Αφηρημένο

Ο καρκίνος του τραχήλου κύτταρα επιδεικνύουν αυξημένη απαίτηση για την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ουβικιτίνης-εξαρτώμενη σχετίζεται με αυξημένο μεταβολικό ρυθμό του κύκλου εργασιών, και για συγκεκριμένες οδούς σηματοδότησης, κυρίως HPV Ε6-στοχευμένη υποβάθμιση των πρωτεϊνών p53 και ΡΟΖ. Φυσικές ενώσεις με αντιοξειδωτικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων φλαβονοειδή και τριτερπενοειδή κρατήσει την υπόσχεση ως αντικαρκινικών παραγόντων παρεμβαίνοντας με την υποβάθμιση πρωτεΐνη ουμπικουϊτίνη-εξαρτώμενη. Ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδεικνύει ότι α-β ακόρεστο σύστημα καρβονυλίου τους είναι το μοριακό καθοριστικός για την αναστολή της πρωτεΐνης αποικοδόμησης ουβικιτίνη μεσολαβεί ανάντη των καταλυτικές θέσεις του πρωτεασώματος 20S. Εδώ αναφέρουμε την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό μιας νέας κατηγορίας χαλκόνης με βάση, ισχυροί και κελί διαπερατό χημικοί αναστολείς της πρωτεϊνικής αποδόμησης ουβικιτίνη-εξαρτώμενη, και μια ένωση μολύβδου RAMB1. RAMB1 αναστέλλει ουβικιτίνη-εξαρτώμενη πρωτεϊνική αποδόμηση χωρίς να διακυβεύονται οι καταλυτικές δραστηριότητες του πρωτεασώματος 20S, ένα μηχανισμό διαφορετικό από εκείνο του Μπορτέζομιμπ. Θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου κυττάρων με RAMB1 προκαλεί εκτυλίχθηκε απαντήσεις πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένων aggresome σχηματισμό και τη σταθεροποίηση Hsp90, και αυξάνει p53 επίπεδα σταθερής κατάστασης. RAMB1 αγωγή έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των οδών αποικοδόμησης λυσοσωματικών εξαρτώμενη ως μηχανισμός για την αντιστάθμιση των αυξανόμενων επιπέδων πολυ-ουβικιτίνης εμπλουτισμένο τοξικά συσσωματώματα. Σημαντικά, RAMB1 πυροδοτεί συνεργιστικά τον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας, όταν συνδυάζεται με τον αναστολέα λυσόσωμα χλωροκίνη

Παράθεση:. Anchoori RK, Khan SR, Sueblinvong Τ, Felthauser Α, Iizuka Υ, Gavioli R, et al. (2011) τονίζοντας την ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος Συστήματος χωρίς 20S κύτταρα πρωτεολυτικά Αναστολή Επιλεκτικά σκοτώνει τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 6 (8): e23888. doi: 10.1371 /journal.pone.0023888

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Ιούν, 2011? Αποδεκτές: 29 Ιουλ 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Anchoori et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας ATIP και SPORE σε καρκίνο του τραχήλου Ρ50 CA098252 να SRK, RKA και RBSR και HERA θεμελίωσης (Υγεία, Ενδυνάμωση, Έρευνας και Ενημέρωσης) και το Υπουργείο άμυνας των ωοθηκών Πρόγραμμα Έρευνας (OCRP) OC093424 σε MB. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

ουμπικουϊτίνης-εξαρτώμενη πρωτεϊνική αποδόμηση μέσω του συστήματος ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος (UPS) είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση των πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση και απόπτωση σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα [1]. Η ανώμαλη έκφραση των συστατικών του συστήματος UPS συμπεριλαμβανομένων ουμπικιτίνης-λιγάσες, ένζυμα de-ubiquitinating και πρωτεασώματα έχει αναφερθεί σε αρκετές ρυθμίσεις του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [1], [2], [3], υποδηλώνοντας ότι, προκειμένου να διατηρήσουν υψηλότερα επίπεδα τους της μεταβολικής δραστηριότητας του καρκίνου κύτταρα βασίζονται περισσότερο σε μεγάλο βαθμό από τη σωστή λειτουργία του UPS σύγκριση με τα φυσιολογικά αντίστοιχά τους [4], [5], [6], [7]. Έτσι, μόρια ικανά να παρεμβαίνει με αποικοδόμηση πρωτεΐνης ουβικιτίνη-εξαρτημένη, συμπεριλαμβανομένων Bortezomib, δείχνουν αντικαρκινική δράση [5]. Των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) είναι η κύρια αιτία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και είναι υπεύθυνη για το 5% όλων των καρκίνων στον κόσμο [8]. Ενώ τα εμβόλια HPV μπορεί να είναι ένα αποτελεσματικό προληπτικό μέτρο κατά του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, δεν υπάρχουν σήμερα θεραπείες του ιού ειδικά γι ‘αυτό, και η αποτελεσματικότητα των τυποποιημένων χειρουργικών και χημειο /radiotherapies περιορίζεται για προχωρημένη νόσο [9]. Έκφραση των δύο ιικών ογκογονιδίων, Ε6 και Ε7, είναι απαραίτητη για την επαγωγή και διατήρηση του μετασχηματισμένου φαινοτύπου [10]. Το Ε6 εξασκεί ογκοπρωτεΐνη ογκογόνο δράση του με σύνδεση προς το Ε3 ουβικιτίνης λιγάση Ε6-ΑΡ και ανακατευθύνει δραστικότητα της προς ρ53 και άλλες πρωτεΐνες καταστολής όγκου για την ταχεία ουβικιτίνη μεσολαβεί αποικοδόμηση του πρωτεασώματος τους [11], [12], [13]. Αυτό μειώνει το επίπεδο αυτής της βασικής ρυθμιστικής κυτταρική κυτταρικού κύκλου, χωρίς μετάλλαξη της. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η σταθεροποίηση της ρ53 μέσω πρόληψης ουμπικιτίνης αποικοδόμηση μεσολάβηση της θα έχουν θεραπευτικές δυνατότητες για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και ενδεχομένως και για άλλους καρκίνους άγριου τύπου για ρ53.

Φυσικές ενώσεις των φλαβονοειδών και των οικογενειών triterpenoids συμπεριλαμβανομένων κουρκουμίνη, Celastrol, πράσινο τσάι πολυφαινόλες και χαλκόνες έχουν δείξει υπόσχεση σαν αντινεοπλαστικοί παράγοντες σε μια ποικιλία ρυθμίσεων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του τραχήλου της μήτρας [14], του παχέος εντέρου [15], [16], του οισοφάγου [17], παγκρεατικό [18] και του προστάτη [19], [ ,,,0],20], [21] ο καρκίνος, συνδέονται με την προ-αποπτωτικών ιδιότητες που σχετίζονται με την αναστολή του πρωτεασώματος. Δείξαμε πρόσφατα ότι χαλκόνης-παράγωγα που περιέχουν μονό αμινοξύ υποκαταστάσεις στη δομή τους, να ενεργούν ως αναστολείς πρωτεασώματος και ότι η φύση του αμινοξικού τμήματος καθορίζει εκλεκτικότητα τους προς τις διάφορες καταλυτικές δραστηριότητες του πρωτεασώματος 20S [14]. Ωστόσο, άλλα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα μόρια θα μπορούσαν να περιέχουν χαλκόνης εντός α- ακόρεστο σύστημα καρβονυλίου τους το μοριακό καθοριστικός για την αναστολή της ουμπικουϊτίνης μεσολάβηση πρωτεΐνη αποικοδόμηση ανάντη του πρωτεασώματος 20S [22], [23], [24], [25].

Αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι μια σειρά χαλκόνης-παραγώγων που στερούνται αμινοξικό συστατικά, εδώ ονομάζονται RAMBs, είναι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος συστήματος (UPS) -stressors μέσω αναστολής της ουβικιτίνης μεσολάβηση πρωτεΐνη αποικοδόμηση ανάντη των 20S πρωτεασώματος καταλυτική δραστηριότητες . Συγκεκριμένα, RAMBs ενώσεις μας είναι ικανές να επιλεκτική θανάτωση του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων μέσω συσσώρευση της πρωτεΐνης πολυ-ουβικουιτινωμένης που ακολουθείται από ενεργοποίηση της ξεδιπλωμένης πρωτεΐνης αποκρίσεων συμπεριλαμβανομένων aggresome σχηματισμό και την σταθεροποίηση Hsp90. Περαιτέρω, αυτή η συσσώρευση του πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες συνοδεύεται από αντισταθμιστική ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής αποδόμησης λυσοσώματος-εξαρτώμενη, σταθεροποίηση του ρ53, η αποσταθεροποίηση της κυκλίνης D1 και την έναρξη της απόπτωσης. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι RAMB θεραπεία ένωση, ενδεχομένως σε συνδυασμό με την χλωροκίνη αναστολέα λυσόσωμα, έχει υπόσχεση ως νέο δρόμο για τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρικές σειρές HeLa, SiHa, CaSki και ΜΕ180, ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 IU /mL πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη σε 5% CO

2. Τα κερατινοκύτταρα ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA) και καλλιεργήθηκαν σε καθορισμένο κερατινοκύτταρα SFM.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με 2,3-δις [2-μεθοξυ-4- νιτρο- 5-σουλφοφαινυλ] -2Η-τετραζολίου-5-καρβοξανιλίδιο εσωτερικό άλας (ΧΤΤ) δοκιμασία (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε συγκέντρωση 1,000 ανά φρεάτιο σε 100 μικρόλιτρα μέσου σε πλάκα 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε αγωγή με παράγωγα χαλκόνης που βασίζεται σε καθορισμένες συγκεντρώσεις. Μετά τις υποδεικνυόμενες περιόδους, τα κύτταρα επωάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με το μίγμα επισήμανσης ΧΤΤ επί 4 ώρες. Χρωστικής φορμαζάνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη φασματοφωτομετρικής πλάκας για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm (αναγνώστης ELISA 190? Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

Προσδιορισμός των αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής

Διέγερση απόπτωσης προσδιορίστηκε με χρώση /7-AAD Annexin-V. χρώση /7-AAD Annexin-V έγινε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-ΡΕ Apoptosis Detection Kit Ι (BD Pharmingen, San Diego, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

5 κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δέσμευσης, 5 μΐ αννεξίνης V-ΡΕ και 5 μΐ 7-AAD στη συνέχεια προστέθηκαν στα κύτταρα τα οποία στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε ένα Becton Dickinson FACSCalibur. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με το λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry συστήματος, Mountain View, CA).

Αντισώματα και ανάλυση Western Blot

Σύνολο κυτταρικής πρωτεΐνης (10-20 μg) από κάθε δείγμα διαχωρίζεται με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και υποβάλλονται σε ανάλυση κηλίδος Western. Αντισώματα για ανάλυση Western Blot ελήφθησαν με τις ακόλουθες εμπορικές πηγές: αντι-ουβικιτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-ρ53 κλώνου DO-1 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) αντι-PARP (BD Pharmingen, San Diego , California), αντι-GAPDH (Sigma, St. Louis, ΜΟ), του συνδεόμενου με υπεροξειδάση αντι-ποντικού ανοσοσφαιρίνη G (Amersham, Piscataway, NJ) και χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση που συνιστά ο κατασκευαστής. Αντι-ουβικιτίνης και αντι-βιμεντίνης αντισώματα για ανάλυση ανοσοφθορισμού λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas red-επισημασμένο αντι-ποντικού κατσίκας ανοσοσφαιρίνη G και φθορεσκεΐνη-επισημασμένο αλόγου αντι-κουνελιού ανοσοσφαιρίνη G ελήφθησαν από την Molecular Probes (Carlsbad, CA), και Vector Laboratories (Burlingame, CA), αντίστοιχα και χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση που συνιστά ο κατασκευαστής.

κυτταρική μορφολογία και ανοσο-φθορισμού αναλύσεις

Μια Nikon Eclipse ΤΕ 2000Ε ανεστραμμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση της κυτταρική μορφολογία με αντίθεση και ανοσοφθορισμό φάση. Για την ανάλυση της ουμπικουϊτίνης και βιμεντίνης υπο-κυτταρικό εντοπισμό, καλλιέργειες κυττάρων HeLa αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στο Lab-Tek II θαλάμων coverglass (Nalge Nunc International, Rochester, ΝΥ). Στους χρόνους που υποδεικνύονται, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με μεθανόλη και επωάζονται με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα. Φθορισμού δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την οπτικοποίηση της πρωτεΐνης εντοπισμός και πυρηνικό DNA οπτικοποιήθηκε με 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης χρώσης (ϋΑΡΙ). Τοποθετημένος δείγματα δει κάτω από ένα Nikon Eclipse ΤΕ 2000Ε ανεστραμμένο μικροσκόπιο και φωτογραφίες που τραβήξατε με Spot 3.5.8 λογισμικό εξαγορά (Διαγνωστικά Όργανα, Sterling Heights, MI).

Η μέτρηση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος στη δεκαετία του ’20 καθαρισμένα πρωτεασώματα

κύτταρα (5 × 10

8) πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 5 mM MgCl

2, 1 mM DTT (Sigma), 2 mM ΑΤΡ και 250 mM σακχαρόζη. Προστέθηκαν χάντρες από γυαλί ισοδύναμος με τον όγκο του κυτταρικού εναιωρήματος, και το μίγμα στροβιλίστηκε για 1 λεπτό στους 4 ° C. Χάντρες και τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε 1000 g, που ακολουθήθηκε από 20 min φυγοκέντρηση στα 10.000

g

[27]. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με υπερφυγοκέντρηση για 1 ώρα σε 100.000

g

, και τα υπερκείμενα περαιτέρω υπερφυγοκεντρήθηκαν για 5 ώρες στους 100 000

g

. σφαιρίδια πρωτεασώματος περιέχουν επαναιωρήθηκαν σε 0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 100 mM ΚΟΙ, 15% γλυκερόλη]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο BCA (Pierce, Rockford, IL). Φθορισμογόνα υποστρώματα Suc-LLVY-AMC, Boc-LRR-AMC και Ac-ΥνΑϋ-AMC χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση χυμοτρυπτικό-όπως, τρυπτικών-όπως και κασπάσης-όπως δραστηριότητες, αντίστοιχα. Ημικαθαρισμένο πρωτεασώματα (10 l), προκατεργασμένο ή όχι με αναστολείς για 30 λεπτά στους 37 ° C, υποβλήθηκαν σε δοκιμασία στους 37 ° C για 45 λεπτά με τη χρήση των διαφορετικών υποστρωμάτων πεπτιδίου σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 5 mM MgCl

2 και 1 mM DTT (τελικός όγκος 100 μΐ). Η αντίδραση σβήστηκε με 1 ml 1% SDS και ο φθορισμός προσδιορίστηκε με φθοριόμετρο (Perkin-Elmer, Beaconsfield, Ηνωμένο Βασίλειο) με διέγερση στα 380 nm και εκπομπή στα 440 nm [18]. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η επί τοις εκατό αναστολή σε σχέση με τα παρασκευάσματα χωρίς θεραπεία πρωτεασωμική.

Μέτρηση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος 26S σε πρωτεασώματα στα ζωντανά κύτταρα

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα (1 χ 10

6) τοποθετήθηκαν σε 60 πιάτα mm και είτε ψευδο ή επεξεργασμένων με διαφορετικές RAMB1 συγκέντρωση για μία περίοδο 4 ωρών. δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε προϊόντα λύσης κυττάρου (ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: 0,1% ΝΡ-40, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 5% γλυκερίνη και 1 mM DTT) προσδιορίστηκε με μέτρηση απομένουσας δραστικότητας φωταύγειας μετά την προσθήκη του Suc -LLVY-Glo ™ υπόστρωμα (Promega, Madison, WI) ειδικό για το τύπου χυμοθρυψίνης ενεργότητα του πρωτεασώματος σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Δοκιμασία 4XUbiquitin-λουσιφεράσης degron

The 4Xubiquitin- λουσιφεράσης κατασκεύασμα σύντηξης που ορίζεται Ub-FL και το πλασμίδιο ελέγχου που έχουν σχεδιαστεί CMV-FL ευγενικά από τον Dr. David Piwnica-Worms (Washington University, St. Louis, ΜΟ) [26]. Υπο-συρρέουσες καλλιέργειες κυττάρων HeLa διαμολύνθηκαν με πλασμίδια DNA χρησιμοποιώντας Lipofectamine αντιδραστήριο 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). FL και Ub-FL επιμολυσμένα κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε 50000 κύτταρα /φρεάτιο σε 24-φρεατίων ή 200 000 κύτταρα /φρεάτιο σε 6-φρεάτια πλάκας 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και επωάζονται με ενώσεις ή όχημα (DMSO) στις δόσεις και χρόνους που υποδεικνύονται. Η δραστικότητα λουσιφεράσης σε κυτταρικό λύμα προσδιορίστηκε με ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εικόνες αποκτήθηκαν για 1 λεπτό με Xenogen IVIS 200 (δαγκάνα, Hopkinton, ΜΑ). Εξίσου μεγέθους περιοχές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Image 2.20 Living λογισμικού.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Εκθετικά αναπτυσσόμενα SiHa, CaSki και HeLa τραχηλικό καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε είτε 1.000 ή 100 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μια μέρα μετά τη σπορά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο μόνο (mock) ή RAMB1 στις ενδεικνυόμενες δόσεις, και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 10 ημέρες. Στο τέλος της θεραπείας το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS πριν στερέωση και χρώση των αποικιών χρησιμοποιώντας ένα μείγμα 6,0% γλουταραλδεΰδη και 0,5% κρυσταλλικό ιώδες, όπως περιγράφεται προηγουμένως [27]. Αποικίες απεικονίστηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse ΤΕ 2000Ε ανεστραμμένο μικροσκόπιο και φωτογραφίες που τραβήξατε με Spot 3.5.8 λογισμικό εξαγορά (Διαγνωστικά Όργανα, Sterling Heights, MI). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών εκτιμήθηκε από δύο ουρών του Student

t

χρησιμοποιώντας Prism (Graphpad V.5, San Diego, CA) και το Excel. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p ≤ 0,05. Ο δείκτης συνδυασμού (CI) του RAMB1 και χλωροκίνη υπολογίστηκε από την ανάλυση μέσου-αποτελέσματος σύμφωνα με την μέθοδο των Chou και Talaly [28]. CI & lt? 1 δείχνει συνέργεια, CI = 1 υποδηλώνει προσθετικότητα, και CI & gt? 1 δείχνει ανταγωνισμό. Περαιτέρω αναλύσεις παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκαν για τη σταθεροποίηση εκτιμήσεις.

Αποτελέσματα

RAMB ενώσεις μειώνουν επιλεκτικά τη βιωσιμότητα του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, ανεξάρτητα από HPV γονότυπου

μέσω

αποκλεισμό του πρωτεασώματος υποβάθμιση

Τα φλαβονοειδή και τριτερπενοειδή μέλη της οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων celastrol [19], η ρεσβερατρόλη [29], [30], η κουρκουμίνη [17], επιγαλλοκατεχίνη-3-gallate [20], [31], [32], [33], [ ,,,0],34] και χαλκόνες [35], [36] εμφανίζουν αντικαρκινικές ιδιότητες που συνδέονται με την δραστικότητα τους ως αναστολείς πρωτεασώματος [14], [15], [16], [21]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι σε αναστολείς πρωτεασώματος χαλκόνης με βάση τη φύση του αμινοξέος τμήματος του μορίου προσδίδει εξειδίκευση προς καταλυτικές δραστηριότητες του πρωτεασώματος 20S [14]. Με βάση διάφορες προηγούμενες μελέτες [22], [23], [37], υποθέσαμε ότι η α-β σύστημα κετόνη χαλκονών μπορεί να αντιπροσωπεύει το ελάχιστο μοριακό καθοριστικός για την αναστολή της αποικοδόμησης πρωτεΐνης διαμεσολαβείται από ουβικουϊτίνη ανάντη πρωτεασώματα.

για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση έχουμε αρχικά σε διαλογή μία βιβλιοθήκη παραγώγων χαλκόνης με βάση μεταφέρουν διάφορους υποκαταστάτες επί των αρωματικών δακτυλίων δίπλα στο σύστημα α-β-κετόνη και χωρίς αμινοξικού τμήματα, για την ικανότητά τους αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων σε εκθετικά αυξανόμενη HPV 18-θετικός HeLa τραχηλικό καρκινική κυτταρική γραμμή σε ένα εύρος συγκεντρώσεων από 100 να 0,01 μΜ (δεν φαίνεται). Τέσσερις παράγωγα χαλκόνης, εφεξής καλούμενη RAMBs, ικανό να μειώσει την βιωσιμότητα κυττάρου των εκθετικά αυξανόμενης HeLa καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με IC

50 τιμές & lt? 5 μΜ, επιλέχθηκαν για περαιτέρω αξιολόγηση (Σχήμα 1). Για τον προσδιορισμό της σκοπιμότητας της χρήσης RAMBs ενώσεων για τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, ελέγξαμε εάν η θεραπεία RAMB1-4 θα εμπόδιζε ειδικά τη βιωσιμότητα κυττάρου των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας πάνω από τα κανονικά κερατινοκύτταρα και αν η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων του τραχήλου της μήτρας σε καρκινικά κύτταρα εξαρτάται από τη HPV -genotype. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, RAMB1 ή RAMB4 θεραπεία παρήγαγε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της βιωσιμότητας των HPV16-θετικών SiHa και Caski κύτταρα και HPV-39-θετικά ΜΕ180 τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές αντίστοιχα με ελάχιστες επιδράσεις επί της βιωσιμότητας των πρωτογενών ανθρώπινων κερατινοκυττάρων και με IC

50 παρόμοια με το ληφθέν με HeLa. Παρόμοια αποτελέσματα με ελαφρώς υψηλότερα IC

50 ελήφθησαν με τη χρήση RAMB2 και RAMB3 (δεν φαίνεται). Για να ελεγχθεί αν η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων του τραχήλου της μήτρας που παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση στις ενώσεις RAMB1-4 ήταν λόγω της ικανότητάς τους παρεμβαίνουν αποικοδόμηση πρωτεΐνης διαμεσολαβείται από ουβικουϊτίνη, παρακολουθήσαμε τα επίπεδα της συσσώρευσης της πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες μετά τη θεραπεία. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του RAMB1, RAMB2, RAMB3, ή RAMB4 ή 10 ηΜ Bortezomib, με το τελευταίο να χρησιμοποιηθούν ως UPS-στρεσογόνο θετικός έλεγχος, σε μία περίοδο 6 ωρών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 (

αριστερό πλαίσιο

), ανάλυση ανοσοστυπώματος των ουβικουιτινωμένης επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα HeLa αποκάλυψε ένα σαφές πρότυπο συσσώρευσης πολυ-ουμπικιτινομένων πρωτεϊνών σε RAMBs κατεργασμένους HeLa καλλιέργειες. Μια ημι-ποσοτική ανάλυση των polyubiquitinated επιπέδων πρωτεΐνης δείχνει ότι τα GAPDH-κανονικοποιημένα επίπεδα polyubiquitinated πρωτεΐνες είναι σταθερά υψηλότερες (μέχρι 3 φορές) σε RAMB αγωγή έναντι ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3,

δεξί πάνελ

). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων που παρατηρείται στην αυχενική πάνελ καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι σε κανονικά κύτταρα μετά από θεραπεία RAMBs συνδέεται με την διαταραχή αποικοδόμησης πρωτεΐνης διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη και λαμβάνει χώρα ανεξάρτητα από το ογκογόνο τύπο του HPV.

IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία XXT. Το IC

50 τιμή αναφερθεί είναι μέση τιμή τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών.

Η

Καλλιέργειες του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων HPV-μετασχηματισμένα (SiHa, CaSki και ΜΕ180) ή πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RAMB1 (

αριστερό πλαίσιο

) ή RAMB4 (

δεξί πάνελ

) για μια περίοδο 48 ωρών. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΧΤΤ και παρίσταται ως κλάσμα των καλλιεργειών ελέγχου χωρίς θεραπεία

Η

Αριστερό πλαίσιο:.

ανοσοστύπωσης ανάλυση ουμπικιτινομένων πρωτεϊνών σε κύτταρα HeLa μετά από 6 ώρες έκθεση με ή χωρίς 10 μΜ RAMBs. Βορτεζομίμπη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Ίση φόρτωση πρωτείνης σε κάθε λωρίδα επαληθεύτηκε με τη χρήση ενός αντισώματος κατά της GAPDH.

δεξί πίνακα:.

Ποσοτικοποίηση των δεικτών /GAPDH Ουμπικουϊτίνη

Η

θεραπεία RAMB πυροδοτεί μια ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος-System (UPS) -stress απάντηση χωρίς να επηρεάζει 20S πρωτεασώματος καταλυτικές δραστηριότητες

για να ελεγχθεί αν η ταχεία (έξι ώρες ή λιγότερο, αδημοσίευτα δεδομένα) συσσώρευση του πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες μετά την έκθεση RAMBs συμβαίνει ταυτόχρονα με την άμεση αναστολή των καταλυτικών δραστηριοτήτων των πρωτεασωμάτων, ελέγξαμε για την ικανότητα των RAMB1 και RAMB4 (η οποία προκάλεσε μεγαλύτερη συσσώρευση της πρωτεΐνης polyubiquitinated από τις άλλες RAMBs, Εικόνα 3) να αναστέλλουν συγκεκριμένη καταλυτική υπο-μονάδες εντός του πρωτεασώματος 20S. Συγκεκριμένα οι RAMBs δοκιμάστηκαν για την ικανότητά τους να αναστέλλουν την χυμοθρυψίνη (CT-παρόμοια), παρόμοια με θρυψίνη (Τ-παρόμοια) και πεπτίδιο υδρόλυσης πεπτιδυλογλουταμυλίου-σαν (PGPH-παρόμοια) δραστηριότητες σε 20S καθαρισμένο πρωτεασώματος προ-εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις έως και 10 μΜ RAMBs για χρονικό διάστημα 30 λεπτών μετά την προσθήκη των φθορισμογόνων υποστρωμάτων [38]. Η FDA άδεια αναστολέας πρωτεασώματος Bortezomib χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το προφίλ της αναστολής πρωτεασώματος δείχνει ότι σε αντίθεση με Bortezomib, RAMB1 και θεραπεία RAMB4 απέτυχε να αναστείλει τις λειτουργίες πρωτεασώματος όταν δοκιμάζονται σε συγκεντρώσεις μέχρι και 10 μΜ (παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τις άλλες ενώσεις της σειράς, δεν παρουσιάζεται).

τα καθαρισμένα 20S πρωτεασώματα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 λεπτά με ή χωρίς RAMB ενώσεις ή Bortezomib, εδώ χρησιμοποιείται ως θετικός έλεγχος, στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και τα ειδικά φθορισμογόνα υποστρώματα για χυμοθρυψίνη-όπως, παρόμοια με θρυψίνη και πεπτίδιο υδρόλυσης πεπτιδυλογλουταμυλίου-όπως υδρολυτικές ικανότητες πρωτεασώματος προστέθηκαν στη συνέχεια. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η αποτυχία να αναστέλλουν τη λειτουργία του πρωτεασώματος

in vitro

μπορούν να ανακεφαλαιωθούν στο άθικτη πρωτεασώματος βρέθηκαν στα ζωντανά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε την ουμπικιτίνη-λουσιφεράσης βιοφωταυγείς ρεπόρτερ 4XUb-FL, που αντιστέκεται διάσπαση από υδρολάσες ουβικιτίνη [26], για την επιμόλυνση κυττάρων HeLa. Χρησιμοποιώντας Ub-FL και FL επιμολυσμένα κύτταρα HeLa έχουμε παρακολουθείται δραστικότητα λουσιφεράσης μετά από έκθεση σε RAMBs σε περίοδο 6 ωρών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5

(αριστερά)

αντίθετα Bortezomib ή πρόσφατα εντοπιστεί RA1 αναστολέα πρωτεασώματος μας [14], εδώ χρησιμοποιούνται ως αναστολείς πρωτεασώματος θετικοί μάρτυρες, RAMB1 ή RAMB4 θεραπεία προκάλεσε μια ασθενέστερη σταθεροποίηση του ρεπόρτερ Ub-FL όταν δοκιμάστηκε σε συγκέντρωση έως 20 μΜ από ό, τι φαίνεται είτε για RA-1 ή Μπορτέζομιμπ. Ποσοτικοποίηση της αναλογίας Ub-FL /FL σε ψευδο έναντι RAMBs εκτεθεί καλλιέργειας παρέχεται στο Σχήμα 5 (

μεσαίο

πίνακας). Στη συνέχεια, η έλλειψη αναστολής της δραστηριότητας του πρωτεασώματος 20S σε κύτταρα RAMB επεξεργασμένο επιβεβαιώθηκε μετρώντας την υπολειμματική δραστηριότητα σε φθορογονικό 20S πρωτεασώματος καθαρίζεται από CaSki καρκίνο του τραχήλου κύτταρα προ-εκτέθηκαν σε RAMB1 ή RAMB4 για 4 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5 (

δεξί πάνελ

), σε αντίθεση με Bortezomib, θεραπεία RAMB1 απέτυχε να αναστείλει την δραστικότητα του χυμοτρυπτική πρωτεασώματα όταν δοκιμάζονται σε συγκεντρώσεις έως και 20 μΜ. Στο σύνολό τους, το γεγονός αυτό δείχνει ότι η απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση RAMBs συμβαίνει ταυτόχρονα με τη συσσώρευση των πρωτεϊνών polyubiquitated χωρίς την άμεση αναστολή της δραστηριότητας του πρωτεασώματος 20S

Αριστερός πίνακας:.

η δραστικότητα λουσιφεράσης σε κυτταρολύματα Ub-FL ή FL-φορέα επιμολυσμένων κυττάρων είτε με είτε χωρίς επεξεργασία με RAMB ενώσεις ή Bortezomib προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε σχετικές μονάδες φωταύγειας (RLU) και εκφράζεται ως% του ελέγχου. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι η τυπική απόκλιση (SD) για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Μέση πίνακα:

Ποσοτικοποίηση του λόγου Ub-FL /FL.

Δεξιό πλαίσιο:

φωταύγεια δραστηριότητα σε προϊόντα λύσης κυττάρων που προέρχονται από CaSki τραχήλου καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς RAMB ή θεραπεία Botezomib ποσοτικοποιείται σε σχετικές μονάδες φωταύγειας (RLUs). *, P & lt? 0,05, **, Ρ & lt?. 0.02

Η

θεραπεία RAMB1 προκαλεί το σχηματισμό aggresome και προκαλεί αντιδράσεις θερμικού σοκ

Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι η αναστολή της ουβικιτίνης μεσολάβηση αποικοδόμηση πρωτεΐνης μέσω της αναστολής του πρωτεασώματος προκαλεί θερμικό σοκ και ξεδιπλωμένη αποκρίσεις πρωτεΐνη συμπεριλαμβανομένης σχηματισμό κυτταροπροστατευτικών δομές που ονομάζονται aggresomes ως μηχανισμός για την αντιστάθμιση για την αναστολή των λειτουργιών του πρωτεασώματος και την αύξηση των επιπέδων της UPS στρες εντός των καρκινικών κυττάρων [4], [6], [39] . Για να ελεγχθεί αν η ταχεία συσσώρευση πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνη κατά την κατεργασία RAMB1 συμβαίνει ταυτόχρονα με αποκρίσεις πρωτεΐνη θερμικού σοκ (UPR) που παρακολουθούνται τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Hsp90 σε HeLa καρκίνου του τραχήλου κύτταρα που εκτίθενται σε 10 μΜ RAMB1-3 για 8 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α (

αριστερό πλαίσιο

) ανάλυση ανοσοστυπώματος των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης Hsp90 αποκάλυψε ότι μια ισχυρή μοτίβο συσσώρευσης Hsp90 σε RAMB1 αγωγή έναντι κυτταρικές καλλιέργειες HeLa ψευδο-αγωγή (παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με το άλλο παράγωγο της σειράς, που δεν φαίνεται). Μια ημι ποσοτική ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης Hsp90 δείχνουν ότι οι GAPDH-κανονικοποιημένα επίπεδα polyubiquitinated πρωτεΐνες είναι σχεδόν 2-φορές υψηλότερη σε αγωγή έναντι μη κατεργασμένων κυττάρων φαίνεται στο Σχήμα 6Α (

δεξί πάνελ

).

Α.

Αριστερό πλαίσιο:

ανοσοστυπώματος ανάλυση των επιπέδων έκφρασης Hsp90 σε HeLa κύτταρα καρκίνου του τραχήλου μετά από 8 ώρες έκθεσης, με ή χωρίς 10 μΜ RAMBs θεραπεία. Βορτεζομίμπη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Ίση φόρτωση πρωτείνης σε κάθε λωρίδα επαληθεύτηκε με τη χρήση ενός αντισώματος κατά της GAPDH.

δεξί πίνακα:

Ποσοτικοποίηση του λόγου Hsp90 /GAPDH. κύτταρα Β HeLa επωάστηκαν με ή χωρίς 5 μΜ RAMB1 ή 10 ηΜ Bortezomib για 18 ώρες πριν από την καθήλωση και ανοσο-φθορισμού χρώση του DNA (μπλε), ουβικιτίνης (πράσινο) και βιμεντίνης (κόκκινο) πριν από την απεικόνιση (60 ×).

Στη συνέχεια, υποθέσαμε ότι η συσσώρευση των πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες μετά την ένωση της έκθεσης RAMB θα οδηγούσε σε ενεργοποίηση εναλλακτικών οδών αντισταθμιστικών στην υποβάθμιση πρωτεΐνη ουμπικουϊτίνη μεσολάβηση, ειδικά για την ενεργοποίηση λυσοσωμικής οδού. Για να εξεταστεί αυτή η υπόθεση θα παρακολουθείται η υπο-κυτταρική εντόπιση της ουβικιτίνης με ανάλυση μικροσκοπία ανοσοφθορισμού σε HeLa καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κύτταρα που εκτίθενται σε 10 μΜ RAMB1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β ανάλυση ανοσοφθορισμού πολυ-ουμπικιτινομένων πρωτεϊνών σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με RAMB1 αποκαλύπτει την παρουσία βιμεντίνης-κλουβί, ubiquitin-θετικών, aggresomes δομή σύμφωνη με εκείνη που περιγράφηκε προηγουμένως κατά την επεξεργασία με Μπορτέζομιμπ [6]. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι σε κύτταρα κατεργασμένα με RAMB1 η συσσώρευση των πολυ-ουμπικιτινομένων αποτελέσματα σε παρόμοιες κυτταροπροστατευτική αποκρίσεις ως αναστολή του πρωτεασώματος καταλυτικές δραστηριότητες από Bortezomib, αλλά συμβαίνει μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου από αυτό.

οδηγεί θεραπεία RAMB1 για σταθεροποίηση p53, κυκλίνη D1 αποσταθεροποίηση και έναρξη της απόπτωσης

Η ογκοπρωτεΐνη Ε6 του HPV εξασκεί την ογκογόνο δράση του με τη στόχευση ρ53 και άλλες πρωτεΐνες καταστολής όγκου για την ταχεία ουβικιτίνη μεσολαβεί αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Αυτό μειώνει το επίπεδο αυτής της βασικής ρυθμιστικής κυτταρική κυτταρικού κύκλου, χωρίς μετάλλαξη του p53. Για να ελεγχθεί κατά πόσο η απομείωση ουβικιτίνη μεσολαβεί πρωτεΐνη αποικοδόμηση μετά από θεραπεία RAMBs οδηγεί σε σταθεροποίηση της ρ53 ως ένα εν δυνάμει συμβολή μηχανισμός κινήσεως κυτταρικό θάνατο, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του p53 επόμενες 6 ώρες, έκθεση σε ενώσεις 10 μΜ RAMBs. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η έκθεση 8 ώρα RAMB1 σχετίζεται με δοσοεξαρτώμενη συσσώρευση της ρ53 σε καρκίνο του τραχήλου CaSki κύτταρα σε σύγκριση με εικονικές ελέγχου. Είναι σημαντικό ότι, η σταθεροποίηση της ρ53 προκαλεί καταστολή της κυκλίνης D1 υποκινητή με αποτέλεσμα την δραστική καταστολή της κυκλίνης D1 μεταγραφής [40]. Για να ελεγχθεί αν αυτό έχει ως αποτέλεσμα μείωση των επιπέδων έκφρασης κυκλίνης D1, CaSki καρκίνο του τραχήλου κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις RAMB1 επί μία περίοδο μέχρι 8 ωρών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β

(αριστερό πάνελ)

θεραπεία RAMB1 προκαλεί εξαρτώμενη από το χρόνο (

κορυφή

) και δοσοεξαρτώμενη (

κάτω

) μείωση της κυκλίνης D1 επιπέδων υποδηλώνει αποτυχία του καρκίνου του τραχήλου να εισέλθουν στο S- φάση του κυτταρικού κύκλου ως αιτία της κυτταρικής τοξικότητας [41]. Μια ημι ποσοτική ανάλυση της β-ακτίνης-κανονικοποιημένα επίπεδα κυκλίνης D1 δίνεται στο Σχήμα 7Β (

δεξί πάνελ κορυφής και πυθμένα

).

A. ανάλυση ανοσοκηλίδας του επιπέδου έκφρασης p53 σε κύτταρα CaSki αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του RAMB1 σε μια περίοδο 8 ωρών. Ίση φόρτωση κάθε λωρίδα επαληθεύτηκε από αμιδικούς μαύρη βαφή. Β

Top αριστερό πίνακα:

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση του επιπέδου έκφρασης της κυκλίνης D1 σε κύτταρα CaSki με ή χωρίς 10 μΜ RAMB1 για χρονικό διάστημα έως και 8 ώρες. Πρωτεΐνη φόρτωση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον β-ακτίνης.

Top δεξί πλαίσιο:

Ποσοτικοποίηση του λόγου κυκλίνης D1 /β-ακτίνης.

Κάτω αριστερά πίνακας:

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση του επιπέδου έκφρασης της κυκλίνης D1 σε κύτταρα CaSki με ή χωρίς RAMB1, στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση για μία περίοδο 8 ωρών. Ίση φόρτωση πρωτείνης σε κάθε λωρίδα επαληθεύτηκε με τη χρήση ενός αντισώματος κατά της β-ακτίνης.

Κάτω δεξιά πίνακας:

Ποσοτικοποίηση του λόγου κυκλίνης D1 /β-ακτίνης. Γ

Αριστερό πάνελ

. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ του RAMB1 για 8 ώρες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση για δέσμευση αννεξίνης V και ενσωμάτωση 7-AAD.

Μέση πάνελ

: Ανάλυση ανοσοστυπώματος του πλήρους μήκους και διασπασμένη PARP σε κύτταρα HeLa επεξεργασία 10 μΜ RAMBs σε μια περίοδο 8 ωρών. Πρωτεΐνη φόρτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον β-ακτίνης.

δεξί πάνελ

:. Ποσοτικοποίηση της διασπασμένης αναλογία PARP /β-ακτίνης

Η

Για να ελέγξετε αν αυτό οδηγεί σε μείωση των επιπέδων έκφρασης της κυκλίνης D1, CaSki του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις της RAMB1 για μια περίοδο έως και 8 ώρες. Μια ημι ποσοτική ανάλυση της β-ακτίνης κανονικοποιήθηκε κυκλίνης D1 επίπεδα δίνεται στο Σχήμα 7Β (

δεξί πάνελ κορυφής και πυθμένα

). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β

(αριστερό πάνελ)

θεραπεία RAMB1 προκαλεί ταχύτατη (

κορυφή

) και δοσοεξαρτώμενη (

κάτω

) μείωση της κυκλίνης D1 επιπέδων υποδηλώνει αποτυχία του του καρκίνου του τραχήλου να εισέλθουν στην S-φάση του κυτταρικού κύκλου μπορεί να συμβάλει στην απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων [41].

Σταθεροποίηση της ρ53 επίπεδα σταθερής κατάστασης και αποσταθεροποίηση της κυκλίνης D1 επίπεδα υποδηλώνουν ότι η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων παρατηρείται στον πίνακα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων μετά από έκθεση RAMBs μπορεί να προκαλέσει την εμφάνιση της απόπτωσης. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, ο καρκίνος του τραχήλου HeLa κύτταρα εκτέθηκαν σε 5 μΜ RAMB1 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση για δέσμευση αννεξίνης V και ενσωμάτωση 7-AAD. Αννεξίνη V και χρώση 7-AAD επιτρέπει να διακρίνει βιώσιμα (αννεξίνη V

αρν /7-AAD

αρνητικά), αποπτωτικών (αννεξίνη V

pos /7-AAD

αρνητικά), και τα νεκρά (αννεξίνη V

pos /7-AAD

POS) κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7C (

αριστερό πλαίσιο

), 24 hr έκθεση σε RAMB1 προκάλεσε μια αύξηση τόσο στην πρώιμη (Αννεξίνη V θετική πληθυσμού) και αργά (αννεξίνη V και 7-AAD διπλά θετικά πληθυσμού) και αποπτωτικών πληθυσμός σε επεξεργασμένες καλλιέργειες έναντι των ελέγχων. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτό οφείλεται σε ενεργοποίηση της κασπάσης, μετρήσαμε τα επίπεδα διάσπασης PARP σε καρκινικά κύτταρα HeLa μετά από έκθεση σε RAMB1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7C (

μεσαίο πλαίσιο

), τα υψηλότερα επίπεδα της διασπασμένης ΡΑΚΡ είναι εμφανή στην αγωγή έναντι μη επεξεργασμένες καλλιέργειες υποδεικνύοντας κασπάσης-3 ενεργοποίησης. Ποσοτικοποίηση της διασπασμένη PARP /GAPDH παρέχεται στο Σχήμα 7C (

δεξί πάνελ

). Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση μας ότι RAMBs θεραπεία προκαλεί απόπτωση σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

θεραπεία RAMB1 αποτρέπει τον σχηματισμό όγκων-αποικίας εξαρτάται από την αγκύρωση του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων και συνεργεί με τον αναστολέα λυσοσώματα χλωροκίνη

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα