανάγκη για νέες μεθοδολογίες που παρέχουν ποσοτικές πληροφορίες για την παρακολούθηση της επίδρασης των φαρμάκων επί της κυτταρικής ανάπτυξης, καθώς και μορφολογικές και φαινοτυπικές αλλαγές στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι μια ποσοτική μέθοδο απεικόνισης φάση γνωστή ως μικροσκοπία χωρική παρεμβολή φωτός (SLIM) αντιμετωπίζει αυτές τις ανάγκες και παρέχει επιπλέον πλεονεκτήματα σε σχέση με τις υπάρχουσες δοκιμασίες πολλαπλασιασμού. Έχουμε αποδείξει αυτές τις δυνατότητες μέσω μετρήσεων σχετικά με τις επιδράσεις της οιστραδιόλης ορμόνης και της ICI182,780 αντιοιστρογόνο (Faslodex) σχετικά με την ανάπτυξη του MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού. Μαζί με την παροχή πληροφοριών σχετικά με τις αλλαγές στη συνολική ανάπτυξη, SLIM παρέχει πρόσθετες βιολογικά σχετικές πληροφορίες. Για παράδειγμα, διαπιστώνουμε ότι η έκθεση με τα αποτελέσματα της οιστραδιόλης σε ταχέως αναπτυσσόμενα κύτταρα με χαμηλότερη μάζα από τον πληθυσμό ελέγχου. Στη συνέχεια τον αποκλεισμό του υποδοχέα οιστρογόνου με αποτέλεσμα την ICI βραδύτερη αναπτυσσόμενα κύτταρα, με χαμηλότερη άνυδρες μάζες από τον έλεγχο. Αυτή η ικανότητα να μετρήσει τις αλλαγές στην κινητική ανάπτυξη ως απάντηση στις περιβαλλοντικές συνθήκες παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς ρύθμισης της ανάπτυξης. Τα αποτελέσματά μας καθορίζει τις δυνατότητες του SLIM ως μια προηγμένη τεχνολογία ελέγχου των ναρκωτικών που παρέχει πληροφορίες σχετικά με τις αλλαγές στην κινητική πολλαπλασιασμού σε κυτταρικό επίπεδο με μεγαλύτερη ευαισθησία από ό, τι οποιαδήποτε υπάρχουσα μέθοδο

Παράθεση:. Mir M, Bergamaschi Α, Katzenellenbogen BS, Popescu G (2014) ιδιαίτερα ευαίσθητες ποσοτική απεικόνιση για την παρακολούθηση της ενιαίας Καρκίνο κινητική ανάπτυξης των κυττάρων και Απόκριση σε φάρμακα. PLoS ONE 9 (2): e89000. doi: 10.1371 /journal.pone.0089000

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9η Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 13 του Ιανουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Mir et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το National Science Foundation (NSF) Επιχορηγήσεις: Επιστήμη και Τεχνολογία Κέντρο για τις νεοεμφανιζόμενες συμπεριφορές των Ολοκληρωμένων CBET κυτταρικών συστημάτων 0939511 (για GP), NSF CAREER 08-46660 (στο GP), CBET-1040461 MRI (σε GP), μαστού Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο (με BSK), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) P50 AT006268 (με BSK), και μεταδιδακτορικής έρευνας από το Υπουργείο άμυνας, W81XWH-09-1-0398 (στην ΑΒ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Γ Popescu έχει οικονομικών συμφερόντων στο Phi Optics, Inc, μια εταιρεία που αναπτύσσει ποσοτικά μικροσκόπια φάση, η οποία, ωστόσο, δεν προώθησε αυτή την έρευνα. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η κυτταρική ανάπτυξη και η μαζική ομοιόσταση έχουν περιγραφεί ως θεμελιώδους σημασίας για τη βιολογία, όμως είναι ανεπαρκώς κατανοητό [1]. Η αδυναμία αυτή μπορεί να αναχθούν στην έλλειψη μεθόδων που επιτρέπουν την ποσοτικοποίηση και μόνο κυτταρική μάζα με την απαιτούμενη ευαισθησία. Ως αποτέλεσμα, πρόσφατα, σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί προς την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών για τη μελέτη της κυτταρικής ανάπτυξης. Αυτές οι μέθοδοι μπορούν να χωριστούν σε

μικρομηχανικές

[2] – [4], μεταφράζοντας συντονισμού μετατοπίσεις συχνότητας μικροδομών σε κυτταρική μάζα πλευστότητα, και

οπτικών

[5] – [8], μετατρέποντας ποσοτική εικόνες φάση σε ξηρή χάρτες πυκνότητα μάζας. Οπτικές μέθοδοι είναι ιδανικά για τη μελέτη της ανάπτυξης των προσκολλημένων μονά κύτταρα καθώς και ομάδες κυττάρων. Αυτή η δυνατότητα ανοίγει νέες ευκαιρίες στον καρκίνο κυτταρική βιολογία, όπου ευαίσθητες μετρήσεις του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της νόσου, καθώς και ποσοτική παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου. Εδώ αποδεικνύουμε ότι

ποσοτική απεικόνιση φάσης (QPI)

παρέχει μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδο για τη μελέτη της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων και για τον έλεγχο των ναρκωτικών. Χρησιμοποιούμε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού ως πρότυπο για την απόδειξη της αρχής της μεθόδου μας.

λογαριασμούς του καρκίνου του μαστού για το 30% όλων των διαγνωσμένων κρουσμάτων καρκίνου και για το 14% όλων των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο στις γυναίκες [9]. Μια σημαντική μείωση (7%), στη συχνότητα εμφάνισης έχει παρατηρηθεί από το 2002 που μπορεί να αποδοθεί άμεσα στην καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ των οιστρογόνων και την ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού [10] – [16]. Αυτή η γνώση έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας κατηγορίας παραγόντων που ρυθμίζουν άμεσα τον υποδοχέα οιστρογόνου (ER) και είναι τώρα ο ακρογωνιαίος λίθος της θεραπείας και της πρόληψης σε ER θετικούς ασθενείς (70% όλων των περιπτώσεων) [17]. Με τη συνειδητοποίηση ότι είναι δυνατό να ασκεί έλεγχο επί της ανάπτυξης του καρκίνου μέσω αντι-ορμόνες και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ήρθε η ανάγκη για δοκιμές μεγάλης κλίμακας πιθανώς χρήσιμων ενώσεων. Μέχρι το 1974, πάνω από 40.000 ενώσεις που ελέγχονται ετησίως με χρήση μοντέλων ποντικών [18], [19]. Το 1990, NCI καθιέρωσε την πρώτη διαλογή των 59 ανθρώπινων κυτταρικών σειρών, η οποία παραμένει σε χρήση σήμερα [20], [21]. Αυτή η νέα πρωταρχική οθόνη που απαιτούνται μέθοδοι για την αξιολόγηση της ανάπτυξης

in vitro

. Αρκετές μεταβολικές δοκιμασίες αναπτύχθηκε για τη μέτρηση κυτταρικής ανάπτυξης και βιωσιμότητας -η οποία, μέχρι σήμερα, έχουν παραμείνει σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητη [20], [22] – [26].

Ένα ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση βασίζεται στην αναγωγή ενός άχρωμο άλας τετραζολίου για να δώσει ένα έγχρωμο formozan ανάλογη προς τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων. Αν και τέτοιες αναλύσεις είναι χρήσιμες για τη μέτρηση της συνολικής κυτταροτοξική αποτελεσματικότητα μιας ένωσης, μεγάλος αριθμός κυττάρων (10

3-10

5) [27] πρέπει να χρησιμοποιηθεί για να αποφευχθεί εσφαλμένα συμπεράσματα από επιδράσεις όπως μεταβλητή φορές διπλασιασμός [20]. Επιπλέον, δεδομένου ότι πολλά φάρμακα έχουν επιπτώσεις στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου που δεν οδηγούν σε μεταβολικές αλλαγές, σε ορισμένες περιπτώσεις, ένας ψευδής ανάγνωση μπορεί να γίνει [28]. Μη-τετραζόλιο δοκιμασίες που βασίζονται έχουν επίσης αναπτυχθεί. Αυτές οι δοκιμασίες χρησιμοποιούν χρωστικές που δεσμεύονται ηλεκτροστατικά να βασικών αμινοξέων [25] και το μετρούμενο σήμα έτσι γραμμική με την καταμέτρηση των κυττάρων. Παρά τις πρακτικές δυσκολίες που εμπλέκονται, ένα τέτοιο αντιδραστήριο είναι γνωστή ως σουλφοροδαμίνης Β (SRB) τελικά υιοθετήθηκε για τη συνήθη προβολές. Και οι δύο τύποι ανάλυσης παρέχουν έμμεσες μετρήσεις της ανάπτυξης: οι δοκιμασίες με βάση το τετραζόλιο μέτρηση της μεταβολικής δραστηριότητας, ενώ η δοκιμασία SRB μετρά ουσιαστικά συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης. Και οι δύο μέθοδοι βασίζονται στη χρήση μεγάλων αριθμών κυττάρων, παρέχουν μόνο χύμα μετρήσεις για το σύνολο της συλλογής των κυττάρων, και δεν είναι σε θέση να μετρήσει εξαρτώνται από το χρόνο αντιμετώπισης των ναρκωτικών σε κυτταρικό επίπεδο. Τυπικά, τα δεδομένα δοκιμασία ανάπτυξης συμπληρωμένο με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογής πειράματα (FACS) για την παροχή πρόσθετων στατιστικών πληροφοριών, και να μελετήσει την γονιδιακή έκφραση και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αν και πολύ κατατοπιστική, FACS αναλύσεις απαιτούν τα κύτταρα να απομακρυνθούν από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας τους, συστάδες κυττάρων να διαχωριστεί, προκαλώντας αλλαγές στο φαινότυπο και τη μορφολογία.

Ως εκ τούτου, γίνεται ολοένα και πιο σαφές ότι για να κατανοήσουμε πραγματικά τη φύση της τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου και για την ανάπτυξη θεραπειών εξατομικευμένες ανοσοενισχυτικό, υπάρχει μια ανάγκη για νέες μεθοδολογίες που παρέχουν ποσοτικές πληροφορίες για την παρακολούθηση των επιδράσεων του φαρμάκου στην κυτταρική ανάπτυξη και τα συνοδευτικά μορφολογικές και φαινοτυπικές αλλαγές στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Το ιδανικό φάρμακο οθόνη πρέπει να είναι αρκετά ευαίσθητη για την ταχεία αξιολόγηση της απόκρισης ενός μικρού αριθμού κυττάρων σε μία ποικιλία πιθανών θεραπειών προκειμένου να αξιολογηθεί άμεσα την απόκριση του ασθενούς ή την αποτελεσματικότητα ενός συγκεκριμένου φαρμάκου. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι QPI [29] αντιμετωπίζει αυτό το τεχνολογικό χάσμα. μικροσκοπία χωρικής φωτεινής παρεμβολές (SLIM) [30] είναι μια προσέγγιση QPI που έχει φεμτογραμμαρίων ευαισθησία επίπεδο με τις αλλαγές στην ξηρή μάζα και μπορεί ταυτόχρονα να παρέχει τις πληροφορίες αυτές, τόσο σε μεμονωμένο κύτταρο και το επίπεδο του πληθυσμού [31]. SLIM μπορεί να συνδυαστεί με μικροσκοπία φθορισμού για τη μέτρηση του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται ανάπτυξη [31]. Στην εργασία αυτή, χρησιμοποιούμε το υποδοχέα οιστρογόνων (ER) -θετικό MCF-7 καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή [32], [33] ως ένα σύστημα μοντέλο για να αποδείξει ότι SLIM μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού φάρμακο εξαιρετικά ευαίσθητα.

Η κυτταρική γραμμή MCF-7, έχει ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο για τη μελέτη ορμονική επίδραση στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού, ιδιαίτερα, σε απόκριση προς τα οιστρογόνα που παίζει καθοριστικό ρόλο στην προώθηση της ανάπτυξης και της εξέλιξης των καρκινικών κυττάρων. Μετρήσαμε την ανάπτυξη των MCF-7 κυττάρων συστάδες σε στάνταρ μέσο καλλιέργειας κυττάρων (Veh), και υπό την επίδραση της οιστραδιόλης (Ε2), την κυρίαρχη μορφή οιστρογόνου κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ηλικίας, και η ICI, 182, 780 – επίσης γνωστό ως Faslodex- [ ,,,0],34], μια πλήρης ανταγωνιστής του ER χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία μεταστατικού καρκίνου του μαστού στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ αποδεικνύουν ότι, εκτός του ότι είναι ένα πολύτιμο δοκιμασία πολλαπλασιασμού, της απεικόνισης ποσοτική φάση παρέχει επίσης βιολογικά σχετικές πληροφορίες σε επίπεδο πληθυσμού μεμονωμένου κυττάρου και σύμπλεγμα κυττάρων που δεν είναι προσβάσιμη μέσω άλλων μεθόδων. Τέτοιες μετρήσεις, σε συνδυασμό με υφιστάμενες δοκιμασίες μοριακού έχουν τη δυνατότητα να βελτιώσουν σχεδιασμό φαρμάκων και τον χαρακτηρισμό και να γεφυρώσει τη σχέση μεταξύ μοριακών κατανόηση του καρκίνου και της θεραπείας του φαρμάκου επιδράσεις στην κυτταρική ανάπτυξη και φαινοτυπικές ιδιότητες όπως το μέγεθος των κυττάρων /μάζα.

Αποτελέσματα

MCF-7 κύτταρα σπάρθηκαν σε δύο καλά θάλαμο slide και οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε τρεις συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων (δείτε το

Υλικά και Μέθοδοι

για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τον πολιτισμό και την επεξεργασία των κυττάρων) . Πρώτον, τα τυπικά μέσα ανάπτυξης των κυττάρων καθώς το όχημα ελέγχου (Veh), δεύτερο μέσο ανάπτυξης κυττάρων που περιείχε 10 ηΜ οιστραδιόλη (Ε2), και, τέλος, μέσα ανάπτυξης κυττάρου με το αντιοιστρογόνο 1 μΜ ICI182,780 10 ηΜ Ε2 (Ε2 + ICI). Για τη θεραπεία Ε2 + ICI, τα κύτταρα αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες Ε2 για 10 ώρες πριν να προστεθεί ICI. Το σημείο 10 ωρών επιλέχθηκε η χορήγηση του φαρμάκου δεδομένου ότι αυτό είναι το νωρίτερο σημείο στο οποίο παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των ρυθμών ανάπτυξης των Veh και Ε2 επεξεργασμένο πληθυσμούς (Εικ. S1). Μια 1,55 × 1,16 χιλιοστών

2 περιοχή κάθε καλά σαρώθηκε κάθε 30 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης εμπορική εξοπλισμένα με SLIM add-on module. Για κάθε πείραμα, ένα φρεάτιο περιείχε ένα μη επεξεργασμένο πληθυσμό ελέγχου (Veh) και το δεύτερο φρεάτιο περιείχε τον πληθυσμό αγωγή Ε2 ή Ε2 + ICI. Δύο μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με ένα τέτοιο τρόπο για κάθε κατάσταση. Όλα τα δεδομένα θα διατίθενται ελεύθερα κατόπιν αιτήματος.

Μια σχηματική του μέσου και εκπρόσωπος SLIM εικόνες από ένα καλά φαίνονται στο Σχ. 1 Α και Β αντίστοιχα. SLIM διατηρεί υποκυτταρική ανάλυση (Εικ. 1Β) σε μια μεγάλη περιοχή με σάρωση κάθε θάλαμο σε ένα μωσαϊκό μοτίβο (για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τη μέτρηση αναφέρονται σε

Υλικά και Μέθοδοι

). Από τις μεγάλες μωσαϊκό εικόνων, από τις άκρες των επιμέρους σχηματισμών (που αποτελείται από 2-3 κυττάρων σε t = 0 ώρες) εντοπίστηκαν σε κάθε χρονικό σημείο και το εμβαδόν της επιφάνειας και της συνολικής ξηρής μάζας μετρήθηκαν (βλέπε ταινία S1 για έναν χρόνο παρέλευση της οπτικό πεδίο για όλες τις ομάδες). Με αυτόν τον τρόπο, μπορούμε να αναλύσουμε τόσο τις γενικές τάσεις ανάπτυξης της κάθε ομάδας και την ανομοιογένεια στο επίπεδο cluster μέσα σε κάθε πληθυσμό. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτό το είδος της μέτρησης είναι επί του παρόντος αδύνατο να εκτελέσει με οποιαδήποτε υπάρχουσα δοκιμασία πολλαπλασιασμού.

(Α) Σχηματική απεικόνιση της πειραματικής διάταξης. Μια πλήρως αυτοματοποιημένη μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης εμπορικές εξοπλισμένη με στάδιο κορυφή έλεγχο επώασης και x, y, z δυνατότητες σάρωσης χρησιμοποιήθηκε για να σαρώσει μια περιοχή 1,5 mm × 1,2 mm σε κάθε φρεάτιο μιας 2-καλά ολισθαίνει κάθε 30 λεπτά. Τα συστατικά στη διακεκομμένη γραμμή περιλαμβάνει το add-on module SLIM: Fourier του φακού 1 (FL 1) έργα το επίπεδο των μαθητών του μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης σε ένα υγρών κρυστάλλων Φάση διαμορφωτή (LCPM), η οποία παρέχει έλεγχο της καθυστέρησης φάσης μεταξύ του διάσπαρτα και un-διάχυτου φωτός? Fourier Lens 2 έργα της εικόνας φάσης διαμορφώνεται σε ένα CCD. Όλα τα συστατικά του μέσου συγχρονίστηκαν με τη χρήση της CPU. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες από μια σαρωμένη οπτικό πεδίο σε έναν από τους θαλάμους στους 0 ώρες και 94 ώρες, η περιοχή στην διακεκομμένη κίτρινη γραμμή είναι διευρυμένη και παρουσιάζεται σε κάθε χρονικό σημείο (κίτρινη γραμμή κλίμακας είναι 50 μικρά). (Γ) μέσο κανονικό επιφάνειας για τα συμπλέγματα σε κάθε ομάδα στα επισημασμένα χρονικές περιόδους. (Δ) μέσο κανονικό μάζα για συμπλέγματα σε κάθε ομάδα στα επισημασμένα χρονικές περιόδους. (C-D) Πλατεία δείκτες δείχνουν μέση, κεντρική γραμμή είναι διάμεσος, κορυφή του κουτιού είναι 25

ου γραμμή εκατοστημόριο, κάτω μέρος είναι 75

ου γραμμή εκατοστημόριο, μουστάκια δείχνουν 5

ου και 95

ου εκατοστημόρια , σημασία δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα un-paired t-test, o: p & gt? 0,05, *: p & lt? 0,05, **: p & lt? 0,01, ***: p & lt? 0.001. (Ε) μέτρηση δοκιμασία WST-1 πολλαπλασιασμό σε 72 ώρες.

Η

χρονικές μεταβολές στις μάζας και Περιοχή

Κατ ‘αρχάς, έχουμε καθιερώσει τις δυνατότητες του SLIM ως δοκιμασία πολλαπλασιασμού με τη μέτρηση των επιπτώσεων της οιστραδιόλης στις σχετικές αλλαγές στην ανάπτυξη, η οποία είναι ποιοτικά παρόμοια με τις πληροφορίες που παρέχονται από τις συμβατικές αναλύσεις. Οι ποσότητες του ενδιαφέροντος εδώ είναι οι σχετικές ποσότητες της ανάπτυξης σε μέγεθος και μάζα, όχι οι απόλυτες τιμές. Για την εκτέλεση αυτής της ανάλυσης, η περιοχή μάζας και της επιφάνειας του κάθε συμπλέγματος είναι κανονικοποιημένη σε σχέση με το αρχικό του μέγεθος, Μ (t) /M (t = 0) και η περιοχή (t) /Περιοχή (t = 0), αντιστοίχως. Η κανονικοποιημένη περιοχή και μάζα για όλα αναλύθηκαν συστάδες (τουλάχιστον 5 ανά ομάδα) διαχωρίστηκαν σε 15 ώρες κάδους όπως φαίνεται στα Σχ. 1C και 1D. Δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στην κανονικοποιημένη περιοχή σε κάθε χρονικό σημείο. Αντιθέτως, οι διαφορές στην κανονικοποιημένη μάζα είναι ανιχνεύσιμες καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου μέτρησης (Εικ. 1 C-D). Το γεγονός αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της μέτρησης της μάζας και όχι απλώς την περιοχή του συμπλέγματος. Επιπλέον, η θεραπεία της ICI δρα ταχέως όπως η ομάδα Ε2 εμφανίζει μεγαλύτερη σχετική αύξηση στη μάζα εντός 30 ωρών. Μία διαφορά μεταξύ της Ε2 + ICI και ομάδα ελέγχου μπορεί να ανιχνευθεί με 60 ώρες. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ενώ οι τρέχουσες δοκιμασίες πολλαπλασιασμού βασίζονται στη χρήση ενός μεγάλου αριθμού κυττάρων, οι μετρήσεις SLIM πραγματοποιήθηκαν σε ατομικό επίπεδο συμπλέγματος.

Σύγκριση με χρωματομετρική δοκιμασία

Για σύγκριση, μετρήσεις από ένα WST-1 προσδιορισμό που λαμβάνονται μετά από 72 ώρες αγωγής φαίνεται στο Σχ. 1Ε. Μπορεί να φανεί ότι υπάρχει μια καλή ποιοτική συμφωνία μεταξύ των δεδομένων WST-1, τα οποία υποδεικνύουν έμμεσα ρυθμό πολλαπλασιασμού, και οι μετρήσεις κανονικοποιημένης περιοχής μετά από 75 ώρες. Ωστόσο, η κανονικοποιημένη μάζα είναι μεγαλύτερη στον έλεγχο από την ομάδα Ε2 + ICI μετά από 60 ώρες. Οι διαφορές αυτές είναι πιθανόν επειδή η δοκιμασία WST-1 μετρά απλώς την αναγωγή μιας βαφής τετραζολίου έξω από το κύτταρο. Αν και το επίπεδο αυτής της μείωσης σχετίζεται με την μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων και αντανακλά τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων στον πληθυσμό, δεν είναι μια άμεση μέτρηση της κυτταρικής μάζας ή το μέγεθος. Επιπλέον, τέτοιες αναλύσεις περιορίζονται στην παροχή ενός αριθμού για ένα πληθυσμό χύδην και δεν παρέχουν καμία πρακτικός τρόπος για να μελετηθεί η ετερογένεια του πληθυσμού. Προκειμένου να επεξηγηθεί καλύτερα η μετρηθείσα διακύμανση των δεδομένων το κανονικοποιημένο μάζα και την περιοχή για τις μεμονωμένες συστάδες φαίνονται στο Σχ. 2.

(Α) Κανονικοποιημένη μάζας συναρτήσει του χρόνου για όλα τα συμπλέγματα που αναλύθηκαν. (Β) Κανονικοποιημένη περιοχή έναντι του χρόνου για όλες τις ομάδες. (Α-Β) διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τα ατομικά δεδομένα διασποράς και συμπαγείς γραμμές δείχνουν ο μέσος όρος των δεδομένων. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν όπου η διαφορά μεταξύ των ομάδων γίνεται σημαντική.

Η

Χρονικά αλλαγές στο ποσοστό Μαζικής Ανάπτυξης

Εκτός από την παροχή μια ποσοτική κατανόηση του πώς διάφορες θεραπείες επηρεάζουν τη σχετική αλλαγές στο μέγεθος και τη μάζα , SLIM μπορεί επίσης να μετρήσει τις αλλαγές του ρυθμού αύξησης των μικρών συστάδων κυττάρων ως συνάρτηση του χρόνου ή το μέγεθος. Τη μέτρηση του ρυθμού ανάπτυξης, με υψηλή ευαισθησία είναι πιο κατατοπιστική από την απλή μέτρηση των σχετικών μεταβολών της μάζας καθώς παρέχει μια κατανόηση του πότε θεραπείες αρχίζουν να τεθούν σε ισχύ και πόσο καιρό το φαινόμενο εξακολουθεί να υφίσταται. Οι ξηρές χάρτες μάζα πυκνότητα του τυπικού συστάδες από κάθε ομάδα την πάροδο του χρόνου που φαίνεται στο Σχ. 3A (βλ Ταινία S2 για). Σύκο. 3Β δείχνει το ρυθμό ανάπτυξης των συνεργατικών σχηματισμών σε κάθε ομάδα έναντι του χρόνου. Μια σημαντική διαφορά στο ρυθμό ανάπτυξης μεταξύ όλων των τριών ομάδων μπορεί να ανιχνευθεί νωρίς, σε 15 ώρες (5 ώρες μετά την αγωγή ICI χορηγήθηκε), η οποία είναι 15 ώρες νωρίτερα από την ανιχνεύσιμη αλλαγή τόσο στη ζώνη και μάζας. Επιπλέον, αν και η κανονικοποιημένη μάζα είναι μεγαλύτερη για την ομάδα Ε2 + ICI από τον έλεγχο μέχρι και 60 ώρες, ο ρυθμός αύξησης του ελέγχου υπερβαίνει την ομάδα Ε2 + ICI κατά 45 ώρες. Μπορεί επίσης να φανεί ότι αν και clusters στην ομάδα Ε2 επιτύχει πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με τις μάζες και τις περιοχές από τον έλεγχο, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στα ποσοστά ανάπτυξης μεταξύ των δύο ομάδων μετά από 90 ώρες.

(Α) Ξηρά χάρτες πυκνότητα μάζας του εκπροσώπου συστάδες από κάθε ομάδα MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού σε κάθε 22 ώρες. Τα χρώματα δείχνουν τη συνολική μάζα πυκνότητας σε κάθε pixel, όπως φαίνεται στη γραμμή χρώμα. Η κίτρινη γραμμή κλίμακας είναι 50 μικρά. Σημειώστε ότι στην ομάδα Ε2 + ICI, ICI προστέθηκαν σε κάθε δείγμα σε 10 ώρες. ρυθμός ανάπτυξης (Β) Cluster σε κάθε ομάδα στην απεικονιζόμενη χρονική περίοδο. ρυθμός ανάπτυξης (C) Cluster σε κάθε ομάδα ως συνάρτηση της κανονικοποιημένης μάζας. Τα στερεά γραμμές φαίνονται ως οδηγός για το μάτι για να καθορίσει πώς ο ρυθμός ανάπτυξης αλλάζει ως συνάρτηση της μάζας της ανάπτυξης. (Β-Γ) Πλατεία δείκτες δείχνουν μέση, κεντρική γραμμή είναι διάμεσος, κορυφή του κουτιού είναι 25

ου γραμμή εκατοστημόριο, κάτω μέρος είναι 75

ου γραμμή εκατοστημόριο, μουστάκια δείχνουν 5

ου και 95

ου εκατοστημόρια , σημασία δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα un-paired t-test, o: p & gt? 0,05, *: p & lt? 0,05, **: p & lt? 0,01, ***: ρ. & lt? 0.001

η

Με σχεδιάζοντας το ρυθμό ανάπτυξης ως συνάρτηση του κανονικοποιημένου μάζας (Σχ. 3C) η τάση ανάπτυξης (εκθετική ή γραμμικό) των ομάδων μπορεί να προσδιοριστεί. Μπορεί να φανεί ότι ο μέσος ρυθμός ανάπτυξης των συστάδων στις ομάδες Ε2 και Veh συνεχίζει να αυξάνεται μέχρις ότου επιτευχθεί μία αύξηση κατά 4 φορές σε μάζα, μετά την οποία ο ρυθμός ανάπτυξης είναι είτε σταθερή ή μειώνεται. Η τάση αυτή υποδηλώνει ότι για περίπου δύο διπλασιασμούς μάζας και οι δύο ομάδες παρουσιάζουν εκθετική αύξηση, μετά την οποία η ανάπτυξη είναι γραμμική. Σε αντίθεση, η ομάδα Ε2 + ICI παρουσιάζει εκθετική ανάπτυξη (γραμμική τάση στο Σχ. 3C) μέχρι μια 2-πλάσια αύξηση της μάζας επιτυγχάνεται, μετά την οποία η ανάπτυξη είναι γραμμική (σταθερή καμπύλη στο Σχ. 3C). Είναι σημαντικό να σημειωθεί εδώ ότι ο διπλασιασμός της μάζας δεν αντιστοιχεί αναγκαστικά σε ένα πλήρες κυτταρικό κύκλο και ως οιστρογόνο και ICI είναι γνωστό ότι οδηγούν σε αλλαγές στο πώς ένα κύτταρο προχωρά μέσω του κυτταρικού κύκλου, δηλαδή, ο χρόνος διπλασιασμού και το μέγεθος και διαίρεση και τα δύο μπορεί να επηρεαστεί.

επιδράσεις της οιστραδιόλης στο τηλέφωνο μέγεθος και διπλασιασμός χρόνου

για να προσδιορίσετε πώς οι αλλαγές στο επίπεδο του ενός κυττάρου συμβάλλουν στις μετρήσιμες αλλαγές στο σχετικό μέγεθος, τη μάζα, και ρυθμούς ανάπτυξης , μετρήσαμε την ώρα και την επί τοις εκατό μεταβολή διπλασιασμό σε μέσο μέγεθος κελιού για μεμονωμένα κύτταρα που συνθέτουν τα συμπλέγματα (Εικ. 4). Ο χρόνος διπλασιασμού υπολογίζεται απλά ως, όπου

t

f

είναι το τελευταίο χρονικό σημείο,

t

0

είναι το αρχικό σημείο του χρόνου, και

N

κυττάρων (t)

είναι ο αριθμός των κυττάρων σε χρόνο

t

. Οι χρόνοι διπλασιασμού για την ομάδα Ε2 βρέθηκαν να είναι σημαντικά χαμηλότερα από τον Veh και ομάδες Ε2 + ICI (Σχ. 4Α). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η οιστραδιόλη επάγει κύτταρα να διαιρούνται σε σχεδόν διπλάσιο του ποσοστού της ομάδας ελέγχου και ότι η θεραπεία με την ICI αναστρέφει σχεδόν πλήρως αυτό το αποτέλεσμα. Σύμφωνα με τις μελέτες που αναφέρθηκαν προηγουμένως, διαπιστώνουμε ότι τα οιστρογόνα επιταχύνουν κυττάρων μέσω του κυτταρικού κύκλου, με αποτέλεσμα την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αξιοσημείωτο είναι ότι η επίδραση της ICI σε αύξηση του χρόνου κύτταρο-διπλασιασμού δεν σημαίνει ότι ο κυτταρικός κύκλος επιστρέφει σε κανονικές συνθήκες αλλά πιο πιθανό είναι αποτέλεσμα των κυττάρων ξοδεύουν ένα μεγαλύτερο χρονικό διάστημα σε μια συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου.

(Α) χρόνος διπλασιασμού σε κάθε ομάδα, ο χρόνος διπλασιασμού μέση μειώνεται κατά 12 ώρες στην ομάδα Ε2 σε σύγκριση με τις ομάδες Veh και Ε2 + ICI, υποδεικνύοντας ότι η προσθήκη ICI επιστρέφει ο χρόνος διπλασιασμού για τον έλεγχο των επιπέδων. (Β) Ποσοστό μεταβολής στη μέση μάζα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της περιόδου μέτρησης για κάθε ομάδα. Μία σημαντική μείωση στην κυτταρική μάζα παρατηρείται τόσο στην Ε2 και Ε2 + ICI ομάδες σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Γ) αποτιμώνται φορά εναντίον μεταβολή στη μέση κυτταρική μάζα για κάθε σύμπλεγμα που μετρήθηκε διπλασιασμού, αυτές οι δύο παράμετροι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το διαχωρισμό των τριών ομάδων εντελώς και μπορεί να χρησιμεύσει ως υπογραφή ανάπτυξης.

Η

Η αλλαγή στη μέση κυτταρική μάζα την πάροδο του χρόνου υπολογίστηκε διαιρώντας τη συνολική μάζα του κάθε συμπλέγματος με τον αριθμό των κυττάρων στο σύμπλεγμα. Το Σχήμα 4Β δείχνει την επί τοις εκατό μεταβολή στη μέση κυτταρική μάζα μεταξύ των αρχικών και τελικών χρονικών σημείων για κάθε συστάδα. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια σημαντική μείωση στη μέση κυτταρική μάζα την πάροδο του χρόνου στα κύτταρα Ε2 και Ε2 + ICI σε σύγκριση με τον έλεγχο. Αυτή η μείωση στην κυτταρική μάζα και χρόνο διπλασιασμού δείχνουν ότι σε σύγκριση με τον έλεγχο, τα αποτελέσματα των οιστρογόνων σε μικρότερα, πιο γρήγορα διαιρούμενα κύτταρα, και ότι η προσθήκη αποτελέσματα ICI σε μεγαλύτερους χρόνους διπλασιασμού μαζί με μικρότερες κύτταρα. Τα μικρότερα κύτταρα στις ομάδες Ε2 + ICI υπονοεί ότι αν και ο χρόνος διπλασιασμού έχει επιστρέψει στα επίπεδα του μάρτυρα, η ICI επηρεάζει μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων και την ικανότητα να αναπτύσσονται κανονικά. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ, ο χρόνος διπλασιασμού και μεταβολή στη μέση κυτταρική μάζα παρέχουν μια αξιόπιστη «υπογραφή ανάπτυξη» για κάθε ομάδα και δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα οιστρογόνου ή παρουσία ενός διαμορφωτή ER μπορεί να αξιολογηθεί απλώς εξετάζοντας αυτά τα δύο παραμέτρους. Από τρέχουσες δοκιμασίες δεν παρέχουν μια άμεση μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης, αυτές είναι οι πρώτες μετρήσεις, εκτελούνται συνεχώς σε έναν πληθυσμό, που αποσαφηνίζουν πως τα οιστρογόνα επηρεάζουν MCF-7 κινητική ανάπτυξη σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ αποδεικνύουν ότι SLIM μετρήσεις της ξηρής πυκνότητας μάζας μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εξαιρετικά ευαίσθητα δοκιμασίες πολλαπλασιασμού. Τα κύρια πλεονεκτήματα έναντι των υπαρχουσών μεθόδων είναι ότι SLIM μπορεί να ανιχνεύσει αλλαγές στην κινητική ανάπτυξη σε λιγότερα αριθμού των κυττάρων, σε λιγότερο χρόνο, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των διαφορών εντός ενός πληθυσμού και όχι μόνο την παροχή ενός αριθμού για το μεγαλύτερο μέρος της ανάπτυξης μιας καλλιέργειας. Ως σύγκριση, η δοκιμασία WST-1 λειτουργεί με αριθμούς κυττάρων σε 10

3-10

5 σειρά [27], ενώ SLIM είναι ευαίσθητη στις μεταβολές του πολλαπλασιασμού, ακόμη και ένα μόνο κύτταρο. Επιπλέον, SLIM παρέχει τη δυνατότητα να αναλύσει το ρυθμό ανάπτυξης των μεμονωμένων κυττάρων και συστάδων ως συνάρτηση της μάζας τους, παρέχοντας τη διορατικότητα για το μηχανισμό ρύθμισης της ανάπτυξης (π.χ. αν ένα κυτταρικό μέγεθος ή την ηλικία σημείο ελέγχου είναι να χρησιμοποιηθεί) [35]. Η πληροφορία αυτή είναι απρόσιτη σε οποιαδήποτε υπάρχουσα δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Αυτό το σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί εύκολα για τη μέτρηση της κινητικής ανάπτυξης και φαινοτυπικά αποτελέσματα για κάθε τύπο και θεραπεία κυττάρου.

Τα αποτελέσματά μας επίσης δείχνουν ότι μετρώντας αύξηση σε κυτταρικό και σύμπλεγμα επίπεδο όχι μόνο παρέχει πλεονεκτήματα όσον αφορά την βελτιωμένη ευαισθησία και μειωμένη τα μεγέθη των δειγμάτων, αλλά παράγει επίσης πρόσθετες πληροφορίες που δεν είναι προσβάσιμο από τις υπάρχουσες μεθόδους. Συγκεκριμένα, δείχνουμε την κινητική και τροπικότητα δράσης της Ε2 σε MCF-7. Πράγματι MCF-7 υπό την επίδραση της Ε2, χωρίζουν γρηγορότερα και να επιτύχει μικρότερες μάζες, με αποτέλεσμα την αύξηση του αριθμού των κυττάρων που είναι κατά μέσο όρο μικρότερο. Λόγω της μειωμένης χρόνο διπλασιασμού, αυτό εξακολουθεί να έχει ως αποτέλεσμα μία συνολική αύξηση της συνολικής μάζας για την Ε2 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Για τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε Ε2 και στη συνέχεια κατεργάζεται με την ICI οι χρόνοι διπλασιασμού επέστρεψε με εκείνα που βρέθηκαν στον έλεγχο, ωστόσο η μείωση του μεγέθους των κυττάρων ήταν ακόμα μεγαλύτερη από ό, τι στην ομάδα ελέγχου.

Τα αποτελέσματα της Ε2 και αντι-οιστρογόνα στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου έχουν προηγουμένως μελετηθεί λεπτομερώς [11], [15], [36], [37]. Και οι δύο έχουν ταχεία και παροδική παρατηρήθηκαν επιδράσεις λόγω λειτουργική δραστηριότητα τόσο στον πυρήνα (γονιδιωματική εφέ) και Extranuclear διαμερίσματος (μη γονιδιωματικών επιδράσεων) [38]. Οι ταχείες επιπτώσεις στην ανάπτυξη είναι σαφώς να παρατηρηθούν σε δεδομένα μας, όπως οι διαφορές στο ρυθμό ανάπτυξης μεταξύ Ε2 και Veh εκτεθειμένα κύτταρα είναι παρατηρήσιμα μετά από 10 ώρες (Εικ. S1) και μπορεί να αποδοθεί στην πρώιμη ενεργοποίηση των γονιδίων του μεταβολισμού που σχετίζονται με [39 ]. Μετά την προσθήκη της ICI, μια καθαρή ανταγωνιστή ER, οι διαφορές στο ρυθμό ανάπτυξης μεταξύ των ομάδων Ε2 και Ε2 + ICI αρχίζουν να εμφανίζονται την πάροδο του χρόνου (Σχ. 3Β). Οι παροδικές επιπτώσεις της Ε2 + ICI εκδηλώνονται επίσης και στο πώς μπορούν να παρατηρηθούν οι αλλαγές ρυθμό ανάπτυξης σε συνάρτηση με την αύξηση του μεγέθους των κυττάρων (Σχ. 3C), μια σαφή ρήξη του ρυθμού ανάπτυξης, όταν οι συστάδες ICI περίπου διπλάσια σε μέγεθος.

τα οιστρογόνα είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν καταρράκτες μεταγωγής που ρυθμίζουν πολλά γονίδια -τόσο θετικά και αρνητικά που παίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το μεταβολισμό [10] – [15], [39]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι τα οιστρογόνα προκαλούν τα κύτταρα μη ποδηλασία (G

0 φάση) να εισέλθουν στον κύκλο του κυττάρου και να προχωρήσει γρήγορα μέσω του G

1 στη φάση S [11], [15], [37 ]. Αυτή η ταχεία εξέλιξη διαμέσου του κυτταρικού κύκλου αντιπροσωπεύει τόσο την μειωμένο χρόνο διπλασιασμού και μείωση του μέσου κυτταρική μάζα που παρατηρήθηκε στην ομάδα Ε2 (Εικ. 4). Από την άλλη πλευρά, η ICI έχει δειχθεί ότι μπλοκάρει τα κύτταρα MCF-7 στο G0-G

1 φάσης [15], [28], [37]. Αυτή η ανασταλτική δράση επί της προόδου μέσω G1 εκδηλώνεται με την αύξηση του χρόνου διπλασιασμού της ομάδας Ε2 + ICI σε σύγκριση με την ομάδα Ε2. ICI επηρεάζει επίσης τη μεταγραφή αρκετών γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ρύθμιση της ανάπτυξης σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Η ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων που είναι γνωστό ότι είναι υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό σε συνδυασμό με την αύξηση του χρόνου που δαπανάται σε G1 είναι πιθανόν υπεύθυνο για τη μείωση του μεγέθους των κυττάρων παρατηρήθηκε στην ομάδα Ε2 + ICI [15].

Όπως και στην περίπτωση του υποδοχέα οιστρογόνων, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ελέγχεται επίσης μέσω της ενεργοποίησης και διαφοροποίησης των ρυθμιστικών καταρράκτες σηματοδότησης από αυξητικούς παράγοντες? μετρώντας αύξηση σε κυτταρικό επίπεδο έχει τη δυνατότητα να γεφυρωθεί το χάσμα μεταξύ του μοριακού κατανόηση της ανάπτυξης του καρκίνου και των πραγματικών ανάπτυξη του όγκου. Έτσι, έχει μεγάλο ενδιαφέρον να συνδυάσει αυτές τις μετρήσεις ανάπτυξης με δείκτες φθορισμού για τη φάση του κυτταρικού κύκλου (όπως έγινε προηγουμένως για U2OS κύτταρα [31]) ή για άλλες πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού. Μέτρηση των μεταβολών στην κινητική ανάπτυξης ως συνάρτηση του κυτταρικού κύκλου ή πιο συγκεκριμένα ενεργοποιήσεις γονίδιο, θα επιτρέψει την καλύτερη κατανόηση της συγκεκριμένης δράσης μιας ένωσης /φαρμάκου για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Εν ολίγοις, έχουμε κατέδειξε μια νέα δοκιμασία εξαιρετικά ευαίσθητο πολλαπλασιασμού για εφαρμογές διαλογής φαρμάκων. Αν και έχουμε επικεντρωθεί σε ένα συγκεκριμένο πρότυπο σύστημα κυτταρικής εδώ, η πειραματική διάταξη ισχύει με την αλλαγή σε άλλους τύπους κυττάρων και θεραπείες. Εκτός από τη μέτρηση της κινητικής της ανάπτυξης, η μέθοδος μας ταυτοχρόνως παρέχει επίσης πληροφορίες σχετικά με την κυτταρική μορφολογία και την κινητικότητα του [40], και μπορεί επίσης να συνδυαστεί εύκολα με άλλες τεχνικές μικροσκοπίας. Ένα αντικείμενο μελλοντικής μελέτης θα είναι να κατανοήσουν και να χαρακτηρίζουν τις μορφολογικές διαφορές που προκύπτουν ως αποτέλεσμα της ρύθμισης της ER (βλέπε Ταινία S1 και S2). Οι βιολογικές γνώσεις που παρέχονται από τις μετρήσεις SLIM σε συνδυασμό με άλλες μοριακές αναλύσεις θα βελτιώσουν αναμφίβολα την κατανόησή μας για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε γενικές γραμμές, και έχουν τη δυνατότητα να οδηγήσουν σε βελτιώσεις στο σχεδιασμό φαρμάκων, το χαρακτηρισμό και τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Εμπορικά διαθέσιμο κύτταρα MCF-7 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με ορό μόσχου 5% (HyClone, Logan, UT), 100 μg /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA), και 25 μg /ml γενταμυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης ΜΕΜ που περιέχει 5% ξυλάνθρακα δεξτράνη ορό μόσχου αντιμετωπίζονται να επωαστούν για 4 ημέρες. Δύο πλάκες θαλάμου (Lab-Tek) με καλυπτρίδες γυάλινο πάτο χρησιμοποιήθηκαν για να επιτρέψει για side-by-side απεικόνιση του ελέγχου και επεξεργασμένα δείγματα. Το μέσο αλλάχθηκε την ημέρα 2 και 4 πριν από την κατεργασία με το όχημα ελέγχου ή συνδετήρα αγωγές (οιστραδιόλη (Ε2, 10 ηΜ) και ICI 182,780 (ICI φουλβεστράντη, 1 μΜ)). Για τους χρωματομετρικών μετρήσεων, μια WST1-δοκιμασία (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα BioRad 680 Microplate Reader.

Κατά τη διάρκεια της απεικόνισης, τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C και σε μια ατμόσφαιρα 5% CO2 με έναν επωαστήρα και θερμαίνεται ένθετο στάδιο. Κάθε καλά σαρώθηκε κάθε 30 λεπτά σε 4 × μοτίβο 4-πλακάκι με ένα Zeiss ΕΚ Σχέδιο Neofluar 10 × /0,3 PH 1 στόχο την παροχή μιας συνολικής οπτικό πεδίο του 1,55 × 1,16 χιλιοστών

2. Ένα z-στοίβα των 12 φέτες (48 μm) καταγράφηκε σε κάθε θέση. Ο χρόνος έκθεσης ήταν 15 ms για κάθε εικόνα σε πλήρη ισχύ του λαμπτήρα (3.200 K, ή 10,7 V). Για κάθε πείραμα, ένα φρεάτιο αφέθηκε χωρίς θεραπεία για να χρησιμεύσει ως ένα πληθυσμό ελέγχου και η άλλη καλά υποβλήθηκε σε επεξεργασία είτε με το Ε2 ή κατάσταση Ε2 + ICI. Κάθε κατάσταση μετρήθηκε μαζί με τον έλεγχο δύο φορές της.

Απεικόνιση

απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικροσκοπία χωρική παρεμβολή φωτός (SLIM) [30], [41]. SLIM είναι ένα λευκό φως οπτική συμβολομετρία τροπικότητα σχεδιαστεί ως μια ενότητα add-on για ένα εμπορικό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Εν συντομία, SLIM λειτουργεί προβάλλοντας το πίσω εστιακό ενός στόχου αντίθεσης φάσης σε ένα διαμορφωτή φάσης υγρών κρυστάλλων (LCPM). Η LCPM έχει βαθμονομηθεί για να μετατοπίσει ακριβώς τη φάση του φωτός που σκεδάζεται από το δείγμα σε σχέση με το φως un-διάσπαρτα. Οι χάρτες ένταση καταγράφεται σε μετατοπίσεις φάσης μηδέν, π /2, π, και 3π /2.

Το SLIM εγκατάσταση που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη βασίζεται σε ένα Zeiss Axio Παρατηρητής Ζ1 (Κατάλογος Zeiss # 431007901000) κινητήρα που ανεστραμμένη έρευνα μικροσκόπιο απεικόνισης. Η βάση μικροσκόπιο είναι εφοδιασμένο με ένα μοτέρ κίνησης εστίασης (ελάχιστο βήμα πλάτος 10 nm). Οι στόχοι που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη αυτή είναι ένα Zeiss ΕΚ Σχέδιο Neofluar 10 × /0,3 PH 1 M27. Η ενδιάμεση εικόνα που ακολουθεί την αντικειμενική και σωλήνα φακός στρέφεται προς τα αριστερά λιμάνι του μικροσκοπίου, όπου η μονάδα SLIM επισυνάπτεται.