Αφηρημένο

Εγγενής ακτινοευαισθησία είναι ένας σημαντικός παράγοντας που διέπουν απόκρισης σε ακτινοθεραπεία, αλλά δεν υπάρχει καμία μέθοδος για τη συνήθη εκτίμηση της σε ανθρώπινους όγκους. υπογραφές γονίδιο επί του παρόντος προέρχονται και κάποια παλαιότερα που παράγεται από την έκφραση προφίλ του NCI-60 του πίνακα κυτταρική σειρά. Είχε υποτεθεί ότι η επικέντρωση σε πιο ομοιογενείς τύπους όγκων θα ήταν μια καλύτερη προσέγγιση. Δύο ομάδες κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από τράχηλο [n = 16] και κεφαλής και αυχένα [n = 11] καρκίνους. Ραδιοευαισθησία μετρήθηκε ως επιζών κλάσμα μετά από ακτινοβόληση με 2 Gy (SF2) με κλωνογόνο προσδιορισμό. Διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ ακτινοευαίσθητα και ακτινοανθεκτικά κυτταρικές σειρές (SF2 & lt? /& Gt? Διάμεσος) ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip εξόνιο 1.0ST (τράχηλος της μήτρας) ή U133A Plus2 (το κεφάλι και το λαιμό) συστοιχίες. Υπήρχαν διαφορές εντός κοόρτεις κυτταρική γραμμή που αφορά ιστό προέλευσης που ανακλάται από την έκφραση του στρωματοποιημένη επιθηλιακών ρ63 δείκτη. 138 γονίδια που ταυτοποιούνται ως συνδεόμενα με SF2, μόνο 2 (1,4%) ήταν σύμφωνες μεταξύ του τραχήλου και της κεφαλής και κυτταρικές σειρές καρκινώματος του λαιμού (MGST1 και TFPI), και αυτά δεν στεγανοποιήσει τα δημοσιευμένα κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-60 βασίζεται σε SF2. Υπήρχε μεταβλητή επιτυχία σε εφαρμογή τρεις δημοσιεύονται υπογραφές ακτινοευαισθησία σε ομάδες μας. Ένα γονίδιο υπογραφή, αρχικά εκπαιδευτεί στις κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-60, έκανε μερικώς χωριστές ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών σε όλες τις τρεις σύνολα δεδομένων κυτταρική γραμμή. Τα ευρήματα δεν επιβεβαιώνουν την υπόθεσή μας, αλλά δείχνουν ότι ένα κοινό μεταγραφικό υπογραφή μπορεί να αντανακλά την ραδιοευαισθησία των όγκων των ετερογενών προέλευση

Παράθεση:. Hall JS, IYPE R, Senra J, Taylor J, Armenoult L, Oguejiofor K, et al. (2014) Διερεύνηση των ακτινοευαισθησία Gene Υπογραφές στον Καρκίνο Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (1): e86329. doi: 10.1371 /journal.pone.0086329

Επιμέλεια: Olivier Gires, Πανεπιστήμιο Ludwig-Maximilians, Γερμανία

Ελήφθη: 29 Ιούλη, 2013? Αποδεκτές: 9 Δεκεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Hall et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Cancer Research Ηνωμένο Βασίλειο (C1094 /A9437, C1467 /A7286, και C147 /A6058), το Ιατρικό ερευνητικό Συμβούλιο του Ηνωμένου Βασιλείου (GO801525), και ECMC (C1467 /A7286) υποστήριξαν αυτή την έρευνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Mark J O’Connor χρησιμοποιείται από την AstraZeneca. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Άλλοι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν συγκρούσεις συμφερόντων. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν.

Εισαγωγή

Εγγενής ακτινοευαισθησία είναι ένας σημαντικός παράγοντας που διέπουν απάντηση ακτινοθεραπεία [1]. Ραδιοευαισθησία μπορεί να μετρηθεί ως το κλάσμα των κυττάρων που επιβίωσαν μία μόνο 2 Gy δόση ακτινοβολίας (SF2) με υψηλές τιμές δείχνουν ραδιοαντοχή. Ενώ άλλες μέθοδοι είναι διαθέσιμες για τη μέτρηση της κυτταρικής ραδιοευαισθησία σε κυτταρικές σειρές, SF2 θεωρείται ότι είναι το χρυσό πρότυπο και υποστηρίζεται από την ισχυρή κλινικές ενδείξεις.

In vitro

μετρήσεις SF2 συσχετίζονται με το

in vivo

radioresponse σε μοντέλα ποντικών [2]. Μέτρηση της SF2 σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με καρκίνωμα του τραχήλου της [3] και κεφαλής και αυχένα [4] παρακάτω πιθανώς θεραπευτική ακτινοθεραπεία. Παρά τα στοιχεία για τη σημασία του, καμία μέθοδος δεν είναι διαθέσιμη για τη συνήθη εκτίμηση της σε ασθενείς, λόγω της προβλήματα, τόσο της μέτρησης ακτινοευαισθησία όγκου. Η ικανότητα να μετρήσει ακτινοευαισθησία ενός όγκου θα είναι ένα μεγάλο βήμα και να επιτρέψει την εξατομικευμένη θεραπεία για τη μείωση της δόσης και /ή παραλείπουν χημειοθεραπεία σε ασθενείς με ευαίσθητο όγκους ή αντίθετα να εντείνουν τη θεραπεία κατά των ανθεκτικών όγκων. εξατομίκευση της θεραπείας θα πρέπει να αυξήσει την επιβίωση και τη μείωση της νοσηρότητας. Οι εκτιμήσεις δείχνουν μια βιολογικά εξατομικευμένη προσέγγιση στη θεραπεία με βάση τις δοκιμές ακτινοευαισθησία θα μπορούσε να αυξήσει τα ποσοστά επιβίωσης από & gt?. 10% [5]

Κατά συνέπεια, υπάρχει ενδιαφέρον απορρέει ένα γονίδιο υπογραφή που αντανακλά ακτινοευαισθησία. Διάφορες μέθοδοι έχουν εξερευνηθεί: αναγνώριση γονιδίων που προκαλείται μετά από ακτινοβόληση σε κυτταρικές σειρές [6]? εντοπισμό διαφορική έκφραση μεταξύ προκαλείται από ακτινοανθεκτικά και γονικής ακτινοευαίσθητα καρκινικές κυτταρικές σειρές [7] και προφίλ του

in vitro

απάντηση του τραχήλου όγκων από την ακτινοβολία [8]. Οι περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες ήταν μικρές και δεν έχουν ανεξάρτητα επικυρωθεί. Τα πιο ολοκληρωμένες μελέτες χρησιμοποίησαν το πάνελ NCI-60 κυτταρικών σειρών [9]. Μια μελέτη εντοπίστηκαν 22 γονίδια που μαζί διακρίσεις μεταξύ χαμηλών και υψηλών τιμών SF2 σε 63 κυτταρικές σειρές, με βάση ένα κατώτατο όριο του 0,2 (δηλαδή κυτταρικές σειρές με λιγότερο από 20% επιβίωση αποικία μετά από 2 Gy ορίζεται ως ακτινοευαίσθητα) [10]. Μια άλλη σειρά μελετών αναπτύξει μια έξυπνη ταξινομητής ακτινοευαισθησία βασίζεται σε προφίλ γονιδιακής έκφρασης που συνδέονται SF2 στα NCI-60 γραμμές [11], [12], [13], [14]. Το τελικό σημείο αυτών των μελετών ήταν ένα μοντέλο παλινδρόμησης των γονιδίων 10-διανομέα, η οποία είχε προγνωστική σημασία, όταν εφαρμόζεται σε τρεις κλινικές σύνολα δεδομένων (πρωκτική, οισοφαγική και κεφάλι & amp? Καρκίνοι του λαιμού) [13] και ήταν επίσης προβλεπτική της όφελος από ακτινοθεραπεία σε καρκίνο του μαστού [15]. Επιπλέον, μια μετα-ανάλυση των δημοσιευμένων στοιχείων από τέσσερις πλατφόρμες μικροσυστοιχιών για NCI-60 κύτταρα εντοπίστηκαν σε 31 γονίδιο ακτινοευαισθησία υπογραφή [16].

Ο πίνακας NCI-60 είναι το πιο εκτεταμένα χαρακτηριστεί το σύνολο των καρκινικών κυτταρικών σειρών και δημόσιος πόρος που χρησιμοποιείται συχνά ως εργαλείο διαλογής για την ανακάλυψη φαρμάκων [9]. Ο πίνακας περιέχει κυτταρικές σειρές από πολλαπλούς ιστούς προέλευσης αλλά λίγοι radiobiologically σχετικών τύπων όγκων όπως του τραχήλου της μήτρας (η = 0) ή κεφαλής και του τραχήλου (n = 0), δηλαδή, καρκίνοι όπου ακτινοθεραπεία είναι ένα σημαντικό μέρος της θεραπείας. Είναι καλά γνωστό ότι οι όγκοι που προέρχονται από διαφορετικούς ιστούς ποικίλουν σε radiosensitivities? με αιματολογικές κακοήθειες είναι ευαίσθητο, και γλοιοβλάστωμα και μελάνωμα τον πιο ανθεκτικά στην ακτινοβολία [17]. Οι μελέτες δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης της βασικής γονιδιακής συσχετίζονται έντονα με ιστό προέλευσης, ιδίως μεταξύ αιματολογικών και συμπαγών όγκων [10]. Ως εκ τούτου, σημαντικές διαφορές και υπάρχει θόρυβος στα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης «βασική» του NCI-60, ενδεχομένως παρεμποδίζει την ταυτοποίηση των γονιδίων που σχετίζονται με SF2. Η Ρ63 παράγοντας μεταγραφής είναι ένας δείκτης του πλακώδους κυττάρου προέλευσης και ρυθμίζει πολλά γονίδια που σχετίζονται με επιδερμοειδείς /πλακωδών κυττάρων μοίρα. Η απώλεια της ρ63 συνδέεται με την ανοδική ρύθμιση γονιδίων που σχετίζονται με μια πιο μεσεγχυματικά /κύτταρο μοίρα μεταναστευτικών [18].

Ήταν η υπόθεση ότι ο υπολογισμός μιας υπογραφής ραδιοευαισθησία χρησιμοποιώντας μια πιο ομοιογενή ομάδα κυτταρικών γραμμών θα ήταν ένα καλύτερη προσέγγιση. Έχουμε λάβει 16 του τραχήλου της μήτρας κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, έναν τύπο όγκου, όπου η ακτινοθεραπεία είναι σημαντική, αλλά αυτό δεν εκπροσωπείται στον πίνακα NCI-60. Τα κύτταρα που χαρακτηρίζεται από το ελέγχονται αυστηρά βασικές συνθήκες? παράμετροι που μετρήθηκαν περιλαμβάνονται SF2, έκφραση πρωτεΐνης με δέσμη πρωτεΐνης αντίστροφης φάσης (ZeptoMARK) και την έκφραση του γονιδίου με συστοιχία Affymetrix Εξόνιο 1.0ST. Επιχειρήσαμε για την ταυτοποίηση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ υψηλών και χαμηλών κυτταρικές σειρές SF2 σε μία και μόνη ομοιογενή τύπο όγκου. Είχαμε πρόσβαση σε ένα δεύτερο ανεξάρτητο radiobiologically σχετικές με το κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) κυτταρική σειρά κοόρτης (n = 11) για την επικύρωση ευρήματά μας και αυτά που προέρχονται από τα δημόσια διαθέσιμα στοιχεία NCI-60.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές

Δεκατέσσερις εμπορικώς διαθέσιμα κυτταρικές σειρές τραχηλικού καρκινώματος ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) ή την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB). Δύο άλλες κυτταρικές γραμμές (778 και 808) προήλθαν στο σπίτι [19]. Όλα τράχηλο κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε ταυτόσημες συνθήκες: 4.5 g DMEM /l γλυκόζη συν Glutamax (Life Technologies, Paisley, UK), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Lot: A04305-0160, ΡΑΑ Laboratories (Γέοβιλ, Ηνωμένο Βασίλειο )) και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή. Έντεκα κεφάλι και το λαιμό κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται στον Πίνακα S1. Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε έλεγχο ταυτότητας STR και ήταν μυκόπλασμα δωρεάν.

κλωνογενείς δοκιμασίες

Η μέθοδος περιγράφεται αλλού [20]. Εν συντομία, εκθετικώς αναπτυσσόμενα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και ακτινοβολούνται με 0-10 Gy σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας μία μονάδα ακτινών Χ σε μια δόση της τάξεως του 1,37 Gy /min. Μετά επιμετάλλωση και την ανάπτυξη από 2-3 εβδομάδες, οι αποικίες που σχηματίζονται βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και εκείνων με & gt? 50 κύτταρα άνοιξε. Κάθε πείραμα περιελάμβανε τουλάχιστον τρεις, αλλά συνήθως έξι τεχνικά αντίγραφα και τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο (n = 4) ή τρία (n = 21) φορές. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος των βιολογικών επαναλήψεις.

HPV γονοτυπικός

Ο HPV προσδιορισμού του γονότυπου αυτών των κυτταρικών γραμμών τραχηλικού καρκινώματος περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Για κυτταρικές γραμμές καρκινώματος κεφαλής και λαιμού qRT-PCR για την Ε2, Ε6 και Ε7 για HPV16 και HPV18 διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [22].

ΜΤΤ Δοκιμασία

χρόνος διπλασιασμού εκτιμήθηκε για κάθε κύτταρο line χρησιμοποιώντας το υδατικό δοκιμασία CellTiter 96 μη ραδιενεργά κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Promega, Madison, WI, USA) όπως ανά κατασκευαστή ‘όλη τη νύχτα »πρωτόκολλο. Μία πρότυπη καμπύλη ανάπτυξης 7 ημερών διεξήχθη σε πλάκες των 96 φρεατίων. Χρωματομετρική αναγνώσεις λήφθηκαν στα 570 nm και συγκρίθηκαν με εκθετικής παλινδρόμησης με μια πρότυπη καμπύλη γνωστής πυκνότητας κυττάρου. Ένας μέσος όρος των τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων σε διαφορετικές πυκνότητες χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της μέσης διπλασιασμό του χρόνου.

RNA Extraction

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο. RNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση χρησιμοποιώντας το Qiagen RNeasy κιτ (Qiagen, UK), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ακεραιότητα RNA (RIN) και ποσοτικοποίηση μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Bioanalyser (Agilent Technologies Ltd, Santa Clara, CA, USA). 260/230 και 260/280 αναλογίες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nanodrop 1000 Φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

Δυτική Blotting

Το καθεστώς της πρωτεΐνης p63 από τις κυτταρικές σειρές καρκινώματος του τραχήλου της μήτρας περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους κηλίδωση Western Διεξήχθη στις γραμμές της κεφαλής και των κυττάρων του λαιμού, χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: ρ63 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (BC4A4) (Abcam, Cambridge, UK) και αντι-β-ακτίνης ποντικού μονοκλωνικό (Κλώνος AC-15) (Sigma . -Aldrich, Dorset, UK)

ZeptoMARK αντίστροφης φάσης δεσμών πρωτεΐνης

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, λύθηκαν σε 75 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως CLB1 (Zeptosens: ένα τμήμα της Bayer ( Schweiz) AG, Ελβετία), αποξέστηκαν σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρου, στροβιλίζεται και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 15,000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και οι συγκεντρώσεις προσδιορίζονται με δοκιμασία Bradford. Η διαδικασία κηλίδες αίματος έχει περιγραφεί πριν [23]. Εν συντομία, προϊόντα λύσεως τραχήλου πρωτεΐνη καρκίνωμα τυποποιήθηκαν σε 2 mg /ml, από την οποία εντοπίστηκαν τέσσερις συγκεντρώσεις (0,20, 0,15, 0,10 και 0,05 mg /ml), εις διπλούν πάνω σε υδρόφοβα τσιπ ZeptoMARK (Zeptosens). Κάθε κυτταρική γραμμή ανεξάρτητα καλλιεργούνται και συγκομίζονται σε δύο περιπτώσεις? κατά συνέπεια δύο βιολογικών επαναλήψεις κηλίδα επί της συστοιχίας. Chips αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό CeLyA (Zeptosens), πριν από την επώαση με πρωτογενή αντισώματα για 22 ώρες στους 20 ° C. επιλεγμένα Εικοσιτέσσερις αντισώματα (Zeptosens) βασίστηκαν σε ρόλο τους στον καρκίνο ή αντίσταση θεραπεία [24]. Μετά την επώαση η περίσσεια πρωτογενούς αντισώματος απομακρύνθηκε και ένα με φθορισμό σημασμένο αντίσωμα συγκεκριμένα είδη υβριδοποιήθηκε επί 2,5 ώρες στους 20 ° C. Μετά το πλύσιμο, συστοιχίες είχαν διαβάσει σε ένα ZeptoREADER (λ

ex /λ

em = 635/670 nm). Η προκύπτουσα σχετική ένταση φθορισμού (RFI) υπολογίσθηκε από μία πρότυπη καμπύλη που κατασκευάζεται από τις τέσσερις συγκεντρώσεις (εις διπλούν). Αυτή είναι μια ποσοτική μέτρηση των πρωτεϊνών. Οι τιμές που εμφανίζονται είναι ο μέσος όρος των δύο βιολογικών επαναλήψεις (δηλαδή 4 τυπικές καμπύλες).

εξόνιο Array υβριδισμός

100 ng RNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας NuGen WT-Ovation FFPE κιτ v2 (NuGen Technologies, San Carlos , CA, USA). Το WT-Ovation εξόνιο Ενότητα V1.0 χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει ST-cDNA και 4 μg υβριδοποιήθηκε να Ανθρωπίνων εξόνιο 1,0 συστοιχίες ST (Affymetrix, Santa Clara, CA). Περισσότερες λεπτομέρειες και τα πρωτογενή δεδομένα (αρχεία CEL) είναι διαθέσιμα σε https://bioinformatics.picr.man.ac.uk/vice (ή GEO:. GSE39066 (μέρος της Super Series GSE39067) Πρώτες στοιχεία για κυτταρικές σειρές HNSCC είναι διαθέσιμα στο GEO :.. GSE51370

εξόνιο Array Ανάλυση δεδομένων

δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας RMA το πακέτο R /BioConductor

annmap

και η βάση δεδομένων annmap [26] χρησιμοποιήθηκαν [25] για την απομάκρυνση μη εξονικό και multi-στόχευση probesets απόδοση Array μετρήθηκε ως το ποσοστό των probesets επισημαίνεται ως «παρών» με μια συντηρητική cut-off (% Ανίχνευση πάνω από το υπόβαθρο [% DABG]

P

& lt?. 0.01 ) και μόνο οι probesets σημαία «παρών» σε τουλάχιστον τρία δείγματα διατηρούνται. Αυτό το φιλτράρισμα μείωσε τον αριθμό των probesets θεωρείται από 1.411.399 σε 353.981 εξονικούς probesets, εκ των οποίων 243.301 πέρασε DABG φιλτραρίσματος. περιλήψεις επίπεδο Gene υπολογίστηκαν λαμβάνοντας την μέση τιμή του σήματος φιλτράρεται probesets που αντιστοιχίζεται με μοναδικό σύμβολα γονιδίου. Όταν συνοψίζονται αυτό οδήγησε σε 31.345 γονίδια θεωρείται. Ανεξέλεγκτη ιεραρχική συσταδοποίηση διεξήχθη στις 1.000 πιο παραλλαγή γονίδια (κατατάσσεται στην συντελεστής μεταβλητότητας) για να δείξει τον διαχωρισμό των δειγμάτων με βάση τα πιο μεταβλητά γονίδια στα δεδομένα, ενώ ελαχιστοποιεί υπολογιστικές απαιτήσεις. Υπογραφή γενιάς: Ένα γονίδιο υπογραφή ήταν αποφασισμένος να είναι το σύνολο των γονιδίων ή probesets που ήταν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων ανάμεσα σε δύο ομάδες των κυτταρικών σειρών σύμφωνα με μία LIMMA ή Rank ανάλυση του προϊόντος. Το cut-off για σημασίας ήταν μια ψεύτικη ανακάλυψη διορθωμένη p τιμή των 0,01. Πακέτα: R: 3.0.2, Annmap: V1.2.1 χρήση ανθρώπινων βάση δεδομένων χτίσει 66, LIMMA: 03/17/26, RankProd: 2.32.0, Pheatmap:. 0.7.7

Επικύρωση Κοόρτεις, Array Χαρτογράφηση και Δεδομένων ανάλυση

κεφαλής και τραχήλου κυτταρική σειρά Affymetrix U133A Plus2 δεδομένων σειρά ήταν RMA ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το

Affy

συσκευασία probesets έλεγχο R. Affymetrix ( «AFFX» σχολιασμένη) αφαιρέθηκαν. Για την ανάλυση διακύμανσης, _x_, _a_ και _s_ σχολιασμένη probesets επίσης αφαιρεθεί. NCI-60 – αρχεία Affymetrix Plus2 cel είχαν κατεβάσει από CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/) και RMA κανονικοποιημένη όπως πριν. Μετά την κανονικοποίηση, αναπαράγουν συστοιχίες για κάθε κυτταρική σειρά ελήφθη ο μέσος όρος. Για σύγκριση με τα συνοπτικά στοιχεία array εξόνιο του γονιδίου-επίπεδο, Plus2 probesets χαρτογραφήθηκαν σε σύμβολα γονίδιο χρησιμοποιώντας

annmap

.

ακτινοευαισθησία Υπογραφή Χαρτογράφηση

Όλοι οι υπογραφές εφαρμόστηκαν στο γονίδιο σε επίπεδο εδάφους περιλήψεις του τραχήλου της μήτρας δεδομένων χρησιμοποιώντας χαρτογράφηση σύμβολο γονιδίου. Για την εφαρμογή των υπογραφών στο HNSCC και NCI-60 Affymetrix Plus 2 σύνολα δεδομένων, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτόκολλα:

Probeset αναγνωριστικά για την Eschrich

et al

[13] δέκα γονίδια κόμβο ελήφθησαν από Πίνακας 3 από την πρώτη χαρτί του ομίλου [13]. NCI-60 δοκιμασία που κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από τον Πίνακα 4 από το δεύτερο χαρτί του ομίλου [12]. Δώδεκα κυτταρικές γραμμές που αναφέρονται, αλλά δεν υπήρχε αντίστοιχη σειρά Plus2 για το κύτταρο μαστού γραμμή MDN.

Οι κορυφαίες τέσσερις κατάταξη γονίδια από Torres-Roca

et al

[14] (

RPIA , RBBP4, RGS19, ZNF208

) χαρτογραφήθηκαν στο Affymetrix Plus2 probesets χρησιμοποιώντας το

annmap

. Τα αντίστοιχα δεδομένα έκφρασης για τους probesets εξήχθησαν και αποτυπώνονται σε γραμμική κλίμακα (αντι-log).

σύμβολα γονίδιο για την Amundson

et al

γονίδιο υπογραφή ελήφθησαν από το δεύτερο πίνακα του αρχικό άρθρο [10]. Ένα γονίδιο δεν θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί (Unigene ID Hs.494347) καθώς δεν υπήρχε αντίστοιχο σύμβολο γονίδιο στον πίνακα. Τα υπόλοιπα 21 σύμβολα γονίδιο χαρτογραφήθηκαν σε Plus2 probesets χρησιμοποιώντας το

annmap

. probesets Multi-χαρτογράφηση αφαιρέθηκαν.

Η Tewari

et al

υπογραφή λήφθηκε από το δεύτερο πίνακα του αρχικού άρθρου [8]. Σαράντα εννέα από τα 60 probesets με ένα μοναδικό σύμβολο γονίδιο εξήχθησαν και χαρτογραφήθηκαν με probesets Plus2 χρησιμοποιώντας annmap. probesets Multi-χαρτογράφηση αφαιρέθηκαν.

Η

Ανεξέλεγκτη αναλύσεις (clustering, PCA) των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, ανάλυση υπογραφή και διαφορική ανάλυση της έκφρασης (

LIMMA

[27],

RankProd

) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας R. το όριο για διαφορική έκφραση χρησιμοποιώντας Rank Ανάλυση Προϊόν (

RankProd

) ήταν ένα τοις εκατό False Positive (PFP) ποσοστό & lt?. 0.01

Γραφικών και Στατιστικά

τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μέση τιμή των βιολογικών επαναλήψεων και μετρήσεις ακριβείας είναι το τυπικό σφάλμα της μέσης εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. τιμές R δείχνουν συντελεστή στιγμή προϊόντος κατά Pearson. Boxplots παρήχθησαν σε GraphPad Prism (v6.0): παράμετροι box-μουστακιού: οριζόντια γραμμή δείχνει μέση έκφραση, το πλαίσιο δείχνει διατεταρτημοριακό εύρος? μουστάκια αντιπροσωπεύουν το εύρος. Για την απεικόνιση των καμπυλών επιβίωσης ακτινοβολίας μια γραμμική τετραγωνική εξίσωση είχε τοποθετηθεί σε R, με ραδιοβιολογικές παραμέτρους που προέρχεται από DRFIT [28]. Το πακέτο R

LIMMA

, χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των διαφορικών τιμών έκφρασης για τα δεδομένα της πρωτεΐνης προφίλ. Όπου κρίνεται σκόπιμο,

σ

-τιμές είναι Benjamini και Hochberg ποσοστό ψευδώς ανακάλυψη (FDR) διορθώνεται [29]. Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) μειώνει πολυδιάστατη δεδομένα (δηλ χιλιάδων γονιδίων) σε δεδομένα σημεία στο χώρο 2-D. Όσο πιο κοντά τα δύο δεδομένα σημεία (δείγματα), η πιο παρόμοια δείγματα. PC1 (άξονας x) αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος της διακύμανσης σε ένα πείραμα, PC2 (άξονας y) αντιπροσωπεύει το στοιχείο που αντιπροσωπεύει το δεύτερο υψηλότερο διακύμανσης.

Αποτελέσματα

Καρκίνος του τραχήλου σειρές κυττάρων μια σειρά από Radiosensitivities

Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τις κυτταρικές σειρές τραχηλικού καρκινώματος. Δύο κυτταρικές σειρές δεν σχηματίζουν αποικίες και αξίες SF2 για τις υπόλοιπες 14 γραμμές κυμάνθηκε από 0,25 να 0,75 (σχήμα 1). τιμές SF2 για έξι από τις κυτταρικές γραμμές δημοσιεύθηκαν από άλλη ομάδα [30], και η κατάταξη ήταν ταυτόσημη σε αμφότερες τις μελέτες. Στις κυτταρικές σειρές 14, δεν υπήρχε καμία συσχέτιση του SF2 με επιμετάλλωση απόδοση (R

2 = 0.005,

σ

= 0,82), χρόνος διπλασιασμού (R

2 & lt? 0,0001,

p

= 0.99) ή την έκφραση του RNA του TP63, δείκτης της πλακώδους διαφοροποίησης κυττάρου (

σ

= 0,90).

καμπύλες α) επιβίωση Ακτινοβολίας δείχνει κλάσμα επιβίωσης (log10) (y -άξονα) μετά από ακτινοβόληση με 2, 4, 6, 8 και 10 Gy για 14 τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα σημεία των δεδομένων είναι η μέση τιμή και το πρότυπο σφάλμα του 2-3 ​​ανεξάρτητων πειραμάτων (3-6 επαναλήψεις ανά πείραμα). Τα δεδομένα σημεία είναι εξοπλισμένα με τη γραμμική τετραγωνική εξίσωση και χρωματίζεται από κάτω (μπλε) ή πάνω (κόκκινο) το μεσαίο SF2.

Η

Μοριακή Χαρακτηρισμός Φαινομενικά Ομογενείς Γραμμές κυττάρων του τραχήλου της μήτρας Καρκίνωμα Δείχνει σημαντικές διαφορές

έκφραση p63 (πρωτεΐνη και mRNA) μετρήθηκε επειδή διακρίσεις μεταξύ των πλακωδών (p63 +) και μη πλακώδους (p63-) ιστολογικών τύπων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [21]. Μετά μεταγραφικό προφίλ, χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση των πιο παραλλαγή 1.000 γονίδια (ανάλογα με συντελεστή μεταβλητότητας) διαχωρίζονται τις γραμμές σε τρεις συστάδες (Εικόνα 2Α) με σύμπλεγμα 1 (C33A και HCSC1) είναι ακραίες τιμές. Τα άλλα 14 κυτταρικές σειρές, κατανέμεται ως p63- και p63 συστάδες + με την εξαίρεση των SKG1 που είχε το χαμηλότερο επίπεδο μεταγραφής TP63 των θετικών γραμμές ρ63. HCS2 και 778, τα οποία δεν σχηματίζουν αποικίες σε συνθήκες μας, δεν σύμπλεγμα μαζί υποδηλώνει καμία κοινή μεταγραφική έκφραση που σχετίζεται με την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι μεγάλες βασικής μεταγραφικής διαφορές μεταξύ των κυτταρικών γραμμών αφορούν έκφραση ρ63. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ τα κύτταρα HeLa ήταν η μόνη αδενοκαρκινώματος (AC) σύμφωνα με πληροφορίες προέλευσης, αρκετές τραχήλου κυτταρικές σειρές είχαν παρόμοια παγκόσμια μεταγραφικό προφίλ. HCSC1 είναι «μικροκυτταρικό καρκίνωμα» που προέρχεται, κατά συνέπεια, θα διερευνηθεί κατά πόσον η ομαδοποίηση των C33A και HCSC1 οφειλόταν σε κοινόχρηστο ιστολογική προέλευση. Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) χρησιμοποιώντας την συνδυασμένη έκφραση γονιδίου από δύο υπογραφές γονίδιο, εκπαιδεύονται στο (i) AC και SCC [21] και (ii) καρκίνωμα μικρών κυττάρων [31], έδειξαν ότι HCSC1 και C33A είχαν πολύ παρόμοια έκφραση ιστολογική γονιδίου ( Σχήμα 2Β). Σχήμα 2C δείχνει ότι C33A και HCSC1 είχαν χαμηλά επίπεδα SCC γονιδίων και υψηλότερα από το μέσο όρο επίπεδα των μικρών γονιδίων καρκίνωμα. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η έκφραση του γονιδίου AC ήταν χαμηλή σε όλες τις κυτταρικές σειρές, περιλαμβανομένων των HeLa, υποδηλώνοντας ότι αυτή η υπογραφή, προέρχονται πρωτογενές υλικό όγκου μπορεί να έχει περιορισμένη δυνατότητα εφαρμογής σε κυτταρικές σειρές. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι C33A είναι ιστολογικά ένα καρκίνωμα μικρών κυττάρων που προέρχονται κυτταρική γραμμή και αναδεικνύει τις μεταγραφικές διαφορές που σχετίζονται με ιστολογικό τύπο που βρέθηκαν σε μια σχετικά ομοιογενή ενιαίο ιστό της κλάσης προέλευσης.

Α) Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση των κορυφαίων 1000 γονίδια ανάλογα με συντελεστή διακύμανσης (από δεδομένα array Exon). Heatmap χρωματισμός είναι με log

2 τιμή έκφρασης. Σειρές αντιπροσωπεύουν γονίδια και οι στήλες είναι κυτταρικές σειρές. άξονα χ δενδρόγραμμα (συστάδες) υποδεικνύει την ομοιότητα των κυτταρικών γραμμών και γ-άξονας δενδρόγραμμα την ομοιότητα των γονιδίων. Cluster 1 αντιπροσωπεύει δύο δείγματα με τις χαμηλότερες τιμές TP63 (ρ63 αρνητική). Cluster 2 δείχνει την ομαδοποίηση των άλλων p63- κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος HeLa. Cluster 3 ομάδες p63 + κυτταρικές σειρές, με την εξαίρεση των SKG1, το οποίο έχει ταξινομηθεί με αρνητικά κύτταρα ρ63. Β) ανάλυση κύριων συνιστωσών των 16 τραχήλου κυτταρικές σειρές καρκίνου βασίζεται σε SCC (n = 1.062), AC (η = 155) και την έκφραση του γονιδίου καρκίνωμα μικρών κυττάρων (n = 77). Το x-άξονας δείχνει κύριο συστατικό 1 (PC1) αντιπροσωπεύοντας το 15,5% της διακύμανσης. PC2 που εμφανίζονται στους λογαριασμούς άξονα y για το 13,7% της διακύμανσης της γονιδιακής έκφρασης υπογραφή ιστολογία. Χρωματισμός αντιπροσωπεύει την έκφραση της πρωτεΐνης ρ63. Γ) Διάγραμμα που δείχνει το μέσο έκφρασης (log2) της SCC, AC και μικρά υπογραφή καρκίνωμα. άξονας γ είναι ο πίνακας εξόνιο που προέρχεται διάμεσο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου, για κάθε μία από τις τρεις υπογραφές. Χ-άξονας δείχνει την κυτταρική γραμμή. Οι κυτταρικές γραμμές κατατάσσονται με βάση TP63 έκφρασης.

Η

Πρωτεΐνη προφίλ του «Καρκίνος του Associated Γονίδια» δείχνει Βασικές διαφορές Διαδρομή ανάμεσα στις γραμμές κυττάρων, αλλά όχι μεταξύ υψηλών και χαμηλών SF2 Ομάδες

Ένα πάνελ του επιλέχθηκαν 24 πρωτεΐνες από έναν κατάλογο των προ-επικυρωμένων αντισωμάτων των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον καρκίνο, ή αντίσταση σε θεραπεία [24]. Λίγοι αντισώματα απόκριση βλάβης του DNA ήταν διαθέσιμα και έτσι η επιλογή περιορίζεται σε καλά επικυρωμένη πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως το ρ53, Rb, EGFR κ.λπ. Όπως p63 είναι απαραίτητη για την πολλαπλασιαστικού δυναμικού των βλαστικών κυττάρων σε στρωματοποιημένο επιθήλιο [32], εμείς υποτίθεται ότι τα κύτταρα p63 + θα εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα του επιθηλιακού πρωτεΐνης δείκτη Ε-καδερίνης, σε σύγκριση με p63- κύτταρα και αυτό επιβεβαιώθηκε από την δέσμη πρωτεΐνης (

σ

= & lt? 0.0001) (Σχήμα 3Α). Συγκρίναμε επίσης το επίπεδο έκφρασης του mRNA της Ε-καδερίνης (εξόνιο-array προέρχεται) με την πρωτεΐνη αφθονία μετράται από τη συστοιχία (σχετική ένταση φθορισμού [RFI]? Σχήμα 3Β). Υπήρξε μια ισχυρή συσχέτιση (R = 0.95,

σ

& lt? 0.001) που αποδεικνύουν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης αντανακλούν τα επίπεδα μεταγραφής για το E-cadherin. Διαπιστώσαμε επίσης υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 σε κύτταρα C33A σύγκριση με όλες τις άλλες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3C), οφείλεται σε μια γνωστή μετάλλαξη στο

ΤΡ53

γονίδιο [33] με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση των πρωτεϊνών. Τα στοιχεία αυτά μας έδωσαν μεγάλη εμπιστοσύνη στα στοιχεία πρωτεΐνη προφίλ. Χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση των δεδομένων πρωτεϊνών δεν έδειξαν σχέσεις με γνωστά χαρακτηριστικά (Σχήμα S1). Κατάταξη των κυτταρικών σειρών με SF2 δεν έδειξαν σαφή οπτική δομή στα δεδομένα (Εικόνα 3C). Τα 14 κυτταρικές γραμμές χωρίστηκαν σε υψηλές και χαμηλές ομάδες ραδιοευαισθησία χρησιμοποιώντας τη μέση τιμή SF2, όπως χρησιμοποιείται προηγουμένως με κλινικά δείγματα [3], [4]. Τέσσερις πρωτεΐνες που εκφράζονται διαφορικά (

σ

& lt? 0,05) μεταξύ των δύο ομάδων: mTOR, PTEN, ΙκΒ άλφα, και ΝΡκΒ, αλλά καμία δεν ήταν σημαντική μετά από ψευδείς ρυθμό ανακάλυψης (FDR) διόρθωση (Σχήμα 3D, Πίνακας S2 ). mTOR ήταν οριακά σημαντική (FDR

p =

0,09) και υπήρχε μια τάση για μια μέτρια συσχέτιση μεταξύ του mTOR και SF2 (R = 0.48,

σ

= 0.08, Σχήμα 3D). Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι ενώ υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων όσον αφορά την έκφραση της πρωτεΐνης και την ενεργοποίηση της οδού, καμία από τις πρωτεΐνες /οδοί σθεναρά σχετίζονται με SF2 σε αυτή την κυτταρική σειρά ομάδα.

Α) Ιστόγραμμα εμφάνιση της ZeptoMARK πρωτεΐνη-array προέρχεται αφθονία για τις 16 τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές. Το επίπεδο Υ-άξονας εμφανίζει Ε-καδερίνης πρωτεΐνη (σχετική ένταση φθορισμού (RFI) για κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές (χ-άξονας). Οι κυτταρικές γραμμές κατετάγη με βάση την έκφραση TP63. Ομαδοποίηση σε ρ63 αρνητικό και ρ63 θετικές κυτταρικές σειρές επιβεβαιώνει τη σύνδεση Ε-καδερίνης με ρ63. Η τιμή ρ είναι Τ-test που προέρχονται συγκρίνοντας τη διαφορά στην έκφραση Ε-καδερίνης μεταξύ του ρ63 θετικών και αρνητικών ομάδων, ράβδοι σφάλματος εμφανιστεί τυπική απόκλιση των δύο βιολογικών επαναλήψεων. Β) Χ-Υ σκέδασης δείχνει Ε- έκφραση καδερίνης γονίδιο (array εξόνιο) στον άξονα Υ έναντι έκφραση πρωτεΐνης Ε-καδερίνης στον χ-άξονα. Διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τέλεια συσχέτιση. Το εξόνιο συστοιχία δεδομένων σημείων αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο των πολλαπλών εξονικές probesets (n = 19) από ένα ενιαίο συστοιχία έκφραση εξόνιο, όπου τα δεδομένα πρωτεΐνη είναι ο μέσος όρος των δύο βιολογικών επαναλήψεις. Γ) Heatmap δείχνει ομαδοποίηση των πρωτεϊνών με παρόμοια έκφραση (άξονας γ) στην πρωτεΐνη ZeptoMARK προφίλ δεδομένων. Οι κυτταρικές σειρές ανάλογα με SF2. Heatmap χρωματισμού βασίζεται σε σειρά Z-score. Δ) οικόπεδο xy-διασποράς που δείχνει την έκφραση (y-άξονα) από τα κορυφαία 5 πρωτεΐνες από LIMMA κατά SF2 (χ-άξονας). Ο πίνακας συνοψίζει τα αποτελέσματα της ανάλυσης της έκφρασης Limma διαφορική πρωτεΐνης μεταξύ υψηλών και χαμηλών ομάδες SF2 και Pearson συσχέτιση της έκφρασης της πρωτεΐνης (RFI) έναντι SF2. σ τιμές υποδηλώνουν αυτές τις πρωτεΐνες με διαφορική έκφραση (* p & lt? 0,05 ή ** p & lt? 0,01) μεταξύ SF2 χαμηλές και υψηλές ομάδες σύμφωνα με την ανάλυση LIMMA. Ωστόσο, αυτά αποτύχουν να περάσουν ψευδώς αποκοπή διόρθωση ανακάλυψη.

Η

καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυττάρων γραμμές δείχνουν ομοιότητες στην Παγκόσμια Gene Expression

Ο Πίνακας 2 συνοψίζει τις κυτταρικές σειρές 11 HNSCC, οι οποίες ήταν όλες HPV αρνητικό (Εικόνα S2). Αν και αναφέρεται ότι είναι πλακώδες καρκίνωμα, τρεις έλειπε η έκφραση πρωτεΐνης ρ63 με στύπωμα Western (Σχήμα S3), και είχαν χαμηλά επίπεδα μεταγραφήματος ανιχνεύθηκε με μικροσυστοιχίας. Το εύρος SF2 (0.3-0.8) ήταν παρόμοιο με εκείνο για τα τραχήλου γραμμές (Σχήμα 4Α), αλλά οι HNSCC κυτταρικές γραμμές ήταν πιο ραδιοανθεκτικά σύγκριση με τον τράχηλο (

σ

= 0,003). Το μεσαίο SF2, χρησιμοποιείται για να στεγανοποιήσει τις κυτταρικές σειρές ήταν 0,36 για τον τράχηλο και 0,61 για κυτταρικές σειρές HNSCC. Όπως και με τον τράχηλο κυτταρικές γραμμές, δεν υπήρχε διαφορά στην SF2 μεταξύ των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν υψηλά έναντι χαμηλών επιπέδων

TP63

(Σχήμα 4Β) και χωρίς επίβλεψη ιεραρχική συσταδοποίηση κατανεμήθηκε τις HNSCC κυτταρικές γραμμές σε τρεις ομάδες που αντανακλούν

TP63

έκφρασης (Σχήμα 4C). Η πιο απομακρυσμένα σύμπλεγμα είχε το χαμηλότερο

TP63

έκφραση, ενώ τα υπόλοιπα δύο συστάδες διαιρείται τις κυτταρικές σειρές με την έκφραση & lt? /& Gt? 6.0 TP63 (log

2). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι και οι δύο γραμμές τραχηλικού καρκινώματος και κυττάρων HNSCC έχουν παρόμοια radiosensitivities και παγκόσμιες μεταγραφικό προφίλ, με την πλειονότητα των διαφορών που σχετίζονται με την ρ63 παράγοντα μεταγραφής. Ως τέτοια, η ομάδα HNSCC είναι ένα τύπου ιστού διακρίνεται από τον τράχηλο, αλλά θα πρέπει να είναι ένας καλός σύγκρισης για SF2 συνδέονται γονίδια που προέρχονται στην τραχηλική κυτταρικές σειρές και

αντίστροφα

.

Α) γραφική παράσταση που δείχνει η μέση SF2 (log10) (άξονας γ) για κάθε μία από τις 11 τραχήλου καρκινικών κυτταρικών γραμμών (χ-άξονας). Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου των 2-3 ανεξάρτητα πειράματα. Β) Διάγραμμα που δείχνει ότι δεν υπάρχει καμία διαφορά στην έκφραση TP63 μεταξύ των SF2 υψηλής και χαμηλής ομάδες. Bar δείχνει το μεσαίο έκφρασης. Γ) Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση των κορυφαίων 1000 γονίδια ανάλογα με συντελεστή μεταβλητότητας (από δεδομένα σειρά U133). Heatmap χρωματισμός είναι με log

2 τιμή έκφρασης. Σειρές αντιπροσωπεύουν γονίδια και οι στήλες είναι κυτταρικές σειρές. άξονα χ δενδρόγραμμα (συστάδες) υποδεικνύει την ομοιότητα των κυτταρικών γραμμών και γ-άξονας δενδρόγραμμα την ομοιότητα των γονιδίων. Cluster 1 αντιπροσωπεύει δύο δείγματα με τις χαμηλότερες τιμές TP63 (ρ63 αρνητική). Cluster 2 δείχνει την ομαδοποίηση των άλλων p63- κυτταρική γραμμή, σε συνδυασμό με χαμηλή TP63 εκφράζουν γραμμές. Cluster 3 ομάδες μαζί όλες οι γραμμές HNSCC με & gt? 6.0 (έκφραση log2) έκφραση TP63. Δ) Διάγραμμα να εκπροσωπεί την ολοκληρωμένη ανάλυση SF2 των κυτταρικών σειρών του τραχήλου της μήτρας και HNSCC. ανάλυση του προϊόντος Rank (FDR & lt? 0,05) προσδιορίζονται 96 γονίδια στον τράχηλο κοόρτη εκφράζονται διαφορικά μεταξύ χαμηλών και υψηλών κυτταρικών σειρών SF2. Ένα πανομοιότυπο ανάλυση στις κυτταρικές γραμμές HNSCC ταυτοποιεί 97 probesets (42 γονίδια) εκφράζονται διαφορικά μεταξύ χαμηλών και υψηλών κυτταρικών σειρών SF2. PCA του τραχήλου γονιδίων δείχνει ότι είναι ικανή να διαχωρίζει τις κυτταρικές σειρές με SF2. PCA των γονιδίων HNSCC είναι εξίσου ικανή να διαχωρίζει τα δείγματα με βάση την SF2. Το διάγραμμα Venn δείχνει ότι μόνο το 4/138 γονίδια είναι κοινά μεταξύ των δύο ομάδες και από αυτά μόνο 2/138 είναι «σύμφωνες» και συνδέονται με την ίδια κατευθυντικότητα (υψηλή SF2 /χαμηλή SF2 τόσο HNSCC και του τραχήλου της μήτρας). PCA δείχνει probeset έκφραση αυτών των δύο «κοινά» και τα γονίδια «παραλληλισμού» (MGST1 και TFPI) στο NCI-60 σύνολο δεδομένων. Η NCI-60 πάνω PCA εμφανίζει τα δεδομένα σημεία που χρωματίζονται για διάμεσο SF2 και κάτω PCA χρωματίζονται για 0,2, που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως να στεγανοποιήσει ακτινοευαίσθητα και ακτινοανθεκτικά κυτταρικές σειρές σε αυτήν την ομάδα.

Η

Τα γονίδια διαφορικά εκφρασμένα μεταξύ υψηλής και χαμηλής Ομάδες SF2 είναι πρωτίστως κυττάρων συγκεκριμένο τύπο και δεν είναι δυνατή η διαστρωμάτωση του NCI-60 σειρές κυττάρων

οι διαφορές μεταξύ των κυτταρικών σειρών κατανέμεται χρησιμοποιώντας διάμεση SF2 διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας γονιδίωμα-ευρεία προφίλ έκφρασης. Δεν διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφές βρέθηκαν από

LIMMA

εξής διόρθωση πολλαπλών δοκιμών. Αυτή ήταν επίσης η περίπτωση για γραμμικά μοντέλα που ενσωματώνουν HPV και έκφραση ρ63 ως συμμεταβλητές, ή σε ένα 3-way ANOVA. Ενώ εντοπίστηκαν γονίδια που εκφράστηκαν διαφορικά (πρώτων p & lt? 0.05), κανένα δεν πέρασε διόρθωση ψευδώς ανακάλυψη. Μια εναλλακτική μέθοδος, Rank ανάλυση του προϊόντος, που εφαρμόζεται στον τράχηλο κυτταρικές σειρές εντοπίζονται 96 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (PfP & lt? 0,01) (Πίνακας S3). Αυτά τα γονίδια διαχωρίζονται ο τράχηλος δείγματα στην πρώτη κύρια συνιστώσα, αντιπροσωπεύοντας το 36% της διακύμανσης (Εικόνα 4D), αλλά δεν θα μπορούσε να διαχωρίσει τα HNSCC κυτταρικές σειρές με βάση SF2 (Σχήμα S4A). Μια αμοιβαία ανάλυση σχετικά με τις γραμμές HNSCC εντόπισε παρόμοιο αριθμό probesets (n = 97, χαρτογράφηση με 42 μοναδικά σύμβολα γονιδίου, PfP & lt? 0.01) που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ υψηλών και χαμηλών SF2 (Πίνακας S4). Αυτά τα γονίδια καλές επιδόσεις κατά το διαχωρισμό των HNSCC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4D), αλλά απέτυχε να διαχωρίσει τις τράχηλο γραμμές (Σχήμα S4B).