Αφηρημένο

Ιστορικό

φενρετινίδη (4-HPR) είναι ένα συνθετικό ρετινοειδές που εμφανίζει ισχυρή αντικαρκινική και χημειοπροληπτική δραστηριότητες εναντίον διαφορετικών κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου όγκους των ωοθηκών. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, 4-HPR επάγει απόπτωση μέσω ενός καταρράκτη σηματοδότησης ξεκινώντας από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και με τη συμμετοχή ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) αντίδραση στο στρες, Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) ενεργοποίηση και επαγωγή η προ-αποπτωτικών μορφογενετικών πρωτεϊνών πλακούντα οστών (ΡΙΑΒ). Από πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το ογκογονίδιο ALL1-συγχωνευμένων από το χρωμόσωμα 1q (AF1q), ένα ρετινοϊκό γονιδίου στόχου οξύ, εμπλέκεται στην επαγωγή απόπτωσης από διάφορους θεραπευτικούς παράγοντες, ερευνήσαμε πιθανή συμμετοχή της στην απόπτωση που επάγεται από 4-HPR στον καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης, που εκτελούνται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και επεκταθεί σε άλλες histotypes (μαστού, νευροβλάστωμα, και του τραχήλου της μήτρας), αποκάλυψε ότι η 4-HPR ενισχυμένη έκφραση σε AF1q τα καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα στην ρετινοειδούς αλλά όχι σε ανθεκτικά κύτταρα. Μέσω γονιδιακής σίγησης, AF1q βρέθηκε εμπλέκονται λειτουργικά στην 4-HPR επαγόμενη απόπτωση σε Α2780, μία ωοθηκών κυτταρική γραμμή ιδιαίτερα ευαίσθητα στις ρητινοειδούς ανασταλτική της ανάπτυξης και αποπτωτικά αποτελέσματα. Η αναστολή των ενδιαμέσων σηματοδότηση του αποπτωτικού καταρράκτη 4-HPR έδειξε ότι AF1q αυξητική ρύθμιση εξαρτιόταν από προηγούμενη παραγωγή ROS, η επαγωγή της απόκρισης ER στρες, ενεργοποίηση JNK και ΡΙΑΒ upmodulation. Τέλος, βρήκαμε ότι η άμεση υπερέκφραση AF1q, εν απουσία εξωτερικών ερεθισμάτων, αυξημένη απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Η μελέτη επεκτείνει την γνώση της 4-HPR μηχανισμό δράσης, ο οποίος δεν έχει ακόμη πλήρως διευκρινιστεί, προσδιορίζοντας AF1q ως νέου μεσολαβητής του ρετινοειδούς αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, δείχνουμε για πρώτη φορά, ότι AF1q παίζει ένα ρόλο στην έναρξη της βασικής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, παρέχοντας έτσι νέες πληροφορίες σχετικά με τη δραστηριότητα της πρωτεΐνης αυτής των οποίων οι βιολογικές λειτουργίες είναι ως επί το πλείστον άγνωστη.

Παράθεση: Tiberio P, Cavadini Ε, Callari Μ, Daidone MG, Appierto V (2012) AF1q: Ένα μυθιστόρημα Mediator της βασικοκυτταρικό και 4-HPR απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (6): e39968. doi: 10.1371 /journal.pone.0039968

Επιμέλεια: Maurizio D’Incalci, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Ιταλία

Ελήφθη: 5 Μάρτη 2012? Αποδεκτές: 5, Ιουνίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Ιουνίου 2012

Copyright: © 2012 Tiberio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από πόρους από τους ιταλούς πολίτες που διέθεσε το 5 × 1000 το μερίδιο του φόρου την πληρωμή τους για την υποστήριξη του Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, σύμφωνα με την ιταλική νομοθεσία (INT-Θεσμικών στρατηγικά έργα «5 × 1000»? www.lavoro.gov. το/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ρετινοειδή, μια μεγάλη οικογένεια φυσικών και συνθετικών ενώσεων δομικά συγγενείς με την βιταμίνη α (ρετινόλη), είναι απαραίτητα μόρια σηματοδότησης που ρυθμίζουν μία ευρεία ποικιλία βιολογικών διαδικασιών όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, συντήρηση του επιθηλιακού ιστού, αναπαραγωγή , το όραμα, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [1], [2]. Ν- (4-υδροξυφαινυλ) ρετιναμίδη (4-HPR), επίσης γνωστή ως φενρετινίδη, είναι ένα συνθετικό παράγωγο της βιταμίνης Α καλώς ανεκτή σε ανθρώπους που έχει προκύψει ως μία από τις πλέον υποσχόμενες ρετινοειδών στην κλινική για πρόληψη και θεραπεία διαφόρων κακοηθειών [ ,,,0],3] – [7]. 4-HPR έχει δειχθεί ότι ίσως να μειώσει την εμφάνιση του καρκίνου των ωοθηκών και να καθορίσει, σε προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, μια σημαντική μείωση του κινδύνου μίας δεύτερης καρκίνου του μαστού που επιμένει για τουλάχιστον 15 έτη [3], [6]. Ακόμα κι αν οι μηχανισμοί 4-HPR της δράσης υπήρξε μια σημαντική εστίαση της έρευνας κατά την τελευταία δεκαετία, τα μοριακά γεγονότα που προκαλούνται από την ρετινοειδή εμφανίζονται πολύπλευρη και δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί [8]. Σε αντίθεση με την κλασική ρετινοειδή (όπως all-trans ρετινοϊκό οξύ), που συχνά διεγείρουν διαφοροποίηση ή /και κυτταρόστασης με την ενεργοποίηση της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ρετινοϊκού οξέος (RARs), 4-HPR έχει δειχθεί ότι προκαλούν διαφορετικά βιολογικά αποτελέσματα μέσω τόσο ρετινοειδούς υποδοχέα εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τους μηχανισμούς [9].

σε καλλιεργημένα κύτταρα, 4-HPR έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την προώθηση απόπτωση με τη μεσολάβηση, τουλάχιστον εν μέρει, από την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και την επακόλουθη οξειδωτικού στρες [8] – [11]. Έχουμε προηγουμένως στοιχεία που αποδεικνύουν ότι, σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, 4-HPR επαγόμενη απόπτωση μέσω ενός καταρράκτη σηματοδότησης ξεκινώντας από την παραγωγή ROS και η συμμετοχή ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) αντίδραση στο στρες, Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) ενεργοποίηση, και επαγωγή της προαποπτωτική πλακούντα μορφογενετική πρωτεΐνη του οστού (ΡΙΑΒ, επίσης γνωστή ως NAG-1, GDF15, MIC-1, PDF, και PTGFB) (ROS → ER στρες → JNK → ΡΙΑΒ) [11], [12].

Η ALL1 -συγχωνευμένο από την 1q χρωμόσωμα (AF1q, επίσης γνωστή ως MLLT11) γονίδιο, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1, ζώνη 21, κωδικοποιεί μία μικρή πρωτεΐνη 9 kDa με όχι καλά καθορισμένες λειτουργικές περιοχές και καμία ομοιότητα με άλλες γνωστές πρωτεΐνες [13]. Οι μηχανισμοί που διέπουν τη ρύθμιση των AF1q έκφρασης έχουν διερευνηθεί σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Μια αύξηση στα επίπεδα mRNA AF1q έχει δειχθεί σε ρετινοϊκό οξύ (RA) -responsive κύτταρα νευροβλαστώματος μετά την έκθεση στον ρετινοειδούς, εντοπίζοντας έτσι AF1q ως γονίδιο RA-στόχου [14]. Πιο πρόσφατα, έχει καταδειχθεί ότι η έκφραση του mRNA AF1q άμεσα ρυθμίζεται από microRNA29b [15], ενώ η πρωτεΐνη υποβάλλεται σε αποικοδόμηση ουβικουϊτίνη διαμεσολαβείται από το πρωτεάσωμα στο centrosomal περιοχή [16]. AF1q είχε αρχικά οριστεί ως ογκογόνο παράγοντα εμπλέκεται σε μια μετατόπιση t (1? 11) (q21? Ε23), υπεύθυνο για περιπτώσεις λευχαιμίας [13]. Επιπλέον, το υψηλό επίπεδο έκφρασης του γονιδίου αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με κακή έκβαση σε παιδιατρικούς οξεία μυελοειδή λευχαιμία (AML), ενηλίκων κανονική κυτταρογενετική AML, και ενήλικων μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο [17] – [19]. Αν και οι βιολογικές λειτουργίες του AF1q είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, μια πιθανή ογκογόνο λειτουργία της πρωτεΐνης έχει επίσης προταθεί σε στερεούς όγκους όπως ο καρκίνος του μαστού και του θυρεοειδούς και των όρχεων oncocytic όγκους γεννητικών κυττάρων [20] – [23]. Εκτός από την προτεινόμενη ογκογόνο ρόλο της AF1q, έχει αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζει την BAD μεσολάβηση αποπτωτική οδό μέσω NF-kB, παίζοντας έτσι έναν ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης και της αντίστασης στα φάρμακα [24], [25] . Μία μείωση της AF1q έκφραση σε συνδυασμό με μειωμένη ευαισθησία δοξορουβικίνη έχει παρατηρηθεί σε κύτταρα ανθρώπινου πλακώδους καρκινώματος, και knockdown της πρωτεΐνης έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από διάφορους θεραπευτικούς παράγοντες, όπως η δοξορουβικίνη και η ακτινοβολία γ [24], [ ,,,0],25].

Η παρούσα μελέτη διερεύνησε την εμπλοκή των AF1q σε 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα όγκου ωοθηκών. Παρέχουμε αποδείξεις ότι η 4-HPR θεραπεία ενισχύει AF1q επίπεδα έκφρασης σε καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα στην ρητινοειδούς και ότι η προς τα πάνω ρύθμιση είναι ένα σημαντικό γεγονός του καταρράκτη σηματοδότησης 4-HPR που οδηγεί σε απόπτωση μέσω δημιουργίας ROS, ER αντίδραση στο στρες, την ενεργοποίηση JNK, και ΡΙΑΒ ρύθμιση προς τα πάνω. Τέλος, με AF1q υπερέκφραση, έχουμε επιδείξει ένα ρόλο του AF1q στην εκδήλωση της βασικής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

4-HPR Προκαλεί AF1q Προς τα πάνω ρύθμιση σε καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα ευαίσθητα στην ρητινοειδούς αλλά όχι σε κύτταρα ανθεκτικά

από AF1q δείχθηκε ότι παίζει ένα ρόλο στην απόπτωση που επάγεται από διάφορους θεραπευτικούς παράγοντες και να ρυθμίζεται από το RA [14], [24], [25], επιδιώξαμε να διερευνήσει την πιθανή συμβολή της πρωτεΐνης στην αποπτωτική δραστικότητα του συνθετικού ρητινοειδούς 4-HPR. Αναλύσαμε την επίδραση της θεραπείας 4-HPR επί AF1q έκφραση στο ανθρώπινο Α2780 καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή, η οποία είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στις αντιπολλαπλασιαστικές και αποπτωτικά αποτελέσματα του ρετινοειδούς [26], [27], και τον ομόλογό του Α2780 /HPR, η οποία έχει επαγόμενη αντίσταση σε 4-HPR [28]. ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης έδειξε ότι τα κύτταρα Α2780 εκφράζεται ιδιοσυστατικώς πρωτεΐνη AF1q και ότι η αγωγή με 5 και 10 μΜ 4-HPR για 24 ώρες αυξημένη έκφραση του σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Αντίθετα, η θεραπεία 4-HPR δεν προκάλεσε καμία αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα AF1q Α2780 /HPR, έστω και αν τα κύτταρα αυτό (Εικόνα 1Β) που εκφράζεται ιδιοσυστατικά. Τέτοια δεδομένα υποδηλώνουν σύνδεσης μεταξύ επαγωγή AF1q από 4-HPR θεραπεία και κυτταρική ευαισθησία στην ρετινοειδές.

ανάλυση κηλίδας Western για έκφραση σε AF1q Α2780 (Α) και τα κύτταρα Α2780 /HPR (Β) θεραπεία για 24 ώρες με 5 και 10 μΜ 4-HPR. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, οι κηλίδες επωάστηκαν με αντίσωμα ακτίνης.

Η

4-HPR Ενισχύει AF1q έκφρασης σε άλλα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και στον Καρκίνο Γραμμές κυττάρων των διαφορετικών Histotypes

Για την εκτίμηση είτε 4-HPR επαγόμενη AF1q αυξητική ρύθμιση περιοριζόταν σε Α2780 κύτταρα ή αντιπροσωπεύονται διακριτικό τρόπο δράσης του ρετινοειδούς, επεκτείναμε την ανάλυση της έκφρασης AF1q σε άλλους ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με διαφορετικές ευαισθησίες προς την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της 4-HPR. Η θεραπεία με 5 μΜ 4-HPR για 24 ώρες επαγόμενη AF1q ρύθμιση προς τα άνω σε ευαίσθητους καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές OVCA432 και SKOV-3 [27] (Εικόνα 2Α), όπως επίσης και σε αποκριτικά κύτταρα διαφορετικών histotypes, δηλαδή, αδενοκαρκίνωμα του μαστού T47D και νευροβλάστωμα SK-N-BE [27] (Σχήμα 2Β). Σε αντίθεση, στα κύτταρα φυσικά ανθεκτικά σε 4-HPR δραστικότητα ανασταλτική της ανάπτυξης, όπως η κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών OVCAR-3 [27] και τις κυτταρικές σειρές τραχηλικού καρκινώματος HeLa (IC

50 & gt? 10 μΜ, σε 72 ώρες, τα δεδομένα δεν φαίνεται), ούτε 5 μΜ (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ούτε 10 μΜ θεραπεία 4-HPR για 24 ώρες προκάλεσε upmodulation του AF1q έκφρασης (Σχήμα 2C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η 4-HPR επαγόμενη AF1q αυξητική ρύθμιση δεν συμβαίνουν μόνο σε Α2780 κύτταρα, αλλά ήταν ένα χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων αποκρίνονται στην ρετινοειδές.

ανάλυση κηλίδας Western για έκφραση σε AF1q OVCA432 και SKOV-3 (Α ) κυττάρων, T47D και SK-N-BE κύτταρα (Β), και OVCAR-3 και HeLa (κύτταρα C) θεραπεία για 24 ώρες με 4-HPR στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, τα στυπώματα επωάστηκαν με αντίσωμα ακτίνης.

Η

AF1q Προς τα πάνω ρύθμιση σε Α2780 κύτταρα συνδέεται με ρετινοειδές Δυνατότητα να αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη και προκαλούν απόπτωση

Ανάλυση του συνδέσμου μεταξύ της έκφρασης AF1q και ανασταλτική της ανάπτυξης του όγκου και αποπτωτικά αποτελέσματα επεκτάθηκε και σε άλλα φυσικά και συνθετικά ρετινοειδή, δηλαδή, RA, και Ν- (4-μεθοξυφαινυλ) ρετιναμίδη (4-MPR) και 4-οξο-Ν- (4-υδροξυφαινυλ) ρετιναμίδη (4-οξο-4-HPR), δύο 4-HPR μεταβολίτες. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι 4-οξο-4-HPR έχει μια επίδραση αναστολής αύξησης (IC

50 = 0.6 μΜ, σε 72 ώρες) και επάγει την απόπτωση σε Α2780 κύτταρα, ενώ 4-MPR και RA δεν επηρεάζουν τέτοια ανάπτυξη (IC

50 & gt? 10 μΜ, στις 72 ώρες και για τα δύο ρετινοειδή) [27] – [29]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, σε κύτταρα Α2780 τη θεραπεία με RA, καθώς και με 4-MPR, δεν επηρέασε ούτε έκφραση AF1q ή κασπάσης-3 ενεργοποίησης, ενώ η αγωγή 4-οξο-4-HPR οδήγησε σε αύξηση AF1q έκφραση και να κασπάσης-3 διάσπασης (Σχήμα 3). Τα δεδομένα έδειξαν ότι ρετινοειδές επαγόμενη AF1q αυξητική ρύθμιση συνδέθηκε με την ικανότητα της ένωσης να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και να επάγουν απόπτωση.

analysiso κηλίδα Western για έκφραση AF1q και κασπάσης-3 διάσπαση σε κύτταρα Α2780 αγωγή για 24 ώρες με 10 μΜ RA ή 4-MPR, ή 3 μΜ 4-οξο-4-HPR. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, η κηλίδα επωάστηκε με αντίσωμα ακτίνης.

Η

AF1q Η αναβάθμιση είναι λειτουργικά Συμμετέχετε στην απόπτωση που επάγεται από 4-HPR σε Α2780 κύτταρα

Για να μελετήσουμε τον πιθανό ρόλο των AF1q σε 4-HPR-απόπτωση, εκτελέσαμε AF1q σίγηση από παροδικές επιμολύνσεις των Α2780 κυττάρων με ένα πλασμίδιο που εκφράζει μια AF1q siRNA ή ένα κωδικοποιημένο siRNA nonsilencing χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Η επιμόλυνση με AF1q siRNA μειωμένη και τα βασικά και 4-HPR επαγόμενη έκφραση AF1q και μειώθηκε σαφώς 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση, όπως δείχνεται με διάσπαση της κασπάσης-3 (Σχήμα 4), αποδεικνύοντας ότι AF1q έπαιξε ρόλο στην επαγωγή απόπτωσης από 4- HPR στα κύτταρα Α2780. Υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες, δεν παρατηρήσαμε διαμόρφωση της προαποπτωτική πρωτεΐνη BAD (Σχήμα 4), που δείχνεται προηγουμένως ότι ρυθμίζεται από AF1q σε ανθρώπινα κύτταρα πλακώδους καρκινώματος [24], [25].

analysiso κηλίδας Western για έκφραση AF1q, η διάσπαση της κασπάσης-3, και BAD έκφραση σε κύτταρα Α2780 παροδικά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα AF1q siRNA ή ένα κωδικοποιημένο nonsilencing siRNA μετά την προσθήκη 5 μΜ 4-HPR για 24 ώρες. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, η κηλίδα επωάστηκε με αντίσωμα ακτίνης.

Η

AF1q εμπλέκεται στην αποπτωτικά Σηματοδοσίας Cascade Induced από 4-HPR σε Α2780 κύτταρα

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι 4 -HPR απόπτωση λαμβάνει χώρα μέσω ενός καταρράκτη σηματοδότησης που περιλαμβάνουν την παραγωγή ROS, επαγωγή στρες ER, ενεργοποίηση JNK και ΡΙΑΒ αυξορρύθμιση (ROS → ER στρες → JNK → ΡΙΑΒ) [11], [12]. Αξιολογήσαμε έτσι αν AF1q συμμετείχε στην προαναφερθείσα αποπτωτικό μονοπάτι με τη δοκιμή των επιδράσεων της αναστολής αυτών των ενδιαμέσων σηματοδότησης σε 4-HPR επαγόμενη AF1q upmodulation. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Α2780 συν-επεξεργασία με 4-HPR και, με τη σειρά του, με την αντιοξειδωτική βιταμίνη C, ο αναστολέας salubrinal ER στρες, και τη φαρμακολογική SP600125 αναστολέα JNK, που έχουν αποδειχθεί για την πρόληψη της δημιουργίας ROS, eIF2α αποφωσφορυλίωση, και ενεργοποίηση JNK, αντίστοιχα, και για να μειωθεί έντονα 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση στην ίδια κυτταρική γραμμή [11]. Η προσθήκη 100 μΜ βιταμίνης C σε κύτταρα Α2780 σε επεξεργασία με 5 μΜ 4-HPR για 24 ώρες ακύρωσε την 4-HPR επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του AF1q (Σχήμα 5Α). Παρομοίως, η προσθήκη 10 μΜ salubrinal ή 10 μΜ SP600125 μειώνεται έντονα 4-HPR επαγόμενη αυξητική ρύθμιση AF1q (Σχήμα 5Β και 5Γ). Για να διερευνήσουν κατά πόσον η ρύθμιση προς τα πάνω της AF1q ήταν μεταγενέστερος εκδήλωση επίσης ΡΙΑΒ ρύθμιση προς τα άνω που προκαλούνται από 4-HPR, ΡΙΑΒ έχει χτυπηθεί κάτω χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό siRNA που στοχεύει ΡΙΑΒ mRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, η θεραπεία των Α2780 κυττάρων με το ΡΙΑΒ ειδικό siRNA ήταν σε θέση να μειώσει σε μεγάλο βαθμό 4-HPR επαγόμενη ΡΙΑΒ καθώς AF1q upmodulation σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο siRNA. Αντίθετα, AF1q σίγηση δεν επηρέασε 4-HPR που προκαλείται ανοδική ρύθμιση ΡΙΑΒ (Σχήμα 5Ε). Τα προαναφερθέντα δεδομένα έδειξαν ότι σε Α2780 κύτταρα AF1q ανοδική ρύθμιση εξαρτιόταν από προηγούμενη ενεργοποίηση του καταρράκτη 4-HPR επαγόμενη-ROS σχετίζονται σηματοδότησης και ότι upmodulation του συνέβη κατάντη της επαγωγής ΡΙΑΒ (Σχήμα 6).

Western blot ανάλυση για AF1q έκφραση σε κύτταρα Α2780 θεραπεία για 24 ώρες με 5 μΜ 4-HPR, με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνη C (Α), 10 μΜ salubrinal (Β), ή 10 μΜ SP600125 (C). (D) ανάλυση κηλίδας Western για AF1q έκφραση σε κύτταρα Α2780 σταθερά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα ΡΙΑΒ siRNA ή ένα κωδικοποιημένο nonsilencing siRNA μετά την προσθήκη 5 μΜ 4-HPR για 24 ώρες. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, τα στυπώματα επωάστηκαν με αντίσωμα ακτίνης.

Η

4-HPR επάγει απόπτωση μέσω ενός καταρράκτη σηματοδότησης που περιλαμβάνει το οξειδωτικό στρες, ER αντίδραση στο στρες, την ενεργοποίηση JNK, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης προαποπτωτικών ΡΙΑΒ, και AF1q ρύθμιση προς τα πάνω.

η

AF1q παίζει ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης Βασικός σε κύτταρα των ωοθηκών Καρκίνο

Για να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ της επαγωγής AF1q και την απόπτωση εμφάνιση, αναλύσαμε είτε άμεσα υπερέκφραση του AF1q, εν απουσία εξωτερικών ερεθισμάτων, θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Α2780 επιμολύνθηκαν παροδικά με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ταμπέλα σήμα φορέα AF1q. Κύτταρα διαμολυσμένα με φορέα που κωδικοποιεί για το GFP χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα πυρηνικά κατακερματισμό και συμπύκνωση χρωματίνης παρακολουθήθηκαν στα πράσινα φθοριζόντων κυττάρων με χρώση των πυρήνων των κυττάρων με Hoechst 33342 (Σχήμα 7Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β (αριστερό πάνελ), GFP-AF1q-κύτταρα που υπερεκφράζουν έδειξε αξιοσημείωτη αύξηση στην αποπτωτικών πυρήνων σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν μόνο με GFP. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε OVCAR-3 κύτταρα, μία άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών που, διαφορετικά από Α2780 κύτταρα, ήταν ανθεκτική στην αντιπολλαπλασιαστική δράση 4-HPR και δεν το έκανε ιδιοσυστατικά εκφράζουν AF1q. Η επιμόλυνση με GFP-AF1q επάγεται επίσης σε OVCAR-3 αύξηση στη βασική απόπτωση σε σχέση με την επιμόλυνση GFP (Σχήμα 7Β, δεξιό πλαίσιο). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ένα ρόλο για AF1q στην έναρξη της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) ανάλυση ανοσοφθορισμού των κυττάρων Α2780 παροδικά επιμολυσμένα με GFP μόνο (άνω πάνελ) ή GFP-tagged φορέα AF1q (AF1q-GFP ) (κάτω πάνελ). Μετά από 48 ώρες, GFP και AF1q-GFP κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 και πυρηνική μορφολογία εξετάστηκε με μικροσκόπιο φθορισμού. Τα κύτταρα του ενδιαφέροντος, σημειωμένες με βέλη. αναγνωρίστηκαν και βαθμολογήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα κύτταρα με συνοπτικές και αποσπασματικές πυρήνες. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία δείχνεται. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 10 μm. (Β) Η απόπτωση παριστάνεται ως εκατοστιαία αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων ανά 100 πράσινη φθορίζουσα κυττάρων (τουλάχιστον 200 κύτταρα ανά δείγμα) σε Α2780 (αριστερό πάνελ) και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως στο (Α) OVCAR-3 (δεξί πάνελ). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Τα πρόσφατα ευρήματα ότι το γονίδιο AF1q, δίπλα τεκμηριωμένη ογκογόνο λειτουργία της [17] – [23], παίζει ένα ρόλο. σε ρύθμιση απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [24], [25] και το γεγονός ότι έχει περιγραφεί ως ένα γονίδιο RA-στόχου [14], μας ώθησε να ερευνήσει πιθανή συμμετοχή της στην απόπτωση που επάγεται από το συνθετικό μη κλασικοί ρητινοειδούς 4-HPR. Η παρούσα μελέτη προσδιόρισε AF1q ως νέου μεσολαβητής της απόπτωσης που επάγεται από 4-HPR και παρείχε στοιχεία ενός ρόλου της πρωτεΐνης στην έναρξη της βασικής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Δείξαμε ότι σε Α2780, μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκινώματος των ωοθηκών εξαιρετικά ευαίσθητη στην ανασταλτική της ανάπτυξης και αποπτωτικά αποτελέσματα του ρετινοειδούς [26], [27], 4-HPR επαγόμενη απόπτωση συνοδεύεται από αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης AF1q. Σε αντίθεση, η upmodulation του AF1q δεν παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα Α2780 /HPR, 4-HPR ανθεκτική παραλλαγή που προέρχεται από Α2780 κύτταρα [28], υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το ρητινοειδές. Ανάλυση της έκφρασης AF1q, επεκτείνεται σε ένα πάνελ ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών (ωοθηκών, μαστού, του τραχήλου της μήτρας, και νευροβλάστωμα) με διαφορετικές ευαισθησίες προς την αντιπολλαπλασιαστική δράση 4-HPR [27], επιβεβαίωσε ότι upmodulation της πρωτεΐνης μετά έκθεση 4 HPR ήταν ένα κοινό χαρακτηριστικό των 4-HPR αποκριτικά κύτταρα αλλά δεν εμφανίστηκε σε καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά στην ρετινοειδές.

Η συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας των κυττάρων σε 4-HPR αντικαρκινικές επιδράσεις και AF1q αυξορρύθμιση πρότειναν έναν ρόλο για AF1q ως υποθετικό μεσολαβητής της δραστηριότητας 4-HPR. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται επίσης από το γεγονός ότι AF1q έκφραση επιλεκτικά ρυθμίζεται αυξητικά κατά 4-HPR και από την ενεργό μεταβολίτη 4-οξο-4-HPR του, αλλά όχι με RA ή 4-MPR, η οποία απέτυχε να επάγει κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα Α2780 [ ,,,0],27] – [29]. Η έλλειψη επαγωγή AF1q και απόπτωση μετά πρόκληση των κυττάρων με RA είναι συνεπής με το θέμα ότι η 4-HPR βιολογικές επιδράσεις και οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω αντικαρκινικές δραστηριότητες σημαντικά διαφέρουν από εκείνες της κλασσικής ρετινοειδών [9] και βρίσκονται αντίθετα πιο κοντά σε εκείνα που περιγράφονται για άτυπες ρετινοειδή [30]. Μια άμεση σύνδεση μεταξύ AF1q ανοδική ρύθμιση και την απόπτωση που επάγεται από 4-HPR καταδείχθηκε με AF1q σίγηση, η οποία οδήγησε σε μείωση των 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση, υποδηλώνοντας έτσι ότι AF1q είναι, τουλάχιστον εν μέρει, υπεύθυνη για τα αποπτωτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από το ρητινοειδές σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

προηγουμένως έδειξαν ότι η 4-HPR ήταν σε θέση να προκαλέσει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μέσω της ενεργοποίησης του ER στρες ROS → → JNK → ΡΙΑΒ καταρράκτη [11], [12 σηματοδότηση ]. Η επαγωγή μιας τέτοιας καταρράκτη ήταν χαρακτηριστική μόνο των καρκινικών κυττάρων αποκρίνονται σε 4-HPR και δεν ενεργοποιήθηκε σε 4-HPR-ανθεκτικά κύτταρα [12]. έτσι Υποθέσαμε ότι η 4-HPR επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του AF1q, η οποία συνέβη μόνο σε κύτταρα ευαίσθητα στην ρετινοειδούς, θα μπορούσε να είναι ένα ενδιάμεσο του προαναφερθέντος αποπτωτική παθολογική οδό. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, βρήκαμε ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του AF1q εμφανίστηκαν κατάντη της γενιάς ROS, ER αντίδραση στο στρες, την ενεργοποίηση JNK και ΡΙΑΒ αυξορρύθμιση επάγεται από 4-HPR. Στην πραγματικότητα, με αναστολή της οδού σε διαφορετικά επίπεδα χρησιμοποιώντας διαδοχικά το αντιοξειδωτικό βιταμίνη C, ο επιλεκτικός αναστολέας της eIF2α αποφωσφορυλίωσης salubrinal, και το SP600125 αναστολέα JNK (όλα προηγουμένως αποδείχθηκε να προστατεύσει τα κύτταρα Α2780 από 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση [12]) , δείξαμε ότι η 4-HPR επαγόμενη AF1q αυξητική ρύθμιση έντονα μειωμένη. Επιπλέον, αποσιώπηση της προαποπτωτική πρωτεΐνη ΡΙΑΒ (φαίνεται προηγουμένως για να μειωθεί 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση [11]) προκάλεσε μειωμένη ικανότητα του ρετινοειδούς να αυξήσει AF1q έκφρασης. Αντιστρόφως, AF1q σίγηση δεν επηρέασε την ικανότητα του 4-HPR να επάγει ΡΙΑΒ αναρρύθμιση Τα πιο πάνω αποτελέσματα κατέδειξαν ότι AF1q ήταν ένα ενδιάμεσο του ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης ενεργοποιούνται από 4-HPR να επάγει απόπτωση και ότι AF1q upmodulation εμφανίστηκαν κατάντη της επαγωγής ΡΙΑΒ (Σχήμα 6). Ωστόσο, η συμβολή των άλλων σημάτων ROS-εξαρτώμενη με την 4-HPR επαγόμενη AF1q upmodulation δεν μπορεί να αποκλειστεί. Δεν αποτελεί έκπληξη, βρήκαμε ότι AF1q ρυθμίζεται αυξητικά επίσης μετά από κατεργασία με 4-οξο-4-HPR, ένα 4-πολικό HPR μεταβολίτη σε θέση να ενεργοποιήσει την προαναφερθείσα αποπτωτικό καταρράκτη (από την παραγωγή ROS σε επαγωγή ΡΙΑΒ) [31].

σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις μας, την ανάλυση μίας διαθέσιμης στο κοινό σύνολο δεδομένων πείραμα μικροσυστοιχιών για 4-HPR-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα CD34 + κύτταρα από τέσσερις ασθενείς με χρόνια μυελογενή λευχαιμία (GEO προσχώρησης: GSE17480) έδειξε ότι η ρετινοειδή που προκαλείται από έξι φορές αύξηση στην AF1q έκφραση mRNA (Ρ & lt? 0,01) (Σχήμα S1). Στα ίδια κύτταρα, 4-HPR ήταν σε θέση να διεγείρει απόπτωση – προτείνεται να διαμεσολαβείται από την επαγωγή του οξειδωτικού στρες, επιβεβαιώνοντας έτσι τη σχέση μεταξύ ROS μεσολάβηση-απόπτωση που διεγείρεται από 4-HPR και AF1q υπερέκφραση

Σύμφωνα με. με την αποπτωτική ρόλος που προτείνεται από τις παρατηρήσεις μας, AF1q συμμετοχή στη ρύθμιση της απόπτωσης και της αντίστασης στα φάρμακα έχει αναφερθεί από άλλη ερευνητική ομάδα [24], [25]. Οι συγγραφείς έδειξαν ότι σε κύτταρα ανθρώπινου πλακώδους καρκινώματος, AF1q μειορρύθμιση σχετίστηκε με κυτταρικό φαινότυπο δοξορουβικίνη ανθεκτικά και ότι upmodulation AF1q προκάλεσε μια αυξημένη δοξορουβικίνη και γ ακτινοβολία απόπτωση που επάγεται μέσω τρανσενεργοποίηση του προαποπτωτική πρωτεΐνη BAD μέσω NF-kB [24], [25]. Αντίθετα, εμείς δεν παρατηρούμε αυξητική ρύθμιση της BAD σε AF1q-απόπτωση που επάγεται από 4-HPR σε Α2780 κύτταρα. Στην πραγματικότητα, η θεραπεία 4-HPR δεν διαμορφώνουν BAD έκφρασης, ούτε AF1q αιτία αλλαγές αποσιώπηση στα επίπεδα πρωτεϊνών του. Μια πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι θα μπορούσε να επηρεάσει AF1q διαφορετικά BAD έκφραση σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων ή /και σε απόκριση μόνο σε συγκεκριμένα ερεθίσματα. Ωστόσο, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι, όπως και για 4-HPR και 4-οξο-4-HPR [12], [31], δοξορουβικίνη και προκαλούμενη από ακτινοβολία απόπτωση γ έχει επίσης αναφερθεί ότι συνδέεται με την παραγωγή ROS [32] – [34]. Ως εκ τούτου, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι AF1q απόπτωση που διαμεσολαβείται μπορούσε να εξαρτηθεί από προηγούμενη επαγωγή του οξειδωτικού στρες, όχι μόνο για 4-HPR και 4-οξο-4-HPR, αλλά και για άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, αν και προς το παρόν δεν επαρκή απόδειξη υποστηρίζει τέτοια α. υπόθεση

ένα σημαντικό εύρημα της μελέτης μας είναι η ένδειξη ενός ρόλου της AF1q στην εκδήλωση της βασικής απόπτωσης: AF1q upmodulation λαμβάνεται με παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών που προκαλούνται, εν απουσία εξωτερικών ερεθισμάτων, μια αύξηση του ρυθμού αποπτωτικό, επιδεικνύοντας έτσι ένα ρόλο AF1q σε ενεργά επαγωγή της απόπτωσης σε αυτά τα κύτταρα. Μια ολοκληρωμένη κατανόηση των ακριβών φυσιολογικών και παθολογικών λειτουργιών του AF1q είναι σίγουρα στα σπάργανα. Ωστόσο, οι λίγες μελέτες που έχουν διερευνήσει τον ρόλο της αποκάλυψε ότι θα μπορούσε να εμπλέκεται σε τόσο αναστολή και την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου [17] – [25]. Εκτός από την απόδειξη ενός ρόλου ως μεσολαβητής της απόπτωσης, AF1q έχει οριστεί ως μια ογκογόνο παράγοντας που εμπλέκεται στην αιματολογικές κακοήθειες, καθώς και σε στερεούς όγκους [17] – [23]. Είναι αξιοσημείωτο να παρατηρήσουμε ότι, όμοια με εκείνη που αναφέρθηκε για AF1q, ΡΙΑΒ έχει επίσης δειχθεί ότι είναι προικισμένη με μια διπλή λειτουργία στην πρόοδο του καρκίνου [35]. Στην πραγματικότητα, αυτό το μέλος του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης-β υπεροικογένειας μπορεί στην πραγματικότητα αρνητικά ή θετικά ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση και μπορεί να συνεισφέρει στη μετανάστευση του καρκίνου, εισβολή, και μετάσταση. Μολονότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν τις πλειοτροπική λειτουργίες των ΡΙΑΒ δεν είναι ακόμη καλά κατανοητός, έχει προταθεί ότι η πρωτεΐνη μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκων στα πρώιμα στάδια της κακοήθειας, ενώ μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου [35] . Μια ενδιαφέρουσα θεώρηση είναι ότι ΡΙΑΒ και AF1q έχουν άλλα κοινά χαρακτηριστικά: είναι και τα δύο γονίδια RA-στόχος και είναι σε θέση να διεγείρει απόπτωση με την απουσία εξωτερικών ερεθισμάτων [11], [36]. Παρά το γεγονός ότι περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να καθορίσει τις ακριβείς λειτουργίες των AF1q και να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση μεταξύ ΡΙΑΒ και AF1q, τα παρόντα δεδομένα καταδεικνύουν για πρώτη φορά μια σχέση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας επεκτείνεται η γνώση των μηχανισμών δράσης των 4-HPR ότι, ακόμη και αν ερευνηθεί για πολλά χρόνια, δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί πλήρως [8]. Η ταυτοποίηση νέων στόχων του ρετινοειδούς είναι ένα σημαντικό ζήτημα γιατί μπορεί να οδηγήσει σε διευκόλυνση των μελλοντικών σχεδιασμό στρατηγικών συνδυασμού φαρμάκων και για να ξεπεραστεί και να αποτρέψουν την ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου. Επιπλέον, παρέχουμε νέες πληροφορίες σχετικά με τη δραστηριότητα του AF1q, μιας πρωτεΐνης σχετίζεται με τον καρκίνο των οποίων βιολογικές λειτουργίες είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Συγκεκριμένα, αναφέρουμε ότι AF1q εμπλέκεται σε 4-HPR αποπτωτικών και ανάπτυξη ανασταλτικές επιδράσεις και ότι προς τα πάνω ρύθμιση της εξαρτάται από την ενεργοποίηση του ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης που επάγεται από το ρητινοειδές, ανακαλύπτοντας έτσι μια νέα σχέση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και AF1q. Τέλος, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά ένας ρόλος για AF1q στην επαγωγή των βασικών απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αν και απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για να καθοριστούν οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν AF1q-απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Το κύτταρο όγκου ωοθηκών Α2780 σειρές (ελήφθη από τον Dr. Ozols, Bethesda, MD, USA) [31], OVCA432 (που ελήφθη από τον Dr. Knapp, Boston, MA, USA ) [12], OVCAR-3 [12], SKOV-3 [12], και η κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος SK-N-BE (και τα τρία αγοράστηκε από την ATCC, Manassas, VA, USA) [31] διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Lonza, Basel, Switzerland) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Α2780 /HPR (δηλαδή κύτταρα Α2780 γίνονται ανθεκτικά σε 4-HPR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]) κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου συμπληρωμένο με 5 μΜ 4-HPR. Η κυτταρική γραμμή όγκου μαστού T47D (που ελήφθη από τον Dr. R. Sutherland, Sydney, New South Wales, Australia) [31] διατηρήθηκε σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και 0.25 U /ml ινσουλίνη. Το αυχενικό κυτταρική γραμμή καρκινώματος HeLa, αγοράστηκε από την ATCC [31], διατηρήθηκε σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Gibco BRL, Paisley, UK) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO2. 4-HPR, 4-MPR (αμφότερα ευγενώς από τον Dr. J. Crowell, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Bethesda, MD, USA), RA (αγορασμένο από την Sigma, St Louis, ΜΟ, USA), και 4-οξο-4- HPR (που συντίθεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]) διαλύθηκαν σε 10 mM σε DMSO, πριν από την αραίωση σε μέσο καλλιέργειας και αποθηκεύεται στους -80 ° C στο σκοτάδι. Η βιταμίνη C (Sigma) και αναστολέα JNK SP600125 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) προστέθηκαν σε κύτταρα 60 λεπτά και 15 λεπτά πριν από 4-HPR, αντίστοιχα. ER στρες αναστολέα απόκριση salubrinal (Calbiochem) προστέθηκε μαζί με 4-HPR.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με λύση κυττάρων σε δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS) ρυθμιστικού δείγματος (62,5 mM Tris- HCl [ρΗ 6.8], 2% SDS) που περιείχε 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 10 μg /mL πεπστατίνη, 12,5 μg /mL λευπεπτίνη, 2 μg /mL απροτινίνη, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, και 1 mM μολυβδικού νατρίου. κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [37]. Τα ακόλουθα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανοσοαποτύπωση αγοράστηκαν από τις υποδεικνυόμενες προμηθευτές: AF1q από Abnova (Taipei City, Ταϊβάν, # H00010962-M01)? διασπασμένης κασπάσης-3 (Asp175) από την Cell Signaling Biotechnology (Beverly, ΜΑ, USA, # 9661)? BAD από Transduction Laboratories (Lexington, KY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, # 610391)? ΡΙΑΒ από R &? D Systems (Minneapolis, MN, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, # BAF940)? και ακτίνη από την Sigma (# A2066).

Ανάλυση Ανοσοφθορισμού

Cells, αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν σε γυάλινα πλακίδια καλυπτρίδα σε 24 mm τρυβλία Petri, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά , πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια χρωματίζονται με Hoechst 33342 (Sigma) 2 μg /ml σε PBS για 2 λεπτά. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν με 0,1% (v /v) Mowiol (Calbiochem) και αντιμετωπίζεται με ένα μικροσκόπιο φθορισμού [εικόνες καταγράφηκαν με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Spot Insight (Δέλτα Sistemi) εξοπλισμένο με ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας (IAS 2000? Δέλτα Sistemi)] . Τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση των πυρηνικών μορφολογία. Πράσινο κύτταρα φθορισμού με συμπυκνωμένο και ταυτοποιήθηκαν κατακερματισμένη πυρήνων και βαθμολογήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα (τουλάχιστον 200 κύτταρα ανά δείγμα).

Κατασκευή του GFP-tagged AF1q Φορέα Έκφρασης

AF1q εκφράστηκε παροδικά ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GFP συγχωνευμένο με C-τερματικό του. AF1q κωδικοποιητική την περιοχή cDNA στερούνται του κωδικονίου στοπ ελήφθη με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) από ένα πλασμίδιο που περιέχει το cDNA που κωδικοποιεί ανθρώπινο AF1q που λαμβάνεται από το ολοκληρωμένο Μοριακή Ανάλυση των γονιδιωμάτων και έκφραση τους (IMAGE) Consortium (Livermore, CA, USA ) (cDNA κλώνος IMAGE: 305990). Χρησιμοποιήσαμε το εμπρός ολιγονουκλεοτιδικό εκκινητή 5′-ACTCGAGCCACCATGAGGGACCCTGTGAG-3 ‘[το οποίο περιέχει μια θέση XhoI περιορισμού και μία αλληλουχία Kozak (CCACC)], και το αντίστροφο ολιγονουκλεοτιδικό εκκινητή 5′-ATCCGGATCCAGCAAGTCCAGTTCG -3’ (το οποίο περιέχει μία θέση περιορισμού BamHI).