Αφηρημένο

Τα επίπεδα των πρωτεϊνών που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο ρυθμίζεται από την υποβάθμιση ουβικιτίνης-μεσολάβηση το σύστημα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος (UPS) με υπόστρωμα-ειδική λιγάσες ουβικιτίνης E3. Ο αναστολέας κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη, p27kip1 (ρ27), που μπλοκάρει τη κυτταρικού κύκλου σε G1, είναι ubiquitylated από το Ε3 λιγάση SCF-Skp2 /Cks1 για αποικοδόμηση από την UPS. Με τη σειρά του, Skp2 και Cks1 είναι ubiquitylated από το Ε3 λιγάση συγκρότημα APC /Cdh1 για την καταστροφή διατηρώντας έτσι άφθονα επίπεδα των πυρηνικών p27. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι η αέναη υποβάθμιση του πρωτεασώματος της p27 είναι ένα πρώιμο γεγονός στην Τύπου Ι ενδομητρίου καρκινογένεση (ECA), ένα οιστρογόνο (Ε2) επαγόμενη από καρκίνο. Οι παρούσες μελέτες δείχνουν ότι η Ε2 διεγείρει την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών ΕΕΣ και φυσιολογικά πρωτογενή ενδομητρίου επιθηλιακά κύτταρα (EECS) και προκαλεί ΜΑΡΚ-ERK1 /2-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του p27 σε Thr187, μια απαραίτητη προϋπόθεση για την p27 ubiquitylation από πυρηνικά SCF-Skp2 /Cks1 και την επακόλουθη υποβιβασμός. Επιπλέον, Ε2 μειώνεται η Ε3 λιγάση [APC] Cdh1 αφήνοντας Skp2 και Cks1 ανέπαφη για να προκαλέσει υποβάθμιση του p27. Επιπλέον, χτυπώντας τα κάτω Skp2 αποτρέπει E2-επαγόμενη αποδόμηση ρ27 και η διέγερση της ανάπτυξης που υποδηλώνει ότι η παθογένεση της Ε2 που επάγεται ECA εξαρτάται Skp2 μεσολάβηση αποικοδόμηση της ρ27. Αντιστρόφως, η προγεστερόνη (PG) ως ένας αναστολέας της ενδομήτριου πολλαπλασιασμού αυξάνει πυρηνικών ρ27 και Cdh1 στην πρωτοβάθμια EECS και τα κύτταρα ECA. Pg, αυξάνει επίσης Cdh1 πρόσδεσης στην APC για να σχηματίσουν το δραστικό E3ligase. Χτύπημα κάτω Cdh1 προλαμβάνει Pg που προκαλείται από τη σταθεροποίηση του p27 και την αναστολή της ανάπτυξης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ούτε Ε2 ούτε Pg επηρεάζονται μεταγραφή Cdh1, Skp2, Cks1 ούτε ρ27. Οι μελέτες αυτές παρέχουν νέες ιδέες στην ρύθμιση των ορμονών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της UPS. Τα δεδομένα εμπλέκει ότι η πρόληψη της υποβάθμισης των πυρηνικών p27 μπλοκάροντας Skp2 /Cks1 μεσολάβηση της υποβάθμισης της p27 ή την αύξηση Cdh1 να μεσολαβήσει υποβάθμιση της Skp2-Cks1 είναι πιθανές στρατηγικές για την πρόληψη και τη θεραπεία του ΕΕΣ

Παράθεση:. Huang KT, Παυλίδης SC, Lecanda J, Λευκά SV, Mittal KR, Gold LI (2012) οιστρογόνων και της προγεστερόνης ρυθμίζουν τα επίπεδα p27kip1 μέσω της ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος Σύστημα: παθογόνοι και θεραπευτικές συνέπειες για τον καρκίνο του ενδομητρίου. PLoS ONE 7 (9): e46072. doi: 10.1371 /journal.pone.0046072

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Απριλίου, 2012? Αποδεκτές: 27 Αυγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 του Σεπτέμβρη 2012

Copyright: © Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, R01 CA 89175 www.nih.gov (για LIG)? και το Πανεπιστήμιο της Νέας Υόρκης (NYU) Cancer Institute Πιλοτικό Grant έργου (σε LIG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα οιστρογόνα (Ε2) διεγείρει τον πολλαπλασιασμό του ενδομητρίου και της προγεστερόνης (Pg) καταστέλλει Ε2 με γνώμονα τον πολλαπλασιασμό. Ευθυγραμμισμένες με τις επιδράσεις των ορμονών αυτών για την ανάπτυξη, Ε2 επάγει τύπου Ι ενδομητρίου καρκινώματος (ECA? Ποσοστό: 85% του συνόλου των ECA) και αντιστρόφως, Pg χρησιμοποιείται ως θεραπευτικός παράγοντας για υπερπλασία του ενδομητρίου, ο πρόδρομος ECA [1]. ECA είναι η πιο συχνή γυναικολογική κακοήθεια με μία συχνότητα εμφάνισης των 136.000 παγκόσμια περιπτώσεις ανά έτος [2]. Τουλάχιστον το 50% των γυναικών με ενδομητρίου άτυπη υπερπλασία (ΑΕΗ) έχουν συντρέχουσα ΕΕΣ? ένα επιπλέον 30% θα εξελιχθεί σε ECA [3]. Ως εναλλακτική λύση για υστερεκτομή, προγεστίνες αντίστροφη AEH και καλά διαχωριζόμενες ECA που οδηγεί σε υψηλό ποσοστό επιτυχούς εγκυμοσύνης [4], [5]. Ένα επίπεδο κατανόησης μοριακό φυσιολογικών και κακοήθων ρύθμιση ανάπτυξης του ενδομητρίου με Ε2 και Pg είναι σημαντικό να προωθήσει το πεδίο όσον αφορά τον καθορισμό νέων προληπτικών και θεραπευτικών μοριακοί στόχοι για αυτή την ασθένεια. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (Cdk) αναστολέα, p27kip1 (ρ27) κρίσιμη για διακοπή αύξησης, είναι απούσα στους αδένες των δύο AEH και ECA ιστού λόγω της ταχείας και διαρκή υποβάθμιση του p27 μέσω του συστήματος ουβικουϊτίνης πρωτεασώματος (UPS) εμπλέκοντας απώλεια του ρ27 λαμβάνει χώρα νωρίς στην ογκογένεση του ECA [6]. Ευθυγραμμισμένες με τις αντίθετες επιδράσεις της Ε2 και Pg στον πολλαπλασιασμό, δείξαμε επίσης ότι Ε2 προκαλείται υποβάθμιση του πρωτεασώματος της p27 στην πρωτοβάθμια EECS ενώ Pg σημαντικά αυξημένη p27 τόσο στην πρωτοβάθμια όσο ενδομητρίου τα επιθηλιακά κύτταρα (EECS) και τα κύτταρα του Ελεγκτικού Συνεδρίου. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ρ27 είναι ένας σημαντικός μοριακό στόχο που εμπλέκονται τόσο στην παθογένεση και τη θεραπεία της ECA.

Ως ογκοκατασταλτικό και μέλος της οικογένειας CIP /Kip αναστολέων CDK, πολλαπλασιασμός συλλήψεις ρ27 κυττάρων σε φάση G1 του ο κυτταρικός κύκλος αναστέλλοντας δραστηριότητα κυκλίνη /Cdk2 [7]. Σε αντίθεση με άλλους καταστολείς όγκων και αρνητικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, το γονίδιο ρ27

CDKN1B

, σπάνια μεταλλαγμένη σε ανθρώπινους καρκίνους, αλλά αντ ‘αυτού ρ27 επίπεδα είναι ιδιαίτερα ρυθμίζονται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις [7]. Η συγκέντρωση, υποκυτταρικό εντοπισμό και φωσφορυλίωση συγκεκριμένων αμινοξέων μέσα στο μόριο ρ27 τελικά ρυθμίζουν την επίδρασή της στη δραστηριότητα Cdk2 και έτσι, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. ρ27 μετάφραση και η σταθερότητα πρωτεΐνης είναι υψηλότερες στην G0 και στις αρχές του G1 όταν ρ27 συνδέεται με και αναστέλλει κυκλίνη /Cdk2 για διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Καθώς ο κυτταρικός κύκλος προχωρά μέσα G1, αυξητική μειώσεις στην ρ27 αυξήσουν τη δραστηριότητα των CylcinE και κυκλίνη συνδέεται με Cdk2, τα οποία ενεργοποιούν τα γονίδια που εμπλέκονται στην πρόοδο από G1 προς S και την έναρξη της αντιγραφής του DNA [8]. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, ρ27 φωσφορυλιώνεται επί T187 [π-ρ27 (T187)] με κυκλίνη /Cdk2, το οποίο διατηρεί ρ-ρ27 (T187) στον πυρήνα όπου ubiquitylated, η οποία απαιτείται για αποικοδόμηση με Skp2 /Cks1 του SCF

Skp2 Ε3 συγκρότημα λιγάση [7], [9]. Η φωσφορυλίωση του ρ27 σε T187 απαιτεί προηγούμενη φωσφορυλίωση τυροσίνης ρ27 σε τρεις τοποθεσίες στην ανασταλτική τομέα του Cdk2, η οποία μπορεί να επιτευχθεί με την Abl ή κινάσες Src οικογένειας [10]. Η φωσφορυλίωση του ρ27 σε άλλα υπολείμματα αμινοξέων από διαφορετικές κινάσες υπαγορεύει υποκυτταρική εντόπιση του [7], [11], [12], [13], [14]. Είτε ρ27 αποικοδομείται στον πυρήνα ή να απορροφάται στο κυτταρόπλασμα, διακοπή του κυτταρικού κύκλου δεν θα συμβεί εάν υπάρχουν επαρκή επίπεδα πυρηνικής ρ27 για την αναστολή της Cdk2. Είναι σημαντικό ότι, στον πυρήνα, ρ27 είναι κατασταλτική του όγκου αλλά στο κυτταρόπλασμα, είναι ογκογόνος καθώς medicates μετανάστευση /μετάσταση [15], [16], [17]. Όπως και στην ECA, η έλλειψη των πυρηνικών p27 έχει βρεθεί σε πολυάριθμες επιθηλιακές κακοήθειες, [6], [7], [17], [18], [19] και οι δύο μια αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της πυρηνικής ρ27 (χαμηλή) και Skp2 (υψηλή) και την παγίδευση του p27 στο κυτταρόπλασμα σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση [7], [15], [20], [21]

Η ΕΕΤ (Skp1-Cul1-Skp2 /Fbox?. ΕΕΤ -Skp2 /Cks1) και ανάφαση προώθηση συγκρότημα (APC? APC /Cdh1? APC /CDC20) είναι πολυ-υπομονάδα συγκροτήματα Ε3 λιγκάσης της UPS που προκαλούν υποβάθμιση του πρωτεασώματος της κυκλίνης /Cdks και των αναστολέων τους Cdk με ακριβές χρονοδιάγραμμα για να συγχρονίσετε και να ρυθμίζουν την εξέλιξη και σύλληψη του κυτταρικού κύκλου με κυκλικό τρόπο [22], [23]. Πολυουμπικιτίνης σύζευξη πρωτεϊνικών υποστρωμάτων επί λυσινών επιτυγχάνεται με τρία ένζυμα, η οποία μεταφέρει /ενεργοποιεί (Ε1), συζυγών (Ε2) και ligates (Ε3) ουβικιτίνης με την πρωτεΐνη για επιλεκτική αναγνώριση και αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα 26S [24]. Η πρωτεΐνη F-box, Skp2, είναι η μονάδα αναγνώρισης υποστρώματος του SCF-Skp2 /Cks1. διεπαφές Skp2 με τη βοηθητική πρωτεΐνη Cks1 σχηματίζοντας ένα θύλακα που προσδιορίζει ρ-ρ27 (T187) και ubiquitylates το μόριο επί λυσινών 134, 153, και 165 [22], [23], [25]? Skp2 και Cks1 είναι περιοριστικό του ρυθμού για την υποβάθμιση του p27 [9]. Στα τέλη G1-S όταν το επίπεδο της SCF-Skp2 /Cks1 είναι υψηλότερη, Skp2 και Cks1 γίνονται στόχοι αναγνώριση υπόστρωμα για την APC /Cdh1 Ε3 λιγάση συγκρότημα ουβικιτίνης μεσολάβηση υποβάθμιση [26]. Αυτή η υποβάθμιση του Skp2 και Cks1 οδηγεί στην πυρηνική συσσώρευση του ρ27 για G1 σύλληψης [7], [9], [27]. Στο σύνολό τους, μια αύξηση της APC /Cdh1 αυξάνει έμμεσα τα επίπεδα των πυρηνικών p27 προκαλώντας υποβάθμιση της Skp2 και Cks1 και αυτή μείωση στην Skp2 /Cks1 αυξάνει άμεσα την πυρηνική επίπεδα του p27. Επιπλέον, τα επίπεδα της πυρηνικής Skp2 και ρ27 είναι αντιστρόφως ανάλογα με τη διέγερση της ανάπτυξης και της αναστολής της ανάπτυξης στα πλαίσια της ύπαρξης prooncogenic ή όγκου κατασταλτική, αντίστοιχα.

Οι παρούσες μελέτες δείχνουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο τα στεροειδή των ωοθηκών ρυθμίζουν την ανάπτυξη του ενδομητρίου, η οποία είναι μέσω χειραγώγησης των επιπέδων των πρωτεϊνών του UPS και όχι με μεταγραφή. Συγκεκριμένα, αναφέρουν ότι η Ε2 προκαλεί ΜΑΡΚ-ERK1 /2-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση των πυρηνικών p27 σε T187 και μειώνεται η Ε3 λιγάση APC /Cdh1 αφήνοντας Skp2 /Cks1 ανέπαφη για να ubiquitylate πυρηνικών p27 για την αποικοδόμηση με αποτέλεσμα την διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών EECS και του Ελεγκτικού Συνεδρίου . Αντίθετα, Pg αυξάνει Cdh1 και δεσμευτική της να APC? το APC /Cdh1 Ε3 λιγάση προκαλεί υποβάθμιση του πρωτεασώματος των Skp2 και Cks1, αφήνοντας ανέπαφη για αναστολή της ανάπτυξης p27. Προτείνουμε ότι η p27 είναι ένα σημαντικό μοριακό στόχο στα ορμόνης με γνώμονα τον έλεγχο της ανάπτυξης του ενδομητρίου και ότι η πρόληψη της υποβάθμισης p27 είτε μπλοκάροντας Skp2 /Cks1 ή αύξηση Cdh1 είναι ορθολογική προσεγγίσεις για θεραπευτική παρέμβαση της ΑΕΗ και του Ελεγκτικού Συνεδρίου.

Αποτελέσματα

τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη έχουν αντίθετα αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και τα επίπεδα του p27, Skp2 και Cks1 πρωτεΐνες

Σύμφωνα με την ορμονική ανάπτυξη ρυθμιστική δράση στο ενδομήτριο, που στο παρελθόν έδειξαν ότι οι ορμόνες των ωοθηκών, οιστρογόνου (Ε2) και προγεστερόνης (Pg? παρουσία της Ε2 για να αυξηθεί το Pg υποδοχείς [PR] για μια φυσιολογική απόκριση που μιμείται την έμμηνο κύκλο [6], [28], [29]) είχαν αντίθετα αποτελέσματα επί των επιπέδων ρ27 σε πρωτογενείς EECS τέτοια ώστε Ε2 μείωσε τα επίπεδα της ρ27 μέσω της υποβάθμισης διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη και αντιστρόφως, Pg προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση στα επίπεδα ρ27 τόσο EECS και πρωτογενή κύτταρα ECA [6]. Από Skp2 και Cks1, ως συστατικά της ΕΕΤ

Skp2 Ε3 λιγάση αιτία υποβάθμισης της p27 [7], [9], [23], προτείναμε ότι Ε2 και Pg θα ομοίως αντιστρόφως επηρεάσει τα επίπεδα των Skp2 και Cks1 για διέγερση και αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας κύτταρα ECC-1 που εκφράζουν τόσο ΥΟ και PR, δείχνουμε ότι Ε2 προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη και εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση στο ρ27 κατά 36% και 33% με τις απαντήσεις των κορυφών της 1 και 10 ηΜ, επηρεάζεται αντίστοιχα, και αντιστρόφως επίπεδα Skp2 και Cks1 με 5,4-πλάσια και 3-φορές αύξηση, αντίστοιχα, με απόκριση αιχμής 100 ηΜ Ε2 (Σχήμα 1Α, Β). Η μείωση της p27 συμβεί το νωρίτερο 2 ώρες και διατηρήθηκε μέχρι 24 ώρες, ενώ η αύξηση των Skp2 και Cks1 συνέβη αργότερα, κορυφώθηκε σε 24 ώρες. Η αρνητική κυτταρική σειρά KLE ER δεν ανταποκρίνονται στις Ε2, αλλά αντ ‘αυτού, εξέφρασε υψηλά επίπεδα Skp2 και Cks1 αφήνοντας λίγα σε καμία p27. Το αντίθετο αποτέλεσμα δείχθηκε για Pg (συν Ε2), το οποίο προκάλεσε μια αύξηση 2,8 φορές σε ρ27 στα 100 ηΜ Pg και ταυτόχρονη 84% και 75% μείωση στην Skp2 και Cks1, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). p27 σταδιακά αυξήθηκε 12 με 48 ώρες, με αύξηση 3 φορές στις 48 ώρες που εξασθένισε σε 2 φορές σε 72 ώρες, ενώ Skp2 και Cks1 μειώθηκε πάροδο του χρόνου και ήταν σχεδόν απούσα από 24 ώρες (Εικόνα 1D). Είναι σημαντικό να σημειωθεί, ότι οι χρόνοι ανοίγματος των στυπώματα λιγότερο μετά την επαγωγή με Pg σύγκριση με Ε2 αφού τα επίπεδα του ρ27 ήσαν τόσο άφθονα και δεν θα μπορούσε να ποσοτικοποιηθεί σε σχέση με την ακτίνη. Έτσι, τα επίπεδα του ρ27 σε χρόνο μηδέν για τις κηλίδες που δείχνει Ε2 επαγόμενη μειώσεις p27 ήταν σταθερά υψηλότερες και εκείνων που παρουσιάζουν το PG-επαγόμενη αυξήσεις ήταν σταθερά χαμηλότερες. Για την εκτίμηση περισσότερο ποσοτικά τις επιδράσεις της Ε2 και χωριστά, Pg (συν Ε2) σε ρ27 και σταθερότητα Skp2, κύτταρα ECC-1 επωάστηκαν με κυκλοεξιμίδιο (CHX) μόνο ή με την παρουσία της Ε2 ή Pg. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Ε, μετά από 6 ώρες σε καλλιέργεια, Ε2 μείωσε τα επίπεδα της ρ27 κατά 61% σε σύγκριση με 47% κατά CHX μόνος αποδίδοντας μια εκτιμώμενη μείωση της ρ27 ημίσειας ζωής από 1.5 h (6,2 h έναντι 4,7 h? Συνολικός χρόνος επώασης = 18 h). Σε συμφωνία με την ταχύτερη αποικοδόμηση του ρ27 επαχθεί από την Ε2, τα επίπεδα πρωτεΐνης Skp2 αυξήθηκαν κατά 1,3 φορές σε αυτό το χρονικό σημείο. Σε αντίθεση, Pg σταθεροποιηθεί p27 όπως το επίπεδο της πρωτεΐνης p27 αυξήθηκε κατά 1,5 φορές σε 6 ώρες ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης Skp2 μειώθηκαν κατά 45% σε σύγκριση με το 24% από CHX μόνος παράγοντας και η εκτιμώμενη μείωση της Skp2 ημίσειας ζωής κατά 6,2 h (12,9 h έναντι 6,7 h συνολικός χρόνος επώασης = 48 ώρες).

οι λεπτομέρειες είναι στο Υλικά και Μέθοδοι και κάθε σχήμα. Α, Ε2 δόσης-απόκρισης: ECC-1 και KLE κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε2 και ρ27, Skp2, και τα επίπεδα πρωτεΐνης Cks1 προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση. Β, Ε2 χρονική πορεία: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 για τους χρόνους που υποδεικνύονται και τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίζεται όπως παραπάνω. C, Pg δόσης-απόκρισης: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Pg /Ε2 και ρ27, Skp2 και τα επίπεδα πρωτεΐνης Cks1 προσδιορίζεται όπως παραπάνω. D, Σελ χρονική πορεία: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Pg /Ε2 για τους χρόνους που δείχνονται και τα επίπεδα πρωτεΐνης όπως παραπάνω. Οι πυκνομετρικές σαρώσεις όλες τις ζώνες πρωτεΐνης φαίνεται από τις γραφικές παραστάσεις στα δεξιά της κάθε κηλίδα. Κάθε ζώνη ήταν ομαλοποιήθηκε ως προς ακτίνη και στη συνέχεια συγκρίνονται με 0 χρόνος ή χωρίς επεξεργασία έλεγχο. Τα δεδομένα εκφράζονται ως σχετική ένταση κάθε ζώνης ± τυπική απόκλιση. Ε, Ε2 /Pg κυκλοεξιμίδιο (CHX) θεραπεία: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 για 18 ώρες ή με Ε2 και Pg για 48 ώρες. CHX προστέθηκε 6 ώρες πριν από την τελική συγκομιδή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 0,1,2, και 6 ώρα h σημεία. CHX και μόνο ήταν η βασική γραμμή ελέγχου. Τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για ρ27 και Skp2 και τα επίπεδα του κάθε ζώνη πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με πυκνομετρία (ένταση ζώνης). Η ποσοστιαία αλλαγή σε κάθε παράμετρο θεραπείας υπολογίστηκε με βάση το χρονικό σημείο μηδέν για κάθε ομάδα. Πρωτεΐνη στροφή-over προσδιορίστηκε με σύγκριση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με CHX μόνη σύγκριση με CHX παρουσία κάθε ορμόνη σε κάθε χρονικό σημείο. Οι γραφικές παραστάσεις γραμμή αντιπροσωπεύουν την σχετική ένταση κάθε ζώνης ομαλοποιήθηκαν με ακτίνη για κάθε ομάδα. F, G: Ε2 διεγείρει και το Pg αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 ή Pg /Ε2 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε με MTS δοκιμασίας (Υλικά και Μέθοδοι) * ρ & lt? 0.05. H, Cell κατανομή του κύκλου: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Ε2 ή Ε2 /Pg και ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε όπως περιγράφεται Υλικά και Μέθοδοι

Η

Σύμφωνα με τις μέγιστες συγκεντρώσεις της Ε2 και Pg επιπτώσεις στην p27. , Skp2, και Cks1, Ε2 επαγόμενο κυτταρικό πολλαπλασιασμό με αποκρίσεις αιχμή του 26-20% σε σχέση με μη επεξεργασμένων ελέγχων στα 0.1 ηΜ και 1 ηΜ (Σχήμα 1 F), αντίστοιχα, ενώ το Pg ανέστειλε πολλαπλασιασμό με κορυφή απόκριση του 27% με 100 ηΜ (Εικόνα 1G). Μετά την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, επιβεβαιώσαμε ότι οι ορμόνες επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως αντικατοπτρίζεται από τις επιπτώσεις τους στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 1). Μετά από 18 ώρες αγωγή με Ε2, ο αριθμός των κυττάρων ECC-1 σε G1 μειώθηκε από 58% σε 49% και την αύξηση σε G2 και S από 14% σε 15% και 29% σε 36%, αντίστοιχα. Μετά τη θεραπεία Pg στις 48 ώρες, το κλάσμα των κυττάρων στην G1 αυξήθηκε από 58% σε 67% και μειώθηκε σε G2 και S από 13% σε 10% και 27% έως 23%, αντίστοιχα.

οιστρογόνο επάγεται ERK εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του p27 σε Thr187

η φωσφορυλίωση του p27 σε T187 παρέχει τη μοριακή διαμόρφωση για ubiquitylation του από SCF-Skp2 /Cks1 [22]. Το σχήμα 2Α απεικονίζει ότι Ε2 προκάλεσε μία 2,5-πλάσια και 2,3-πλάσια αύξηση στην φωσφορυλίωση της ρ27 στο T187 (ρ-p27 [T187]) στο 1 ηΜ και 10 ηΜ Ε2, αντίστοιχα σε κύτταρα ECC-1 (και σε κύτταρα HEC-1B? Σχήμα S1A), με μια 11-πλάσια κορυφή απόκριση του ρ-p27 (T187) σε 18 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα 2Β) που ήταν ΜΑΡΚ-εξαρτώμενο (Σχήμα S1B). Όπως δείχνεται εδώ, αυτή είναι η ταυτόσημη κορυφή δόση και χρόνος απόκρισης στις οποίες ρ27 αποικοδομείται από Ε2 (συνεπής με τα Σχήματα 1Α και 1C) σε κύτταρα ECC-1. Σε αρχικά πειράματα, ούτε η πρωτεασώματος αναστολέας, λακτακυστίνη και ο αναστολέας φωσφατάσης σερίνης /θρεονίνης, οκαδαϊκό οξύ ήταν αναγκαίο να διατηρηθεί ρ27 στην κατάσταση υψηλής π-ρ27 (T187) υποδηλώνοντας ότι ο ρυθμός αποικοδόμησης του πρωτεασώματος του ρ-p27 (T187) είναι πιο αργή από ό, τι φωσφορυλίωση T187. Δείχνουμε επίσης ότι η ERK ενεργοποιείται με Ε2 καθοδικά από ΜΕΚ1 (μπλοκαριστεί από U0126) (Σχήμα 2C). Από αυτά τα δεδομένα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι E2-επαγόμενη φωσφορυλίωση της ρ27 στο T187 είναι ΜΑΡΚ /ΕΚΚ-εξαρτώμενη και ER-ειδικές αποκρίσεις. Τέλος, siRNA knock-down του ERK1 και χωριστά, ERK2 (82%, 70% αποδοτικότητα, αντίστοιχα) μειώθηκε ρ-ρ27 (T187) στα μη επεξεργασμένα κύτταρα knockdown σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (Εικόνα 2D). Όπως φαίνεται και στις δύο μη επιμολυσμένα και να ελέγχουν siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, φαίνεται ότι ERK2 είναι περισσότερο εντόνως εκφρασμένος από ERK1 (Ν.Β. αυτό μπορεί να οφείλεται σε υψηλότερη ειδικότητα του αντισώματος για ΕΚΚ2 από ERK1). Η κηλίδα δείχνει ότι χτυπήσει κάτω ERK2 μείωσε τη φωσφορυλίωση του ρ27 σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι να χτυπήσει τα κάτω ERK1 (σύγκρινε τα επίπεδα του p-p27 (T187) σε ERK1 και ERK2 knock-down για τον έλεγχο siRNA). Λόγω της αποτελεσματικότητας knock-down και την υψηλότερη έκφραση του ERKs από αυτά τα κύτταρα με και χωρίς E2-επαγωγή, είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί η συμβολή των ERK1 και ERK2 στον E2-επαγόμενη ΜΑΡΚ καθοδηγείται φωσφορυλίωση της ρ27 στο T187. Παρ ‘όλα αυτά, φαίνεται ότι η Ε2 ενεργοποιεί τόσο ERK1 και ERK2 για την φωσφορυλίωση της ρ27 επί T187 για αναγνώριση από SCF-Skp2 /Cks1 (Εικόνα 2D και σχήμα S1B)

Α, Ε2 δόσης-απόκρισης:. ΕΟΚ-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε2 και ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κουνελιού αντι-ανθρώπινου φωσφο-ρ27 (ρ-p27 [T187]), όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Β, χρονική πορεία Ε2: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα επίπεδα Ε2 και της πρωτεΐνης προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση όπως στο Α, C, Ε2, φωσφο-ΕΚΚ: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 παρουσία των προϊόντων λύσης U0126 ή ICI και κύτταρο ανοσοστυπώθηκαν για ρ-ρ27 (T187), φωσφο ΕΚΚ (ρ-ERK), και ολική ΕΚΚ, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. D, Ε2, Ανάλυση ERK1 και ενεργοποίηση ERK2 εξής knock-down τους με siRNA: κύτταρα ECC-1 επιμολύνθηκαν με ERK1, ERK2, ή ελέγχουν siRNA, υφίσταται κατεργασία με Ε2 παρουσία ή απουσία της ICI, που ακολουθείται από κυτταρική κλασμάτωση, και ανοσοκηλίδωση για το σύνολο και φωσφο-ΕΚΚ-1 (ρ-ERK1) και ERK2 (ρ-ΕΚΚ2), όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

η

η κατάρριψη Skp2 αυξημένη πυρηνικά και κυτταροπλασματικά ρ27 και αποκλείστηκαν σε οιστρογόνο επαγόμενη αποικοδόμηση της ρ27 [από SCF-Skp2 /Cks1] και στα δύο κυτταρικά διαμερίσματα

δείχνουν σαφώς ότι καθώς τα επίπεδα Skp2 και Cks1 αυξημένα, τα επίπεδα ρ27 μειώνονται με την διέγερση της ανάπτυξης σε απόκριση προς Ε2 (Σχήματα 1Α, Β, ΜΙ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, να χτυπήσει κάτω Skp2 (SKP2 siRNA? 80% αποδοτικότητα) προκάλεσε 8.2-πλάσια αύξηση σε ρ27. Η υποβάθμιση του p27 από Skp2 φέρεται να συμβεί στον πυρήνα [9], [30]. Ωστόσο, βρήκαμε ότι Ε2 προκάλεσε μια 2,5 φορές και 1,9 φορές αύξηση στην Skp2 στον πυρήνα και κυτταροπλασματική κλάσματα, αντίστοιχα, και μία μείωση 50% σε ρ27 στα δύο κλάσματα (Σχήμα 3Β, αριστερά πάνελ). Είναι σημαντικό ότι, αποδεικνύουμε ότι μετά knockdown του Skp2, Ε2-επαγόμενη αποικοδόμηση ρ27 μπλοκαρίστηκε στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα (Σχήμα 3Β, δεξιά πάνελ και το Σχήμα S2), ότι η διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με Ε2 εντελώς αποτραπεί (Σχήμα 3C), και ότι η E2-επαγόμενη μείωση σε ρ27 ήταν ER- και πρωτεασώματος εξαρτώμενη στις δύο υποκυτταρικά κλάσματα (Σχήμα 3Β, αριστερό πάνελ). Πιθανόν, η μείωση της ανάπτυξης μετά Skp2 knockdown οφείλεται στην αύξηση των επιπέδων ρ27 (όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, δεξιό πλαίσιο). Αυτά τα πειράματα εμπλέκουν Skp2 της SCF-Skp2 /Cks1 ως άμεσο διαμεσολαβητή του Ε2 που προκαλείται υποβάθμιση του p27

Α, Β, Ε2, Skp2 νοκ ντάουν:. Κύτταρα ECC-1 επιμολύνθηκαν παροδικά με Skp2 ή τον έλεγχο siRNA , επεξεργασμένα με Ε2 μόνο του ή σε παρουσία 1 μΜ λακτακυστίνη (Lac) ή 10 ηΜ ICI, υποβάλλεται σε κυτταρικό κλασματοποίηση, ρ27 και τα επίπεδα Skp2 προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Στον Πίνακα Α, knock-down αποδοτικότητα προσδιορίσθηκε με σύγκριση κυτταρολύματα από Skp2 siRNA και ελέγχου siRNA κατεργασμένα κύτταρα με ανοσοκηλίδωση. Τα σχετικά επίπεδα ρ27 που αντιπροσωπεύεται από τον πυκνομετρική σάρωση κάτω από την κηλίδα. Ε2, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε Skp2 knockdown κυττάρων: τα κύτταρα ECC-1, επιμολυσμένα με Skp2 ή ελέγχουν siRNA, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε2 ή δεν αντιμετωπίζεται και τον πολλαπλασιασμό προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. * P ≤ 0,05

Η

Τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη έχουν αντίθετα αποτελέσματα στα επίπεδα της πρωτεΐνης Cdh1 να ρυθμίσει τελικά το επίπεδο της πρωτεΐνης πυρηνικής p27.? Pg και Ε2 δεν επηρεάζουν τα επίπεδα του mRNA της Cdh1, Skp2, Cks1 ή p27

Η ubiquitylation και την υποβάθμιση των Skp2 και Cks1 από το Ε3 λιγάση APC /Cdh1 θα αποτρέψει την υποβάθμιση του p27. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι τα επίπεδα [APC] Cdh1 θα μεταβάλλονται άμεσα με την p27 και ως εκ τούτου να ρυθμιστεί σε ένα αντιτιθέμενο τρόπο με Ε2 και Pg. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, ενώ η αγωγή Ε2 κυττάρων ECC-1 χρονικά εξαρτώμενο μειώθηκε Cdh1 με μέγιστο αποτέλεσμα 56% σε 18 ώρες (Εικόνα 4Α), Pg-θεραπεία αυξήθηκε Cdh1 την πάροδο του χρόνου με μέγιστη απόκριση του 1,7 φορές στους 48 h (Σχήμα 4Β). Σε αντίθεση ούτε Ε2 ούτε Pg επηρεάζονται μεταγραφή του Cdh1, ρ27, Skp2, ή Cks1 σε πρώιμα χρονικά σημεία έως 24 ώρες (Εικόνα 4C), και 12 ώρες (Εικόνα 4D), αντίστοιχα, ενώ η απόκριση του mRNA των κοινών γονιδίων που περιέχουν μεταγραφικές ανταποκρινόμενα στοιχεία για ER και PR, δηλαδή, PR και glycodelin, αντίστοιχα, είναι υψηλή (Εικόνα 4D).

Α, Β, Χρόνος πορεία της Ε2 και Pg [συν Ε2] επεξεργασία των κυττάρων ΕΟΚ-1. κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 και Pg συν Ε2, τα πειράματα τερματίζεται κατά τους χρόνους που υποδεικνύονται, τα προϊόντα λύσης παρασκευάζονται, και τα επίπεδα πρωτεΐνης Cdh1 προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. C, τα επίπεδα D, Ε2, Pg, το mRNA του ρ27, Skp2, Cks1 και Cdh1: κύτταρα ECC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 ή Pg /Ε2, το ολικό RNA εκχυλίζεται στους χρόνους που παρουσιάζεται, και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR εκτελέστηκε, όλα στο Υλικά και Μέθοδοι. PR και glycodelin εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για ER και του στόχου PR γονίδια, αντίστοιχα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Μετά Ε2- θεραπεία του ΕΚΚ-1 κύτταρα και μετέπειτα υποκυτταρική κλασματοποίηση, μείωση 21% σε Cdh1 δείχθηκε στο πυρηνικό κλάσμα. Αυτή η μείωση του επιπέδου των Cdh1 αντιστράφηκε με λακτακυστίνη (Σχήμα 5Α) υποδηλώνοντας ότι E2 ρυθμίζει τα επίπεδα των Cdh1 με αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της Skp2 μειώθηκε κατά 18% με τη θεραπεία Ε2 παρουσία λακτακυστίνη τόσο στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα και επίσης, κατά λακτακυστίνη και μόνο, φαίνεται εδώ σε συνολικά κυτταρολύματα (κατά 37%? Ένθετο του Σχήματος 5Α). Το αποτέλεσμα αυτό είναι δύσκολο να εξηγηθεί και αν λακτακυστίνη χρησιμοποιείται ευρέως για την αναστολή της υποβάθμισης πρωτεασώματος, θα μπορούσε να υπάρχει εκτός στόχου επιπτώσεις, όπως πρωτεόλυση Skp2 με διαφορετικά μονοπάτια υποβάθμισης

Α, Ε2.? Β, Pg, Cell κλασματοποίηση και ανάλυση των Cdh1, Skp2, Cks1, πρωτεΐνες ρ27 και ρ-ρ27 (T187): Τα κύτταρα είτε χωρίς θεραπεία, θεραπεία με Ε2, Ε2 συν Lac ή σε επεξεργασία με Pg /Ε2 με ή χωρίς 1 μΜ λακτακυστίνη ( Lac) ή RU486. Τα κύτταρα κλασματοποιήθηκαν και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση, όλοι περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η

και κύριο θέμα στην Α

δείχνει ότι λακτακυστίνη μειώνει τα επίπεδα της πρωτεΐνης Skp2. C., Pg, Cdh1 πρόσδεσης στην APC: Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Pg /Ε2, λύματα κυττάρων ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-Cdh1 ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με αντι-Cdc27, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. D, διάγραμμα απεικονίζει APC /Cdh1 ως ανάντη Ε3 λιγάση που ubiquitylates Skp2 /Cks1 (από το συγκρότημα ΕΕΤ), η οποία είναι ο μεταγενέστερος Ε3 λιγάση που ubiquitylates p27 στη ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης p27.

Η

Είναι αξιοσημείωτο ότι σε αντίθεση με Skp2, Cks1, και ρ27, Cdh1 δεν είναι παρόν στο κυτταρόπλασμα. Μια ταυτόχρονη μείωση στην ρ27 παρατηρήθηκε σε αμφότερα τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα κατά 30% και 61%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους (βασικοκυτταρικό ρ27 ήταν υψηλότερη στον πυρήνα από το κυτταρόπλασμα των μη επεξεργασμένων κυττάρων). Συνεπής με την πυρηνική μείωση της p27, π-p27 (T187) αυξήθηκε για τον εντοπισμό και ubiquitylation της p27 από Skp2 /Cks1 για την αποικοδόμηση της. Επιπλέον, λακτακυστίνη ανέστειλε αποδόμηση ρ27 τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα και αυξημένη ρ-ρ27 (T187) κατά 2,4 φορές μόνο στο πυρηνικό κλάσμα επιβεβαιώνοντας ότι ρ27 φωσφορυλιώνεται επί T187 στον πυρήνα και επιπλέον, παραμένει και συσσωρεύεται στον πυρήνα, όταν του αποικοδόμηση αναστέλλεται από λακτακυστίνη (ίδια όπως το Σχήμα 3Β, αριστερό πάνελ). Μια αναμενόμενη αντίστροφη σχέση μεταξύ της p27 και των επιπέδων Skp2 φάνηκε μετά από Ε2-αγωγή τόσο στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα. Αντιστρόφως, θεραπευτική αγωγή Pg του ΕΚΚ-1 κύτταρα προκάλεσε μία 1,65-πλάσια αύξηση τόσο Cdh1 και ρ27 στον πυρήνα, ενώ αυτή η ορμόνη μειώθηκαν Skp2 κατά 66% στο κυτταρόπλασμα και τόσο Skp2 και Cks1 κατά 62% στο πυρηνικό κλάσμα? Αυτές οι ανταποκρίσεις ήταν PR-ειδική (Σχήμα 5Β). Σε αντίθεση με τη θεραπεία Ε2 στην οποία έλαβε χώρα αποικοδόμηση ρ27 και στα δύο κυτταρικά διαμερίσματα, ρ27 σταθεροποιήθηκε σε μεγάλο βαθμό στον πυρήνα με Pg (1.7 έναντι 1.1 φορές). Είναι πιθανό ότι Skp2 και Cks1 αποικοδομήθηκαν μέσω του UPS αφού λακτακυστίνη αυξημένη Skp2 και Cks1 στον πυρήνα και Cks1 στο κυτταρόπλασμα, καθώς και. Ενώ δείχνουμε τα επίπεδα Cdh1 αυξήθηκε κατά Pg, αυτή η πρωτεΐνη θα πρέπει να συνδέεται με το συγκρότημα APC [σε υπο-φωσφορυλιωμένη κατάσταση] για να ασκήσει ειδική δραστικότητα του Ε3 λιγάσης [31], [32], [33]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, Pg πράγματι αύξησε την πρόσδεση του Cdh1 στην APC φαινομενικά αυξανόμενη δραστηριότητα λιγάσης Ε3 για Skp2 και Cks1 και έτσι, την υποβάθμιση του πρωτεασώματος τους. Στο σύνολό τους, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, τα αποτελέσματα μας εμπλέκουν Cdh1 ως ανάντη ρυθμιστής των επιπέδων του ρ27 μέσω του UPS (δηλαδή, SCF-Skp2 /Cks1) και την κρίσιμη σύνδεσμο για επιτέλεση ορμονική ρύθμιση της ανάπτυξης.

η κατάρριψη μπλοκ Cdh1 Pg μεσολάβηση συσσώρευση των πυρηνικών p27 και την ανάπτυξη αναστολή

το σχήμα 6Α δείχνει ότι χτυπούν κάτω Cdh1 (

FZR

γονίδιο? 87% απόδοση) μπλοκάρει εντελώς το Pg που προκαλείται από 1.6 πλάσια αύξηση στην πυρηνική p27 (Σχήμα 6Β, δεξιά πάνελ) και την επίδραση αναστολής αύξησης 30% (Σχήμα 6C). Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός μερικώς μπλοκαριστεί στα μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα Pg Cdh1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Ενώ Pg προκάλεσε μία μείωση στην πυρηνική Skp2 και Cks1 (σχήματα 5Β, 6Β), η έλλειψη δραστηριότητας λιγάσης Cdh1 Ε3 στα κύτταρα knock-down, expectedly αυξάνει τα βασικά επίπεδα της πυρηνικής Skp2 και Cks1 (Σχήμα 6Β, δεξιά πάνελ). Επιπλέον, Pg-θεραπεία μειώθηκε κυτταροπλασματική Skp2 τόσο στον έλεγχο όσο και siRNA Cdh1 siRNA κατά 51% και 45%, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β, αριστερά πάνελ). Αυτά τα δεδομένα παρέχουν ισχυρή στήριξη για ένα μηχανισμό με τον οποίο PR μεσολάβηση δράση Pg αυξάνει την πυρηνική ρ27 για την αναστολή του πολλαπλασιασμού αυξάνοντας Cdh1 στον πυρήνα, η οποία με τη σειρά της αποικοδομεί Cks1 και Skp2, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση τους σε παρουσία λακτακυστίνη και Pg [ ,,,0],συν Ε2] (Σχήμα 5Β)

Α, Pg, Cdh1 knockdown:. κύτταρα ECC-1 επιμολύνθηκαν παροδικά με Cdh1 siRNA που ακολουθείται από κυτταροπλασματικές /πυρηνικού διαχωρισμού, και knockdown αποτελεσματικότητα προσδιορίζεται σε κάθε κλάσμα με σύγκριση ελέγχου siRNA και Cdh1 siRNA επιμολυσμένα λύματα κυττάρων. Β, Pg, Cdh1 knock-down και υποκυτταρικής κλασμάτωσης: επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Pg /Ε2 με ή χωρίς RU486, υποβάλλεται σε κυτταρική κλασμάτωση, και ανάλυση ανοσοστυπώματος πραγματοποιήθηκε σε knock-down και κύτταρα ελέγχου siRNA για πρωτεΐνες που φαίνεται? όλα περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι Πυκνομετρικές σαρώσεις (σχετική ένταση) κάθε ζώνης πρωτεΐνης που αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα απόκρισης σε σχέση με την ακτίνη και σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες φαίνεται στο παρακάτω διάγραμμα. C, Pg, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα knockdown Cdh1: κύτταρα επιμολυσμένα με Cdh1 ή ελέγχου siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία pg /Ε2 ή δεν αντιμετωπίζεται και τον πολλαπλασιασμό αναλύθηκαν με δοκιμασία MTS όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι? * P & lt?. 0.05

Η

Τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη έχουν αντίθετες επιπτώσεις στην p27 και πρωτεΐνες της ουβικιτίνης-πρωτεασώματος συστήματος στην πρωτοβάθμια ενδομητρίου επιθηλιακά κύτταρα

EECS από ενδομήτριου ιστού έδωσαν τις ίδιες απαντήσεις για p27 , Cdh1, Skp2 και Cks1 όπως φαίνεται για την κυτταρική γραμμή ECC-1 μετά από αγωγή με Ε2 και Pg. Συγκεκριμένα, Ε2 μέσω του ER μειώθηκε ρ27 κατά 88% (Σχήμα 6Α) και Cdh1 κατά 71% και την αύξηση της Skp2 και Cks1 κατά 1,2 και 2,3 φορές, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, Pg-θεραπεία της πρωτογενούς EECS αυξημένη ρ27 και Cdh1 κατά 2,7 φορές και 1,8 φορές, αντίστοιχα, ενώ Skp2 και Cks1 και οι δύο μειώθηκαν κατά 69% (Σχήμα 7Β). Θεραπεία πρωτογενών κυττάρων με Ε2 διεγείρονται αύξηση κατά 18% και 15%, ενώ Pg (συν Ε2) ανέστειλε την ανάπτυξη κατά 33% και 29%, η οποία ήταν σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη με RU486 (Σχήμα 7C και 7D) και στους δύο ασθενείς. Πυρηνική-κυτταροπλασματική κλασμάτωση EECS από μία κανονική ενδομήτριου ιστού αποκάλυψε ότι Cdh1 ήταν παρούσα μόνο στον πυρήνα και ότι Ε2 μειώθηκε Cdh1 κατά 41%, μειώθηκε ρ27 κυρίως στον πυρήνα (κατά 50%), αυξημένη Skp2 στα δύο κλάσματα, αλλά ως επί το πλείστον στην πυρήνα (1,3 φορές), και αυξημένη Cks1 στα δύο κλάσματα, αλλά με περισσότερο στο κυτταρόπλασμα (1,5-φορές? Σχήμα 7Ε). Σε άμεση αντίθεση, Pg αυξημένη κυρίως πυρηνική ρ27 κατά 2,6 φορές και πυρηνικών Cdh1 κατά 1,3 φορές ενώ Skp2 μειώθηκε στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα κατά 41%, και 89%, αντίστοιχα. Pg μειωμένη Cks1 κατά 50% στον πυρήνα και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ Cdh1 δεν βρέθηκε στο κυτταρόπλασμα στην κυτταρική σειρά ECC-1 και πρωτογενείς κανονική EECS (n = 3), Cdh1 ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα σε πρωτογενή κύτταρα ECA (n = 3, των τάξεων II, III? Σχήμα 7F) , η οποία μειώθηκε κατά 44% σε αυτό το υποκυτταρικού κλάσματος, ενώ αυξήθηκε στον πυρήνα κατά 44%, μετά από αγωγή Pg. Το ίδιο πρότυπο φάνηκε για ρ27, η οποία ήταν παρούσα στο κυτταρόπλασμα και αυξημένη στον πυρήνα κατά 1,4 φορές σε απόκριση προς το PG. Οι συνεπείς απαντήσεις σε Ε2 και Pg παρατηρήθηκε μεταξύ των τεσσάρων κανονική πρωτοβάθμια EECS όχι μόνο εμπλέκουν αυτή τη συνοχή μπορεί να επιτευχθεί παρά την ετερογένεια των ασθενών, αλλά δείχνουν ότι οι απαντήσεις των ορμονών που παρατηρείται στις αθάνατες κυτταρικές γραμμές είναι πιθανό φυσιολογικές.

Α, Ε2? Β, η θεραπεία της πρωτογενούς Pg EECS: κανονική EECS από πολλαπλασιαστική φάση υπέστησαν αγωγή είτε με Ε2 χωρίς ή με την ICI ή αγωγή με Pg /Ε2 με ή χωρίς RU486, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για τα επίπεδα πρωτεΐνης η οποία απεικονίζεται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Α και Β είναι διαφορετικοί ασθενείς δείχνουν διαφορετικές βασικά επίπεδα της ρ27 και Cdh1. C, D: Ε2, Ε2 συν θεραπεία Pg, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (με δοκιμασία MTS): παράλληλο πείραμα για ασθενή # 2, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι? * P & lt? 0,05. Ε, Ε2, θεραπεία Pg, υποκυτταρική κλασματοποίηση: Πρωτογενής EECS από πολλαπλασιαστική φάση υπέστησαν κατεργασία με Ε2 ή Pg /Ε2, υποβάλλεται σε υποκυτταρική κλασματοποίηση, και ανάλυση ανοσοστυπώματος για τα επίπεδα πρωτεΐνης η οποία απεικονίζεται και πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.