Αφηρημένο

Η FOXO3 παράγοντας μεταγραφής είναι μια καλά εδραιωμένη ογκοκατασταλτικό των οποίων η δραστηριότητα, τη σταθερότητα, και τον εντοπισμό ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση και ακετυλίωση. Προηγούμενη δεδομένα από το εργαστήριο μας έδειξαν ενισχυμένο θρομβοξάνης-Α

2 σηματοδότηση συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και υπερέκφραση του θρομβοξάνης-Α

2 ισομορφή-β υποδοχέα (TPβ), αλλά όχι TPα, που προκαλείται από κακοήθη μετασχηματισμό της αθάνατα κύτταρα της ουροδόχου κύστης

in vivo

. Εδώ, περιγράφουμε έναν μηχανισμό TP μεσολάβηση ρύθμιση της δραστικότητας FOXO3 και τον εντοπισμό με φωσφορυλίωση και αποακετυλίωση σε ένα μοντέλο καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων.

In vitro

κέρδος και την απώλεια των μελετών του έργου που επιτελούν σε μη-μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές, UROsta και SV-HUC, αποκάλυψε νοκ ντάουν της έκφρασης FOXO3 από shRNA αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή, ενώ εξωγενώς υπερεκφράζουν TPβ έθεσε βασική φωσφορυλιωμένη (p ) επίπεδα FOXO3-S294. Αντιστρόφως, η υπερέκφραση του ERK-ανθεκτικό, μεταλλαγμένο FOXO3 μειωμένη αυξήσεις στην κυτταρική μετανάστευση UMUC3 και εισβολή, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προκαλούνται από ΤΡ αγωνιστή (U46619). Επιπλέον, η διέγερση των κυττάρων με UMUC3 U46619 αυξημένη έκφραση pFOXO3-S294, το οποίο θα μπορούσε να ελαττωθεί με την θεραπεία με έναν ανταγωνιστή TP (PTXA

2) ή αναστολέα της ERK (U0126). Αρχικά 46619 προκάλεσε πυρηνική συσσώρευση pFOXO3-S294? Ωστόσο, η παρατεταμένη διέγερση αυξάνεται FOXO3 κυτταροπλασματική εντόπιση. διέγερση 46619 μειώθηκε συνολικά FOXO3 μεταγραφική δραστηριότητα, αλλά σχετίζεται με αυξημένη έκφραση του στόχου προ-επιβίωσή του, μαγγανίου δισμουτάση του υπεροξειδίου. Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι ΤΡ διέγερση αύξησε την έκφραση της αποακετυλάσης ιστόνης, SIRT1, και αντιστοιχούσαν με μειωμένη ακετυλιωμένης FOXO3. Συλλογικά, τα δεδομένα υποδεικνύουν ένα ρόλο για TP σηματοδότησης στη ρύθμιση της δραστηριότητας FOXO3, διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω φωσφορυλίωσης και αποακετυλίωσης

Παράθεση:. Sobolesky μμ, Halushka PV, Garrett-Mayer Ε, Smith MT, Moussa O ( 2014) κανονισμός του FOXO3 Ογκοκατασταλτικής από την θρομβοξάνης-Α

2 υποδοχείς στον Καρκίνο ουροθηλιακά. PLoS ONE 9 (9): e107530. doi: 10.1371 /journal.pone.0107530

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 19 Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 9, Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Sobolesky et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εγκαταστάσεις απεικόνισης για την έρευνα αυτή στηρίχθηκαν, εν μέρει, από το Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης επιχορήγησης Ρ30 CA138313 στο Κέντρο Καρκίνου Hollings, MUSC. Το ερευνητικό έργο που περιγράφεται ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις RO1127905CA, UL1TR000062, και UL1RR029882 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η πέμπτη συχνότερος καρκίνος στις Ηνωμένες Πολιτείες με επιφανειακό καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (TCC) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται μορφή [1]. TCC έχει ένα υψηλό ποσοστό υποτροπής και απαιτεί δαπανηρές δια βίου συνέχειας, καθιστώντας τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης ένα από τα πιο ακριβά καρκίνους για τη θεραπεία κατά τη διάρκεια ζωής του ασθενούς [2]. Η κατανόηση των μηχανισμών ογκογόνο μετασχηματισμό των ουροφόρων κυττάρων είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό αποτελεσματικών και νέες θεραπείες για την αντιμετώπιση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Έχουμε προηγουμένως εντοπιστεί μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ θρομβοξάνης συνθάσης (TXS) έκφραση και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο για θρομβοξάνης της προσταγλανδίνης (TP) σηματοδότησης σε urothelial προόδου των όγκων [3]. TXS είναι ένα σημαντικό ένζυμο που καταλύει την μετατροπή της προσταγλανδίνης H

2 έως θρομβοξάνη Α

2 (ΤΧΑ

2). Το ΤΧΑ

2 συνδετήρα, με τη σειρά του, ενεργοποιεί τον υποδοχέα ΤΡ, προωθώντας την κυτταρική μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή, τα οποία είναι βασικά χαρακτηριστικά της κυτταρικής μεταμόρφωσης και την εξέλιξη της νόσου [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει έναν ρόλο για ΤΧΑ

2 σηματοδότηση στην ογκογένεση και κακοήθεις φαινότυποι προστάτη [8] και καρκίνων του μαστού [9], [10].

Το ανθρώπινο γονίδιο του υποδοχέα ΤΡ κωδικοποιεί δύο ισομορφές, TPα και TPβ [11]. Και οι δύο ισομορφές είναι επτά τρανς-μεμβράνη G πρωτεΐνη υποδοχείς που διαφέρουν μόνο στο C-τερματικό πεδίο [12]. Το Ο-τερματικό παραλλαγή επιτρέπει σε κάθε ισομορφή να αλληλεπιδρούν τόσο με πανομοιότυπα και μοναδική μεσολαβητές σηματοδότηση [13]. Η έκφραση των ισομορφών του υποδοχέα ΤΡ είναι ιστός και τύπο κυττάρων εξαρτώμενη. Αναφέραμε προηγουμένως TPβ υπερέκφραση σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης συνδέθηκε με μία σημαντική μείωση στην επιβίωση [14]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του TPβ, αλλά δεν TPα, ήταν επαρκής για να αυξήσει τη μετανάστευση, εισβολή και εξάπλωση, καθώς και επάγουν την κακοήθη μετασχηματισμό μιας αθανατοποιημένων μη μετασχηματισμένων urothelial κυτταρική γραμμή [14]. Ο μηχανισμός του μετασχηματισμού που προκαλείται από TPβ υπερέκφραση παραμένει άγνωστη.

Ο συντελεστής forkhead μεταγραφής box-Ο3 (FOXO3) ρυθμίζει βασικές διεργασίες κυτταρικής επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένης της αντοχής του οξειδωτικού στρες, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης μέσω της ρύθμισης των γονιδίων στόχων του π.χ. μαγγανίου δισμουτάση υπεροξειδίου (MnSOD), ρ27

Kip1, συνδέτη Fas (FasL), και ΒΙΜ [15], [16]. FOXO3 μεταγραφική δραστηριότητα μπορεί να ρυθμιστεί μέσω μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (ΡΤΜ) όπως ακετυλίωση και φωσφορυλίωση. Δυσλειτουργία του δραστηριότητα FOXO3 και εντοπισμός έχει συσχετιστεί με την έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου, καθώς και αντίσταση χημειοθεραπευτικά [17], [18], [19]. Η ακετυλίωση του FOXO3 από το ιστόνης p300 ακετυλο-τρανσφεράσης έχει συνδεθεί με μειωμένη δραστηριότητα FOXO3, αυξημένη κυτταροπλασματική εντόπιση και η υποβάθμιση του [20]. Αποακετυλίωση με NAD-εξαρτώμενες αποακετυλάσης Sirtuin-1 (SIRT1) έχει δειχθεί να ρυθμίζει διαφορικά στόχους FOXO3 προωθώντας τη μεταγραφή του p27

Kip1 και MnSOD, ενώ παράλληλα θα μειώνει τη μεταγραφή του Bim και FasL [21]. Εξωκυτταρική κινάση σήματος ρυθμίζονται 1 και 2 (ERK1 /2) έχει δειχθεί ότι φωσφορυλιώνει FOXO3 στο -S294, -S344, και -S425, και επηρεάζουν αρνητικά τη λειτουργία και τη σταθερότητα της μέσω του ποντικού διπλό λεπτά 2 (MDM2) μεσολάβηση FOXO3 αποδόμηση [ ,,,0],22]. Ενώ η διέγερση του TPβ είναι γνωστό ότι προκαλεί φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της ERK [23], [24], [25], με τις γνώσεις μας, καμία μελέτη δεν εξέτασε τις επιπτώσεις της TP σηματοδότησης για τη διαφοροποίηση FOXO3.

Εδώ, προσδιορίζονται FOXO3 ως μεταγενέστερος στόχος της οδού του υποδοχέα ΤΡ και εξέτασε τις αρνητικές επιπτώσεις της σηματοδότησης ΤΡ επί FOXO3 εντοπισμό και λειτουργία στην κύστη καρκίνου κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται UMUC3. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συνολική FOXO3 μεταγραφική δραστηριότητα μειώθηκε μετά από διέγερση αγωνιστή ΤΡ με αποτέλεσμα τη μειωμένη έκφραση ενός αποπτωτικού στόχου, ακόμη ενισχυμένη έκφραση ενός στόχου αντίσταση στην καταπόνηση. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [21], η διαφορική έκφραση των στόχων FOXO3 μετά από διέγερση αγωνιστή ΤΡ συνδέθηκε με αυξημένη έκφραση SIRT1 και αποακετυλιωμένη FOXO3. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή διαφωτίζει ένα μηχανισμό με τον οποίο TP που προκαλείται από τη διαφοροποίηση της δραστηριότητας FOXO3 μέσω μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις συμβάλλει στην κακοήθη φαινότυπο των ουροφόρων κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Η κυτταρική σειρά UROsta, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Donald Sens (Πανεπιστήμιο της Βόρειας Ντακότα, Grand Forks, ND) προήλθε από φυσιολογικά ανθρώπινα ουροθηλιακά κύτταρα και απαθανάτισε με το SV40 Τ-αντιγόνο [26]. κύτταρα UROsta διατηρήθηκαν σε ένα μίγμα 70:30 μέσου DMEM (1 g /L γλυκόζη: 4,5 g /L γλυκόζη? Mediatech, VA, USA), 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS). Το ιό πιθήκου 40-αθανατοποιημένα ανθρώπινα ουροεπιθηλιακά (SV-HUC), μη μεταμορφωμένες urothelial κυτταρική γραμμή ευγενώς από τον Dr. Santhanam Swaminathan (Πανεπιστήμιο του Wisconsin, Comprehensive Cancer κέντρο, Madison, WI) [27], [28], [29] και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Ρ12Κ Khaigns τροποποιημένο μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS, ινσουλίνη, υδροκορτιζόνη, και τρανσφερρίνη. Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κυτταρική γραμμή UMUC3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) που περιέχει 10% FBS. Κάθε μέσο περιείχε 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2

Αντισώματα, τα αντιδραστήρια και πλασμίδια

Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή:. pFOXO3-S294 , pc-Jun Ser63, c-Jun, ρΑΚΤ Ser473, pMAPK Thr202 /Tyr204, Akt, ΕΚΚ, p300, SIRT1, Bim, p27

Kip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), FOXO3, GFP (Santa Cruz), Lamin Β1 (GeneTex, Irvine, CA, USA) MnSOD (EnzoLife Επιστημών, Ann Arbor, MI, USA), α-τουμπουλίνης (Abd Serotec, Raleigh, NC, USA), GAPDH (Sigma-Aldrich, St. Louis , ΜΟ, USA). TP συγκεκριμένο αγωνιστή, 46619 αγοράστηκε από την Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). ERK1 /2 αναστολέα U0126 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. πλασμίδιο FHRE-Luc ήταν ένα δώρο από τον Michael Greenberg (Addgene πλασμίδιο # 1789, Cambridge, MA, USA). Η GFP-FOXO3

3Α (σερίνες-294, -344, -425 και αντικατασταθεί με αλανίνες) και τον έλεγχο pEGFP-C

2 πλασμίδιο ήταν δώρα από Mien-Chie Hung στο Πανεπιστήμιο του Τέξας M.D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. Το πλασμίδιο GFP-TPβ ήταν ένα δώρο από τον Jean-Luc Μητρική από το Πανεπιστήμιο Sherbrooke, Καναδάς.

ανάλυση Western blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (Thermo Fisher Scientific ), συμπληρωμένο με Πλήρη δισκία κοκτέιλ αναστολείς πρωτεάσης και ταμπλέτες κοκτέιλ Αναστολείς PhosSTOP φωσφατάση (Roche Applied Science). Οι πρωτεΐνες μετουσιώθηκαν με βρασμό σε ρυθμιστικό Laemmli (BioRad, Hercules, CA, USA) και αναλύθηκαν με 12% SDS-PAGE. Μετά τη μεταφορά πρωτεΐνης, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μπλοκαρίστηκε με 5% γάλα σε 1 χ TBST και ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε 5% BSA σε 1 χ TBST όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την επώαση πρωτογενές αντίσωμα, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε 1 χ TBST και επωάστηκαν με HRP-συνδεδεμένη δευτερεύον αντίσωμα (Cell Signaling Technology) σε 1 × TBST. Οι μεμβράνες πλύθηκαν 5 × για 5 λεπτά με 1 χ TBST και ανίχνευση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Thermo Fisher Scientific). Western κηλίδες ποσοτικά με τη χρήση Studio Image Lite Ver. 3.1 ακολουθώντας τις οδηγίες του λογισμικού και γράφημα σε GraphPad Prism 5.

Επιμολύνσεις και παραγωγή σταθερών κλώνων

Για να δημιουργηθούν σταθερές FOXO3 knockdown κλώνους, SV-HUC και UROsta κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε pRFP-C- RS πλασμίδιο ελέγχου, pRFP-C-Ομελέτα ή pRFP-c-shRNA να πλασμίδιο FOXO3 (Hush-29? ΟηΟεηε, Rockville, MD, USA) χρησιμοποιώντας FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Ενιαία κλώνοι επελέγησαν σε μέσο που περιέχει 2,5 μg /ml πουρομυκίνη (Invivogen, San Diego, CA, USA) και knockdown αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα FOXO3 (H-144? SC-11351? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , ΗΠΑ). Η επιμόλυνση του GFP-TPβ σε κύτταρα SVHUC διεξήχθη με αντιδραστήριο TurboFect επιμόλυνσης (Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιώντας μια αναλογία 1,5 μg DNA σε 4 μΐ TurboFect. κύτταρα UROsta (1 × 10

6) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροδιάτρηση με 3.5 μg GFP-TPβ χρησιμοποιώντας τη Amaxa Κυτταρική Γραμμή Nucleofector κουτί διάλυμα κιτ V (cat #: VCA-1003, Lonza, Allendale, NJ, USA) και η 2b Nucleofector συσκευή (Lonza) με την προ-προγραμματισμένο πρωτόκολλο Τ-030. Τέσσερις ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση media αναρροφήθηκε, αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ελέγχεται 24 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση. Για τη δημιουργία σταθερών GFP-FOXO3

3Α εκφράζουν UMUC3 κλώνων, τα κύτταρα σε μια πλάκα 6 φρεατίων επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο 4 μΙ X-tremeGENE ΗΡ DNA επιμόλυνσης (Roche Applied Science) και 1,5 μg πλασμιδίου DNA. Ενιαία κλώνοι επελέγησαν σε μέσο που περιέχει 500 μg /ml του Γενετικίνης επιλεκτικό αντιβιοτικό (Life Technologies, Grand Island, NY, USA).

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Το BD Falcon Cell Culture Εισαγωγή συστήματος που περιέχει τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (ΡΕΤ) μεμβράνες με 8 μm πόρους (BD Biosciences, Rockville, MD, USA) χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη δοκιμασία. Τα ένθετα προ-επικαλυμμένες όλη τη νύκτα με 5 μg /cm

2 ινωδονεκτίνη στους 4 ° C και εξισορροπημένη σε νερό για 2 ώρες στους 37 ° C πριν από την χρήση. Θρυψίνη κύτταρα συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν και 5 × 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 250 μΙ μέσου χωρίς ορό. Το άνω τμήμα του ενθέτου πληρώθηκε με το κυτταρικό εναιώρημα, ενώ 750 μΙ μέσου που περιέχει FBS προστέθηκαν στον πυθμένα του κάθε φρεάτιο 10%. κύτταρα UROsta αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 16 ώρες σε υγροποιημένο περιβάλλον στους 37 ° C με 5% CO

2. Μετά τη μετανάστευση, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης σκουπίζοντάς το με ένα υγρό βαμβάκι. Η κάτω επιφάνεια των μεμβρανών χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης Hema-3 (Fisher Scientific, Pittsburg, ΡΑ, USA). Μόλις η χρώση τελείωσε οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό για υπέρβαση αφαίρεση λεκέδων και ξηραίνεται στον αέρα όλη τη νύκτα. Ποσοστό μετανάστευση ή την εισβολή υπολογίστηκε μετρώντας και κατά μέσο όρο του αριθμού των κυττάρων εισέβαλαν σε 10 τυχαία πεδία του άποψη σε μεγέθυνση 40 φορές, διαιρούμενη με την περιοχή του πεδίου προβολής μικροσκοπίου και στη συνέχεια πολλαπλασιάζεται με την περιοχή του ενθέτου transwell. Στη συνέχεια, χωρίζουν το προηγουμένως υπολογίζεται αριθμό με τον αριθμό των κυττάρων σπάρθηκε και τέλος πολλαπλασιάζουμε με 100 για να πάρει ένα τοις εκατό. Αυτό το πείραμα διεξήχθη ανεξάρτητα τρεις φορές εις διπλούν.

τηλέφωνα εισβολή δοκιμασία

Το BD BIOCOAT Matrigel εισβολής Επιμελητήριο Cell Culture Εισαγωγή συστήματος που περιέχει 8 μm μεμβράνης ΡΕΤ (BD Biosciences) με ένα λεπτό στρώμα της MATRIGEL Υπόγειο Μεμβράνη Matrix χρησιμοποιήθηκε για αυτή τη δοκιμασία. Θρυψίνη κύτταρα συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 5 × 10

4 κύτταρα /ml σε μέσο χωρίς ορό. Η κορυφή του θαλάμου έλαβε 500 μΐ του κυτταρικού εναιωρήματος, ενώ 750 μΙ RPMI με 10% FBS προστέθηκε στο φρεάτιο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 16 ώρες σε υγροποιημένο περιβάλλον στους 37 ° C με 5% CO

2 πριν από την αφαίρεση των κυττάρων από την άνω επιφάνεια με ένα υγρό βαμβάκι. Οι μεμβράνες βάφτηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης Hema-3 (Thermo Fisher Scientific) και το ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο δοκιμασία κυτταρική μετανάστευση. Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε τρεις φορές ανεξάρτητα εις διπλούν.

Διπλή λουσιφεράσης δοκιμασία

κύτταρα UMUC3 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 0.3 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο, τότε παροδικά επιμολυσμένα εντός 24 ώρες χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης X-tremeGENE ΗΡ DNA (Roche Applied Science) με 4 μg 3 × forkhead στοιχείο απόκρισης (FHRE) κατασκεύασμα ανταποκριτή (Addgene πλασμίδιο # 1789) και 0,1 μg pBind Renilla φορέα ελέγχου λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, ΗΠΑ). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε υγροποιημένο περιβάλλον στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα στη συνέχεια πέθαναν από τη διάρκεια της νύχτας και αγωγή είτε με τον έλεγχο του οχήματος (οξικό μεθύλιο, Sigma-Aldrich) ή 1 μΜ U46619 (Cayman Chemical) για 30 ή 120 λεπτά ορό. Μετά τα κύτταρα θεραπεία πλύθηκαν δύο φορές με PBS και συλλέχθηκαν σε Reporter Lysis Buffer (Promega). Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Veritas Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA) σε 20 μΐ από κάθε δείγμα για 10 δευτερόλεπτα μετά από κάθε ένεση 50 μΙ αντιδραστηρίου δοκιμής Luciferase II έπειτα 50 μΙ Διακοπή και λάμψη. Η μέση έκφραση λουσιφεράσης Firefly ρυθμίστηκε σε συνολική έκφραση λουσιφεράσης πρωτεΐνης και τον έλεγχο των φορέων της Renilla, και στη συνέχεια κανονικοποιούνται προς έλεγχο του οχήματος. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ποσοστό δραστηριότητας των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που διεξάγονται εις διπλούν, Φοιτητής

t-test

(*) P & lt?.

Πυρηνική /κυτταροπλασματική κύτταρο κλασματοποίηση

UMUC3 κύτταρα 0,05 στερήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας στον ορό, στη συνέχεια προκατεργασία με 1 μΜ ινδομεθακίνη (Cayman Chemicals) για 10 λεπτά ώστε να μειωθεί η ενδογενής

2 σηματοδότηση ΤΧΑ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 1 μΜ U46619 για 5, 30, ή 120 λεπτά. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκε και πλύθηκε δύο φορές με PBS. Η κλασμάτωση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Pierce NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδα Western.

Ανοσοκαταβύθιση

Ανοσοκαθίζηση FOXO3 από UMUC3 κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας το NHS-συνδεδεμένη κιτ IP /Co-ΠΕ (Thermo Fisher Scientific) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα UMUC3 αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή σε πλάκες 10 cm, και στη συνέχεια τοποθετούνται σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες σε υγροποιημένο περιβάλλον στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο ελέγχου (οξικό μεθύλιο, Sigma-Aldrich) ή 1 μΜ U46619 (Cayman Chemical) για 30, 60, ή 120 λεπτά. Μετά τα κύτταρα θεραπεία πλύθηκαν μία φορά με PBS (-Ca,-Mg) και συλλέχθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης IP /πλύση συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης χωρίς ΕϋΤΑ κοκτέιλ και PhosSTOP κοκτέιλ αναστολέα (Roche). Συλλέγονται λύμα στη συνέχεια φυγοκεντρείται για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και προσδιορίζεται η συγκέντρωση της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας BCA κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών (Thermo Fisher Scientific). Οι ΝΗδ-ενεργοποιημένα μαγνητικά σφαιρίδια περιδινήθηκαν και 25 μΙ πολτού μεταφέρθηκε σε σωλήνες 1,5 ml ανά αντίδραση ΠΕ. Οι σωλήνες τοποθετήθηκαν στο διάλυμα μαγνήτη και αποθήκευση απορρίφθηκε, και στη συνέχεια πλύθηκε με παγωμένο 1 mM HCl και στροβιλίστηκαν ήπια για 5 δευτερόλεπτα. Τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν σε μαγνητικό περίπτερο και απορρίπτεται το υπερκείμενο.

Το διάλυμα αντισώματος παρασκευάστηκε με αραίωση δύο μg FOXO3 (Santa Cruz Biotechnology) και αρνητικό κλάσμα ελέγχου κουνελιού ανοσοσφαιρίνης (στερεάς φάσης που απορροφάται) (Dako, Carpinteria, CA , USA) σε μια τελική συγκέντρωση 2 μg αντισώματος σε 100 μL 0,067 βορικό ρυθμιστικό διάλυμα. Προστέθηκαν 100 μΙ διαλύματος έτοιμη αντισώματος στα ενεργοποιημένα σφαιρίδια, στροβιλίστηκαν ήπια και επωάστηκαν σε μια περιστρεφόμενη πλατφόρμα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αντιδράσεις στροβιλίστηκαν κάθε 10 λεπτά κατά τη διάρκεια της επώασης για να εξασφαλιστεί ότι τα σφαιρίδια παρέμειναν σε εναιώρημα. Τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν και υπερκείμενο απορρίφθηκε. Τα πλυμένα σφαιρίδια δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης, στροβιλισμό σωλήνες κάθε πλύση προς απομάκρυνση του μη-ομοιοπολικά δεσμευμένο αντίσωμα. Την απόσβεση ρυθμιστικό προστέθηκε στα σφαιρίδια και επωάστηκαν σε μια περιστρεφόμενη πλατφόρμα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν σε μαγνητικό περίπτερο και απορρίπτεται το υπερκείμενο. Παρασκευάζεται και προστέθηκαν 0,5 ml τροποποιημένου ρυθμιστικού διαλύματος βορικού σε κάθε ΠΕ και αναμίχθηκαν ήπια με vortex, τότε σφαιρίδια συλλέχθηκαν σε μαγνητική βάση και απορρίπτεται το υπερκείμενο. Οι αντιδράσεις πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό λύσης IP /πλύση, στη συνέχεια επωάστηκαν σε κάθε αντίδραση IP με 100 μg λύματος σε τελικό όγκο μL ρυθμιστικό λύσης IP /πλύση 500 συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης κοκτέιλ όλη τη νύκτα (μεταξύ 14-18 ώρες στους 4 ° C επί ένα πετάλου. τα σφαιρίδια στροβιλίζονται κάθε 15 λεπτά την πρώτη ώρα για να εξασφαλιστεί τα σφαιρίδια έμεινε στο εναιώρημα. Μετά την επώαση του αντιγόνου συλλέχθηκαν τα σφαιρίδια, πλένονται δύο φορές με IP λύσης ρυθμιστικού /πλύσης και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα 1,5 ml. τα πλυμένα σφαιρίδια με υπερκαθαρό νερό (ρΗ 7.0), στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε μαγνητικό περίπτερο και απορρίπτεται το υπερκείμενο. οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης χαμηλού ρΗ (ρΗ 2.0) δύο φορές και εξουδετερώθηκε με Τρις-ΗΟΙ ρΗ 8.5. οι εκλουσμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν στη συνέχεια με κηλίδα Western .

η στατιστική ανάλυση

Συνεχής αποτελέσματα συγκρίθηκαν σε όλη συνθήκες με τη χρήση δύο όψεων Student δύο δείγματος

t-test

. Πειράματα που περιέχουν περισσότερες από δύο μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μονόδρομη ANOVA που ακολουθήθηκε με Tukey τεστ post-hoc. Μια τιμή Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Νοκ ντάουν της FOXO3 Αυξάνει ουροθηλιακά τη Μετανάστευση και την εισβολή

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν έναν ρόλο για τον υποδοχέα TPβ στο ουροθηλιακό. μετανάστευση, εισβολή, και κακοήθη μετασχηματισμό [3], [14]. Μειωμένη έκφραση FOXO3 σε ασθενείς έχει επίσης συνδεθεί με ουροθηλιακό διεισδυτικότητα του καρκίνου [30]. Για να καθοριστεί εάν FOXO3 απενεργοποίηση θα είναι επαρκής για να προκαλέσει μια κακοήθη φαινότυπο ανεξάρτητη από TPβ, χαμηλή ενδογενή TPβ κυτταρικές σειρές που εκφράζουν UROsta και SVHUC (προηγουμένως προσδιορισθείσα [14]) διαμολύνθηκαν σταθερά με FOXO3 ειδικό shRNA (Σχήμα 1Α). FOXO3-shRNA επιμολυσμένα κύτταρα μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης FOXO3 πάνω από το μισό σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο (SCR) -shRNA παρατηρήθηκε με κηλίδα Western και επικυρώνεται από την εξέταση της κατάντη στόχου MnSOD (Σχήμα 1Α). Σε σύγκριση με τα κύτταρα SCR-shRNA knockdown έκφρασης FOXO3 οδήγησε σε αύξηση κατά 39% και 114% στη μετανάστευση, καθώς και μια αύξηση κατά 63% και 18% σε εισβολή των κυττάρων SV-HUC και UROsta, αντίστοιχα, (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 1Β-C). Δεδομένου ότι η απουσία FOXO3 ήταν αρκετή για να προκαλέσει μια κακοήθη φαινότυπο σε αθανατοποιημένα μη μετασχηματισμένα κύτταρα ουροθηλιακό, εξετάσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης TPβ στην αδρανοποίηση FOXO3. SV-HUC και UROsta κύτταρα επιμολυσμένα με TPβ εμφάνισαν 0,5-πλάσια αύξηση στην βασική έκφραση της πρωτεΐνης ανενεργό pFOXO3-S294 (Σχήμα 1 D-E).

(Α) Western στύπωμα της κυτταρικής λύσης ολόκληρο από SV -HUC και UROsta κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με FOXO3-shRNA ή τον έλεγχο ομελέτα (scr-) shRNA ανοσοαποτύπωση για το σύνολο FOXO3 και γνωστή προς τα κάτω το στόχο της MnSOD. α-τουμπουλίνης εφαρμόστηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων και οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τις κατά μέσο όρο αναλογίες FOXO3 σε α-τουμπουλίνης. Αναλογίες ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας Studio Image Lite Ver.3.1. SV-HUC και UROsta FOXO3 knockdown και ελέγχου κλώνοι εμβολιάστηκαν σε ένθετα επικαλύφθηκαν με ινωδονεκτίνη ή Matrigel και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν (Β) ή εισβάλλουν (C) για 16 ώρες. Εξόντωση FOXO3 αυξημένη SV-HUC και μετανάστευση UROsta κυττάρων (39% και 114%) και εισβολή (63% και 18%, αντίστοιχα) σε σύγκριση με SCR-shRNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα δοκιμασίες γίνονται εις διπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με δύο όψεων δύο δειγμάτων

t-test

, (* = Ρ & lt? 0,05, η = 3) σε σύγκριση με scr- ελέγχου. (Δ) Η υπερέκφραση του GFP ετικέτα TPβ στα κύτταρα UROsta και SVHUC αυξάνει τη βασική pFOXO3-S294 έκφρασης (Ε) σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα (n = 3). Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τις κατά μέσο όρο αναλογίες pFOXO3-S294 για να FOXO3. Αναλογίες ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας Studio Image Lite Ver.3.1. [ΑΕ] = αυθαίρετες μονάδες.

Η

Επιπτώσεις της TP Αγωνιστή διέγερση σε FOXO3 φωσφορυλίωση, Localization, και μεταγραφική δραστηριότητα

Για να αποδείξει ΤΧΑ

2 σηματοδότηση εμπλέκεται στη ρύθμιση FOXO3, η κατάσταση φωσφορυλίωσης του FOXO3 και των γνωστών ρυθμιστής της ERK εξετάστηκαν σε UMUC3 κύτταρα μετά από διέγερση αγωνιστή U46619 ΤΡ (Εικόνα 2Α). Ο αγωνιστής TP μεσολάβηση φωσφορυλίωση του ERK σε T202 /Y204 ήταν σημαντικά αυξημένη (~ 1 φορές) 15 και 30 λεπτά μετά τη διέγερση (Σχήμα 2Α και C). Αντίστοιχα, μια σημαντική αύξηση των pFOXO3-S294 παρατηρήθηκε 15 (5 φορές), 30 (7 φορές), και 60 (3,5 φορές) λεπτά μετά τη διέγερση αγωνιστή TP (Σχήμα 2Α-Β). Θεραπεία της UMUC3 κυττάρων με την πινανίου ανταγωνιστή TP (PTXA

2) ή αναστολέα της ERK (U0126) εξασθενεί το 46619 μεσολάβηση αποτελέσματα των ενεργοποιημένων ERK και pFOXO3-S294 (Σχήμα 2D-Ι).

(Α) κύτταρα UMUC3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ U46619 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. λύματα των κυττάρων αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση τόσο για την ολική και την φωσφορυλιωμένη ERK και FOXO3. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα στυπώματα ποσοτικοποιήθηκαν και αναλογίες για το (Β) pFOXO3-S294 για FOXO3 και (C) pERKT202 /Y204 να ERK1 /2 απεικονίστηκαν γραφικά χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5. UMUC3 κύτταρα προκατεργάστηκαν για 15 λεπτά με (D) 2 μΜ ανταγωνιστή TP πινανίου (PTXA

2) ή (G) 10 αναστολέα ΕΚΚ μΜ (U0126) εξασθένησε την ενεργοποίηση της ERK και φωσφορυλίωση FOXO3 μετά τη θεραπεία με 1 μΜ U46619 για 30 λεπτά. λύματα κυττάρων ανοσο τόσο για την ολική και την φωσφορυλιωμένη ERK και FOXO3. α-τουμπουλίνης χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν ποσοτικά αναλογίες για το (Ε και Ι) pFOXO3-S294 για να FOXO3 και (F και G) pERKT202 /Y204 να ERK1 /2 απεικονίστηκαν γραφικά. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε για όλους τους ποσοτικοποιημένους κηλίδες χρησιμοποιώντας μια επαναλαμβανόμενη μέτρο One-way ANOVA με Tukey τεστ post-hoc. P & lt?. 0.05

Η

Τα αποτελέσματα της διέγερσης αγωνιστή TP για FOXO3 μεταγραφική δραστηριότητα εξετάστηκαν από μια διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης. κύτταρα UMUC3 επιμολύνθηκαν παροδικά με το στοιχείο απόκρισης forkhead (FHRE) λουσιφεράση πυγολαμπίδας κατασκεύασμα ανταποκριτή και φορέα μάρτυρα Renilla, πριν από την αγωγή με όχημα ή TP αγωνιστή. FOXO3 μεταγραφική δραστηριότητα μειώθηκε σημαντικά κατά 36% και 44% στα 30 και 120 λεπτά, αντίστοιχα, μετά τη διέγερση του αγωνιστού ΤΡ σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (Σχήμα 3Α).

(Α) κύτταρα UMUC3 παροδικά επιμολυσμένα με 3 × forkhead στοιχείο απόκρισης (FHRE) κατασκεύασμα ανταποκριτή και Renilla φορέα ελέγχου λουσιφεράσης υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ U46619 για 30 ή 120 λεπτά και οδήγησε σε μειωμένη FOXO3 μεταγραφική δραστικότητα. Το μέσο έκφρασης λουσιφεράσης Firefly ρυθμίστηκε σε συνολική έκφραση λουσιφεράσης πρωτεΐνης και τον έλεγχο των φορέων ΚβηϊΙΙθ πριν την κανονικοποίηση για τον έλεγχο του οχήματος. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση δραστικότητα λουσιφεράσης τοις εκατό των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που διεξήχθησαν εις διπλούν. * P & lt? 0,05, One-way ANOVA με Tukey τεστ post-hoc. (Β) κύτταρα UMUC3 στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα και προκατεργάστηκαν για 15 λεπτά. με 1 μΜ ινδομεθακίνη πριν από την αγωγή είτε με έκδοχο ή 1 μΜ U46619 για 5, 30, ή 120 λεπτά. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλασματοποίηση και πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδα Western. α-τουμπουλίνης και Lamin-B1 χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης για κυτταροπλασματικά και πυρηνικά κλάσματα, αντίστοιχα. (Γ) πυκνομετρία στυπώματα δείχνουν παρατεταμένη διέγερση αγωνιστή αυξήθηκε κυτταροπλασματική πρωτεΐνη FOXO3 και αυξημένη πρωτεΐνες πυρηνικών pFOXO3 σύγκριση με τους ελέγχους οχήματος. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε για όλους τους ποσοτικοποιημένους κηλίδες χρησιμοποιώντας μια επαναλαμβανόμενη μέτρο One-way ANOVA με Tukey τεστ post-hoc. Ρ & lt?. 0.05

Η

Με βάση την κινητική φωσφορυλίωσης FOXO3, εξετάσαμε την κυτταρική κατανομή των FOXO3 σε UMUC3 κύτταρα κατεργασμένα με όχημα ή TP αγωνιστής για 5, 30, ή 120 λεπτά. κλάσματα Πυρηνική και κυτταροπλασματική πρωτεΐνη αναλύθηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα 3Β) και πυκνότητες μπάντα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Image Studio Lite Ver 3.1 (Σχήμα 3C). κύτταρα UMUC3 διεγερμένα με αγωνιστή ΤΡ έδειξε μια αρχική αύξηση της πυρηνικής FOXO3 οποία επίσης συνδέεται με την αύξηση στην πυρηνική pFOXO3-Ser294 (Σχήμα 3C). Η παρατεταμένη διέγερση είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση των συνολικών FOXO3 στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 3C).

διέγερση TP αυξάνει την έκφραση SIRT1, αποακετυλίωσης FOXO3, και επηρεάζει FOXO3 εκφράσεις στόχος

Η επίδραση της διέγερσης U46619 σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης του καλά χαρακτηρισμένα στόχων FOXO3 ρ27

Kip1, MnSOD, και ΒΙΜ εξετάστηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα 4Α). κύτταρα UMUC3 διεγερμένα με U46619 για 30, 120, και 240 λεπτά παρατηρήθηκαν μειώθηκαν ρ27

Kip1 και Bim πρωτεΐνες, και αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης MnSOD (Σχήμα 4Α). Δεδομένου ότι το πρότυπο έκφρασης των στόχων FOXO3 έμοιαζε με το πρότυπο που παρατηρείται μετά από υπερέκφραση του ιστόνης deacetyltransferase SIRT1 [21], διερευνήσαμε την επίδραση της διέγερσης U46619 στην έκφραση SIRT1. κύτταρα UMUC3 διεγερμένα με αγωνιστή TP επέδειξαν αυξημένη έκφραση του SIRT1 και μειωμένη έκφραση του Ρ300 σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (Εικόνα 4Β-C). Για να προσδιοριστεί εάν η αυξημένη έκφραση SIRT1 σε UMUC3 κύτταρα διεγερμένα με αγωνιστή TP κατάσταση επηρεάζεται FOXO3 ακετυλίωση, FOXO3 ανοσοκαταβυθίστηκε από UMUC3 κύτταρα επεξεργασμένα είτε με όχημα ή U46619, και ανοσοστυπώθηκαν για ακετυλιωμένα υπολείμματα λυσίνης. Η διέγερση των κυττάρων με UMUC3 U46619 για 120 και 240 λεπτά εμφανίζεται μία μείωση 48% και 70% σε ακετυλιωμένη FOXO3, αντίστοιχα (Εικόνα 4D-Ε).

κύτταρα (Α) UMUC3 αγωγή με όχημα ή 1 μΜ U46619 για 30, 120, και 240 λεπτά. Τα κυτταρολύματα συλλέχτηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδα Western για έκφραση σύνολο FOXO3 και κατάντη στόχοι ρ27

Kip1, MnSOD, και ΒΙΜ. (Β) Η έκφραση της πρωτεΐνης του p300 και SIRT1 σε ίδια κυτταρολύματα. α-τουμπουλίνης χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης. (γ) Ποσοτική τιμές από κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα γράφημα. (*) Υποδεικνύει ρ & lt? 0,05, Μονόδρομη ANOVA, σε σύγκριση με το χρόνο 0 για κάθε λόγο Target. (Δ) Η αυξημένη έκφραση SIRT1 διαμεσολαβείται από 46619 σε UMUC3 κύτταρα αντιστοιχεί με μειωμένη ακετυλιωμένο FOXO3. Σύνολο FOXO3 ανοσοκαταβυθίστηκε από κύτταρα UMUC3 στερήθηκαν ορού υποβάλλεται σε επεξεργασία με όχημα ή 1 μΜ U46619 για 30, 120, ή 240 λεπτά. Οι εκλουσμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδα Western με αντισώματα εναντίον ακετυλιωμένα υπολείμματα λυσίνης και FOXO3. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα στυπώματα ποσοτικοποιήθηκαν και αναλογίες για το (Ε) ακετυλιωμένη-λυσίνη (ακετυλο-Κ) που FOXO3 απεικονίστηκαν γραφικά. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με τη χρήση επαναλαμβανόμενων μετρήσεων One-way ANOVA με Tukey τεστ post-hoc. P & lt?. 0.05

Η

ERK ανθεκτικά Μεταλλαγμένα FOXO3

3Α Μειωμένη αγωνιστή TP διαμεσολαβούμενη τη Μετανάστευση και την εισβολή

κύτταρα UMUC3 ήταν σταθερά επιμολυσμένα με GFP-φορέα ή μεταλλαγμένες GFP-FOXO3

3Α κατασκεύασμα στο οποίο όλα τα τρία υπολείμματα φωσφορυλίωση ERK υποκαταστάθηκαν για υπολείμματα αλανίνης να μιμηθεί ένα μη φωσφορυλιωμένη ή ενεργή κατάσταση (Σχήμα 5Α). Για να προσδιοριστεί εάν U46619 μεσολάβηση φωσφορυλίωση του ERK FOXO3 με επηρεάζει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, τα σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν και να εισβάλουν μετά από διέγερση με όχημα ή U46619. Τα κύτταρα ελέγχου GFP-φορέα οδήγησε σε 2-πλάσια αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή με διέγερση U46619 σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, ενώ η έκφραση του GFP-FOXO3

πρωτεΐνη 3Α ελαττωμένη U46619 μεσολάβηση μετανάστευση και εισβολή (Σχήμα 5Β-C) .

(Α) GFP-FOXO3

3Α ή EGFP-C

2 (Vector) ήταν σταθερά επιμολυσμένα σε κύτταρα UMUC3 και έκφραση μεταλλαγμένων FOXO3 επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση για GFP. α-τουμπουλίνης χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένθετα επικαλυμμένα με ινονηκτίνη για μετανάστευση ή Matrigel για εισβολή σε μέσο ελεύθερο ορού που περιέχει 1 μΜ U46619 και τοποθετήθηκαν σε φρεάτια που περιέχουν πλήρες μέσο με 1 μΜ U46619. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν (Β) για 8 ώρες ή εισβάλλουν (C) για 16 ώρες. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με δύο όψεων δύο δειγμάτων

t-test

, (* = Ρ & lt? 0,05, η = 3) σε σύγκριση με τον έλεγχο GFP-φορέα. (D) κύτταρα UMUC3 προκατεργάστηκαν με 10 μΜ U0126 για 15 λεπτά πριν από τη διέγερση με 1 μΜ U46619 και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 16 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα δοκιμασίες γίνονται εις διπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με μια μονόδρομη ANOVA με Tukey τεστ post-hoc. P & lt?. 0.05

Η

Για να καταδειχθεί περαιτέρω τη σημασία της σηματοδότησης ERK σε ΤΧΑ

2 μεσολάβηση της κινητικότητας των κυττάρων, έχουμε προ-θεραπεία με το U0126 αναστολέα ΕΚΚ (10 μΜ) για 10 λεπτά πριν από τη μέτρηση της επηρεάσει σε U46619 μεσολάβηση της μετανάστευσης.