Αφηρημένο

Andrographis lineata

είναι ένα φυτικό φαρμακευτικό φυτό που χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή ιατρική ως υποκατάστατο για το

Andrographis paniculata

. Εδώ, χρησιμοποιώντας ώριμο έκφυτα φύλλων του

A

.

lineata

έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά η επαγωγή κάλων καθορίστηκε με μέσο MS που περιέχει 1.0 mg l

-1 ΙΑΑ. Αποξηραμένα κάλος υποβλήθηκε σε εκχύλιση με διαλύτη με ακετόνη. Περαιτέρω το υπόλειμμα ακετόνη διαχωρίστηκε με χρωματογραφία στήλης σίλικα τζελ, κρυσταλλώνεται και η οποία χαρακτηρίζεται με βάση πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (πρωτόνιο και C13) και υγρής χρωματογραφίας φασματοσκοπίας μάζας. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε την εμφάνιση δύο γνωστών φλαβόνες δηλαδή, 7-

O

-methylwogonin (MW) και Echioidinin (ED). Επιπλέον, αυτές οι ενώσεις ελέγχθηκαν ως προς την κυτταροτοξικότητα τους ενάντια λευχαιμική κυτταρική σειρά, CEM. Εντοπίζουμε ότι ED και MW επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε ένα χρόνο και τη συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω αύξηση στην απελευθέρωση LDH κατά την κατεργασία με ED και MW επιβεβαιώθηκε περαιτέρω αποτελέσματα κυτταροτοξικότητας μας ενάντια λευχαιμική κυτταρική σειρά. Εντυπωσιακά, MW ήταν πιο ισχυρό από ED σε σύγκριση με trypan blue και ΜΤΤ δοκιμασίες. Τα αποτελέσματά μας ανακεφαλαιώνουν τη χρησιμότητα των καλλιέργειες κάλου για την παραγωγή φυτικών ειδικών βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών αντί να χρησιμοποιούν άγρια ​​φυτά. Μαζί,

in vitro

μελέτες μας παρέχουν νέες ιδέες του

A

.

lineata

κάλος πολιτισμών χρησιμεύει ως πηγή για τον καρκίνο χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

Παράθεση:. Mohammed A, Chiruvella ΚΚ, Rao YK, Geethangili Μ, Raghavan SC, Ghanta RG (2015)

Σε vitro

Παραγωγή Echioidinin, 7-

O

-Methywogonin από κάλων καλλιέργειες

Andrographis lineata

και κυτταροτοξικότητα τους σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (10): e0141154. doi: 10.1371 /journal.pone.0141154

Επιμέλεια: Brett Neilan, Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: May 26, 2015? Αποδεκτές: 3η Οκτωβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 21 Οκτώβρη του 2015

Copyright: © 2015 Mohammed κ.ά.. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Συντομογραφίες: MS, Murashige και Skoog? ΒΑ, βενζυλαδενίνη? ΙΑΑ, ινδόλη 3 οξικό οξύ? ΝΑΑ, ναφθαλινο οξικό οξύ? 2,4-D, 2,4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ? TLC, χρωματογραφία λεπτής στιβάδας? NMR, πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός? LC /MS, υγρή χρωματογραφία /φασματομετρία μάζας? UV, υπεριώδης ορατή φασματοσκοπία? IR, υπέρυθρη φασματοσκοπία? ΜΤΤ, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου? MW, 7-

O

-methylwogonin? ΕΔ, echoidinin? DMF, διμεθυλοφορμαμίδιο? DMSO, διμεθυλοσουλφοξείδιο? nm, νανόμετρο? MHz, μέγα hertz

Εισαγωγή

Μεταξύ όλων των τύπων καρκίνου, λευχαιμίας θεωρείται μία από τις πιο επιθετικές απειλεί αιματολογικές κακοήθειες με τα εκατομμύρια των ασθενών που διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο τη ζωή. Λευχαιμία βρίσκεται να είναι πολύ ευαίσθητα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [1]. Διαλογή φυσικών προϊόντων που προέρχονται από φαρμακευτικά φυτά έχουν πολλά υποσχόμενη ως πολύτιμες πηγές για αντικαρκινικών φαρμάκων. Φυσικά προϊόντα ασκούν αντικαρκινική δυναμικά με αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης [2,3]. Φυτικά εκχυλίσματα τα οποία εμφανίζουν αντικαρκινική δράση είναι μίγμα όλων των ενώσεων που υπάρχουν στο εκχύλισμα αντί της συγκεκριμένης ένωσης [4,5]. Αυτό προτρέπει για την αναζήτηση των απομονωμένων ενώσεων με σαφώς καθορισμένες φαρμακολογικές ιδιότητες.

In vitro

πολιτισμούς που απασχολούν φυτό τεχνολογία καλλιέργειας ιστών είναι πλεονεκτική έναντι άθικτο φυτό να παράγει δευτερογενείς μεταβολίτες, χωρίς να καταστρέφουν το φυσικό ενδιαίτημα [6,7,8]. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ο ρυθμός ανάπτυξης κυττάρου και τη βιοσύνθεση σε καλλιέργεια ξεκίνησε από μία μικρή ποσότητα του φυτικού υλικού είναι αρκετά υψηλό, αισθητά παράγεται σε ένα σύντομο χρονικό διάστημα. Χειρισμό συνθήκες καλλιέργειας, φυτορμονών είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την αύξηση του επιπέδου των βιοδραστικών μεταβολιτών [9]. Αυτό είναι σε αντίθεση με μεγάλο αριθμό

in vivo

φυτά που χρησιμοποιούνται για τη λήψη μιας μικρής ποσότητας ναρκωτικών.

Η παραγωγή των φαρμακευτικών ενώσεων φυτικής προέλευσης είναι ένα ζήτημα σημαντικό κοινωνικο-οικονομική σημασία. Αυτό ώθησε τις βιομηχανίες, καθώς και επιστήμονες για να εξετάσει τη χρήση του

in vitro

πολιτισμούς ως μια εναλλακτική προσφορά. Παραγωγή φυτικών δευτερογενών προϊόντων από την αυξανόμενη αδιαφοροποίητα ιστούς

in vitro

μεγάλες ποσότητες έχουν από καιρό αναγνωριστεί ως ένα μέσο στο οποίο θα πρέπει να παρακαμφθεί τόσο την εποχικότητα και την ώρα ιδιαιτερότητας της παραγωγής. Οι κάλος καλλιέργειες υπόσχεται να αποκτήσουν πολύτιμες μεταβολίτες φυτό-συγκεκριμένες αξιοποιηθεί για τη βελτίωση της απόδοσης των βιοδραστικών ενώσεων, να επισπεύσει το ρυθμό της διατήρησης και διάδοσης της ένα σημαντικό εθνο-φαρμακευτικών φυτών [10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν πετύχει στην παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών μέσω

in vitro

πολιτισμού [11,12,13,14,15,16]. Για παράδειγμα, πρενυλιώνεται φλαβανόνες όπως sophoraflavanone G και lehmanin ελήφθησαν από

Sophora flavescens

καλλιέργεια τύλου [17]. Κάλου του

Hypericum perforatum

yeilded λουτεολινο 6-Ο-πρενυλ, μαζί με λουτεολίνη-5,3′-διμεθυλ αιθέρας, λουτεολίνη-5-γλυκοζίτη και λουτεολίνη-3′-γλυκοσίδιο [18]. Είναι σημαντικό ότι αντικαρκινική ένωση όπως ταξόλη ελήφθη επίσης από καλλιέργειες κάλου του είδους Taxus [19,20,21]. Εντυπωσιακά, περιεκτικότητα σε ισοφλαβόνες από καλλιέργειες κάλου του είδους Genista ήταν περισσότερο από ό, τι τα

in vivo

φυτά [22,23].

Andrographis

(Acanthaceae) αποτελείται από 250 γένη και 2500 είδη. Ανάμεσα σε όλα τα γένη, Andrographis

paniculata

είναι δυνητική σημασία στην παραδοσιακή ιατρική για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών που οφείλονται σε ευρύ φάσμα της βιολογικής δραστηριότητας [24,25]. Οι φαρμακολογικές δραστηριότητες του

Andrographis

είναι λόγω της παρουσίας φλαβονοειδών, τερπενοειδή και φλαβονοειδή γλυκοσίδια όπως andrographolide, echiodinin και echiodinin 5-

o

-β-D-γλυκοπυρανοσίδη. Andrographolide και τα παράγωγά τους έχουν το δυναμικό αντικαρκινικές ιδιότητες [26]. 7-

O

μεθυλ dihydrowogonin, 5-υδροξυ-3,7,8,2′-τετραμεθοξυ flavone και flavone 7-

O

-methylwogonin από τις ρίζες του

A

.

paniculata

έχουν εντοπιστεί [27]. Κάλος καλλιέργειες

A

.

paniculata

αναφέρθηκαν ότι είναι 7-

O

-methylwogonin, σκούφου φλαβόνης Ι και 5-υδροξυλ-7,8,2′-τριμεθοξυ flavone [28]. Η εμφάνιση της 7-

O

-methylwogonin αποτελεί την πρώτη έκθεση της 2′-deoxyflavone.

Andrographis lineata

που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη είναι μια φυλετική φαρμακευτικό φυτό που εξυπηρετούν ως καλό υποκατάστατο για το

A

.

paniculata

. Ομοίως, αυτό το φυτό χρησιμοποιείται από τους γιατρούς για τη θεραπεία δαγκώματα φιδιών, ο διαβήτης, παθήσεις του δέρματος, πυρετός, δυσκοιλιότητα, βρογχίτιδα, καρκίνο, φλεγμονή και στομαχικό. Διαθέτει επίσης antihelminthic, αντιφλεγμονώδεις, αντιπυρετικές και αντιπεριοδικά ιδιότητες [29,30]. πάστα Leaf χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των λοιμώξεων του αναπνευστικού, ενώ ρίζα αφέψημα ως αντίδοτο. έχουν φλαβονοειδή, μαζί με andrographolide έχουν αναφερθεί από εκχυλίσματα φύλλων [31]. Φαρμακολογικές μελέτες με εκχυλίσματα φύλλων εμφανίζεται αντιβακτηριακό, διουρητικό hepatoprotective και αντιδιαβητικών δραστηριότητες [32,33,34].

Προηγούμενες μελέτες με

A

.

paniculata

έχουν αποδείξει την χρησιμότητα του καλλιέργειες κάλου για την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών αντί να χρησιμοποιεί άγρια ​​φυτά. Αυτό μας ώθησε να αναπτύξουμε επαγωγή τύλου για

in vitro

παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα με πέρασμα εποχιακές πίεση όλο το χρόνο. Εδώ αναφέρουμε για πρώτη φορά καθιέρωση καλλιέργειες κάλου από έκφυτα φύλλων του

A

.

lineata

. Δείχνουμε απομόνωση και δομικός χαρακτηρισμός echioidinin (ED) και 7-

O

-methywogonin (MW) με χρωματογραφία στήλης πυριτικής γέλης ακολουθούμενη από πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (πρωτόνιο και C13) και υγρής χρωματογραφίας φασματοσκοπίας μάζας. Περαιτέρω έχουμε αποδείξει ΕΔ και MW που προκαλείται κυτταροτοξικότητα έναντι των λευχαιμικών κυττάρων σε ένα χρόνο και τη συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Χημικών

Χημικά όπως ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΑΑ ελήφθησαν από τη Sigma. HgCl

2 ήταν από E.Merck, σακχαρόζη από Σίσκο, σίλικα τζελ από Acme συνθετικά χημικά και Αγαρ από CDH, Mumbai, Ινδία. DMSO, DMF, ακετόνη, εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και μεθανόλη ελήφθησαν από τη Sigma.

φυτικού υλικού και Tissue Culture Προϋποθέσεις κάλου Επαγωγή

ώριμα φύλλα που συλλέγονται από το πεδίο που καλλιεργούνται φυτά

A

.

lineata

χρησιμοποιήθηκαν ως έκφυτα. Τα φύλλα αποστειρώθηκαν επιφανειακά σε 70% αιθανόλη για 30 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από ξέπλυμα σε αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό, κατόπιν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,1% HgCl

2 (w /v) (Merck) για 2 λεπτά και ακολουθήθηκε από έκπλυση σε στείρο απεσταγμένο νερό. Τα κομμένα άκρα των μοσχευμάτων κόπηκαν με αιχμηρή άκρη αποστειρωμένα χειρουργικά λεπίδες. Περαιτέρω, τα μοσχεύματα στυπώθηκαν επί αποστειρωμένου δίσκους διηθητικού χαρτιού πριν από τον ενοφθαλμισμό. Θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη ήταν Murashige και Skoog που, το 1962. Τα μέσα congealed με άγαρ (0.8%) και σακχαρόζη 3% χρησιμοποιήθηκε ως πηγή υδατάνθρακα. Το ρΗ του μέσου στη συνέχεια ρυθμίστηκε στο 5.6 έως 5.8 και το μέσο έγινε τελικά σε ένα γνωστό όγκο. Άγαρ προστέθηκε στα μέσα ενημέρωσης πριν τη διανομή εντός των δοχείων (15 ml για τους σωλήνες 25 χ 150 δοκιμή mm) τα οποία σε αυτόκαυστο για 15 λεπτά στους 15 lbs /in

2. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες που περιείχαν αποστειρωμένο μέσο τοποθετήθηκαν σε μία θέση κεκλιμένη, προκειμένου να αυξηθεί το εμβαδόν της επιφάνειας του μέσου. Όλες οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε ένα δωμάτιο καλλιέργειας στους 25 ± 2 ° C με σχετική υγρασία 50-60% και 16 h φωτοπερίοδο σε πυκνότητα ροής φωτονίων από 15-20 μ E m

2 s

-1 από λευκό δροσερό λάμπες φθορισμού

μέσο MS με διαφορετικές συγκεντρώσεις των αυξινών (2,4-D, ΙΑΑ και ΝΑΑ) κυμαίνεται 0,1 έως 1,0 MGL

-. l χρησιμοποιήθηκαν για να μελετήσουν τις επιπτώσεις τους στην επαγωγή κάλων σε ποικίλες συγκεντρώσεις (Πίνακας 1). Στη συνέχεια, η καθιερωμένη κάλος που λαμβάνεται στο μέσον MS εμπλουτισμένο με 1,0 mg l

-1 ΙΑΑ υποκαλλιεργήθηκε 4-5 φορές για τη βέλτιστη παραγωγή κάλο σε τακτά χρονικά διαστήματα 20 ημερών μετά τον εμβολιασμό. Αυτή η τεχνική της επαγωγής τύλου για την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών έχει περιγραφεί προηγουμένως από διάφορες ομάδες [10,14,23,35].

Η

Εκχύλιση, Απομόνωση και Ταυτοποίηση καθαρισμένες ενώσεις από

A

.

lineata

Calli

Η προμηθεύονται τύλοι για πρώτη φορά ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου για λίγες μέρες και το υλικό στη συνέχεια συνθλίβονται σε μια λεπτή σκόνη (750 g). Η σκόνη που ελήφθη υποβλήθηκε σε εκχύλιση με διαλύτη χρησιμοποιώντας θερμή ακετόνη σε Soxhlet Τρωκτικών [10]. Hot εκχύλιση ενισχύει την διαλυτότητα διαλυμένης ουσίας των φυσικών προϊόντων και, αποσπάσματα τα περισσότερα από τα δευτερογενών μεταβολιτών. Προκειμένου να επιτύχει το μέγιστο αριθμό των ενώσεων από

Andrographis lineata

κάλοι, χρησιμοποιήσαμε ακετόνη για soxhlation κάτω από ζεστό κατάσταση. Επιπλέον, η χρήση ακετόνης ως διαλύτη εκχύλισης δεν είναι να εξάγει τα λιπίδια με την ίδια αποτελεσματικότητα όπως θα έκανε για δευτερογενείς μεταβολίτες. Η εξάτμιση του εκχυλίσματος

σε κενό

απέδωσε ένα σκούρο καφέ υπόλειμμα, εκχύλισμα ακετόνης (30 g) (Σχήμα 1Β). Το εκχύλισμα ακετόνης αιωρήθηκε σε H

2O, κατανεμήθηκε με εξάνιο για να δώσει εξάνιο διαλυτά και αδιάλυτα κλάσματα. Περαιτέρω, θα πραγματοποιηθεί εξάνιο κλασματοποίηση καθώς αφαιρεί έξω χλωροφύλλη και μη-πολικών συστατικών.

(Α) κάλου προκλήθηκε από έκφυτα φύλλων σε μέσο MS συμπληρωμένο με 1.0 mg l

-1 ΙΑΑ (Bar = 2,5 mm) μετά από 4 εβδομάδες. (Β) Σχηματική αναπαράσταση των φυτοχημικών ανάλυση του κάλου του

Andrographis lineata

για απομόνωση των βιοδραστικών ενώσεων.

Η

Το εξάνιο αδιάλυτο υπόλειμμα (20 g) χρωματογραφήθηκε πάνω από silica gel με χρήση εξανίου μέσον έκλουσης βαθμίδωσης οξικού αιθυλεστέρα, και παρόμοια κλάσματα συνδυάστηκαν για να παράγουν τέσσερις υπο-κλάσματα (Fr. Ι έως Fr. IV). Τα κλάσματα II διαχωρίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μία στήλη silica gel με έκλουση με βαθμιαίο διαλύτη εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα για να δώσει ένα κίτρινο στερεό (24 mg) το οποίο χαρακτηρίστηκε ως ALC-1. Αυτό έδωσε ένα πράσινο χρώμα με Fe

3+ πορτοκαλί κόκκινο χρώμα με δύο Mg-HCI και Zn-HCI. Από την άλλη πλευρά, επαναλαμβανόμενη CC πυριτικής πηκτής (5 χ 90 cm) από το εξάνιο διαλυτό κλάσμα με την αύξηση της πολικότητας χρησιμοποιώντας μίγματα οξικού αιθυλεστέρα /εξάνιο έδωσε τρεις υπο-κλάσματα (F1-F3). Το κλάσμα F2 επαναχρωματογραφήθηκε επί στήλης πυριτικής πηκτής χρησιμοποιώντας εξάνιο /ΕίΟΑο (60:40) για να δώσει ένα λευκό στερεό (20 mg). Περαιτέρω, αυτή η σχετικά κρυστάλλωση από μεθανόλη έδωσε άχρωμες βελόνες (19 mg). Αυτό ορίστηκε ως ALC-2. Έδωσε ένα πράσινο χρώμα με αλκοολούχα τριχλωριούχου σιδήρου και ροζ χρώμα με Mg-HCl οξύ.

Περαιτέρω καθαρισμός των υποκλασμάτων από εξάνιο αδιάλυτο (π Ι, π III-IV), και εξανίου διαλυτές (F1 και F3) κλάσματα δεν αποφέρει κανένα κρυσταλλική αρχή. Όλα τα εκλούσματα που περιείχαν «υπόλειμμα» ή «όχι υπόλειμμα» εξετάστηκαν με TLC όπως περιγράφεται παρακάτω με ψεκασμό 8% μεθανολική θειικό οξύ. Αυτό ακολουθείται από θέρμανση επί θερμής πλάκας στους 100 ° C για 4 λεπτά για τη βέλτιστη ανάπτυξη του χρώματος. Οι πλάκες οπτικοποιήθηκαν και τιμές Rf υπολογίστηκαν. Επόμενη οι καθαρισμένες ενώσεις εκλούστηκαν στα αντίστοιχα συστήματα διαλύτη και τα εκλούσματα διατηρήθηκαν για φασματική ανάλυση.

υπεριώδες (UV) φάσματα καταγράφηκαν σε Beckman 25 και Shimadzu UV-240 φασματοφωτόμετρα και οι τιμές δόθηκαν σε nm. Φασμάτων υπερύθρου (IR) καταγράφηκαν με το μοντέλο Perkin-Elmer 283B και 297 φασματοφωτόμετρα διπλής δέσμης και

ν

τιμές δόθηκαν σε cm

-1. Τα φάσματα πρωτονίου μαγνητικού συντονισμού (

1Η NMR) καταγράφηκαν σε Varian, 200, JEOL FX-90Q και Bruker-ΑΜ-300 φασματοφωτόμετρα με TMS ως εσωτερικό πρότυπο. Carbon-13 πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (

13C NMR) φάσματα καταγράφηκαν σε JEOL FX-90Q φασματοφωτόμετρο. Οι χημικές μετατοπίσεις δόθηκαν σε δ ppm. Τα φάσματα μάζας (MS) καταγράφηκαν σε LC-MSD-παγίδα-SL (Agilent Technologies) στο Εθνικό Κέντρο για την φασματοσκοπία μάζας στο Ινδικό Ινστιτούτο Χημικής Τεχνολογίας, Hyderabad.

χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC)

οι γυάλινες πλάκες (20 χ 20 cm) πλύθηκαν σχολαστικά με τρεχούμενο νερό βρύσης και μετά με αποσταγμένο νερό και οι πλάκες φυλάσσονται έτοιμο για εφαρμογή πυριτικής πηκτής. Silica gel 25 g (ακμή) διαλύθηκε σε 50 ml διπλά αποσταγμένου νερού, αναδεύεται καλά και ο πολτός στη συνέχεια διαβιβάστηκε στο διασκορπιστή. Η σπάτουλα απαλά τράβηξε κατά μήκος των πλακών, (πάχος 2-3 mm) για να πάρετε μια ακόμη εφαρμογή. Οι πλάκες ενεργοποιήθηκαν στους 100 ° C για περίπου 45 λεπτά, αφήνεται να ψυχθεί, απομακρύνεται από τον φούρνο και υποβάλλεται σε χρήση.

Τα εκλούσματα εφαρμόζεται υπό τη μορφή του τόπου με μικροπιπέττα, 2 cm πάνω από τη βάση του η πλάκα και αφέθηκαν να στεγνώσουν με στεγνωτήρα μαλλιών. Στη συνέχεια, οι πλάκες αναπτύχθηκαν σε εξάνιο: οξικό αιθυλεστέρα 9: 1 (ν /ν) και σε εξάνιο: οξικό αιθυλεστέρα 8: 2 (ν /ν). Ο διαλύτης αφέθηκε να κινηθεί μέχρι 15 cm, τότε απομακρύνθηκαν, αφέθηκαν να στεγνώσουν. Οι πλάκες ψεκάστηκαν με 8% μεθανόλη θειικό οξύ, εκεί μετά υποβάλλεται σε θέρμανση σε φούρνο θερμού αέρα στους 100 ° C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, οι ενώσεις οπτικοποιήθηκαν και τιμές Rf υπολογίστηκαν. επικαλυμμένες πλάκες Ομοίως πριν γίνει γέλη πυριτίου αναπτύχθηκε σε διαφορετικά συστήματα διαλυτών με εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και τα εκχυλίσματα μεθανόλης. Οι πλάκες σε αντίθεση με τις chromatoplates έλαβε το αντιδραστήριο ψεκασμού. Το περίγραμμα των ενώσεων σημαδεύτηκε με μια βελόνα για τα μη ψεκασμένα πλάκες silica gel.

Cell Culture

Ανθρώπινο κυτταρική γραμμή λευχαιμίας CEM αγοράστηκε από το Εθνικό Κέντρο για την Επιστήμη των κυττάρων, Pune, Ινδία. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (SERA LAB, USA) που περιείχε 10% FBS (GIBCO BRL, USA), 100 U πενικιλλίνης G /ml και 100 μg στρεπτομυκίνης /ml στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε αναλογία 1:10 κάθε 3-5 ημέρες.

Echioidinin (ED) και 7-

O

-methywogonin (MW) που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη είναι φυσικά φλαβονοειδή καθαρίζεται από φύλλο κάλος του

A

.

lineata

. Ενώσεις ED και MW διαλύθηκε σε DMF (Sigma, USA). Η μέγιστη συγκέντρωση του DMF (διμεθυλοφορμαμίδιο) που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα ήταν ίση με 0,05% και το ίδιο ποσό χρησιμοποιήθηκε σαν τον έλεγχο του οχήματος. Σε όλα τα πειράματα που περιγράφονται εδώ echioidinin και 7-Ο-methywogonin προστέθηκαν 24 ώρες μετά την καλλιέργεια.

Κυττάρων Η βιωσιμότητα με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου

μπλε δοκιμασία αποκλεισμού

Trypan διεξήχθη για να εκτιμηθεί η επίδραση της ΕΔ και MW στη βιωσιμότητα των κυττάρων CEM. Περίπου 0,75 χ 10

5 κύτταρα /ml υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ED και MW. Μετά από 24 ώρες ανάπτυξης των κυττάρων, διαφορετικές συγκεντρώσεις ED και MW (10, 50, 100, ή 250 μΜ) ή φορέα (DMF) προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα κύτταρα που αποσύρονται από την καλλιέργεια μετά από κάθε 24 ώρες και χρωματίζονται με κυανούν τρυπανίου όπως περιγράφεται [2,36]. Ο αριθμός των κυττάρων (βιώσιμων-βάφτηκε και μη βιώσιμων-μπλε) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιματοκυτταρόμετρο. Κάθε πείραμα έγινε τρεις ανεξάρτητες φορές με καλή συμφωνία.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού με ΜΤΤ δοκιμασία

Η κυτταρική επιβίωση αξιολογήθηκε περαιτέρω με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, τετραζολίου (ΜΤΤ) δοκιμασία μείωσης χρωστικής 5-διφαινύλιο, η οποία βασίζεται στην ικανότητα των βιώσιμων κυττάρων να μεταβολίζουν ένα κίτρινο άλας τετραζολίου προς ιώδες προϊόν φορμαζάνης που μπορεί να ανιχνευθεί φασματοφωτομετρικά. CEM κύτταρα αυξάνονται σε λογαριθμική φάση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ED και MW (10, 50, 100, 250 μΜ) και επωάστηκαν σε

2 ατμόσφαιρα με υψηλή υγρασία 5% CO. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 και 72 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΜΤΤ (0,5 mg /ml) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36,37]. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm σε αναγνώστη πλάκας πολλαπλών φρεατίων ELISA. Η μέση απορρόφηση του μέσου ελέγχων ήταν η κενή και αφαιρέθηκε. Η συγκέντρωση της ένωσης που προκαλεί 50% αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (IC

50) εκτιμήθηκε μετά από 72 ώρες έκθεσης. Η απορρόφηση των κυττάρων ελέγχου λήφθηκαν ως 100% βιωσιμότητα και οι τιμές των κατεργασμένων κυττάρων υπολογίστηκαν ως ένα ποσοστό του ελέγχου. Τα δεδομένα που εμφανίζονται λαμβάνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα παρτίδες.

δοκιμασίας LDH Release

Απελευθέρωση γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) είναι ένας δείκτης της ακεραιότητας της μεμβράνης και ως εκ τούτου, η ζημία των κυττάρων. δοκιμασία LDH διεξήχθη για να αξιολογηθεί η απελευθέρωση LDH στην καλλιέργεια ακόλουθο ED και θεραπεία MW (10, 50, 100 και 250 μΜ) σε κύτταρα CEM επί 48 και 72 ώρες σύμφωνα με τα πρότυπα πρωτόκολλα [37]. Η ενδοκυτταρική LDH προσδιορίστηκε μετά τη λύση των κυττάρων με κατάψυξη και ταχεία απόψυξη. Η απελευθέρωση της LDH μετρήθηκε σε απορρόφηση 490 nm. Το ποσοστό της απελευθέρωσης LDH υπολογίστηκε ως: (LDH δραστηριότητα στο μέσο) /(δραστικότητα LDH στα μέσα ενημέρωσης + ενδοκυτταρική δραστηριότητα LDH) × 100. Κάθε πείραμα έγινε τρεις ανεξάρτητες φορές με καλή συμφωνία.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος συν ή πλην το τυπικό σφάλμα. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό GraphPad χρησιμοποιώντας μονόδρομη ΑΝΟνΑ που ακολουθήθηκε από Tukey-Kramer εξέταση πολλαπλού Σύγκριση. Η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

In vitro

κάλων επαγωγής από τα ώριμα φύλλα Μοσχεύματα

Εμείς ιδρύθηκε καλλιέργειες κάλου από ώριμη έκφυτα φύλλων σε μέσο MS εμπλουτισμένο με αυξίνες, όπως ΝΑΑ, 2,4-D και ΙΑΑ. Η φύση του κάλου διέφερε με τη συγκέντρωση των διαφόρων αυξινών που χρησιμοποιούνται (Πίνακας 1). Λευκό, μαλακό και εύθρυπτο κάλος ελήφθη σε μέσο MS συμπληρωμένο με 2,4-D (0,1-0,5 mg l

-1). Η συχνότητα του φωτός κιτρινοπράσινο, σκληρά, οργανογενετικά ογκογόνο από την άποψη της αύξησης της βιομάζας βρέθηκε να είναι μέγιστο (75%) υπό την παρουσία 1,0 mg l

-1 ΙΑΑ (Σχήμα 1Α) μετά από 4 εβδομάδες (Πίνακας 1).

Ωστόσο, 1.0 mg l

-1 ΝΑΑ και 2,4-D επιδείνωσε σημαντικά την συχνότητα του σχηματισμού κάλων. Η ηλικία του έκφυτο φύλλου ήταν κρίσιμη για κάλους συνεχή πολλαπλασιασμό. Χρήση των παλαιότερων φύλλων μείωσε το σχηματισμό κάλων. Η βέλτιστη επαγωγή κάλου παρατηρήθηκε σε παρουσία 1.0 mg l

-1 ΙΑΑ και χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση των βιοενεργών ενώσεων (Εικ 1Α). Οργανογενετικά κάλος αυξήθηκαν σε όγκο της εκ νέου καλλιέργεια τμήματα κάλων σε μέσο MS εμπλουτισμένο με 1,0 mg l

-1 ΙΑΑ για κάθε είκοσι μέρες. Κάλο ήταν υγιής κατά τη διάρκεια όλων των υποκουλτούρες και υποκαλλιέργεια των κάλων παρέχονται μεγάλες ποσότητες για τη δευτερογενή εκχύλιση μεταβολίτη. Όπως ήταν αναμενόμενο, μετά την μεταφορά σε μέσα που περιέχουν κυτοκινίνη, BA έδειξε πυροβολούν μορφογενετική ανταπόκριση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Δομή Αναγνώριση Echioidinin και 7-

O

-methylwogonin

Χαρακτηρισμός και συντακτικός προσδιορισμός των echioidinin (ΕΔ) και 7-

O

-methywogonin (MW) καθορίστηκαν κυρίως με βάση 1D NMR και φασματομετρίας μάζας μελέτες. Η ένωση ALC-1 κρυσταλλώθηκε από μεθανόλη ως κίτρινους κρυστάλλους (20 mg) με το σημείο τήξεως, 264-265 ° C. Αναλύθηκε για το μοριακό τύπο της C

16H

12O

5 με μοριακό βάρος 285 [Μ + Η]

+. Ήταν μωβ κάτω από UV και UV /ΝΗ

3. Οι φασματικές στοιχεία της ένωσης που δίνονται παρακάτω

UV (S1 Α σχήμα):.

λ

max (MeOH) (log ε) 265 (4.40), 335 (4.19) nm . IR (S1B Εικ):

ν

max (KBr) 3416 (ΟΗ), 2980, 1662 (& gt? C = O), 1614, 1504, 1452, 1350, 1245, 1159, 865 , 831 εκατοστά

-1.

1Η NMR (σχήμα 2Α): (300 MHz, DMSO-

d

6) δ 12,88 (1Η, s, 5-ΟΗ, εναλλάξιμο με D

2O), 10.90 ( 1Η, s, 2′-ΟΗ, εναλλάξιμο με D

2O), 7,90 (1Η, dd,

J

= 2,0, 8,0 Ηζ, Η-6 ‘), 7,40 (dt, 1Η,

J

= 2,0, 8,0 Ηζ, Η-4 ‘), 7,10 (s, 1Η, Η-3), 6.99-7.05 (m, 2Η, Η-3’, 5 ‘), 6.75 (d, 1Η,

J

= 2,5 Ηζ, Η-8), 6,35 (d, 1Η,

J

= 2.5 Hz, Η-6), 3,90 (s, 3Η, OMe-7) .

13C NMR (Σχήμα 2Β): (300 MHz, DMSO-

d

6) δ 182.0 (C-4), 165.1 (C-7), 161.4 (C-2), 161.0 (C-5), 157,3 (C-8a), 156.7 (C-2 ‘), 132,8 (C-4’), 128,4 (C-6 ‘) 119.3 (C-5’), 117,0 (C-1 ‘), 116,9 (C-3’), 109.1 (C-3), 104.6 (C-3a), 97,8 (C-6), 92,4 (C-8), 55,9 (OMe-7). LC-MSD (Σχήμα 2C):.

m

/

z

= 284 [Μ]

+, 285 [Μ + Η]

+

(Α)

φάσματα 1Η NMR (Β)

13C NMR φάσματα (Γ) Υγρή χρωματογραφία φάσματα μάζας (D) Δομή της echioidinin.

η

Έτσι, από την παραπάνω ανωτέρω φασματικές μελέτες ALC -1 χαρακτηρίστηκε ως 5, 2′-διϋδροξυ-7-methoxyflavone (Echioidinin, ED) (Εικ 2Δ), όπως φυσικά και φασματικά δεδομένα ήταν σε καλή συμφωνία με τις τιμές της βιβλιογραφίας [38].

στη συνέχεια, η ένωση ALC-2 κρυσταλλώθηκε από εξάνιο σαν ασθενώς κίτρινες βελόνες (20 mg) με ένα σημείο τήξεως, 181-182 ° C. Αναλύθηκε για το μοριακό τύπο της C

17Η

14o

5 με το μοριακό βάρος, 298. Ήταν μωβ κάτω UV και UV /ΝΗ

3. Οι φασματικές στοιχεία της ένωσης που δίνονται παρακάτω

UV (S2A σχήμα):.

λ

max (MeOH) nm (log

ε

) 272 (4,52 ), 345 (3.78) nm. IR (S2B σχήμα):

ν

max (KBr) 3416 (ΟΗ), 2938 (-OMe), 1661 (& gt? C = 0), 1605, 1510, 1447, 1376, 1274 , 1225, 1125, 1030, 970, 833, 767, 686 εκατοστά

-1.

1Η NMR (σχήμα 3Α): (300 MHz, DMSO-

d

6) δ 12,65 (1Η, s, ΟΗ-5), 8,10 (2Η, m, Η-2 ‘ , 6 ‘), 7,61 (3Η, m, Η-3’, 4 ‘, 5’), 7,01 (1Η, s, Η-3), 6,60 (1Η, s, Η-6), 3,98 (3Η, s , OMe-7), 3,87 (3Η, s, OMe-8).

13C NMR (σχήμα 3Β): (300 MHz, DMSO-

d

6) δ 183.5 (C-4), 164.7 (C-2), 160.0 (C-7), 159.4 (C-5), 150,3 (C-8a), 132.8 (C-4 ‘), 132,3 (C-8), 130,0 (C-1’), 130.1 (C-3 ‘, 5’), 127,2 ( C-2 ‘, 6’), 105,8 (C-3), 105.4 (C-4a), 96,7 (C-6), 61,6 (OMe-8), 56,8 (OMe-7). LC-MSD (Σχήμα 3C):.

m

/

z

= 299,1 [Μ + Η]

+

(Α)

1 NMR φάσματα (Β)

13C NMR φάσματα (C) φάσματα μάζας Υγρή χρωματογραφία (D) Δομή 7-

O

μεθυλ wogonin.

Η

Έτσι, από τα ανωτέρω φασματικές μελέτες, η δομή του ALC-2 διευκρινιστεί ως 5-υδροξυ-7, 8-dimethoxyflavone (7-

O

-methylwogonin) (Εικ 3D) και επιβεβαιώθηκε επίσης με σύγκριση των αξιών βιβλιογραφία [39].

Echioidinin (ED) και 7-

O

-Methylwogonin (MW) προκάλεσε κυτταροτοξικότητα σε λευχαιμικά κύτταρα σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο

στη συνέχεια, εξετάσαμε την κυτταροτοξική δράση του ED και MW (Σχήματα 4Α και 5Α) στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των λευχαιμικών κυτταρικής γραμμής, CEM (λευχαιμία Τ-κυττάρων). Trypan blue δοκιμασίας ήταν η πρώτη γραμμή έρευνας μας, όπου CEM υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10, 50, 100 ή 250 μΜ του ED και MW. Τα κύτταρα χωρίς προσθήκη της ένωσης χρησίμευσαν ως έλεγχος. Δεδομένου ότι η ένωση διαλύθηκε σε DMF (διμεθυλοφορμαμίδιο), τα κύτταρα με DMF χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του οχήματος. Η μέγιστη συγκέντρωση του DMF που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα ήταν ίση με 0,05% και το ίδιο ποσό χρησιμοποιήθηκε σαν τον έλεγχο του οχήματος. Μετά την προσθήκη της ένωσης, τα κύτταρα μετρήθηκαν σε διαστήματα 24 ώρες μέχρις ότου τα κύτταρα ελέγχου επιτυγχάνονται στατική φάση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανάπτυξη των κυττάρων επηρεάστηκε με αύξηση του χρόνου (Σχ 4Β και 5Β). Το αποτέλεσμα ήταν περιορισμένη όταν χρησιμοποιήθηκε 10 μΜ ΕΔ και MW. Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις των 100 και 250 μΜ είχε ως αποτέλεσμα αυξημένο κυτταρικό θάνατο (Σχ 4Β και 5Β). Το IC

50 των ΕΔ και των MW ήταν περίπου 100 μΜ, σε 72 ώρες της θεραπείας.

(Α) Διάρθρωση της ΕΔ. (Β) Αξιολόγηση της βιωσιμότητας κυττάρων με χρήση κυανού τρυπάνης δοκιμασία ακόλουθες 10, 50, 100 και 250 μΜ του ΕΔ ή DMF (έλεγχος) θεραπεία. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, trypan blue χρωματίζονται και μετρώνται κάθε 24 ώρες μέχρι να φθάσει στην στατική φάση. (Γ) Προσδιορισμός της βιωσιμότητας% κυττάρων με ΜΤΤ δοκιμασία σε κύτταρα CEM. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 10, 50, 100 και 250 μΜ του ΕΔ ή ελέγχου του οχήματος για 24, 48 και 72 ώρες. Η% βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε λαμβάνοντας υπόψη DMF επεξεργασμένα κύτταρα ως 100% και σχεδιάστηκαν με παράσταση μπάρες σφάλματος. (Δ) Η μέτρηση της έκλυσης LDH μετά από θεραπεία με ΕΔ. Μετά την έκθεση των κυττάρων CEM με ED σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 50, 100 και 250 μΜ) για 24, 48 και 72 ώρες, η απελευθέρωση της LDH μετρήθηκε στα 490 nm. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστό της απελευθερώσεως LDH. Κάθε πείραμα έγινε τρεις ανεξάρτητες φορές με καλή συμφωνία.

Η

(Α) Διάρθρωση MW. (Β) Αξιολόγηση της βιωσιμότητας κυττάρων με χρήση κυανού τρυπάνης δοκιμασία ακόλουθες 10, 50, 100 και 250 μΜ του MW ή DMF (έλεγχος οχήματος) θεραπεία. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, trypan blue χρωματίζονται και μετρώνται κάθε 24 ώρες μέχρι να φθάσει στην στατική φάση. (Γ) Προσδιορισμός της βιωσιμότητας% κυττάρων με ΜΤΤ δοκιμασία σε κύτταρα CEM. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 10, 50, 100 και 250 μΜ του ελέγχου του οχήματος MWor για 24, 48 και 72 ώρες. Η% βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε λαμβάνοντας υπόψη DMF επεξεργασμένα κύτταρα ως 100% και σχεδιάστηκαν με παράσταση μπάρες σφάλματος. (D) Μέτρηση της απελευθερώσεως LDH μετά από θεραπεία με MW. Μετά την έκθεση των κυττάρων CEM με MW σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 50, 100 και 250 μΜ) για 24, 48 και 72 ώρες, η απελευθέρωση της LDH μετρήθηκε στα 490 nm. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστό της απελευθερώσεως LDH. Κάθε πείραμα έγινε τρεις ανεξάρτητες φορές με καλή συμφωνία.

Η

Η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από ΕΔ και MW στον πολλαπλασιασμό των λευχαιμικών κυττάρων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ. CEM κύτταρα σε επεξεργασία με 10, 50, 100 και 250 μΜ του ED και MW συλλέχθηκαν μετά από 24, 48 ή 72 ώρες και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήματα 4C και 5C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων επηρεάζεται κατά την κατεργασία με ED και MW στα 100 και 250 μΜ, ειδικά μετά από 72 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν περαιτέρω ότι ED και MW επάγει την κυτταροτοξικότητα.

Περαιτέρω, προσδιορισμός LDH διεξήχθη για να προσδιοριστεί η κυτταρική ακεραιότητα εξής ED και θεραπεία MW (10, 50, 100 και 250 μΜ). Τα αποτελέσματα έδειξαν μια συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη αύξηση στην απελευθέρωση LDH κατά την κατεργασία με ED και MW, περαιτέρω επιβεβαιώνοντας τα παραπάνω αποτελέσματα (Σχ 4D και 5D). Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η ΕΔ και MW ήταν ικανή να επάγει κυτταροτοξικότητα στην κυτταρική σειρά καρκίνου.

Συζήτηση

Έχει υπάρξει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για την αναγνώριση των φυτικών προϊόντων ως θεραπευτικοί παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν αποτελεσματικά με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Ένα εντυπωσιακό φαρμακευτικό φυτό σε αυτό το μητρώο είναι

Μια

.

lineata

με ένα ευρύ φάσμα των φαρμακολογικών αποτελεσμάτων. Στην παρούσα μελέτη, πρώτον, περιγράφουμε δημιουργία καλλιέργειες κάλου από ώριμα έκφυτα φύλλων. Δεύτερον, έχουμε αποδείξει απομόνωση και δομικός χαρακτηρισμός echioidinin, 7-

O

-methywogonin από καλλιέργειες κάλων. Τρίτον, χρησιμοποιώντας δοκιμασίες με βάση κύτταρα που εμφανίζουν θεραπεία echiodinin, 7-

O

-methywogonin σε κύτταρα λευχαιμίας καταργηθεί πολλαπλασιασμό των κυττάρων του. Τα παραπάνω συμπεράσματα βασίζονται σε πολλές διαφορετικές αναλύσεις, όπως περιγράφεται στο έγγραφό μας. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σημαντική λόγω υλοποιήσεις για ανθρώπους όπως η αναζήτηση νέων φαρμακολογικά δραστικών ενώσεων από τα φυτά έχει οδηγήσει στην ανακάλυψη πολλών κλινικώς χρήσιμα φάρμακα.

Πολλές γραμμές αποδείξεως κατά το παρελθόν υποδηλώνει οι ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών ρόλο διέγερσης η βιοσύνθεση της ιατρικώς σημαντικές δευτερογενείς μεταβολίτες σε φυτικά

in vitro

καλλιέργειες ιστών [10,22,35,40]. Τέτοια δευτερογενής παραγωγή μεταβολίτη

in vitro

βασίζεται στην παραδοχή ότι το πολύτιμο προϊόν που παράγεται στη φύση σε οποιοδήποτε όργανο ή άλλο ιστό από ένα φυτό μπορεί να διεγείρεται για να συσσωρεύονται σε αδιαφοροποίητα κύτταρα. Τέτοιες καλλιέργειες κάλου είναι ικανοί να παράγουν μεταβολίτες τους σε ποσότητες πολύ πάνω από το όριο ανίχνευσης, ανάλογα με θρεπτικό μέσο, ​​συγκέντρωση σακχαρόζης, την ηλικία της γραμμής κάλου και των κυττάρων. Wewetzer [40] ανέφερε ότι μορφολογική διαφοροποίηση δεν αποτελεί προϋπόθεση για την αζαδιραχθίνη παραγωγή? ωστόσο οι υψηλότερες συγκεντρώσεις ανιχνεύτηκαν σε εντελώς αδιαφοροποίητα κύτταρα. Αναφέρουμε για πρώτη φορά ΙΑΑ συσσωρεύονται τα φλαβονοειδή σε κάλο κουλτούρα

Μια

.

lineata

. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί η επίδραση του ΙΑΑ σε αύξηση της περιεκτικότητας ισοφλαβόνης σε καλλιέργειες κάλου του

Genista tinctoria

μαζί με κυτοκινίνη [22]. Περαιτέρω παρατήρηση μας πράσινα σημεία για κάλο δείχνουν τον υψηλό ρυθμό ανάπτυξης κάλων καθώς κάλο ικανότητα να παράγουν βλαστούς. Οι ερευνητές έχουν καταφέρει να παράγουν αρκετές πολύτιμων δευτερογενών φυτοχημικά σε ανοργάνωτη καλλιέργειες κάλου [14,35,41,42,43,44,45].

Στην παρούσα μελέτη, μια συστηματική φυτοχημική έρευνα του

A

.

lineata

κάλος καλλιέργειες οδηγήσει στην απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των δύο ενώσεων: 5, 2′-διϋδροξυ-7-methoxyflavone (echioidinin) και 7-

O

-methylwogonin. Απομόνωση της 2′-οξυγονωμένο φλαβονοειδή, τα οποία συμβαίνουν σπάνια στη φύση, από το

A

.