Abstract

Neuropilins, αρχικά χαρακτηρίστηκε ως νευρωνικούς υποδοχείς, ενεργούν ως συν-υποδοχείς για σχετίζονται με τον καρκίνο αυξητικούς παράγοντες και συμμετείχαν πρόσφατα σε αρκετές οδούς σηματοδοτήσεως που οδηγούν στην κυτταροσκελετική οργάνωση, την αγγειογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου. Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να διερευνηθεί η ικανότητα του νευροπιλίνη-2 για να ενορχηστρώσει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ειδικά siRNA με στόχο την έκφραση νευροπιλίνη-2, είτε με μεταφορά γονιδίων, που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά ότι η έκφραση νευροπιλίνη-2 προικίζει ΗΤ29 και Colo320 για το σχηματισμό ξενομόσχευμα. Επιπλέον, νευροπιλίνη-2 παρείχε ινοβλαστική σχήμα που μοιάζει σε καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας εμπλοκή νευροπιλίνη-2 σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης. Πράγματι, η παρουσία του νευροπιλίνη-2 σε ορθοκολικό κυτταρικές σειρές καρκινώματος συσχετίστηκε με απώλεια των επιθηλιακών δεικτών όπως κυτοκερατίνη-20 και Ε-καδερίνης και με την απόκτηση μορίων μεσεγχυματικών όπως βιμεντίνη. Επιπλέον, δείξαμε με πειράματα συντονισμού πλασμονίου επιφανείας που νευροπιλίνη-2 είναι ένας υποδοχέας για το μετασχηματισμό-αυξητικού παράγοντα-β1. Η έκφραση του νευροπιλίνη-2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου πράγματι αποδειχθεί ότι προάγει μετασχηματισμό ανάπτυξης σηματοδότηση παράγοντα-β1, οδηγώντας σε μια συστατική φωσφορυλίωση του /3 συμπλόκου Smad2. Η θεραπεία με ειδικούς αναστολείς της κινάσης του υποδοχέα ΤΟΡβ-type1 αποκατασταθεί επίπεδα Ε-καδερίνης και ανέστειλε εν μέρει νευροπιλίνη-2-επαγόμενη έκφραση βιμεντίνη, υποδηλώνοντας ότι νευροπιλίνη-2 συνεργάζεται με ΤΘΡβ-type1 υποδοχέα για την προώθηση της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν έναν άμεσο ρόλο της NRP2 σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης και επισημάνετε ένα cross-talk μεταξύ νευροπιλίνη-2 και ΤΟΡ-β1 σηματοδότησης για την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι νευροπιλίνη-2 πληροί όλα τα κριτήρια μιας θεραπευτικό στόχο να διαταράξει πολλαπλές ογκογόνο λειτουργίες σε συμπαγείς όγκους

Παράθεση:. Grandclement C, Pallandre JR, Valmary Degano S, Viel Ε, Bouard Α, Balland J , et al. (2011) Έκφραση νευροπιλίνη-2 Προωθεί TGF-β1-διαμεσολαβούμενη Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (7): e20444. doi: 10.1371 /journal.pone.0020444

Επιμέλεια: Hang Thi Πέμ Nguyen, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Νοέμ 2010? Αποδεκτές: 3η του Μάη 2011? Δημοσιεύθηκε: 1, Ιούλ 2011

Copyright: © 2011 Grandclement et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. API Grant -CHU 2008 του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Μπεζανσόν? CG έλαβε υποτροφία από το γαλλικό «Agence nationale pour la Recherche technologique»? JRP έλαβε υποτροφία από το περιφερειακό συμβούλιο της Φρανς Κοντέ? επιχορήγηση από το «Ligue contre le καρκίνο du Doubs» υποστήριξε αυτό το έργο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Neuropilins (ΕΠΜ) είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες κινάσης μη-τυροσίνης που περιγράφεται αρχικά στο νευρικό σύστημα. Νευροπιλίνη (ΕΠΜ) οικογένεια αποτελείται από δύο γονίδια, νευροπιλίνη-1 (NRP1) και νευροπιλίνη-2 (NRP2). Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος, NRP1 και NRP2 παίζουν κρίσιμο ρόλο στην νευράξονα ανάσυρσης και καθοδήγηση από δεσμευτικές κατηγορίας ΙΙΙ σεμαφορίνες [1]. Αρχικά η οποία χαρακτηρίζεται ως νευρωνικούς υποδοχείς, ΕΠΜ βρέθηκαν επίσης να εκφράζεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα και στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι παίζουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος [2].

ΕΠΜ εμφανίσει μια σύντομη ενδοκυτταροπλασματική ουρά η οποία δεν περιέχουν ένα πεδίο κινάσης. Οι αρχικές έρευνες των μοριακών οδών νευροπιλίνη-εξαρτώμενη πρότεινε ότι neuropilins δεν μπορεί να μεταδώσει απευθείας ενδοκυτταρικά σήματα. Αυτό οδήγησε στην πρόταση ότι ετερο-διμερισμού με άλλους υποδοχείς χρειάζεται να μεσολαβήσουν νευροπιλίνη-κατάντη σηματοδότησης. Ένα από αυτά τα σύμπλοκα συν-υποδοχέα που περιγράφηκαν μέχρι τώρα περιλαμβάνει αγγειακό ενδοθηλιακό υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (VEGFR) [3], [4], [5]. Εκτός από την ενίσχυση του VEGFR σηματοδότησης, ΕΠΜ μπορεί να αλληλεπιδρά με πλεξίνες να μεσολαβεί τάξη μεταγωγής σήματος 3 σημαφορίνης μέσω Rho-συναφείς πρωτεΐνες G, διαμορφώνοντας οργάνωση του κυτταροσκελετού [6].

Πάντως, ένα άκρως συντηρημένη αλληλουχία αμινοξέων προώθηση ΕΠΜ ενδοκυτταρική σύνδεση με την περιοχή PDZ της GAIP-C άκρο αλληλεπιδρά πρωτεΐνη-1 ουρά (GIPC-1) αναφέρθηκε πρόσφατα υποδηλώνει την πιθανότητα ότι τα ΕΠΜ θα μπορούσαν να ρυθμίζουν εναλλακτικές βιολογικές λειτουργίες [7].

Οι πολλαπλές λειτουργίες του ΕΠΜ ήταν υπογράμμισε πρόσφατα από την αναγνώριση των ΕΠΜ ρόλο στην ογκογένεση. Εκτός από την παρουσία του ΕΠΜ σε σκάφη που σχετίζονται με όγκους, ΕΠΜ εκφράστηκαν από μια μεγάλη ποικιλία όγκων, προτείνοντας έναν πιθανό ρόλο αυτής της γλυκοπρωτεΐνης σε εξέλιξη του καρκίνου. Πράγματι, η έκφραση NRP2 βρέθηκε σε οστεοσάρκωμα [8], το μελάνωμα [9], καρκίνους του πνεύμονα [10], [11], οι όγκοι του εγκεφάλου [12], [13] καρκίνων του παχέος εντέρου [14], καρκίνους του παγκρέατος [15], [16 ], [17], καρκίνους του μαστού [18], μυελοειδή λευχαιμία [19], σιελογόνους αδενοκυστικό καρκίνωμα [20], τη βρεφική αιμαγγείωμα [21], νεοπλάσματα ωοθηκών [22] και καρκίνους της ουροδόχου κύστης [23]. Σε καρκίνωμα του κόλου, NRP2 προωθεί άμεσα την εξέλιξη του όγκου σε ένα κύτταρο αυτόνομο τρόπο (βλέπε ανασκόπηση έκφρασης NRP2 σε καρκινικά κύτταρα στον Πίνακα S1). Προτάθηκε ότι NRP2 ογκογόνο ιδιότητες βασίζονται σε αυξημένη φωσφορυλίωση VEGFR1 και την ενεργοποίηση της σηματοδότησης VEGFR1 /PI3K /Akt. [14] Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακές οδοί οδηγείται από NRP2 και εμπλέκονται στην ογκογένεση παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι ένα από τα σημαντικότερα μοριακών μηχανισμών που πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης για την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου. EMT χαρακτηρίζεται από μια κατανομή των κυτταρικών συνδέσμων, την απώλεια των επιθηλιακών χαρακτηριστικών και κυτταρικών πολικότητα, συμβάλλοντας στην εξέλιξη καρκίνωμα. Εκτός από το κέρδος των δεικτών μεσεγχυματικών, ΕΜΤ προικίζει καρκινικών κυττάρων για μετανάστευση, διεισδυτικότητα και τον επακόλουθο σχηματισμό μετάστασης [24]. Παρά τις πολλές μελέτες που αφορούν στο ρόλο της NRP2 στην πρόοδο του καρκίνου, καμία ουσιαστική απόδειξη καθιέρωσε μια εμπλοκή αυτού του μοριακού μονοπατιού σε ΕΜΤ.

Εδώ, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου επιμολυσμένα με NRP2 διαγονιδίου ή siRNA να ερευνήσει τη συμμετοχή NRP2 στην EMT. Αυτά τα πειράματα προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία που NRP2 προικίζει κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου για σχηματισμό αποικιών και ξένου μοσχεύματος. Επιπλέον, μια μετατροπή από επιθηλιακά να μοιάζουν με ινοβλάστες σχήμα πυροδοτήθηκε με έκφραση NRP2, καθώς και την απόκτηση βιμεντίνη και EMT ειδικούς παράγοντες μεταγραφής. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της NRP2 στη μετατροπή β1 αυξητικού παράγοντα (TGF-β1) σηματοδότησης που πιστεύεται να συμβάλει στην καρκίνωμα τελικού σταδίου επάγοντας EMT. Δείξαμε ότι NRP2 προωθεί μια συστατική Smad2 /3 φωσφορυλίωση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, ειδικές siRNA που στοχεύει NRP2 ή θεραπεία με φαρμακολογικές αναστολείς της ΤΟΡβ-1 τύπου 1 υποδοχέα (TGFβRI) απέτρεψε /3 φωσφορυλίωση Smad2 και το NRP2 μεσολάβηση ΕΜΤ ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι NRP2 συνεργάζεται με TGFβRI για την προώθηση της EMT σε ορθοκολικό καρκίνωμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ΗΤ29, Colo320, SW620, MCF7 , Caki, Α498, ΗΕΚ293 αγοράστηκαν από την American Type Cell Culture Collection και καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 ή DMEM (Lonza, Παρίσι, Γαλλία) συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο ενδοτοξίνη ελεύθερο ορού εμβρύου μόσχου (FCS), (Invitrogen, Cergy-Pontoise , Γαλλία). BES-PAC01, BES-PAC03, BES-PAC04 και Bes-PAC05 κυτταρικές σειρές (παγκρέατος αδενο-καρκίνωμα) αρχικά απομονώθηκε από ασκητικά υγρά που προέρχονται από τέσσερις ασθενείς με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, το πανεπιστήμιο μας νοσοκομείο. κυτταρική σειρά R3III παρασχέθηκε ευγενώς από τον Nathalie Labarriere, Inserm (Νάντη, Γαλλία). κυτταρικές σειρές Jijoye και Raji (Human Burkitt λέμφωμα) παρασχέθηκαν από Diaclone (Besançon, Γαλλία). Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας προφίλ DNA (σύντομη ανάλυση διαδοχικές επαναλήψεις), σύμφωνα με τις συστάσεις ATCC (βλέπε Πίνακα 1). ανάλυση Short διαδοχική επανάληψη (STR) είναι μια μέθοδος μοριακής βιολογίας συνιστάται για την ταυτοποίηση κυτταρικής γραμμής. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ο γονότυπος πριν από την κατάψυξη και κάθε δύο μήνες. ανάλυση STR διεξήχθη με το AmpFISTR Identifiler Ενίσχυση PCR Kit (Applied Biosystems). Ύψος συγκεκριμένες θέσεις συμπεριλαμβανομένων διαδοχικές επαναλήψεις στο DNA από κυτταρικές σειρές καρκίνου αναλύθηκαν. ανάλυση STR μετρά τον ακριβή αριθμό των επαναλαμβανόμενων μονάδων για κάθε αλληλόμορφο (D7S820 8,20 σημαίνει ότι οι 8 και 20 επαναλήψεις που προσδιορίζονται σε κάθε αλληλόμορφο του τόπου D7S820 για την κυτταρική γραμμή Jijoye). Εάν εμφανιστεί μια παραλλαγή που περιέχει μια μερική επανάληψη, ότι η μερική μονάδα επανάληψης ορίζεται από ένα δεκαδικό ακολουθούμενη από τον αριθμό των βάσεων στη μερική επανάληψη.

Η

πλασμίδια έκφρασης pcDNA

Η επιρροή του NRP2 στην εξέλιξη των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου αξιολογήθηκε με μεταφορά γονιδίων NRP2 στην ΗΤ29 κυτταρική γραμμή. Εμείς παράγεται ΗΤ29

κυτταρικές σειρές NRP2 χρησιμοποιώντας δύο πλασμίδια έκφρασης που κωδικοποιούν hNRP2 (pcDNA3.1-NRP2, ευγενώς από τον Μ Klagsbrun) και pCMV6-XL5-NRP2 (αγοράστηκε από ΟηΟεηε (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα ελέγχου ΗΤ29 παρήχθησαν χρησιμοποιώντας pcDNA3.1 ή pCMV6-XL5 φορείς. 1.5 × 10

6 ΗΤ29 κύτταρα σπάρθηκαν σε 60 mm

3 φιάλη σε 4 mL μέσου και επωάστηκαν για 24 ώρες. στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με 1 μα pcDNA3.1-NRP2 ή pCMV6-XL5-NRP2 φορείς έκφρασης ή φορείς ελέγχου χρησιμοποιώντας το κιτ Effectene (Qiagen, Courtaboeuf, Γαλλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα μετεμβολιασμένα με φορείς pcDNA3.1 επιλέχθηκαν με 0,8 mg /mL του γενετικίνη (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Γαλλία), 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

Χρησιμοποιώντας το εργαλείο σχεδιασμού ιστοσελίδων Ambion siRNA, εντοπίσαμε ένα δυναμικό NRP2-ειδικής αλληλουχίας στόχου. Ειδικά NRP2 siRNA (αίσθηση 5′-ΑΑΑ GGC ΤΟΟ ΑΑΟ TCA GCA CTA ΑΤΤ Τ-3 ‘και αντι-νόημα 5′-ΑΑΑ ΑΑΤ TAG TGC TGA CTT CCA GCT Τ-3′) και αγωνίζομαι siRNA (αίσθηση 5’-AAAGGAGGGGCATGCCACGTTGG- ) ακολουθίες 3 ‘και αντι-νόημα 5′-AAAACCAACGTGGCATGCCCCTC-3’ ανοπτήθηκαν και κλωνοποιείται στη θέση BbsI του 3 ‘LTR του φορέα /U6 pFIV-H1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA). Οι αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση BLAST ΝΙΗ να μην έχουν ουσιαστική ομολογία προς αλληλουχίες σε άλλες σπονδυλωτών γονίδια. Λεντοϊών υπερκείμενο παραγωγή και επακόλουθη μόλυνση των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA). Colo320 σταθερώς επιμολυσμένα επελέγησαν με 3 μg /mL πουρομυκίνης (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Γαλλία), 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Η κυτταρομετρία ροής

Anti-NRP2, αντι-NRP1, αντι-pSmad2 /3, αντι-ΤGFβ1, αντι-TGFβR1 ήταν από τη Santa Cruz Biotechnology-(Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Αντι-Smad2 /3 και αντι-TGFRII, ήταν από το σύστημα RD (Λιλ, Γαλλία). Alexafluor488-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από Fluoprobes (Interchim, Montluçon, France). Δέκα χιλιάδες κύτταρα από κάθε δείγμα αξιολογήθηκαν για ανίχνευση φθορισμού χρησιμοποιώντας BD FACSCanto κυτταρόμετρο. (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Γαλλία) Για ενδοκυτταρική χρώση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 20 λεπτά στους 4 ° C σε 2% παραφορμαλδεΰδη. Η χρώση στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 0.4% σαπωνίνη και 5% FCS. Ρυθμιστικό έκπλυσης περιείχε 0.1% σαπωνίνη, 5% FCS. Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, Σχετική ένταση φθορισμού (RFI) υπολογίσθηκε.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων in vitro αναλύθηκε με άλατος τετραζολίου 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2- υλ) -2,5 διφαινυλτετραζολίου (ΜΤΤ). Εν συντομία, 4000 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 96 φρεατίων μικρο-πλάκες που περιέχουν 100 μL μέσου ανά φρεάτιο. Για την ανάλυση, 10 μΙ υποστρώματος ΜΤΤ (από ένα απόθεμα διαλύματος 5 mg /ml σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και οι πλάκες αφέθηκαν να πρότυπες συνθήκες επώασης ιστού για επιπλέον 2 ώρες. Τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν σε 200 μL διμεθυλοσουλφοξείδιο, και χρωματομετρικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν (μήκος κύματος, 570 nm). Οι πλάκες αναλύθηκαν κάθε 24 ώρες για τις επόμενες 3 διαδοχικές ημέρες.

ELISA δοκιμασία

Τα κύτταρα επωάστηκαν σε RPMI ή DMEM-1% FCS για 24 ώρες. Στη συνέχεια τα κύτταρα μετρήθηκαν και 10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 96 μικροπλάκα σε 200 μL DMEM-0,1% FCS για 24 ώρες. παραγωγή VEGF αξιολογήθηκε σε υπερκείμενα χρησιμοποιώντας ανθρώπινα κιτ VEGF Elisa (Strathmann Biotec, Hamburg, Germany).

Ανάλυση Κυτταρομετρίας Ροής του DNA

περιεχομένου

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν με παγωμένο PBS , μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη. Πριν από την ανάλυση του DNA, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich, Lyon, France) και 2 μg /mL άνευ ϋΝάσης RNase (Sigma-Aldrich, Λυών, Γαλλία) επί 15 λεπτά στους 37 ° C σε το σκοτάδι. περιεκτικότητα DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Γαλλία) και αναλύθηκαν με το πρόγραμμα CellQuest.

Ξενομοσχεύματος πειράματα

Γυμνοί ποντικοί ελήφθησαν από Janvier (Le Genest St Isle, Γαλλία), και διατηρήθηκε στην εγκατάσταση των ζώων μας, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Animal Experimental Επιτροπή Δεοντολογίας. 1 × 10

6 κύτταρα ΗΤ29

Ctrl, ΗΤ29

NRP2, Colo320

si-RNA-NRP2 και Colo320

siRNA-ctrl κυτταρικές σειρές επαναιωρείται σε 100 μL PBS εμβολιάστηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε δύο φορές την εβδομάδα σε κάθε ομάδα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο

V

= 1/2

μια

×

β

2, όπου

μια

είναι το μεγαλύτερο όγκο άξονα, και

β

είναι η συντομότερη άξονα όγκου. Όταν οι όγκοι έφθασαν 1 cm σε διάμετρο, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη για επακόλουθη ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Επίδραση της έκφρασης NRP2 στον σχηματισμό αποικιών in vitro αξιολογήθηκε με μαλακό δοκιμασία αποικίας σχηματισμό άγαρ. 5000 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 500 μΐ μέσου 2% αγαρόζης σε ένα 24-φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO2 και οι φωτογραφίες ελήφθησαν μετά 10 ημέρες καλλιέργειας.

δοκιμασία Invasion

Εισβολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας 96W QCM Δοκιμασία Invasion (Millipore, USA). Εν συντομία, ίσος αριθμός (100000) των κυττάρων ελέγχου (ΗΤ29

Ctrl) ή NRP2 κύτταρα που εκφράζουν (ΗΤ29

NRP2) επαναιωρείται σε μέσο ελεύθερο ορού τοποθετήθηκαν στο επάνω διαμέρισμα ενός προτύπου 8 μΜ πόρων Boyden θάλαμο. φρεάτια δίσκο του τροφοδότη περιείχε μέσο χωρίς ορό ή μέσον 10% FCS. Μετά 16 ώρας εισβολή (37 ° C, 5% CO2), επεμβατική κύτταρα επωάστηκαν με ρυθμιστικό κύτταρο απόσπαση, λύθηκαν και σημειώνονται με CyQuant GR βαφής. (Δοκιμασία 96W QCM, Millipore, International). Ο φθορισμός στη συνέχεια αξιολογήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού (Cell Lab Quanta, Beckman-Coulter) χρησιμοποιώντας ένα σετ φίλτρων 480 έως 520 nm.

κύτταρα θεραπείες

σηματοδότηση ΤΟΡ-β1 ανεστάλη χρησιμοποιώντας SD- 208 ή SB-431542 (αναστολέας κινάσης TGFRI) αραιώνεται σε DMSO (Sigma-Aldrich, Lyon, France). DMSO χρησίμευσε ως μέσο αναφοράς σε όλα τα πειράματα. Σε ορισμένα πειράματα Avastin (φαρμακείο του CHU Jean Minjoz, Μπεζανσόν, Γαλλία) χρησιμοποιήθηκε για την αναστολή του VEGF-A. ΤΟΡ-β1 αγοράστηκε από την RD System (Lille, France).

Western Blot ανάλυση

Εν συντομία, μετά από δύο στάδια έκπλυσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης containing1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM βαναδικό και ένα πλήρες Mini δισκίο κοκτέηλ αναστολέα πρωτεάσης (πλήρης μίνι ελεύθερο από EDTA, ανά 10 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, Roche, France). 30 μg των προϊόντων λύσης πλήρων κυττάρων διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου-duodecyl νάτριο και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου με ηλεκτροστύπωση. Οι κηλίδες στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για 1 ώρα σε 5% γάλα πριν από την επώαση με ειδικά αντισώματα ως εξής: αντι-NRP2 και αντι-twist1 (Santa Cruz Biotechnology, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), αντι-Smad2 /3 (R &? D System, Lille, France), αντι-βιμεντίνη, αντι-Ecadherin, αντι-ΤGFβ1, αντι-Smad2 /3, αντι-pSmad2, αντι-σαλιγκάρι (όλα από την Cell Signaling Technology, Danvers, USA). Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν σε Trisbuffered φυσιολογικό ορό και 0.1% (ν /ν) Tween-20 που περιέχει σκόνη γάλακτος. Κηλιδωμένη πρωτεΐνες ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά σε ένα σύστημα απεικόνισης βιοφωταύγεια και ΒΙΟ-1D προηγμένο λογισμικό (Wilber-Lourmat, Marne-la-Vallée, Γαλλία), μετά από επώαση κηλίδες με χρένο peroxidaseconjugated κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα (Beckman Coulter, Παρίσι). Για ορισμένα πειράματα, κυτταρόπλασμα και πυρηνική υποκυτταρικά κλάσματα συλλέχθηκαν μετά από διαφορική φυγοκέντρηση σε προσαρμοσμένα ρυθμιστικά? η παρουσία ή απουσία του υποκυτταρικού συγκεκριμένων πρωτεϊνών (όπως β-ακτίνη ή ιστόνης Η1) πιστοποιείται υποκυτταρικά διαχωρισμού.

συνανοσοκαθίζησης ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε PBS που περιέχει 200 ​​mM τρις- HCl ρΗ 7,4, 100 mM NaCl, 1% ν /ν tritonX100, 1 mM DTT, 15 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM βαναδικό και ένα πλήρες Mini δισκίο κοκτέηλ αναστολέα πρωτεάσης (Complete Mini ελεύθερο από EDTA, ανά 10 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης , Roche, Γαλλία). Rabbit anti-TGFRI πολυκλωνικά αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology-) και IgG Κουνελιού πολύκλωνα αντισώματα προστέθηκαν στα προϊόντα λύσης σε μια τελική αραίωση 1/100 και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Protein-G μαγνητικά σφαιρίδια (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Γαλλία) προστέθηκαν στο μίγμα και επωάστηκαν για δύο επιπλέον ώρες στους 4 ° C. Οι πρωτεΐνες μετά εκλούστηκαν με μαγνητικό διαχωρισμό και μετουσιώθηκαν. Western Blot-στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-NRP2 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany).

Ιστοπαθολογική Ανάλυση και ανοσοϊστοχημική χρώση των ιστών

Δείγματα ιστών, που λαμβάνεται από ξενομοσχεύματα μονιμοποιήθηκαν σε 4 % φορμόλης και τομές παραφίνης. Στη συνέχεια, μπλοκ κόπηκαν σειριακά σε πάχος 4 μm. HES χρώση (Αιματοξυλίνη Eosine Safran) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της μορφολογίας. Ένα πρότυπο ανοσοϊστοχημική τεχνική διεξήχθη χρησιμοποιώντας Ventana BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) ανοσοκηλιδωτή με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι Ε-καδερίνης (Zymed, San Francisco-, USA), αντι-κυτοκερατίνης-20 ( Zymed, San-Francisco, USA).

επιφανειακών πλασμονίων ανάλυση

Σχεδιασμός και κατασκευή σπιτικές μάρκες συμβατές με SPR (συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων) έχουν διεξαχθεί όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί με τη βοήθεια του MIMENTO τεχνολογική πλατφόρμα, Μπεζανσόν, Γαλλία [25]. Οι μάρκες NRP2 κατασκευάζονται σε αυτή τη μελέτη συνίστανται στην ομοιοπολική μεταμόσχευση Fc-NRP2 οντότητες χημικώς ενεργοποιημένου αυτο συναρμολογούνται μονοστοιβάδα ακολουθώντας τη διαδικασία του κτιρίου chip πρωτεΐνης που δημοσιεύθηκε πρόσφατα [26]. Fc-NRP2 ήταν από RD Συστήματος (Λιλ, Γαλλία). Αυτή η διαδικασία οδηγεί σε μια κάλυψη 7,4 +/- 0,1 femtomole /mm

2 του NRP2. Ενέσεις BSA (έλεγχος -) είναι, VEGF (Control +) και TGFβ1 εκτελείται στα 250 nm σε PBS-Tween 0,05%, ρΗ 7,4. πειράματα Biacore πραγματοποιήθηκαν με τη συσκευή Biacore 2000 στους 25 ° C με ρυθμό ροής περιλαμβάνουν μεταξύ 2 και 30 μl /min.

Real Time-ποσοτική PCR (RT-qPCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, Courtaboeuf, Γαλλία) και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή και Moloney ιός λευχαιμίας ποντικού αντίστροφης μεταγραφάσης (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Διπλά δείγματα υποβλήθηκαν σε RT-qPCR. mRNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές που αναφέρονται παρακάτω:. NRP2 (Hs00187290_m1), Snail1 (Hs001955991_m1), ΤΟΡ-β1 (Hs00171257_m1), Gli1 (Hs00171790_m1), Twist1 (Hs00361186_m1) (Applied Biosystems)

ABL mRNA από κάθε δείγμα ποσοτικοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος των εσωτερικών RNA. έκφρασης σε σχέση mRNA υπολογίστηκε με τη μέθοδο της Delta-Delta-Ct και μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως βαθμονομητή.

προετοιμασία διαφανειών και συνεστιακή μικροσκοπία

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες θαλάμου Labteck (Sigma-Aldrich, Λυών, Γαλλία) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τα κατάλληλα αντιδραστήρια. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ100. Μετά από 20 λεπτά το κλείδωμα σε 20% ορό εμβρύου και το πλύσιμο των βοοειδών, τα κύτταρα βάφτηκαν με τα κατάλληλα αντισώματα Στοίβες από ομοεστιακό εικόνες συλλέχθηκαν με την Olympus FV1000 σάρωσης με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο. Οι κυτταρικοί πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό φθορισμού, αναλογία έντασης φθορισμού υπολογίστηκε για κάθε κατάσταση. Αναλογία έντασης φθορισμού υπολογίστηκε σε διαίρεση του πυρηνικού φθορισμού με τον φθορισμό κυτταρόπλασμα-μεμβράνη. ένταση φθορισμού των 50 κυττάρων έχει αναλυθεί σε κάθε κατάσταση.

Smad

δοκιμασία ρεπόρτερ

Έχουμε χρησιμοποιήσει τη δοκιμασία ρεπόρτερ TGF-β από SABiosciences (Qiagen, Courtaboeuf, Γαλλία) για την ποσοτικοποίηση των TGF -β-επαγόμενη SMAD2 /3 σηματοδότηση. Ποσοτικοποίηση της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Dual-Luciferase Reporter σύστημα δοκιμασίας (Promega Co, Madison, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολες οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το κιτ Lipofectamine. (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Μετά από 24 h επιμόλυνσης, μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ng /mL του ΤΟΡ-β1 για επιπλέον 24 ώρες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο λόγος μεταξύ του

λουσιφεράσης πυγολαμπίδας

δραστηριότητα και το

renilla

λουσιφεράσης δραστηριότητα (Ren /Luc) για κάθε συνθήκες. Στη συνέχεια, οι τιμές αναφέρθηκαν με τις τιμές του αρνητικού μάρτυρα.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος συν ή πλην το τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). συγκρίσεις ομάδας πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Φοιτητής

t

τεστ. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

έκφραση NRP2 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου

Πρέπει πρώτα προσπάθησε να εξετάσει την έκφραση της NRP2 γλυκοπρωτεΐνη σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ανάλυση ανοσοφθορισμού επιβεβαίωσε ότι NRP2 εκφράζεται στη μεμβράνη των διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου ανθρώπου (Σχήμα 1Α). Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC), που απομονώνεται από φυσιολογικό ανθρώπινο ομφάλιο φλέβα, χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για έκφραση NRP2. Παρατηρήσαμε έκφραση NRP2 στη μεμβράνη του 2 από 3 κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (SW620, Colo320 αλλά όχι ΗΤ29). NRP2 εκφράστηκε επίσης σε όλες τις νεφρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν (ΗΕΚ 293, Caki, R3III και Α498), σε δύο από τα τέσσερα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (BES-PAC03 και Bes-PAC04, που προέρχεται από ασκιτικό υγρό ασθενούς στο ινστιτούτο μας), σε NCIH441 πνεύμονα καρκίνος κυτταρική γραμμή και σε 5.637 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Α). MDAMB231 καρκίνο του μαστού-κυτταρική γραμμή που εκφράζεται NRP2 ενώ δεν χρώση NRP2 βρέθηκε σε Burkitt κύτταρα λεμφώματος γραμμές (Raji, Jijoye) (Εικόνα 1Α).

Α,

κυτταρομετρία ροής της έκφρασης NRP2 σε ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών.

Β,

Ανοσοϊστοχημική χρώση των NRP2 σε ανθρώπινους ιστούς του παχέος εντέρου και ιστούς του μαστού (καφέ). Φορμαλίνη σταθερού εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου με αντίσωμα αντι-ανθρώπινης NRP2. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα λήφθηκαν σε μια πρωτότυπη x1000 μεγέθυνση? NRP2 εκφράζεται στη μεμβράνη του ανθρώπινου κόλου και του μαστού καρκινώματα ενώ δεν εκφράζεται σε υγιείς ιστούς.

Η

μελέτες ανοσοϊστοχημείας συνέχεια για να προσδιοριστεί εάν NRP2 εκφράζεται στη μεμβράνη των διαφόρων τομές παραφίνης-ανθρώπου δείγμα του καρκίνου. NRP2 εκφράστηκε στις 3 από τις 10 καρκινώματος κόλου, 5 από καρκίνωμα 15 του μαστού και 4 από 12 παγκρεατικό καρκίνωμα. Αξίζει να σημειωθεί, NRP2 δεν ανιχνεύθηκε σε καρκίνους του προστάτη (n = 10) και λέμφωμα Β κυττάρων (η = 10) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε ότι NRP2 εκφράζεται στη μεμβράνη του ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου και καρκινώματος του μαστού, ενώ δεν εκφράζεται σε μη κακοήθεις ιστούς (σχήμα 1Β). Τα αποτελέσματά μας είναι σύμφωνη με τις προηγούμενες δημοσιευμένες αναφορές. Πράγματι, σε μια πρόσφατη μελέτη, Gray et al παρατήρησαν ότι NRP2 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε μη κακοήθεις κολονικό βλεννογόνο, αλλά ήταν εμφανής σε 10 (83%) του 12 δίπλα αδενοκαρκινώματος κόλου και σε πέντε (71%) του επτά ηπατικές μεταστάσεις με χρώση IHC. Επιπλέον, σε μια άλλη μελέτη, η έκφραση NRP2 βρέθηκε σε 5 από τις 6 που χρησιμοποιούνται συνήθως παγκρεατικών κυτταρικών σειρών (83%) [15] και σε 7 από τα 11 (64%) χειρουργικά δείγματα αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος με χρώση IHC [14]. Τέλος, στον καρκίνο του μαστού, Yasuoka et al ανέφεραν Nrp2 έκφραση σε 60 από 113 διηθητικό καρκίνωμα μαστού (53,1%) [18]. Από αυτές τις διάφορες μελέτες, φαίνεται ότι NRP2 φαίνεται να είναι ειδικό πολλών ιστών όγκου, ενώ δεν έκφραση αυτής της γλυκοπρωτεΐνης παρατηρείται συνήθως σε υγιείς ιστούς, επιβεβαιώνοντας ότι NRP2 είναι ένας ελκυστικός στόχος για καινοτόμες θεραπείες κατά του όγκου (βλέπε Πίνακα S1 για αναθεώρηση της έκφρασης NRP2 σε καρκίνους).

για να μελετήσουμε τον ακριβή ρόλο της NRP2 στην εξέλιξη του καρκίνου, αποφασίσαμε να δημιουργήσει κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου που εκφράζουν ή όχι NRP2, χρησιμοποιώντας γονιδιακή μεταφορά NRP2 ή NRP2 συγκεκριμένες siRNA. Ως εκ τούτου, NRP2 επιμολύνθηκε σε ΗΤ29 και ένα ειδικό siRNA χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση knockdown NRP2 σε Colo320. Η κυτταρομετρία ροής πειράματα διεξήχθησαν για να επιβεβαιωθεί η διαμόρφωση της έκφρασης NRP2 σε ΗΤ29 και Colo320 (Σχήμα 2Α). Αριθ διαμόρφωση της έκφρασης NRP1 παρατηρήθηκε σε ΗΤ29 ή Colo320 επιμολυσμένα κύτταρα. Caki-1 νεφρικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για χρώση NRP1. NRP2 παρουσία σε ΗΤ29

Ctrl, ΗΤ29

NRP2, Colo320

siRNA-Ctrl, Colo320

siRNA-NRP2 ελέγχθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 2Β).

Τα επιμολυσμένα κύτταρα αναλύθηκαν για την έκφραση NRP1 και NRP2 από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (

Α

) ή με κηλίδωση Western (

Β

). Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, Σχετική ένταση φθορισμού (RFI) υπολογίστηκε. Caki1 και HUVEC κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για NRP1 και χρώση NRP2 αντίστοιχα.

C,

πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ29 και Colo320, σύμφωνα με την έκφραση NRP2 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. 4000 κύτταρα αφέθηκαν σε καλλιέργεια κατά τη διάρκεια της 24, 48 ή 72 ώρες πριν από την ανάλυση. NRP2 έκφραση συνδέεται με μια ενισχυμένη πολλαπλασιασμό σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο τριπλών συν ή πλην το τυπικό σφάλμα (SE) ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος από τα τρία που εκτελούνται. (

**, Ρ & lt? 0,01). D,

Παρόμοια πειράματα ΜΤΤ αναπαρήχθησαν με την παρουσία bevacizumab (0,25 και 1 mg /mL, 72 ώρες). HMEC-1 μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για την βιοδραστικότητα του bevacizumab. Πράγματι, bevacizumab μειώνει σημαντικά HMEC-1 πολλαπλασιασμού ενώ καμία μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρατηρείται με ΗΤ29

NRP2 και Colo320 καρκινικά κύτταρα. Εμπειρία έγινε 3 φορές, και κάθε φορά εις τριπλούν.

E,

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου DNA των επιμολυσμένων κυττάρων καρκίνου του κόλου. NRP2 έκφραση είναι συνδεδεμένη με ένα αυξημένο αριθμό κυττάρων στην φάση S. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος από τα 3 εκφράζονται ως ο μέσος όρος των εις διπλούν προσδιορισμών (*,

P & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01, ** * P & lt?. 0.001)

η

NRP2 προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών

Πήραμε πλεονέκτημα των προηγούμενων κυτταρικών σειρών για να μελετήσει το ρόλο της NRP2 στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου in vitro και της ανάπτυξης των όγκων in vivo. Ο πολλαπλασιασμός παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. ΗΤ29

κύτταρα NRP2 έδειξε μια ανώτερη ρυθμό πολλαπλασιασμού στις 24, 48 και 72 ώρες σε σύγκριση με ΗΤ29

Ctrl (Σχήμα 2C). Αντιστρόφως, NRP2 knockdown χρησιμοποιώντας ειδικά siRNA, αρνητικά διαμορφωμένο τον πολλαπλασιασμό Colo320 κυτταρική γραμμή όγκου (Σχήμα 2C). Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι η έκφραση NRP2 ενισχύει καρκίνου του παχέος εντέρου πολλαπλασιασμού κυτταρικής γραμμής in vitro (το significativity σε κάθε χρονικό σημείο από αυτούς τους προσδιορισμούς ΜΤΤ υποδεικνύεται στον Πίνακα S2). Για να επιβεβαιώσετε την επιρροή της NRP2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, έχουμε αξιολογηθεί σε δύο επιπλέον πειράματα οι διπλασιασμό-φορές των ΗΤ29

Ctrl, ΗΤ29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl και Colo320

siRNA-NRP2 καρκίνο κύτταρα. NRP2 κύτταρα που εκφράζουν ΗΤ29

NRP2 και Colo320

siRNA-ctrl είχε χρόνο διπλασιασμού των 8 και 11 ώρες αντίστοιχα, ενώ χρόνους διπλασιασμού των NRP2 λείπει κυττάρων ΗΤ29

Ctrl και Colo320

siRNA-NRP2 ήταν 13 και 14 ώρες. Από το ΕΠΜ είναι VEGF συν-υποδοχείς, που παρακολουθείται VEGF-A παραγωγής σε ΗΤ29 και πολιτισμούς Colo320 με δοκιμή Elisa. Αυτά τα κύτταρα παράγονται χαμηλά επίπεδα VEGF-A. έκφραση NRP2 δεν επηρέασε την παραγωγή VEGF (Σχήμα S1). Επιπλέον, το bevacizumab εξουδετέρωσης mAb, είναι γνωστό ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων γραμμή HMEC-1 [27], χρησιμοποιήθηκε για την αντιμετώπιση της εν δυνάμει ρόλο της VEGFA σε NRP2 μεσολάβηση της ανάπτυξης νεοπλασματικών κυττάρων. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι VEGFA εξουδετέρωση δεν επηρέασε NRP2 μεσολάβηση ΗΤ29 ή τον πολλαπλασιασμό Colo320. (Σχήμα 2D)

Επιπλέον, NRP2 είναι ένας λειτουργικός υποδοχέας για σημαφορίνης 3F, το οποίο περιγράφεται ως ένας αναστολέας της αγγειογένεσης, την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση [28]. Δυτική πειράματα κηλίδωσης έδειξαν ότι ΗΤ29

Ctrl και ΗΤ29

NRP2 εκφράζουν το ίδιο επίπεδο σημαφορίνης 3F, ενώ δεν σημαφορίνης βρέθηκε 3F στα κύτταρα Colo320, γεγονός που υποδηλώνει ότι NRP2 μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των όγκων δεν συνεπάγεται σημαφορίνη 3F (Εικόνα S2) . Στη συνέχεια, η διανομή του περιεχομένου του πυρηνικού DNA μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής σε ΗΤ29

Ctrl, ΗΤ29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl και Colo320

siRNA-NRP2 καρκινικά κύτταρα. έκφραση NRP2 συνδέθηκε με ένα ενισχυμένο αριθμό κυττάρων στη φάση S (Σχήμα 2Ε). Ορός στέρηση σε μέσο καλλιέργειας προκάλεσε αύξηση στο κλάσμα subG1 μόνο σε αρνητικές συνθήκες NRP2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση NRP2 σε ορθοκολικό καρκίνωμα κυττάρων προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση.

NRP2 κατάλυση χρησιμοποιώντας siRNA αναστέλλει τον σχηματισμό ξενομοσχευμάτων

Ο ακριβής ρόλος του NRP2 στην εξέλιξη του καρκίνου για πρώτη φορά χαρακτηρίζεται

in vivo

. Να εξετάσει την επίδραση της έκφρασης NRP2 στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου, θα εμβολιάζονται ισάριθμους (1.10

6 κύτταρα ανά ποντίκι) της ΗΤ29

NRP2 ή ΗΤ29

Ctrl υποδορίως σε γυμνά ποντίκια. συχνότητα εμφάνισης όγκου και του όγκου αξιολογήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Οι όγκοι εμφανίστηκαν σε όλα τα ποντίκια που εμβολιάσθηκαν με ΗΤ29

Ctrl και ΗΤ29

NRP2. NRP2 ενισχύεται σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου in vivo (Σχήμα 3Α). Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα, αποφάσισε να ερευνήσει εάν NRP2 στόχευση χρησιμοποιώντας ειδικά siRNA θα μπορούσε να αναστείλει το σχηματισμό όγκων. Ενώ 1,10

6 Colo320

siRNA-Ctrl κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως σε γυμνούς επάγεται ποντικούς εμφύτευση του όγκου σε όλους τους ποντικούς, η αναστολή NRP2 χρησιμοποιώντας ειδικά siRNA εμποδίζεται Colo320 εμφύτευση σε όλα τα ζώα που υποδηλώνει έναν κρίσιμο ρόλο του NRP2 σε τα πρώτα γεγονότα που συμβάλλουν στην όγκων σχηματισμό (Εικόνα 3Β) .Η επίδραση της αναστολής NRP2 χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα siRNA για Colo320 ογκογενετικότητας επιβεβαιώθηκε

in vitro

. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Colo320 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA NRP2 ή Ctrl siRNA και καλλιεργούνται σε ένα μαλακό δοκιμασία άγαρ. NRP2 knockdown σε Colo320 μείωσε τον αριθμό των αποικιών που παρατηρήθηκαν σε μαλακό άγαρ πειράματα (Σχήμα 3C). Από ΗΤ29 δεν σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ πολιτισμούς, αποφασίσαμε να ερευνήσουμε την επίδραση της NRP2 για ΗΤ29 εισβολή και τη μετανάστευση.