Αφηρημένο

Η εμφάνιση της φασματομετρίας μάζας (MS) -με βάση υπογραφών ως βιοδείκτες έχει προκαλέσει μεγάλο ενθουσιασμό στους ογκολόγους. Ωστόσο, υπάρχουν και παραλλαγές σε φυσιολογικά άτομα, και μια καλύτερη κατανόηση των προτύπων πεπτιδίου στον ορό υγιών ατόμων θα είναι σημαντικό για την περαιτέρω διερεύνηση πρότυπα πεπτιδίου ορού που αφορούν συγκεκριμένες νόσους. Μετά την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας μοτίβο πεπτιδίου ορού, αναλύσαμε 500 δείγματα ορού που λαμβάνονται από υγιή άτομα. από του μαστού (n = 84), εξετάστηκαν επίσης δείγματα πνευμόνων (n = 70), και του ορθού (n = 30) ασθενείς με καρκίνο. Εκτενή ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε αμελητέα συμβολή της ηλικίας τους με τα πρότυπα του πεπτιδίου στον ορό, εκτός από υγιή άτομα μεταξύ 20-30 και 60+ ετών. Σχετίζονται με το φύλο διαφοροποιήσεις στα πρότυπα των υγιών ατόμων στον ορό παρατηρήθηκαν μόνο σε 20-30 ετών άτομα. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν σημαντική διακύμανση σε μεμονωμένα προφίλ πεπτίδιο, αλλά το 65 πεπτίδια ανιχνεύθηκαν σε 20% υψηλότερη συχνότητα στον υγιή πληθυσμό. Ένα προφίλ πεπτίδιο αναπτυχθούν για κάθε τύπο καρκίνου, που περιέχει 10 διακρίσεις πεπτίδια δεν επικρατεί σε υγιή άτομα. προσδιορισμός αλληλουχίας των 111 πεπτιδίων υπογραφή αποκάλυψε ότι έπεσαν σε αρκετές σφιχτά συμπλέγματα και οι περισσότεροι ήταν εξωπεπτιδάσης προϊόντα των πρωτεϊνών που διαμένουν στον ορό. Έχουμε πάρει ένα προφίλ πεπτίδιο ορό MS-βάση για υγιή άτομα, παρέχοντας μια αναφορά για την παρατήρηση της εμφάνισης του καρκίνου ειδικά πεπτίδια

Παράθεση:. Ο Κ, Wen ΧΥ, Li AL, Li Τ, Wang J, Wang HX, et al. (2013) Παραλλαγές του ορού πεπτιδιώματος σε υγιή πληθυσμό: αναφοράς για τον προσδιορισμό του Καρκίνου-ειδικά πεπτίδια. PLoS ONE 8 (5): e63724. doi: 10.1371 /journal.pone.0063724

Επιμέλεια: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, Γαλλία

Ελήφθη: 26 του Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 11, Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Ο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Key Technology R & amp? Α Προγράμματος (2009BAK61B04), καινοτομία Μεθοδολογίας (2010IM030300), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (21007092), και επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό και Τεχνολογικό Μεγάλου Έργου (2008ZX10002-016). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η εμφάνιση της φασματομετρίας μάζας (MS) -με βάση υπογραφών ως βιοδείκτες έχει προκαλέσει μεγάλο ενθουσιασμό στους ογκολόγους και αναλυτικούς χημικούς [1]. τεχνικές MS επιτρέπουν την ανάλυση των εκατοντάδων μικρών και μεσαίου μεγέθους πεπτιδίων από μόνο μικρολίτρα ορού. Villanueva και συνεργάτες απέδειξαν ότι ο καρκίνος μπορεί να ανιχνευθεί και να ταξινομηθούν με βάση πεπτίδια ορού που δημιουργείται ως αποτέλεσμα της δράσης της πρωτεάσης του όγκου [2]. Αυτά τα λεγόμενα πρωτεομική μοτίβα τέθηκε κανονικά πρωτεομική με τη δημοσίευση μιας μελέτης Lancet το 2002, το οποίο σύντομα ακολουθήθηκε από ένα σημαντικό αριθμό ερευνητικών μελετών και σχόλια. Αρκετές πρόσφατες εκθέσεις κατέδειξαν MS-based προσδιορισμούς συγκεκριμένα μοτίβα πεπτιδίου που υποδηλώνουν την παρουσία όγκων με πολύ υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα [3] – [16]. Αυτές οι μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με τα μέσα υψηλής ανάλυσης με τη χρήση υποβοηθούμενης από μήτρα λέιζερ εκρόφησης /ιοντισμού (ΜΑΙΟΙ) πηγές ιόντων και του χρόνου-πτήσης ανιχνευτές (TOF) ιόν [2], [10] – [16]. Πιο εξελιγμένα όργανα όπως Μετασχηματισμός Fourier (FT) MS /MS επιτρέπει την αναγνώριση του μεγαλύτερου αριθμού πεπτιδικών αλληλουχιών

15. Πρόσφατα, η συγγένεια καθαρισμό χάντρα-based έχει αναπτυχθεί και υιοθετηθεί από ορισμένους ερευνητές, αφού σφαιρικές χάντρες έχουν μεγαλύτερες περιοχές συνδυασμένη επιφάνεια και μια υψηλότερη ικανότητα δέσμευσης από κηλίδες μικρής διαμέτρου [14] – [19].

Το μοτίβο πεπτιδίων ορού που παράγονται από διάφορες νοσηρές καταστάσεις κατέχει μεγάλη διαγνωστικών πληροφοριών που αφορούν συγκεκριμένες νόσους. Ελπίζεται ότι πάνελ δεκάδων έως εκατοντάδων δεικτών πεπτιδίου μπορεί να ξεπεράσει την ετερογένεια των δειγμάτων ορού για την παραγωγή ενός υψηλού επιπέδου διαγνωστική εξειδίκευση. Μέτρηση πάνελ δεικτών πεπτιδιώματος μπορεί να είναι πιο ευαίσθητη και συγκεκριμένη από συμβατικές προσεγγίσεις βιοδείκτη. Ωστόσο, οι επικριτές έχουν εκφράσει ανησυχίες σχετικά με διάφορες πηγές μεροληψίας στον ορό πρωτεομική με βάση την ανακάλυψη βιοδεικτών. Μεταξύ αυτών, η ηλικία και το φύλο είναι οι κύριες πηγές της προκατάληψης που μπορεί να επηρεάσουν τη σύνθεση και τη σχετική αφθονία των πεπτιδίων στον ορό [20]. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των προτύπων πεπτιδίου σε ορό από υγιή άτομα θα είναι σημαντικό για την περαιτέρω διερεύνηση της νόσου συγκεκριμένα προφίλ πεπτίδιο ορού.

Σε αυτή τη μελέτη, θα αντιμετωπίσει αν οι παράμετροι των μοντέλων του πεπτιδίου στον ορό των δύο φύλων και την επιρροή της ηλικίας στην υγιή άτομα. Η μελέτη περιελάμβανε 500 δείγματα ορού από υγιείς άνδρες και γυναίκες μεταξύ 20 και 80 ετών. Δείγματα από του μαστού, του πνεύμονα, και ασθενείς με καρκίνο του ορθού εξετάστηκαν επίσης. Εκτενή ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε αμελητέα συμβολή της ηλικίας τους με τα πρότυπα του πεπτιδίου στον ορό, εκτός από υγιή άτομα μεταξύ 20-30 και 60+ ετών. και ότι η μεταβολή σχετίζονται με το φύλο στα πρότυπα του ορού σε υγιή άτομα συνέβη μόνο μεταξύ 20-30 ετών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα προφίλ πεπτίδιο μεταβάλλεται μεμονωμένα, αλλά ότι το 65 πεπτίδια ανιχνεύθηκαν σε 20% υψηλότερη συχνότητα στον υγιή πληθυσμό. Ένα προφίλ πεπτίδιο αναπτυχθούν για κάθε τύπο καρκίνου, που περιέχει 10 διακρίσεις πεπτίδια δεν επικρατεί σε υγιή άτομα. προσδιορισμός αλληλουχίας των 111 πεπτιδίων υπογραφή αποκάλυψε ότι έπεσαν σε αρκετές σφιχτά συμπλέγματα και οι περισσότεροι ήταν εξωπεπτιδάσης προϊόντα των πρωτεϊνών του ορού κάτοικος

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήριο

κιτ καθαρισμού χαλκού-χηλικών μαγνητικό σφαιρίδιο παρασκευάστηκε από το εργαστήριο μας [21]. πρότυπα βαθμονόμησης που περιέχει εννέα πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν ως τεχνητό δείκτες (Bruker Daltonik) και αποτελούνταν από τα ακόλουθα μόρια με μέσο μοριακό μάζες δίνονται σε παρένθεση: αγγειοτενσίνη II (1046,54180), αγγειοτενσίνη Ι (1296,68480), ουσία Ρ (1347,73540), μπομπεσίνη (1619,82230) , ACTH clip1-17 (2093.08620), ACTH clip18-39 (2465.19830), σωματοστατίνη (3147.47100), Ins bov (5734.55700), ουβικιτίνης (8565.88500).

Η ηθική δήλωση

Αφού λάβει έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας του 301 Γενικού νοσοκομείου και την επιτροπή δεοντολογίας της πρώτης κλινικής του νοσοκομείου του πανεπιστημίου Τζιλίν, όλοι οι χορηγοί είχαν υπογράψει τα έντυπα συγκατάθεσης.

τα δείγματα ορού

τα δείγματα αίματος από υγιείς εθελοντές και συλλέχθηκαν από 301 Γενικό Νοσοκομείο και υποβλήθηκε σε φυσική εξέταση και ορίζονται ως κλινικά υγιείς. Οι ασθενείς διαγνώστηκαν με καρκίνο του πνεύμονα, ο καρκίνος του μαστού και του καρκίνου του ορθού συλλέχθηκαν από το πρώτο κλινικό νοσοκομείο του Jilin πανεπιστήμιο (Πίνακας S1, S2 και Πίνακας Πίνακας S3). Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν μετά από τυπική κλινική πρωτόκολλο. Οι μη αντιπηκτικό συλλέχθηκαν δείγματα αίματος το πρωί πριν οι χορηγοί είχε πρωινό και αφέθηκε να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου για δύο ώρες, και φυγοκεντρείται στα 1500-2000 στροφές ανά λεπτό για 15 λεπτά. Οι οροί μεταφέρθηκαν σε τέσσερα κρυοφιαλίδια και αποθηκεύθηκαν κατεψυγμένα στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Για τα πειράματα αναπαραγωγής, οροί από τα δείγματα αίματος από 10 υγιείς εθελοντές αναμείχθηκαν ως οροί ποιοτικού ελέγχου. Όταν ορό έφθασε το εργαστήριο φασματομετρίας μάζας (MS), το καθένα κρυοφιαλίδιο δείγματος αποψύχθηκε πάνω σε πάγο και χρησιμοποιείται για να παράγει δέκα μικρότερα κλάσματα (20 μί έκαστο) σε σωληνάρια μικρο-eppendorf και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Κάθε δείγμα ορού είχαν ως εκ τούτου έχουν καταψυχθεί και αποψυχθεί δύο φορές πριν υποβλήθηκε σε εκχύλιση πεπτιδίων και MS ανάλυση.

Ο χαλκός-χηλική εξόρυξη μαγνητικά σφαιρίδια πεπτίδιο και MALDI-TOF-MS (φασματομετρία μάζας)

Ο χαλκός-χηλική μαγνητικά σφαιρίδια που παρασκευάζονται στο εργαστήριό μας χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή πεπτιδίων ορού. Ένα κλάσμα 5-μι ενός ομογενούς διαλύματος μαγνητικών σφαιριδίων μεταφέρθηκε σε ένα 0,2-mL σωλήνα λεπτού τοιχώματος PCR, και προστέθηκαν και αναμίχθηκαν πλήρως 50 μL του διαλύματος πρόσδεσης. Οι σωλήνες τοποθετήθηκαν σε έναν διαχωριστή μαγνητικού σφαιριδίου (MBS) να καθορίσει τα μαγνητικά σφαιρίδια και το υπερκείμενο αναρροφήθηκε. Μετά το στάδιο δέσμευσης, διάλυμα δέσμευσης 20 μι προστέθηκε και αναμίχθηκε στην PCR σωλήνα. Στη συνέχεια, το δείγμα 5 μL ορού προστέθηκαν, αναμίχθηκαν και στη συνέχεια τοποθετείται στη συσκευή MBS. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε, και 100 μL του διαλύματος πλύσης προστέθηκαν και αναμίχθηκαν με τα μαγνητικά σφαιρίδια. Μετά την τελική βαθμίδα πλύσης, δεσμεύεται πεπτίδια εκλούστηκαν με επώαση του διαλύματος έκλουσης 20 μι για 10 λεπτά πριν από τη συλλογή του διαλύματος έκλουσης χρησιμοποιώντας τη συσκευή MBS. 1 μί του μέσου έκλουσης αναμίχθηκε με 1 μL του διαλύματος μήτρας (HCCA). 1 μί εντοπίστηκε πάνω σε ένα 600 μm διαμέτρου μέγεθος κηλίδας 384 MTP πλάκα στόχου (Bruker Daltonik) και αφήνεται να στεγνώσει. Το πρότυπο βαθμονόμησης πεπτιδίων και πρωτεϊνών (1 μL) στην ίδια μήτρα εφαρμόστηκε σε στόχευση σημεία στη γειτονία των δειγμάτων ορού για την εξωτερική βαθμονόμηση του οργάνου. Τα επεξεργασμένα δείγματα αναλύθηκαν με ένα φασματόμετρο επένδυση MALDI-TOF /TOF μάζα (Ultraflex? Bruker Daltonics) εφοδιασμένο με μία πηγή εκχύλισης ιόντος παλμική. Το σύστημα MALDI-TOF-MS ελέγχθηκε με flex v.2.0 λογισμικό ελέγχου (Bruker Daltonics). Ιονισμού επιτεύχθηκε με ακτινοβολία με ένα λέιζερ αζώτου (337 nm) που λειτουργεί σε 4 Hz. Ιόντα επιταχύνονται σε 20 kV με 250 ns καθυστέρησης εξαγωγή ιόντων παλμική. Κάθε φάσμα ανιχνεύθηκε σε γραμμικό θετικό τρόπο και εξωτερικά βαθμονομηθεί χρησιμοποιώντας ένα μίγμα προτύπων πεπτιδίου /πρωτεΐνης μεταξύ 1.000 και 10.000 Da.

αλληλούχιση Peptide

διαδοχικό φασματόμετρο μάζας FT-ICR (Bruker Daltonics) είναι εξοπλισμένο με ένα σύστημα HPLC 9,4 Τ υπεραγώγιμο μαγνήτη και νανο. Χρησιμοποιήσαμε πηγή nanoESI εξοπλισμένο με ένα γωνιακό σύστημα ψεκασμού εκτός άξονα στον τρόπο θετικού ιόντος. Η τάση που εφαρμόζεται στο μέταλλο επικαλυμμένο με τριχοειδή είσοδο του ηλεκτροψεκασμού πηγής ρυθμίστηκε μεταξύ-1200 V και -1,600 V. Οι εκχυλίζεται πεπτίδια αφαλατώθηκαν και αλληλουχήθηκαν με λειτουργία autoMSn με MS /MS λειτουργία ώθηση. Η Q ΡΤΜδ συστάθηκε για να κάνουμε MS /MS σάρωση. Το επιλεγμένο ιόντων διαμελισμένο από σύγκρουση που προκαλείται διαστάσεως (CID). Όλα τα φάσματα μάζας αποκτήθηκαν με τον τρόπο ευρυζωνικών στη μάζα σειρά από m /z 300 να 3000 με 512 k σημεία δεδομένων. Τα φάσματα βαθμονομηθεί εξωτερικά με Agilent ES μίγμα tuning (αριθμός καταλόγου G2421A, Palo Alto, CA) από τέσσερις-σημείο βαθμονόμησης. Το όργανο ελέγχονταν με χρήση λογισμικού Apex 1,0 και τα δεδομένα αναλύθηκαν με DataAnalysis 3.4. (Bruker Daltonics). Όλα τα δεδομένα MS /MS σε ένα τρέξιμο ήταν αποσυσπειρωμένο και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα αρχείο (.mgf), και εισήχθησαν στην μασκότ μηχανή αναζήτησης (www.matrixscience.com). Πεπτίδιο ανοχή μάζα ορίστηκε σε 10 ppm, θραύσμα ιόντων μάζα ανοχή καθορίστηκε στο 0,01, και ο τύπος μάζα του μητρικού πεπτιδίου και θραύσμα πεπτιδίου τέθηκαν σε μονοϊσοτοπική.

Signal επεξεργασία

φάσματα μετατράπηκαν στο Excel μορφή αρχείου που περιλαμβάνεται m αξίας /z και εντάσεις σήματος χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlexAnalysis 2.0. Κάθε φάσμα εξομαλύνθηκε καμπύλη, αφαίρεση της γραμμής βάσεως και της κορυφής της επισήμανσης. Όλα τα φάσματα ειδική κορυφές μάζας (σήματος προς θόρυβο αναλογία & gt? 5) με μάζα προς φορτίο αναλογίες (m /z) μεταξύ 1000 και 10000 Dalton συντάχθηκαν επισήμανση. Όλες οι εντάσεις κορυφής κανονικοποιήθηκαν προς το ολικό ρεύμα ιόντων με m /z και όλα τα φάσματα ελήφθησαν στη συνέχεια για την ευθυγράμμιση. Εμείς ομαλοποιηθεί και να ευθυγραμμιστούν κορυφές από διακριτά φάσματα χρησιμοποιώντας το λογισμικό MatchPeaks μας. Ευθυγράμμιση ξεκινά με την πρώτη κορυφή [του οποίου η μάζα προς φορτίο αναλογία (m /z) συμβολίζεται με Χ] ως «άγκυρα». Εάν μια άλλη κορυφή έχει m /z = Y, ορίζουμε το σχετικό σφάλμα μάζα για να