Αφηρημένο

RGS10 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιβίωσης και χημειοαντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών. Εμείς πρόσφατα έδειξαν ότι η έκφραση μεταγραφή RGS10 καταστέλλεται κατά τη διάρκεια αποκτηθεί χημειοαντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών. Η καταστολή του RGS10 οφείλεται σε υπερμεθυλίωση του DNA και απακετυλίωση ιστόνης, δύο σημαντικούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στην αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Εδώ, έχουμε διερευνήσει πλήρως τους μοριακούς μηχανισμούς των επιγενετικών αποσιώπηση της έκφρασης RGS10 σε χημειοθεραπεία Α2780-AD καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Εντοπίζουμε δύο σημαντικές επιγενετικές ρυθμιστικές αρχές, HDAC1 και DNMT1, που επιδεικνύουν παρεκκλίνουσα ένωση με τους υποψηφίους RGS10 στη χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Εξόντωση HDAC1 ή έκφραση DNMT1, και φαρμακολογική αναστολή του DNMT ή HDAC ενζυμική δραστηριότητα, αυξάνει σημαντικά την έκφραση RGS10 και σισπλατίνη μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Τέλος, DNMT1 γκρεμίζω μειώνει επίσης HDAC1 σύνδεση με τον υποκινητή RGS10 σε χημειοθεραπεία κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει την πρόσληψη HDAC1 στους υποψηφίους RGS10 απαιτεί δράση DNMT1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HDAC1 και DNMT1 συμβάλλει στην καταστολή της RGS10 κατά τη διάρκεια απέκτησε χημειοαντίσταση και υποστήριξη αναστολή της HDAC1 και DNMT1 ως ανοσοενισχυτικό θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση του καρκίνου των ωοθηκών χημειοαντίσταση

Παράθεση:. Cacan E, Αλί MW, Boyd ΝΗ , γάντζοι SB, Γκριρ SF (2014) Αναστολή της HDAC1 και DNMT1 Modulate RGS10 Έκφραση και Μείωση των ωοθηκών χημειοαντίσταση. PLoS ONE 9 (1): e87455. doi: 10.1371 /journal.pone.0087455

Επιμέλεια: Malu Γ Tansey, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 του Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 25, Δεκ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιαν, 2014

Copyright: © 2014 Cacan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα ήταν που υποστηρίζεται από επιχορήγηση # ΕΓΓ-09-067-01-LB από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια από τις πλέον θανατηφόρες γυναικολογικών καρκίνων, με ποσοστό θνησιμότητας 60% σε ασθενείς με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 30% σε προχωρημένο στάδιο της νόσου [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην ανάπτυξη αντοχής σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [2], [3]. Έτσι, η κατανόηση των μοριακών και γενετικών μηχανισμών που οδηγούν στην ανάπτυξη των κεκτημένων χημειοαντίσταση θα μας επιτρέψει να βελτιώσουμε την τρέχουσα θεραπευτικούς παράγοντες για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. υποδοχείς που συνδέονται με G-πρωτεΐνη (GPCRs) να κινήσει πολλαπλές οδούς ογκογόνο σηματοδότηση στα καρκινικά κύτταρα με την ενεργοποίηση συνδεδεμένων G-πρωτεΐνες τους [4], [5]. Η ενεργοποίηση των GPCR από αυξητικούς παράγοντες όπως Λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) ενεργοποιεί οδούς σηματοδότησης επιβίωσης που οδηγούν αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως σισπλατίνη και ταξάνη [6]. GPCR ενεργοποίηση των G-πρωτεϊνών σε αντίθεση με τη δραστηριότητα του ρυθμιστή σηματοδότησης G-πρωτεΐνη πρωτεϊνών (RGS). RGS πρωτεΐνες αναστέλλουν την G-πρωτεϊνη μονοπατιών σηματοδότησης με άμεση σύνδεση προς την ενεργοποιημένη Οα υπομονάδας των πρωτεϊνών G για την επιτάχυνση της υδρόλυση του GTP σε ΑΕΠ, η οποία επιστρέφει G-πρωτεϊνών σε μία ανενεργή κατάσταση [7] – [10]. Σχετικές με τις μελέτες μας, πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι RGS πρωτεΐνες αναστέλλουν μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη, και ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω αναστολής των GPCRs μονοπάτια σηματοδότησης [2], [11] – [15].

RGS10 είναι μεταξύ η μικρότερη από τις πρωτεΐνες RGS και εκφράζεται έντονα σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων [16] – [19]. RGS10 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιβίωσης και χημειοαντίσταση [2], και η έκφραση μεταγράφου RGS10 σημαντικά καταστέλλεται σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών [15]. Έτσι, η καταστολή των πρωτεϊνών RGS10 μπορεί να συμβάλει στην χημειοαντίσταση ενισχύοντας την κυτταρική ανάπτυξη GPCR μεσολάβηση και τα μονοπάτια σηματοδότησης επιβίωσης. Δείξαμε πρόσφατα ότι η καταστολή της RGS10 οφείλεται εν μέρει στο DNA υπερμεθυλίωση και να απακετυλίωση ιστόνης, δύο σημαντικούς μηχανισμούς γονίδιο-αποσιώπηση που συμβάλλουν στην πρόοδο πολλών καρκίνων. Μεθυλίωσης του DNA διατηρείται από DNA μεθυλ τρανσφεράσες (DNMTs) [20] και απακετυλίωση ιστόνης διατηρείται με αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) [21]. Συχνά, αυτά τα δύο ένζυμα καταστέλλουν συντονισμένα μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων [22], [23]. Fuks

et al.

Έχουν αναφέρει ότι DNMT1 σχετίζεται με δραστικότητα αποακετυλάσης ιστόνης και έχει την ικανότητα να δεσμεύουν HDAC1 [24]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους υπερμεθυλίωση του DNA και απακετυλίωση ιστόνης καταστολή RGS10 και η συμβολή αυτών των ενζύμων να αποκτήσει χημειοαντίσταση παραμένει άγνωστη.

Ερευνούμε εδώ των μοριακών μηχανισμών της επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης RGS10 στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και εστίαση για χημειοευαίσθητων γονικών κυττάρων Α2780 και παράγωγα κυτταρική σειρά τους, στη χημειοθεραπεία Α2780-AD. Εντοπίζουμε δύο σημαντικές επιγενετικές ρυθμιστικές αρχές, HDAC1 και DNMT1, τα οποία σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με τον υποκινητή RGS10 στη χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. HDAC1 και DNMT1 γκρεμίζω αυξάνει σημαντικά την έκφραση RGS10 και σισπλατίνη διεγείρονται κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HDAC1 και DNMT1 συμβάλλει στην καταστολή της RGS10 κατά τη διάρκεια απέκτησε χημειοαντίσταση και υποστήριξη αυξανόμενες ενδείξεις ότι η αναστολή της HDAC1 /DNMT1 αντιπροσωπεύουν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση χημειοαντίσταση καρκίνο των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Η χημειοευαίσθητων Α2780 γονική κυτταρική σειρά και των παράγωγων χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD τους (που προέρχεται όπως περιγράφεται [25]) έχουν γενναιόδωρα από τον Dr. Bob Brown, Imperial College του Λονδίνου. Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Mediatech Inc.) συμπληρωμένο με 10% FBS και 5 mM L-γλουταμίνη. Χημειοθεραπεία κύτταρα περαιτέρω διατηρήθηκαν σε 3 μΜ cisplatin. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 5 mM πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C με 5% CO

2. Ον2008 και C13 κυττάρων (που προέρχονται όπως περιγράφεται [26], [27]) έχουν γενναιόδωρα από τον Dr. Patricia Kruk, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα.

5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC ), Τριχοστατίνη Α (TSA), και σισπλατίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν RGS10, HDAC1, IgG-HRP (Υπεροξειδάση αρμορακίας), και HRP αντισώματα συζευγμένα κουνελιού κατσίκας-αντι-αρουραίου λήφθηκαν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν DNMT1 ελήφθησαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). HRP αντισώματα συζευγμένα ποντικού αγοράστηκαν από την Promega (Madison, WI). Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν β-ακτίνης ελήφθησαν από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ).

κατασκευάσματα siRNA και παροδική επιμόλυνση

σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA) προ-σχεδιασμένα για HDAC1 (Qiagen), RGS10 και DNMT1 (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκαν για να γκρεμίσουμε την έκφραση της HDAC1, RGS10 ή DNMT1. Κωδικοποιημένα All Star ελέγχου siRNA (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. κύτταρα Α2780-AD διαμολύνθηκαν με 10 ηΜ HDAC1 ή ειδικών siRNA DNMT1 ή All Star μπερδεμένο siRNA ελέγχου χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης HiPerfect (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά προκαθορισμένο χρόνο επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν σε στύπωμα western, έκφραση RNA, ή χρωματίνη πειράματα ανοσοκαθίζησης.

έκφραση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

mRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο εκχύλισης RNA Qiazol (Qiagen) όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε Qiazol και αναταράσσεται σε ένα 3D περιστροφέα για 5 λεπτά. 200 μΐ χλωροφορμίου προστέθηκε και επωάστηκε για τρία λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και η υδατική φάση (400 μΐ) μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα Eppendorf. 500 μΙ ισοπροπανόλης προστέθηκαν και επωάστηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα σφαιρίδια πλύθηκαν με 1 mL ψυχρής αιθανόλης 75%, φυγοκεντρήθηκε και επαναιωρήθηκε σε 50 μΐ RNAse ελεύθερο νερό. RNA προσδιορίστηκε ποσοτικά και cDNA δημιουργήθηκε από 1 μg του συνολικού εξαχθέντος RNA χρησιμοποιώντας ένα Omniscript Reverse Transcription Kit (Qiagen). Μετά την σύνθεση cDNA, ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan καθολική PCR Master Mix (Roche) και ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές που στοχεύουν RGS10 ή GAPDH περιοχές κωδικοποίησης. έκφραση Απομαγνητοφώνηση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ πρίσμα 7900HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Οι αντιδράσεις ομαλοποιήθηκαν ενάντια έκφραση GAPDH και οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση πρότυπων καμπυλών που δημιουργούνται. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: RGS10 Forward: 5′-GAC CCA AGA ΑΓΓ CGT GAA AAG Α-3 ‘, RGS10 Reverse: 5′-GCT GGA CAG ΑΑΑ GGT CAT GTA GA-3′, RGS10 καθετήρα: 5’-AGA ΤΑΑ GAC GCA GAT GCA GGA ΑΑΑ GGC-3 ‘, GAPDH Forward: 5′-GGA AGC TCA CTG GCA ΤΟΟ C-3′, GAPDH Reverse: 5’-TAG ACG GCA GGT CAG GTC CA-3 ‘και GAPDH καθετήρα: 5’-CCC CAC TGC ΥΠΑ CGT GTC AGT G-3 ‘.

για να προσδιοριστεί η επίδραση της 5-Aza-dC και έκθεση TSA στην έκφραση μεταγραφή RGS10, 1 × 10

6 κύτταρα Α2780-AD απλώθηκαν ανά 10 cm

πλάκα καλλιέργειας 2 ιστού και επωάστηκαν για μια νύχτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ 5-αζα-DC ή με 500 ng TSA διαλύονται σε DMSO. κύτταρα κατεργασμένα TSA επωάστηκαν για 48 ώρες και 5-Αζα-άΟ επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν για τρεις, πέντε ή επτά ημέρες, με μέσο αναρροφάται και αντικαθίσταται καθημερινά. Απομόνωση RNA και σύνθεση του DNA διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, τα κύτταρα απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 2 χ 10

6 σε 10 cm

2 πλάκες. Τρία εκατομμύρια κύτταρα συνδέθηκαν σταυροειδώς με 1% φορμαλδεΰδη για οκτώ λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Διασταύρωσης αντιδράσεις σταμάτησαν με την προσθήκη 0.125 Μ γλυκίνη. πυρήνες των κυττάρων απομονώθηκαν και συμπυκνώθηκαν με λύση σε SDS ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris ρΗ 8.0) συν αναστολείς πρωτεάσης για 30 λεπτά επί πάγου που ακολουθείται από flash κατάψυξη σε υγρό άζωτο. Οι πυρήνες σε επεξεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας μία Bioruptor υδατόλουτρο υπερήχων (Diagenode) για να δημιουργήσει ένα μέσο όρο 500 bp του διασπασμένο DNA η οποία επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Ήχο διασπώμενα προϊόντα λύσης προκαταρκτική διαύγαση με χάντρες σπέρματος σολομού /αγαρόζης (Millipore), 5% του συνολικού προϊόντος λύσης αποθηκεύονται ως είσοδος για ομαλοποίηση. Το ήμισυ του υπόλοιπου προϊόντος λύσεως ανοσοκαταβυθίζεται με 5 μg ενδεικνυόμενο αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και το άλλο μισό του λύματος ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα ελέγχου. Μετά από δύο επιπλέον ώρα ανοσοκαθίζηση με σφαιρίδια αγαρόζης επικαλυμμένα σπέρματος σολομού, όλα τα δείγματα πλύθηκαν με κάθε ένα από τα ακόλουθα ρυθμιστικά διαλύματα: ρυθμιστικό χαμηλού άλατος (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris ρΗ 8,0, 150 mM NaCl), ρυθμιστικό υψηλού άλατος (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris ρΗ 8,0, 500 mM NaCl), LiCI (0,25 Μ LiCl, 1% ΝΡ40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris ρΗ 8,0), και 1 χ ΤΕ (Tris-EDTA)? DNA μετά εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα SDS έκλουσης (1% SDS, 0,1 Μ NaHCO3). Μετά την έκλουση, διασυνδέσεις αντιστράφηκαν τη διάρκεια της νύχτας με 5 Μ NaCl στους 65 ° C και το ανοσοκαταβυθισμένο DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας φαινόλη: χλωροφόρμιο: ισοπροπανόλη μίγματος (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Απομονωμένα DNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε ένα ΑΒΙ Prism 7900 ΗΤ (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές που στοχεύουν RGS10 και GAPDH υποκινητές περιοχή. Οι τιμές που δημιουργούνται από PCR σε πραγματικό χρόνο αντιδράσεων υπολογίστηκαν με βάση πρότυπες καμπύλες δημιουργούνται, διεξήχθησαν εις τριπλούν αντιδράσεις, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SDS 2.0 (Applied Biosystems).

δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης σε siRNA επεξεργασμένα κύτταρα

κυττάρων στη χημειοθεραπεία Α2780-AD απλώθηκαν σε πυκνότητα 1,2 × 10

6 κύτταρα ανά 10 εκατοστά

2 τρυβλία καλλιέργειας ιστού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA κατασκευάσματα όπως περιγράφεται παραπάνω και επωάστηκαν για 72 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 1/10 του όγκου των κυττάρων απομακρύνθηκε για ανάλυση των knockdown απόδοσης με ανάλυση κηλίδος Western. δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω για τις υπόλοιπες συλλεγέντα κύτταρα.

έκφραση RNA σε siRNA επεξεργασμένα κύτταρα

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 χ 10

6 κύτταρα 10 εκατοστόμετρα πλάκα καλλιέργειας

2 ιστού και επωάστηκαν για μια νύχτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA κατασκεύασμα όπως περιγράφεται παραπάνω και επωάστηκαν για 72 ώρες, και μια εξαγωγή RNA έγινε όπως περιγράφεται παραπάνω.

Προσδιορισμός απόπτωσης

απόπτωση κυττάρων Α2780-AD ήταν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το αννεξίνης V: ΡΕ απόπτωση Detection Kit Ι (BD Pharmingen). 1 × 10

6 κύτταρα Α2780-AD απλώθηκαν σε 10 cm

2 πλάκα καλλιέργειας ιστού και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA HDAC1 ή με έλεγχο siRNA χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης HiPerfect. Μετά 48 ώρες επώασης, 50 μΜ cisplatin προστέθηκε σε τόσο HDAC1 siRNA και ελέγχουν κύτταρα επεξεργασμένα siRNA και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. κύτταρα Α2780-AD ήταν λίγο θρυψίνη και συλλέχθηκαν. Ένα κλάσμα του κυτταρικού όγκου απομακρύνθηκε για ανάλυση στυπώματος western και το υπόλοιπο κλάσμα των κυττάρων πλύθηκε με ψυχρό PBS δύο φορές και επανεναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό δέσμευσης αννεξίνης V σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε σωλήνες καλλιέργειας 5 ml που περιείχε 5 μΙ αννεξίνης V-ΡΕ και /ή 5 μl από 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD). Τα δείγματα αναμίχθηκαν απαλά και επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την προσθήκη 400 μΙ αννεξίνης V ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης σε κάθε σωλήνα, τα δείγματα αναλύθηκαν και ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής και προκύπτοντα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo.

Αποτελέσματα

Η ακετυλίωση των ιστονών καταστέλλεται σε υποκινητές RGS10 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Δείξαμε πρόσφατα ότι τα επίπεδα της ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 ιστόνης μειώθηκε σημαντικά κατά τον υποκινητή RGS10-1 στο μοντέλο Α2780-AD κύτταρο του χημειοαντίσταση ωοθηκών [15]. Για την επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων σε πρόσθετες κυτταρικές σειρές, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες διεξήχθησαν στη νόσο ευαίσθητη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών OV2008 και σε χημειοθεραπεία θυγατρικά κύτταρα C13. Ενώ τα συνολικά επίπεδα των ιστονών Η3 είναι παρόμοια και στα δύο υποστηρικτές RGS10 και GAPDH στη νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία κύτταρα (Εικ. 1Α), τα επίπεδα των ακετυλιωμένων ιστόνης Η3 είναι σημαντικά χαμηλότερες σε υποστηρικτές RGS10 στα χημειοθεραπεία C13 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε σύγκριση με νόσο ευαίσθητη κύτταρα OV2008 ( Εικ. 1Β).

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σε Ον2008 γονικά κύτταρα και ανθεκτικοί στα φάρμακα κυττάρων C13. Τα υλικά λύσεως ανοσοκατακρημνίσθηκαν με έλεγχο, αντι-ιστόνης Η3, αντι-ακετυλο ιστόνης Η3, ή αντισώματα αντι-H3K18 ακετύλιο. Associated DNA απομονώθηκε και αναλύθηκε μέσω πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που εκτείνονται τους προαγωγούς RGS10 και GAPDH. Real-time PCR τιμές κανονικοποιήθηκαν προς τη συνολική ποσότητα του υποκινητή DNA προστίθεται (εισόδου). τιμές εισόδου αντιπροσωπεύουν το 5% του συνολικού κυτταρικού λύματος. ** P & lt? 0.005. Α) Παγκόσμια ιστόνης Η3 τα επίπεδα που σχετίζονται με RGS10 και GAPDH υποστηρικτές. Β) Η παγκόσμια επίπεδα των ιστονών Η3 ακετυλίωση σχετίζεται με RGS10 και GAPDH υποστηρικτές. Γ) Τα επίπεδα της ιστόνης Η3 ακετυλιωμένων σε λυσίνη 18 συνδέονται με RGS10 και GAPDH υποστηρικτές.

Η

Οι μειώσεις H3 λυσίνη 18 ακετυλίωση (H3K18Ac) έχουν συσχετιστεί με την επιθετική φαινοτύπους καρκίνου και με κακή πρόγνωση των ασθενών [28] , [29]. Είμαστε δίπλα εκτελούνται αναλύσεις τσιπ για να καθορίσει αν η απώλεια της H3K18 συμβάλλει στην απώλεια της παγκόσμιας ακετυλίωση των ιστονών σε υποστηρικτές RGS10 σε χημειοθεραπεία κύτταρα C13. Μια σημαντική μείωση σε H3K18 ακετυλίωση σε προαγωγούς RGS10 παρατηρήθηκε σε χημειοθεραπεία κύτταρα C13, ενώ H3K18 ακετυλίωση στα υποκινητές GAPDH σε κύτταρα Ον2008 και C13 παρέμεινε αμετάβλητη (Εικ. 1 C). Μαζί αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απώλεια της ακετυλίωσης σε υποκινητές RGS10 συμβάλλει στην απώλεια έκφρασης RGS10 σε δύο ανεξάρτητες μοντέλα κυττάρων στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

HDAC1 και έκφραση DNMT1 καταστέλλουν RGS10 σε χημειοθεραπεία ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων

Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι οι πρωτεΐνες HDAC1 δεσμεύονται με σημαντικά αυξημένη συχνότητα στον προαγωγέα RGS10 σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-Αϋ σε σύγκριση με τη γονική χημειοευαίσθητων κύτταρα Α2780 [15]. Για να διερευνήσουν το μοριακό ρόλους για HDAC1 στη ρύθμιση της έκφρασης RGS10, ένα siRNA διπόλου χρησιμοποιήθηκε για να χτυπήσει ειδικά κάτω από την ενδογενή έκφραση HDAC1 στα κύτταρα Α2780-AD. siRNA μεσολάβηση knockdown του HDAC1 οδήγησε σε αύξηση κατά περισσότερο από 3 φορές σε ενδογενή έκφραση RGS10 μεταγραφής σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (Σχ. 2Α), προτείνοντας ότι HDAC1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής RGS10. ανάλυση Western blot επιβεβαίωσε HDAC1 γκρεμίζω αυξημένη έκφραση RGS10 πρωτεΐνης (Σχήμα 2Β). Σε ένα παρόμοιο πείραμα, τα κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με HDAC1 να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της έκτοπη έκφραση της HDAC1. Η υπερέκφραση του HDAC1 μειώνεται δραματικά η έκφραση RGS10 σε χημειοθεραπεία Α2780-AD κύτταρα (Σχ. 2C-Ε). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι HDAC1 συσσώρευση στο υποκινητές RGS10 πιθανόν συμβάλλει στην καταστολή της RGS10 σε χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Α) εξόντωση HDAC1 αυξάνει μεταγραφή RGS10 mRNA. κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με HDAC1 siRNA ή ελέγχουν siRNA και επωάστηκαν για 72 ώρες. RNA εκχυλίστηκε και cDNA δημιουργήθηκε με χρήση αντίστροφο έναυσμα στόχευσης για RGS10 ή GAPDH περιοχή κωδικοποίησης. Δεδομένα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας qPCR με εκκινητές και ανιχνευτές ειδικούς για RGS10 και GAPDH περιοχές κωδικοποίησης. Γράφημα δεδομένα δείχνουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, με γραμμές σφάλματος δηλώνουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Η σημαντικότητα υπολογίστηκε με t δοκιμασία κατά Student ** ρ & lt? 0.005. Β) ανάλυση Western blot αποδεικνύοντας την αποτελεσματικότητα των HDAC1 νοκ ντάουν και πρωτεΐνη έκφρασης RGS10 παρακάτω HDAC1 γκρεμίζω με β-ακτίνη μάρτυρες. C-D) HDAC1 υπερέκφραση μειώνει την έκφραση RGS10 σε χημειοανθεκτική κύτταρα. κύτταρα Α2780 /AD απλώθηκαν σε πλάκα 24-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 500 ng HDAC1 ή κενό φορέα χρησιμοποιώντας Fugene 6 αντιδραστήριο (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και η έκφραση των γονιδίων και RGS10 HDAC1 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR, όπως περιγράφεται, και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση του γονιδίου ακτίνης. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα *** p & lt? 0,0005. Ε) Η ανάλυση στυπώματος Western καταδεικνύει έκφραση πρωτεΐνης RGS10 εξής HDAC1 υπερέκφραση με β-ακτίνη μάρτυρες.

Η

Ο υποκινητής RGS10-1 περιέχει υψηλή συγκέντρωση του CpG δινουκλεοτιδίων καθιστώντας το ένα πιθανό στόχο για μεθυλίωση συντήρηση DNMT κατά τη διάρκεια των ωοθηκών εξέλιξης του καρκίνου. Αρχικά προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος Western ότι τα επίπεδα έκφρασης DNMT1 είναι παρόμοιες σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές Α2780 και Α2780-AD (Σχ. 3Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη σημασία της DNMT1 στην ειδική καταστολή της έκφρασης RGS10, αναλύσεις ChIP διεξήχθησαν Α2780 γονική και τα παράγωγα ανθεκτικά κύτταρα Α2780-AD τους. Τα υλικά λύσεως ανοσοκατακρημνίσθηκαν με έλεγχο ή αντι-DNMT1 αντίσωμα και που συνδέεται DNA αναλύθηκε μέσω ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές που εκτείνονται τους προαγωγείς RGS10 και GAPDH. Σε αντίθεση με ολική πρωτεΐνη αφθονία, δοκιμασίες ChIP αποκαλύπτουν ότι η σύνδεση του DNMT1 είναι σημαντικά αυξημένη στο προαγωγό RGS10 σε χημειοθεραπεία κύτταρα σε σύγκριση με νόσο ευαίσθητη καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Σχ. 3Α). Μαζί αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι η συσσώρευση του DNMT1 στον υποκινητή RGS10 πιθανό συμβάλλει στην καταστολή της RGS10 διάρκεια χημειοαντίσταση καρκίνου των ωοθηκών.

Α) Επίπεδα DNMT1 συνδέονται με προαγωγούς RGS10 σε Α2780 και Α2780-AD καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα. δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σε Α2780 γονική και τα παράγωγα ανθεκτικά κύτταρα Α2780-AD τους. Τα υλικά λύσεως ανοσοκατακρημνίσθηκαν με έλεγχο ή αντι-DNMT1 αντίσωμα. Associated DNA απομονώθηκε και αναλύθηκε μέσω πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές που εκτείνονται τους προαγωγείς RGS10 και GAPDH. Real-time PCR τιμές κανονικοποιήθηκαν προς τη συνολική ποσότητα του υποκινητή DNA προστίθεται (εισόδου). Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH και αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ** ρ & lt? 0.005. Ανάλυση Β) Western blot των παγκόσμιων επιπέδων DNMT1 στο Α2780 και Α2780-AD κύτταρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαθίζηση. σφαιρίδια αγαρόζης αντίσωμα συζευγμένο (ΙΡ) για DNMT1 επωάστηκαν με περιστροφή για όλη τη νύχτα. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν, εκλούσθηκαν και υποβλήθηκε σε στύπωμα western με αντίστοιχα αντισώματα. C) κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με DNMT1 siRNA ή με siRNA ελέγχου και επωάστηκαν για 72 ώρες. RNA εκχυλίστηκε και cDNA δημιουργήθηκε με χρήση αντίστροφης εκκινητές στοχεύουν RGS10 και GAPDH περιοχές κωδικοποίησης. Τα δεδομένα που παράγονται ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR με εκκινητές και ανιχνευτές ειδικούς για την περιοχή κωδικοποίησης RGS10. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων ** ρ & lt? 0.005. Δ) ανάλυση Western blot για την αποτελεσματικότητα της να χτυπήσει κάτω DNMT1 και για την έκφραση της πρωτεΐνης RGS10 παρακάτω DNMT1 γκρεμίζω.

Η

Η συσσώρευση των DNMT1 στο υποστηρικτής RGS10 μας οδήγησε να καθορίσει εάν η συσσώρευση επηρεάζει το επίπεδο έκφρασης μεταγραφή RGS10 στην χημειοανθεκτική κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με DNMT1 siRNA ή ελέγχου siRNA. RNA εκχυλίστηκε και δημιουργήθηκε cDNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR με εκκινητές και ανιχνευτές ειδικούς για την RGS10 περιοχή κωδικοποίησης και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση του γονιδίου GAPDH καθαριότητας. Τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι χτυπήσει κάτω DNMT1 αυξάνει σημαντικά την ενδογενή έκφραση RGS10 μεταγραφής (Σχ. 3C) και η έκφραση της πρωτεΐνης (Εικ. 3D) σε κύτταρα Α2780-AD. Η αύξηση αυτή δείχνει ότι λειτουργεί DNMT1 με HDAC1 να ρυθμίζει την καταστολή των RGS10 μεταγραφή σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD.

Η αναστολή της HDAC και τη δραστηριότητα DNMT ενισχύει την έκφραση RGS10 και μειώνει τον καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικής βιωσιμότητας

δίπλα επιδίωξαν να καθορίσουν εάν φαρμακολογική αναστολείς της απακετυλίωση ιστόνης και μεθυλίωσης του DNA μπορεί να αλλάξει την έκφραση του RGS10 σε χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Η TSA αναστολέας HDAC και DNMT αναστολέας της 5-Αζα-άΟ χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή της HDACs και DNMTs, αντίστοιχα. κύτταρα Α2780-AD υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 500 ηΜ TSA και επωάστηκαν για 2 ημέρες ή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ 5-αζα-DC και επωάστηκε για 3, 5 και 7 ημέρες. Ολικό RNA απομονώθηκε από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, TSA και 5-Αζα-dC κύτταρα που υπέστησαν αγωγή. Η σχετική έκφραση της έκφρασης μεταγράφου RGS10 ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR και κανονικοποιήθηκε προς GAPDH έκφραση μεταγράφου. Συνεπής με τις παρατηρήσεις από HDAC1 και DNMT1 γκρεμίζω πειράματα, TSA και 5-Aza-dC θεραπείες τόσο σημαντικά ενισχυμένη έκφραση μεταγραφή RGS10 σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD (Εικ. 4Α και 4Β). Για να διερευνήσουν το δυναμικό συνεργιστική ρόλους για HDAC1 και DNMT1 στη ρύθμιση της έκφρασης RGS10, μελέτες συνδυασμού εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας TSA και 5-Αζα-dC σε χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Και πάλι, TSA ή 5-Αζα-άΟ μόνος ενισχυμένη έκφραση RGS10 σε κύτταρα Α2780-AD, και ο συνδυασμός αυτών των δύο φαρμάκων οδηγεί σε μια τριπλάσια αύξηση στην έκφραση RGS10 μεγαλύτερη από το άθροισμα των επιμέρους αποτελέσματος, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή συνεργατική επίδραση (Εικ . 4C). Για να διερευνηθεί ρόλους συνεταιρισμό για HDAC1 και DNMT1 στην κυτταρική ανάπτυξη και χημειοαντίσταση, τα κύτταρα Α2780-AD υποβλήθηκαν σε αγωγή με TSA και /ή 5-Αζα-dC παρουσία προσδιορισμούς σισπλατίνη και η κυτταρική βιωσιμότητα διεξήχθησαν. 5-Αζα-άΟ μειώνεται μόνο τα κυτταρική ανάπτυξη κατά 40% περίπου, ενώ TSA μόνο είχε μια μέτρια αλλά σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου? Ωστόσο, ο συνδυασμός της TSA και 5-Αζα-άΟ αναστέλλεται η κυτταρική βιωσιμότητα κατά 90%. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα Α2780-Αϋ ήταν ανθεκτικά σε τοξικότητα σισπλατίνης, αλλά είτε TSA ή 5-Αζα-άΟ μερικώς επαναευαισθητοποιούνται τα κύτταρα να σισπλατίνη διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα (Εικ. 4D). Για να προσδιοριστεί εάν RGS10 αυξορρύθμιση από TSA /5-Αζα-άΟ συνδυασμένη θεραπεία θα μπορούσε πλήρως αντιπροσωπεύουν απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων, επιχειρήσαμε να διασώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσία 5-Αζα-DC και TSA με RGS10 siRNA. Δεν αποτελεί έκπληξη, knock-down της RGS10 μόνη της δεν διάσωση βιωσιμότητα των κυττάρων, σύμφωνα με το ευρύ φάσμα των HDAC και DNMT γονιδίων-στόχων στα καρκινικά κύτταρα (Εικ. 4Ε). Έτσι, RGS10 ρυθμίζει συντονισμένα βιωσιμότητα των κυττάρων και τηςχημειοευαισθησίας με επιπλέον HDAC και γονιδίων-στόχων DNMT.

Ολικό RNA απομονώθηκε από μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου και TSA ή 5-Αζα-dC επεξεργασμένα κύτταρα. Η σχετική έκφραση του mRNA RGS10 ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση GAPDH μεταγραφής * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0.005. Α) αναστολή HDAC αυξάνει την έκφραση RGS10 σε χημειοθεραπεία κύτταρα Α2780-AD. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα

2 πλάκα 10 cm και επωάστηκαν για 24 ώρες. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ηΜ TSA και επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Β) DNMT αναστολέας της 5-Αζα-άΟ ενισχύει την έκφραση RGS10 σε χημειοανθεκτική κύτταρα. Δύο εκατομμύρια κύτταρα Α2780-AD σπάρθηκαν σε 10 cm

2 πλάκες και επωάστηκαν για 24 ώρες. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ 5-αζα-DC. Μέσα μαζικής ενημέρωσης και τα ναρκωτικά ήταν ανανεώνεται κάθε 24 ώρες. Μετά από προκαθορισμένο χρόνο επωάσεως (3, 5, και 7 ημέρες), τα κύτταρα συλλέχθηκαν, το mRNA απομονώθηκε και δημιουργήθηκε cDNA και ποσοτικά χρησιμοποιώντας qRT-PCR με ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτή. C) κύτταρα Α2780-AD επιστρώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ 5-αζα-DC για 5 ημέρες, 500 ηΜ TSA για 36 ώρες, ένα συνδυασμό 5 μΜ 5-αζα-DC για 5 ημέρες και 500 ηΜ TSA για τις τελικές 36 ώρες ή DMSO. Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR, όπως περιγράφεται, και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση του γονιδίου RPL13A. Το βέλος δείχνει το επίπεδο έκφρασης που προβλέπεται από ένα προσθετικό αποτέλεσμα από TSA και 5-Αζα-DC. Δ) Σε ένα παράλληλο πείραμα, τα κύτταρα Α2780-AD υπέστησαν αγωγή υπό τις ίδιες συνθήκες όπως 4C, με ή χωρίς 30μΜ cisplatin για τις τελικές 12 ώρες. Η κυτταρική επιβίωση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας φθορομετρικό δοκιμασίες βιωσιμότητας CellTiter-Blue. ***: Ρ & lt? 0.001 σύγκριση επιγενετικό φάρμακο για τον έλεγχο DMSO απουσία της σισπλατίνης. ###: P & lt? 0.001 σύγκριση όχημα έναντι σισπλατίνης θεραπεία εντός επιγενετικές ομάδες θεραπείας από τα ναρκωτικά. Η διάστικτη κουτί υποδεικνύει την βιωσιμότητα των κυττάρων που προβλέπεται από ένα προσθετικό αποτέλεσμα από TSA και 5-Αζα-DC. Ε) κύτταρα Α2780 /AD (5000 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με αρνητικό μάρτυρα ή δίπολα RGS10 siRNA (Ambion Grand Island, ΝΥ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Dharmafect1 (Dharmacon). Τα κύτταρα δοσολογήθηκαν με συνδυασμό 5 μΜ 5-αζα-DC για 3 ημέρες και 500 ηΜ TSA για την τελευταία 36 ώρες ή DMSO. 30μΜ cisplatin ή όχημα προστέθηκαν για την τελευταία 12 h. Η επιβίωση των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας φθορομετρικό αναλύσεις βιωσιμότητας CellTiter-Blue.

Η

Η κατάρριψη HDAC1 ενισχύει σισπλατίνη διεγείρεται απόπτωση σε χημειοθεραπεία κύτταρα

προηγούμενη εργασία μας δείχνει ότι η καταστολή της έκφρασης RGS10 συμβάλλει στην ανάπτυξη του χημειοαντίσταση κατά τη διάρκεια εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών, μέσω ενίσχυσης των ενδογενών οδών σηματοδότησης επιβίωσης [2], [15], και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υποδεικνύουν ότι HDAC1 συμβάλλει στην απώλεια έκφρασης RGS10 σε χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Για τον προσδιορισμό HDAC1 μεσολάβηση αλλαγές στην κυτταρική επιβίωση στη χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με HDAC1 siRNA. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μΜ σισπλατίνη και η απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια αννεξίνης V: κιτ ανίχνευσης απόπτωσης PE (BD Pharmingen). Annexin V συνδέει φωσφατιδυλοσερίνη, το οποίο εκτίθεται μόνο σε αποπτωτικά κύτταρα, ενώ η μεμβράνη ετικέτας διαπερνά DNA 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD) δεσμεύεται επιλεκτικά σε περιοχές GC του DNA μόνο στα τέλη αποπτωτικών ή νεκρά κύτταρα με εκτεθειμένες μεμβράνες [30] – [32]. Έτσι, οι αρχές του αποπτωτικά κύτταρα χρωματίστηκαν με μόνο αννεξίνη V-ΡΕ, ενώ αργά αποπτωτικά και τα νεκρά κύτταρα βάφτηκαν τόσο με αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκε για να γίνει διάκριση μεταξύ των πληθυσμών των μη επισημασμένου και μονο-ή ή διπλά-επισημασμένα κύτταρα. HDAC1 γκρεμίζω αύξησε σημαντικά τον πληθυσμό των κυττάρων cisplatin που διεγείρεται από 12,9% έως 32,1% που είναι θετικά τόσο για αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD (τέλη αποπτωτικά ή νεκρά κύτταρα) (Σχ. 5Α). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σχ. 5Β). Γκρεμίζω αποτελεσματικότητα της έκφρασης πρωτεΐνης HDAC1 και RGS10 μετά την HDAC1 γκρεμίζω επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα Α2780-AD με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 5C). Μαζί αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι HDAC1 μεσολαβούμενη μείωση της έκφρασης RGS10 αμβλύνει την ικανότητα της σισπλατίνης να επάγει κυτταρικό θάνατο σε Α2780 /AD καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

κύτταρα Α2780-AD υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA HDAC1 ή ελέγχουν siRNA και επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ cisplatin και επωάστηκαν για προσθήκη 48 ώρες σε RPMI 1640. Μια Annexin V: ΡΕ απόπτωση Detection Kit Ι (BD Pharmingen) χρησιμοποιήθηκε για χρώση? αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση κυτομετρίας ροής και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo. Βιώσιμα κύτταρα ήταν αρνητικά τόσο για αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD? πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων ήταν θετικά για αννεξίνη V-ΡΕ και αρνητικά για 7-AAD, ενώ αργά αποπτωτικών νεκρά κύτταρα ήταν θετικά τόσο για αννεξίνη V-PE και την επισήμανση 7-AAD. Α) Η σχετική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων σε HDAC1- siRNA επιμολυσμένα κύτταρα Α2780-AD, που ενσωμάτωσε την αννεξίνη V-ΡΕ και 7-AAD λεκέδες. Β) Διάγραμμα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, με γραμμές σφάλματος που δηλώνει SEM * ρ & lt? 0.05. Γ) ανάλυση Western blot αντιπροσωπεύει την αποδοτικότητα των HDAC1 νοκ ντάουν και RGS10 έκφραση της πρωτεΐνης μετά από HDAC1 γκρεμίζω.

Η

DNMT1 γκρεμίζω μειώνεται HDAC1 σύνδεση με τον υποκινητή RGS10 στη χημειοθεραπεία καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

HDAC1 και DNMT1 συμβάλει στην αποσιώπηση του γονιδίου, μέσω της προσλήψεως μεταγραφικοί καταστολείς υποστηρικτής περιοχές [33] – [35] και να εργαστούμε μαζί για την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης [24], [36]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι HDAC και DNMT δραστηριότητες συνεργατικά φιμώσουν RGS10 (Εικ. 4C). Για να διερευνηθεί αλληλοπαρεμβολές μεταξύ αυτών των δύο επιγενετικές ρυθμιστές, τα κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με DNMT1 siRNA ή ελέγχου siRNA και επωάστηκαν για 72 ώρες. σύνδεση με τον υποκινητή RGS10 HDAC1 εξετάστηκε από δοκιμασίες τσιπ DNMT1 siRNA ή ελέγχουν κύτταρα Α2780-AD αντιμετωπίζονται siRNA. DNMT1 γκρεμίζω μειώθηκε σημαντικά τη σύνδεση του HDAC1 με τον υποκινητή RGS10 (Εικ. 6Α) και ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 6Β) απέδειξαν την επιτυχή και ειδική knockdown του DNMT1. Το αντίστροφο πείραμα εκτελέστηκε επίσης όπου τα κύτταρα Α2780-AD επιμολύνθηκαν με HDAC1 siRNA. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε knockdown του HDAC1 οδήγησε σε καταστολή της έκφρασης πρωτεΐνης DNMT1 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? μια παρατήρηση θεωρείται από τους άλλους, καθώς και [37]. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι HDAC1 στρατολογείται στον υποκινητή RGS10 μέσω DNMT1 και μεθυλο-CpG δεσμευτική πρωτεΐνη 2 (MeCP2) εξαρτάται από τους μηχανισμούς (Εικ. 6C).