Αφηρημένο

ιδρυτική ενεργοποίηση των κινασών προ-επιβίωση έχει γίνει ένας πολλά υποσχόμενος στόχος των μικρών μορίων με αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη πολλαπλών-στόχων παράγοντες. Οι μηχανισμοί που διέπουν την δυνατότητα ανταπόκρισης σε πιο παράγοντες που στοχεύουν καρκίνου συγκεκριμένες οδούς επιβίωσης είναι ακόμη πλήρως κατανοητό, αλλά ζωτικής σημασίας για την κλινική εφαρμογή τους. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το sunitinib, ένα μικρό μόριο αναστολέα πολλαπλών κινασών τυροσίνης συμπεριλαμβανομένων VEGFRs και PDGFRs επάγει την απόπτωση και αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου σε κυτταρική καλλιέργεια και τα μοντέλα ξενομοσχεύματος μέσω του BH3-μόνο πρωτεΐνη PUMA. Η χορήγηση sunitinib που προκαλείται

PUMA

μεταγραφή μέσω του άξονα AKT /FOXO3a. Puma, μιμητικά ΒΗ3, ή 5-Flurourical ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου κόλου σε sunitinib επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, PUMA προκλήθηκε από θεραπεία με sunitinib σε όγκους ξενομοσχεύματος, και η ανεπάρκεια σε

PUMA

κατέστειλε σημαντικά τα αποτελέσματα κατά των όγκων του sunitinib. Η μελέτη μας δείχνει ότι PUMA απόπτωση που διαμεσολαβείται είναι σημαντική για τις θεραπευτικές αποκρίσεις σε sunitinib, και ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής οδού με μιμητικά ΒΗ3 ή χειραγώγησης PUMA μπορεί να είναι χρήσιμη για τη βελτίωση της αντικαρκινική δράση του φαρμάκου. Διαμόρφωση της PUMA και επιλεκτική μέλη της οικογένειας Bcl-2 μπορεί να είναι δυναμικό βιοδείκτες για την πρόβλεψη απαντήσεις sunitinib

Παράθεση:. Sun J, Q Sun, Brown MF, Dudgeon C, Chandler J, Xu Χ, et al. (2012) Το Multi-Targeted κινάσης αναστολέα Το sunitinib διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω της PUMA. PLoS ONE 7 (8): e43158. doi: 10.1371 /journal.pone.0043158

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Μαρτίου 2012? Αποδεκτές: 17 Ιουλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Αυγούστου του 2012

Copyright: © Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) CA129829 επιχορήγηση, επιδότηση American Cancer Society RGS-10-124-01-CCE και FAMRI (J. Yu), καθώς και από ΝΙΗ επιχορηγήσεις CA106348, CA121105 και American Cancer Society επιχορήγηση ΕΓΓ-07- 156-01-CNE (L. Zhang). Το έργο αυτό χρησιμοποίησε τα UPCI κοινόχρηστες εγκαταστάσεις που υποστηρίζεται εν μέρει από το βραβείο P30CA047904. J. Sun και Y. Shu υποστηρίζονται εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Επιχορηγήσεις 30772549. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στις ΗΠΑ και η επίπτωση είναι σχετικά. η αύξηση στις αναπτυσσόμενες χώρες [1]. Ακόμη και με το συνδυασμό των βελτιωμένων χημειοθεραπείας και ακτινοβολίας σε προηγούμενες δεκαετίες, η 5 ετής επιβίωση των ασθενών CRC με προχωρημένη νόσο παραμένει απαράδεκτα χαμηλή. Η ανώμαλη ενεργοποίηση διαφόρων κινασών οδούς είναι κοινή στις περισσότερες συμπαγείς όγκους, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, αγγειογένεση ή εισβολή [2], [3]. Τα τελευταία χρόνια, σημαντικές ελπίδες έχει τοποθετηθεί για τους πράκτορες που αναπτύχθηκε με στόχο ογκογόνων κινασών, η χρήση των οποίων σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία θα μπορούσε να βελτιώσει την επιβίωση και την έκβαση των ασθενών με CRC [4]. Η στοχευμένη προσέγγιση αναμένεται να παραδώσει, τελικά, ασφαλέστερη και πιο αποτελεσματική θεραπευτική του καρκίνου [5]. Μια σημαντική πρόκληση στην κλινική χρήση αυτών των παραγόντων είναι η επικράτηση της εγγενούς και επίκτητης αντίστασης, των οποίων η υποκείμενη μηχανισμοί παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες και ένα αντικείμενο έντονης έρευνας [4], [5].

Το sunitinib (επίσης γνωστή ως SU11248) αναπτύχθηκε ως ένα RTK) αναστολέας (multi-στοχευμένες τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα, και έχει εγκριθεί από το FDA το 2006 για τη θεραπεία της νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) και imatinib ανθεκτικά γαστρεντερικών στρωματικών όγκων (GIST) [6], [7] . Οι τρέχουσες κλινικές δοκιμές που διεξάγονται για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητά του σε άλλους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου [7], [8] (https://clinicaltrials.gov/). Το sunitinib αναστέλλει μια ποικιλία των κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) που είτε μεταλλαγμένες ή ενεργοποιημένα στον καρκίνο. Αυτές περιλαμβάνουν υποδοχείς για προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικού παράγοντα (PDGF-R α και β) και των υποδοχέων του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGFR1, 2 και 3), καθώς και ΚΙΤ (CD117), RET, CSF-1R, και flt3 [6] , [7]. Sunitinib έχει προταθεί ως θεραπεία δεύτερης γραμμής σε GISTs που ανέπτυξε αντίσταση στο imatinib λόγω δευτερογενών μεταλλάξεων στο

c-KIT

. Η αναστολή της αγγειογένεσης, ανοσορύθμιση και επαγωγή της απόπτωσης έχει προταθεί ότι μεσολαβεί τα αποτελέσματα κατά του όγκου του sunitinib [7]. Οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω του κυττάρου αυτόνομη δράση του sunitinib όπως θανάτωση των κυττάρων δεν είναι καλά κατανοητός.

Τα μιτοχόνδρια απόπτωση που διαμεσολαβείται παίζει σημαντικό ρόλο στις δραστικότητες κατά του όγκου μιας ευρείας ποικιλίας συμβατικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων, καθώς και στοχευμένες θεραπείες [9], [10]. Η οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών είναι οι κεντρικές ρυθμιστές των μιτοχονδρίων-μεσολαβούμενη απόπτωση, η οποία ασχολείται με την επιλεκτική ενεργοποίηση ή διέγερση του εγγύς ΒΗ3-μόνο τα μέλη σε απόκριση σε διακριτές καθώς και επικαλυπτόμενα σήματα [11], [12]. Η ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη PUMA παίζει σημαντικό ρόλο σε ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και τα ποντίκια [13], και ενεργοποιεί το μιτοχονδριακό μονοπάτι μέσω του μέλους της οικογένειας Bcl-2 Βαχ /Bak εξής εξουδετέρωσης όλα τα μέλη της Bcl αντιαποπτωτικών -2 μόρια που μοιάζουν με [14], [15], [16], [17]. βλάβη στο DNA που προκαλείται από ακτινοβολία γάμμα ή που χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), αδριαμυκίνη και ετοποσίδη, επάγουν ρ53-εξαρτώμενη επαγωγή PUMA και απόπτωσης [15], [18]. Μη γονοτοξική καταπονήσεις όπως παράγοντα στέρηση της ανάπτυξης, ενδοπλασματικό δηλητήρια δίκτυο και έναν αριθμό αναστολέων κινάσης επάγει PUMA μέσω ενός αριθμού άλλων παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων ρ73, NF-κΒ και FOXO3a [13], [19], [20], [21], [22], [23].

στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι το sunitinib επάγει την έκφραση PUMA ανεξάρτητα από p53 στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Η επαγωγή της PUMA έγινε μέσω του μεταγραφικού παράγοντα FOXO3a μετά την αναστολή της ΑΚΤ.

PUMA

ανεπάρκεια οδήγησε σε αντίσταση σε sunitinib επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα καθώς και σε ξενομοσχεύματα. Η μελέτη μας παρέχει ένα μοριακό μηχανισμό της απόπτωσης που προκαλείται από αυτή τη μη-εκλεκτικός αναστολέας της κινάσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, και έχει σημαντικές συνέπειες για την ανακάλυψη βιοδεικτών και πιθανές στρατηγικές για να ξεπεράσει την αντίσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture and Drug Θεραπεία

κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου ελήφθησαν από την ATCC. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 και καλλιεργούνται σε μέσο 5Α Mycoy του (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% FBS (HyClone, Logan, UT), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα σωματικά κύτταρα νοκ-άουτ γραμμές HCT 116

p53

KO [24], HCT 116

PUMA

KO [15], DLD1

PUMA

KO [18], HCT 116

FOXO3a

σταθερό knockdown (KD) κύτταρα και μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) [19] έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Αντικαρκινικών παραγόντων ή χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στη μελέτη περιλαμβάνουν sunitinib malate (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), γκοσσυπόλης (Sigma, St. Louis, ΜΟ), HA14-1 (Axxora LLC, Σαν Ντιέγκο , CA), ABT-737 (Σέλεκ Chemicals LLC, Houston, TX). Στοκ διαλύματα όλων των ενώσεων παρασκευάσθηκαν σε DMSO και αραιώνονται με μέσο καλλιέργειας σε συγκεντρώσεις εργασίας πριν από τη χρήση. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό που εκφράζει PUMA, Ad-PUMA [15] (20 ΜΟΙ) μόνο του ή με την προσθήκη του sunitinib. Επιμόλυνση κατασκευασμάτων έκφρασης Flag-Mcl-1 [16], Bcl-2 και συστατική ΑΚΤ (Millipore) διεξήχθη όπως περιγράφεται [20].

Western Blotting και Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για κηλίδωση Western περιλαμβάνονται εκείνοι έναντι κασπάσης-3, Myc (9B11), FOXO3a (σύνολο), ρ-FOXO3a, ΑΚΤ (σύνολο), ρ-ΑΚΤ (S473) (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), κυτόχρωμα c, α- τουμπουλίνη, Bcl-xL, Mcl-1 (BD Biosciences), κασπάσης-9 (Stressgen Bioreagents, Ann Arbor, ΜΙ), κυτόχρωμα οξειδάση υπομονάδα IV (Cox IV, Invitrogen), Bcl-2 (Dako, Carpinteria, CA, USA) Σημαία (Sigma), PUMA [15], p53, p21, Bim, Bid, Noxa, Smac και β-ακτίνη (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

Η απελευθέρωση cytochorme c και Smac ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα ακόλουθο subcelluar κλασματοποίηση όπως περιγράφεται [20], [26]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε φιάλες Τ75 για υποδεικνυόμενους χρόνους και υπό διαφορική φυγοκέντρηση για να ληφθεί κυτταροπλασματικά και μιτοχονδριακή κλάσματα. Συγκεντρώσεις κυτοσολικά κλάσματα που λαμβάνονται ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο βαφής ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hercules, CA). Τα κλάσματα αναμίχθηκαν με ίσους όγκους ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 2χ Laemmli και υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western blotting.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) έγινε χρησιμοποιώντας το κιτ χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση Δοκιμασία (Millipore, Billerica , ΜΑ) με αντίσωμα FOXO3a για χρωματίνη καθίζηση όπως περιγράφεται [18]. Τα ιζήματα αναλύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές 5-GCGCACAGGTGCCTCGGC-3 και 5-TGGGTGTGGCCGCCCCT-3 όπως περιγράφεται [22].

λουσιφεράσης

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ανταποκριτές PUMA περιέχει είτε WT ή μεταλλαγμένης θέσεις πρόσδεσης FOXO3a [19], με τον ρΟΜνβ έλεγχος επιμόλυνσης β-γαλακτοσιδάση ανταποκριτού (Promega), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 12 μΜ sunitinib για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και δραστηριότητες λουσιφεράσης μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Όλα τα πειράματα ρεπόρτερ έγιναν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

(Α) Οι αναγραφόμενες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου υποβλήθηκαν σε αγωγή με 15 μΜ sunitinib για 24 ώρες. Τα επίπεδα PUMA αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Β) Η γονική HCT 116 (WT) ή

p53

κύτταρα ΚΟ υποβλήθηκαν σε θεραπεία όπως στο (Α) με αυξανόμενες δόσεις του sunitinib και αναλύθηκαν για PUMA, p53 και της έκφρασης του p21. (Γ) και (Δ) HCT 116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 μΜ sunitinib για τους υποδεικνυόμενους χρόνους.

PUM

Ένα mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως.

GAPDH

mRNA χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος για ομαλοποίηση σε RT-PCR, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τη φόρτωση σε κηλίδωση Western.

Η

σε πραγματικό χρόνο Αντίστροφη Transcription- PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ Mini Απομόνωση RNA II (Zymo Research, Irvine, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA (1 μ§) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του cDNA με τη χρήση ανάστροφης μεταγραφάσης SuperScript II (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε για PUMA και GAPDH όπως περιγράφεται [22].

(Α) HCT 116 WT και

PUMA

κύτταρα ΚΟ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις του sunitinib για 48 ώρες. Η απόπτωση αναλύθηκε με δοκιμασία πυρηνική κατακερματισμού. Τα δεδομένα ελήφθησαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01, KO

vs

WT.. (Β) HCT 116 κύτταρα με τις δεικνυόμενες γονότυπους ήταν η θεραπεία με 15 μΜ sunitinib για 48 ώρες.

Άνω

, τα προϊόντα διάσπασης της κασπάσης-3 και -9 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Κάτω

, η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και Smac στο κυτταρόπλασμα αναλύθηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνη και CoxIV είναι οι έλεγχοι για τη φόρτωση, και του κυτταροπλάσματος και των μιτοχονδρίων κλασματώσεων, αντίστοιχα. (C) σχηματισμό αποικιών σε HCT 116 WT και

PUMA

ΚΟ κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με sunitinib. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με θεραπεία με sunitinib 12 μΜ για 48 ώρες, στη συνέχεια απλώνονται σε 1:200 ή 1:400 αραίωσης (περίπου 600 ή 300 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε πλάκες 12-φρεατίων και αφέθηκαν να σχηματίσουν αποικίες για 14 ημέρες.

Άνω,

εκπρόσωπος εικόνες των αποικιών.

Κάτω

, οι αποικίες που περιέχουν & gt? 50 κύτταρα απαριθμήθηκαν και η σχετική επιβίωση υπολογίστηκε με μη επεξεργασμένα κύτταρα, ορίζεται σε 100%. Τα δεδομένα ελήφθησαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0.005, KO

vs

WT.. (D) DLD1 WT και

PUMA

ΚΟ κύτταρα θεραπεία με 30 μΜ sunitinib για 48 ώρες.

Αριστερά

, PUMA και τα προϊόντα διάσπασης της κασπάσης-3 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Δεξιά

, απόπτωση αναλύθηκε με τη δοκιμασία των πυρηνικών κατακερματισμό. **

P

& lt?. 0.01, KO

vs

WT

Η

Η απόπτωση Αναλύσεις

Τα προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν, χρωματισμένο. με Hoechst 33258 (Invitrogen), και αναλύθηκαν για απόπτωση με δοκιμασία πυρηνική χρώση. Ένα ελάχιστο 300 κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε θεραπεία [25], [27]. Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, ίσο αριθμό κύτταρα υποβλήθηκαν σε διάφορες επεξεργασίες και επιστρώθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων σε διαφορετικές αραιώσεις. Οι αποικίες έγιναν ορατές με χρώση κρυσταλλικού ιώδους 11 έως 14 ημέρες μετά την επίστρωση όπως περιγράφεται προηγουμένως [25], [28]. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

(Α) HCT 116 και ΗΤ 29 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 15 μΜ sunitinib για ενδεικνυόμενους χρόνους. Τα επίπεδα της ολικής FOXO3a, φωσφορυλιωμένη (ρ) – FOXO3a, σύνολο-ΑΚΤ και φωσφορυλιωμένο (p) -Akt (S473) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Β) HCT 116

ρ53

ΚΟ κύτταρα και ΗΤ 29 κύτταρα μορφομετατράπηκαν είτε με κενό φορέα ή με ιδιοσυστατικά ενεργή έκφραση ΑΚΤ κατασκευάσματα για 16 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 15 μΜ sunitinib για 24 ώρες. Τα επίπεδα του p-ΑΚΤ και PUMA αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Γ) HCT 116

ρ53

ΚΟ κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με μπερδεμένο siRNA ή

FOXO3a

ειδικό siRNA για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 15 μΜ sunitinib για 24 ώρες. Τα επίπεδα υποδεικνύονται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (D)

FOXO3a

σταθερό knockdown κυττάρων (KD) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 μΜ sunitinib για 24 ώρες. Τα επίπεδα υποδεικνύονται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Η συγκεκριμένη ζώνη του συνολικού-FOXO3a υποδεικνύεται με ένα βέλος. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για τη φόρτωση.

Η

Ξενομοσχεύματος Όγκων

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ. HCT 116 WT και

PUMA

ΚΟ ξενομοσχευμάτων ιδρύθηκαν και μετρήθηκαν όπως περιγράφεται [25]. Εν συντομία, ηλικίας 5-6 εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών (Harlan, Indianapolis, ΙΝ) εμβολιάστηκαν με 5 × 10

6 κύτταρα ανά θέση και στις δύο πλευρές. Οι όγκοι αφέθηκαν να καθιερώσει για 7 ημέρες. Οι ποντικοί ήταν του στόματος καθετηριάζονται για 10 συνεχείς ημέρες με 80 mg /kg /ημέρα sunitinib αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου (ρΗ 4.7, όχημα), ή όχημα [29]. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν σε δύο διαστάσεις με χρήση παχυμέτρου. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες, έτσι ώστε ο μέσος όγκος του όγκου σε όλες τις ομάδες ήταν η ίδια πριν από τη θεραπεία. Για όλους

in vivo

πειράματα, οι όγκοι του όγκου μετρήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα σε 2 διαστάσεις και οι όγκοι προσδιορίστηκαν σε mm

3 χρησιμοποιώντας τον τύπο l × b

2 × 0,52 (όπου L είναι το μεγαλύτερο διάμετρος και το b είναι η μικρότερη διάμετρος του όγκου). Τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. 2 ώρες πριν τη θυσία με μία μόνο δόση βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) σε 150 mg /kg για την επισήμανση των κυττάρων στη φάση S. BrdU διαλύθηκε σε PBS σε μια τελική συγκέντρωση 30 mg /mL. ανάλυση Η ιστολογική και ανοσοφθορισμού για απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό πραγματοποιήθηκαν σε 5-μΜ κατεψυγμένες τομές, όπως περιγράφεται [25]. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 21 ημέρες μετά την αγωγή, ή 24 ώρες μετά την τρίτη αγωγή (ημέρα 4). Οι όγκοι αποκόπηκαν και καταψύχθηκαν για western αποτύπωση ή σταθερό σε 10% φορμόλη πριν από εμβάπτιση σε παραφίνη.

(Α) χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) διεξήχθη σε HCT 116

p53

KO κυττάρων μετά από 15 μΜ η θεραπεία με sunitinib για 8 και 12 ώρες. IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την FOXO3a-ειδικό αντίσωμα. (Β) κύτταρα HCT 116 διαμολύνθηκαν με τον ανταποκριτή PUMA που περιέχει το WT ή μεταλλαγμένης θέσεις δέσμευσης FOXO3a για 16 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 15 μΜ sunitinib για 24 ώρες. Οι δραστηριότητες ρεπόρτερ μετρήθηκαν με δοκιμασία λουσιφεράσης όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (C)

FOXO3a

σταθερά νοκ ντάουν κύτταρα (KD) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις του sunitinib για 48 ώρες. Η απόπτωση αναλύθηκε με δοκιμασία πυρηνική κατακερματισμού. Τα δεδομένα ελήφθησαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01, KD

vs

WT.. (D) Έκφραση Mcl-1 κατέστειλε sunitinib επαγόμενη απόπτωση σε HCT 116 κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Flag-tagged Mcl-1 για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 15 μΜ sunitinib για 48 ώρες. Η απόπτωση αναλύθηκε με δοκιμασία πυρηνική κατακερματισμού. Τα δεδομένα ελήφθησαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01, KO

vs

WT..

Δεξιά

, Mcl-1 επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

TUNEL και ανοσοχρώση

Η ιστολογική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με αιματοξυλίνη και χρώση ηωσίνης. Τελική δεοξυριβονουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης μεσολάβηση τέλος επισήμανση dUTP nick (TUNEL) χρώση σε κατεψυγμένα τμήματα έγινε με ανασυνδυασμένο τερματική τρανσφεράση (Roche) και uUTP-Alexa 594 (Invitrogen) σύμφωνα με τις κατασκευές »οδηγίες, και αντίθετα με 4 ‘, 6-diamidino- 2-φαινυλινδόλη (DAPI) με μικρή τροποποίηση γίνεται για παραφίνη δειγμάτων [25], [30], [31]. Τα αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού σε τυχαία επιλεγμένα πεδία, και ο δείκτης απόπτωσης υπολογίστηκε ως ποσοστό των TUNEL θετικών κυττάρων σε τουλάχιστον 1000 άνοιξε κύτταρα. ενσωμάτωσης BrdU οπτικοποιήθηκε με αντι-BrdU- Alexa 594 αντίσωμα (Invitrogen) και οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με DAPI. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε με μέτρηση των κυττάρων κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού σε διάφορα τυχαίως επιλεγέντα πεδία. Ο δείκτης BrdU υπολογίστηκε ως ποσοστό των BrdU-θετικών κυττάρων σε τουλάχιστον 1000 άνοιξε κύτταρα. Φωσφο-ΑΚΤ φωσφογλυκόζης FOXO3a και δραστική κασπάση-3 ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφεται [19].

Η απόπτωση προσδιορίστηκε με δοκιμασία πυρηνική κατάτμηση και την ενεργοποίηση των κασπασών. Όλα τα δεδομένα στην απόπτωση ελήφθησαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα, ενώ οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western φαίνεται. (Α) κύτταρα HCT 116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ sunitinib, 5 μΜ HA14-1, 5 μΜ γκοσσυπόλης, 1 μΜ ΑΒΤ-737, 20 ΜΟΙ Ad-PUMA (0,2 μl /mL) μόνο του, ή ο συνδυασμός τους για 48 ώρες. *,

P

& lt? 0.05, ο συνδυασμός

vs

μόνο παράγοντα..

Δεξιά

, επεξεργασία κασπάσης-3 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. (Β) HCT 116

PUMA

κύτταρα ΚΟ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 12 μΜ sunitinib, 5 μΜ HA14-1, 5 μΜ γκοσσυπόλης, 1 μΜ ΑΒΤ-737, 20 ΜΟΙ Ad-PUMA (0,2 μl /ml) και μόνο, ή ο συνδυασμός τους για 48 ώρες. *,

P

& lt? 0.05, ο συνδυασμός

vs

μόνο παράγοντα..

Δεξιά

, επεξεργασία κασπάσης-3 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. (Γ) HCT 116 WT και

PUMA

κύτταρα ΚΟ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ sunitinib, 30 μg /ml 5-FU είτε μόνα είτε σε συνδυασμό για 48 ώρες. *,

P

& lt? 0,05, KO

vs

WT..

Δεξιά

, επεξεργασία κασπάσης-3 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού GraphPad Prism IV. Όλες οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν με t-test του μαθητή, και Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Μέσα ± μια τυπική απόκλιση (SD) έχουν εμφανιστεί σε αριθμούς ανάλογα με την περίπτωση.

Αποτελέσματα

PUMA προκαλείται από sunitinib σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Η έκφραση της PUMA είναι χαμηλή σε πιο άτονα κυττάρων και προκαλείται από διάφορα γονιδιοτοξικές και μη-γονοτοξικό στρες [23]. Για να προσδιοριστεί ένα δυνητικό ρόλο της PUMA σε sunitinib προκαλούμενη απόκριση, αναλύσαμε τα επίπεδα Puma, p21 και p53 πριν και μετά τη θεραπεία σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πέντε κόλον. Τρεις από αυτές τις γραμμές, HCT 116, RKO και SW 48 περιέχει WT

p53

ενώ δύο γραμμές HT 29 και SW 480 περιέχουν μεταλλαγμένα

p53

. PUMA προκλήθηκε από sunitinib σε όλες τις πέντε κυτταρικές σειρές (Εικ. 1Α). επαγωγή PUMA ήταν δοσοεξαρτώμενη και συνέβη σε τόσο HCT 116 WT και κυττάρων

p53

νοκ-άουτ (ΚΟ) (Εικ. 1Β). Τα βασικά επίπεδα του PUMA ήταν χαμηλότερα σε

ρ53

knockout κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα WT όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (Εικ. 1Β) [15]. p53 και p21 επίσης προκαλείται από θεραπεία με sunitinib.

PUMA

mRNA γρήγορα προκαλείται από sunitinib, προηγείται επαγωγή πρωτεΐνης (Εικ. 1Γ και 1Δ). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η PUMA είναι μεταγραφικά προκαλείται από sunitinib ανεξάρτητη από ρ53 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

(Α)

Αριστερά

, καμπύλη ανάπτυξης των HCT 116 WT και

PUMA

KO όγκους που έλαβαν sunitinib (Suni, από του στόματος καθετηριασμό, 80 mg /kg /ποντικό, ημερησίως για 10 ημέρες) ή φορέα (vE, κιτρικό ρυθμιστικό pH4.7) για 21 ημέρες. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε κάθε δεύτερη μέρα. Ν = 7 ανά ομάδα. **

P

& lt? 0,01, WT + Ve

vs

WT + Suni: *,

P

& lt? 0,05, WT + Suni

vs.. PUMA

KO + Suni.

Ριγκ

t, μια αντιπροσωπευτική εικόνα της WT και

PUMA

ΚΟ όγκοι αντιμετωπίζονται όπως υποδεικνύεται κατά την ημέρα 21. (Β) Το sunitinib που προκαλείται PUMA σε όγκους ξενομοσχεύματος. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών σε υποδεικνύονται τέσσερα τυχαίως επιλεγμένα όγκους WT ΚΟ ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. (Γ) Τα επίπεδα του p-ΑΚΤ και π-FOXO3a σε WT όγκους 24 ώρες μετά την τρίτη δόση αναλύθηκαν με IHC. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται. (D)

PUMA

ανεπάρκεια ανέστειλε sunitinib απόπτωση και την ανάπτυξη καταστολή σε όγκους ξενομοσχεύματος. Τα τμήματα παραφίνης των όγκων HCT 116 24 ώρες μετά την τρίτη ένεση υποβλήθηκαν σε TUNEL και χρώση BrdU για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης και του πολλαπλασιασμού, αντίστοιχα. Ο δείκτης του TUNEL θετικών ή BrdU-επισημασμένα κύτταρα υπολογίστηκε. **

P

& lt? 0,01, WT + Ve

vs

WT + Suni: *,

P

& lt? 0,05, WT + Suni

vs.. PUMA

KO + Suni.

Η

PUMA Παρεμβαίνει Το sunitinib απόπτωση

Για να εξετάσει έναν πιθανό ρόλο της PUMA στο sunitinib απόπτωση, συγκρίναμε τις απαντήσεις των HCT 116 κύτταρα με ισογονιδιακές

PUMA

νοκ-άουτ (KO) κύτταρα [15].

PUMA

ΚΟ κύτταρα ήταν άκρως ανθεκτικά σε sunibinib απόπτωση (Σχ. 2Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -9, ή κυτοσολικά απελευθέρωση του κυτοχρώματος c ή Smac ήταν μειωμένη σε κύτταρα

PUMA

ΚΟ, αλλά όχι σε

ρ53

ΚΟ κύτταρα (Εικ. 2Β) . Σε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας μακροπρόθεσμη,

PUMA

KO κύτταρα που δημιουργούνται πάνω από 4 φορές περισσότερο αποικίες από τα κύτταρα WT (Σχ. 2C). PUMA επίσης επάγεται σημαντικά με sunitinib στο

p53

κύτταρα μεταλλαγμένα DLD 1, ενώ

PUMA

ανεπάρκεια μπλοκάρει σημαντικά sunitinib απόπτωση και η ενεργοποίηση της κασπάσης σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 2D). Εξετάσαμε επίσης τα επίπεδα διαφόρων ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες και αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 μετά τη θεραπεία με sunitinib. Καμία σταθερή μεταβολή παρατηρήθηκε στις περισσότερες από αυτές, εκτός από την ταχεία Mcl-1 ρύθμιση προς τα κάτω και μια καθυστερημένη επαγωγή Bim μετά από 24 ώρες, σε HCT 116 κύτταρα (Σχ. S1 Α). Ωστόσο, μικρή ή καθόλου Mcl-1 προς τα κάτω ρύθμιση ή επαγωγή Bim παρατηρήθηκε σε κύτταρα DLD1 (Εικ. S1B). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα αρκετών μελών της οικογένειας Bcl-2 αυξήθηκε σε

PUMA

ΚΟ κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα WT, αντανακλώντας ίσως την αποδόμησή τους από πρωτεάσες ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια της θεραπείας και την απόπτωση (Σχ. S1B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η PUMA διαδραματίζει καίριο ρόλο στις αποπτωτικών απαντήσεις σε sunitinib σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Ο μηχανισμός της PUMA επαγωγή από Το sunitinib

Το μονοπάτι PI3K /AKT είναι μια κοινή τελεστής κατάντη πολλαπλών κινασών στόχο sunitinib. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε την ενεργοποίηση ΑΚΤ σε ένα πείραμα χρονικής πορείας εξής sunitinib θεραπεία, και βρήκε de-φωσφορυλίωση ΑΚΤ μέσα σε λίγα λεπτά (Εικ. 3Α). FOXO3a είναι ένας παράγοντας μεταγραφής και καθιερωμένη στόχο της ΑΚΤ, και η φωσφορυλίωση της από ΑΚΤ οδηγεί σε αδρανοποίηση και την πυρηνική αποκλεισμού. Sunitinib θεραπεία οδήγησε σε ταχεία de-φωσφορυλίωση FOXO3a, αλλά δεν είχε καμία εμφανή επίδραση στα επίπεδα της ολικής FOXO3a (Εικ. 3Α). Σημειώνεται ότι οι αλλαγές στην FOXO3a και φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, ή

PUMA

mRNA είναι δυναμικές και παροδικές? ενώ επαγωγή PUMA πρωτεΐνης είναι επίμονη και ομοιόμορφη σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 και 3Α). Η εξωγενής έκφραση της ενεργού συμμετοχής ΑΚΤ κατέστειλε την επαγωγή PUMA με sunitinib (Σχ. 3Β). Η επαγωγή της PUMA ανεστάλη σημαντικά από

FOXO3a

νοκ ντάουν είτε παροδική έκφραση του siRNA ή σταθερή έκφραση shRNA τόσο WT και

p53

KO HCT 116 κύτταρα (Εικ. 3C και 3D).

p53

κύτταρα ΚΟ χρησιμοποιήθηκαν για τη μείωση της p53-εξαρτώμενου από επαγωγή PUMA από την επιμόλυνση.

επόμενο καθοριστεί αν FOXO3a ενεργοποιεί άμεσα

PUMA

μεταγραφή από χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) δοκιμασία. Δύο θέσεις πρόσδεσης FOXO3a βρίσκεται στο πρώτο ιντρόνιο του

PUMA

[19]. Η πρόσληψη FOXO3a για το

PUMA

υποκινητή που περιέχουν αυτές τις περιοχές αυξήθηκε μόλις 8 ώρες μετά τη θεραπεία με sunitinib (Σχ. 4Α). Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες αναφορέα βρήκαμε ότι οι μεταλλάξεις στις θέσεις πρόσδεσης FOXO3a σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα ανταποκριτή PUMA εξής sunitinib θεραπεία (Εικ. 4Β). Επιπλέον,

FOXO3a

σταθερή knockdown κύτταρα βρέθηκαν να είναι ανθεκτικά σε sunitinib επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 4C). επίπεδα Mcl-1 αναστηλώθηκαν από

FOXO3a

siRNA στα κύτταρα έλαβε θεραπεία με sunitinib (Εικ. 1D και 3Γ, S1), γεγονός που υποδηλώνει την υποβάθμιση του θα μπορούσε να είναι ένας πρόσθετος μηχανισμός του sunitinib απόπτωση σε HCT 116 κύτταρα. Το sunitinib απόπτωση συνέβη στις άλλες γραμμές CRC συμπεριλαμβανομένων ΗΤ29, και κατεστάλη με υπερέκφραση του Mcl-1 ή ΒοΙ-2 (Σχ. 4D και S2). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι FOXO3a ρυθμίζει την επαγωγή PUMA και το μιτοχονδριακό μονοπάτι στο sunitinib απόπτωση.

ΒΗ3 μιμητικά ή Αυξημένα PUMA Επίπεδα ευαισθητοποίηση του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα στο sunitinib

Οι παραπάνω παρατηρήσεις προβλέπουν υψηλά επίπεδα της PUMA , ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, ή μικρό μόριο ΒΗ3 μιμητικά ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε sunitinib επαγόμενη απόπτωση. Αρκετοί μιμητές ΒΗ3 συμπεριλαμβανομένων HA14-1, κατακάθι και ΑΒΤ-737, και PUMA αδενοϊό (Ad-PUMA [15]), ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει HCT 116 κύτταρα με sunitinib. Αυτοί οι παράγοντες μόνοι που προκαλείται μικρή ή περιορισμένη απόπτωση (Σχ. 5Α). Είναι ενδιαφέρον, ΒΗ3 μιμητικά επάγεται σημαντική απόπτωση και την ενεργοποίηση της κασπάσης σε κύτταρα

PUMA

KO όταν συνδυάζεται με sunitinib (Σχ. 5Α και 5Β). Παράγοντες βλάβης του DNA όπως το 5-FU προκαλεί PUMA και Noxa σε κύτταρα p53 WT [14], [32], [33], [34]. 5-FU synergized επίσης με sunitinib για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα HCT 116 (Σχ. 5C), η οποία συνδέεται με αυξημένη επαγωγή PUMA (Εικ. S3). Αυτή η συνέργεια εξασθένησε αλλά δεν αποκλείστηκε σε

PUMA

ΚΟ κύτταρα (Σχ. 5C) ίσως λόγω διαμορφώσεις των άλλων μελών οικογένειας Bcl-2 μέσω δύο ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητους μηχανισμούς. Τα στοιχεία αυτά αποδεικνύουν ότι τα αυξημένα επίπεδα της PUMA ή ΒΗ3 μιμητές μπορούν να ενισχύσουν αποπτωτική απαντήσεις σε sunitinib, ακόμη και σε απόπτωση-ανθεκτικά κύτταρα.

PUMA μεσολαβούσα Θεραπευτικές Απαντήσεις σε sunitinib σε Μοντέλα Ξενομοσχεύματος

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον PUMA διαμορφώνει θεραπευτικές αποκρίσεις

in vivo

, WT και

PUMA

KO HCT 116 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά του BALB /c (ηυ /ηυ) γυμνών ποντικών για τη δημιουργία ξενομοσχεύματα. Σε σύγκριση με το όχημα, sunitinib αγωγή είχε ως αποτέλεσμα 62% και 38% αναστολή της ανάπτυξης σε HCT 116 WT και

PUMA

KO όγκων, αντίστοιχα (Σχ. 6Α). Οι διαφορές μεταξύ των

PUMA

γονότυπων ήταν στατιστικά σημαντικές στο σκέλος του sunitinib (P & lt? 0.01)., Αλλά όχι στο βραχίονα του οχήματος όσον αφορά την απόδοση ή το ρυθμό ανάπτυξης κατά την ίδρυσή του όγκου (Σχ. 6Α)

PUMA ήταν σημαντικά επάγεται σε όγκους WT από sunitinib αγωγή ποντίκια (Σχ. 6Β). Οι μεταβολές του Mcl-1, φωσφορυλιωμένα FOXO3a και ΑΚΤ παρατηρήθηκαν επίσης (Σχ. 6Β και 6C). Αναλύοντας τα τμήματα των όγκων από ποντίκια μία ημέρα μετά την τρίτη χορήγηση sunitinib (4η ημέρα), βρήκαμε ένα σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό της απόπτωσης και υψηλότερο ποσοστό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στο

PUMA

KO όγκους σε σύγκριση με τους όγκους WT (Εικ. 6D και S4A). Active χρώσης κασπάσης-3 επιβεβαίωσε μείωσε σημαντικά την απόπτωση σε

PUMA

KO όγκους (~ 80%), σε σύγκριση με το WT όγκοι αντιμετωπίζονται με τον ίδιο τρόπο (Εικ. S4B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπευτική ανταπόκριση στο sunitinib

in vivo

διαμεσολαβείται από PUMA-εξαρτώμενη απόπτωση.

Συζήτηση

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης είναι ένας σημαντικός μηχανισμός της μια ευρεία ποικιλία των αντικαρκινικών παραγόντων [2], [10], [35]. Evasion του κυτταρικού θανάτου είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου και συμβάλλει σημαντικά στην θεραπευτική αντίσταση [2], [3]. Εκτός από τις καλά τεκμηριωμένες επιδράσεις του sunitinib στην αναστολή της αγγειογένεσης των όγκων [6], [7], [36], [37], το έργο μας αποδεικνύει ότι το sunitinib εμφανίζει μια ισχυρή προ-αποπτωτική δραστηριότητα στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω της επαγωγής PUMA μέσω μεταγραφής παράγοντας FOXO3a, αλλά όχι p53, ΝΡ-κΒ ρ65 ή ρ53 ομόλογο ρ73 και ρ63. Το sunitinib επαγόμενη απόπτωση συνδέεται με την επαγωγή του Bim ή προς τα κάτω ρύθμιση των Mcl-l σε μερικές καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές που εξετάσαμε. Νωρίτερα εργασία κατέδειξε την εμπλοκή Bim και STAT3 διάρκεια sunitinib επαγόμενη απόπτωση σε άλλους τύπους κυττάρων [38], [39], [40]. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η επαγωγή του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες θα μπορούσε να είναι ένα κοινό μηχανισμό υποκείμενες sunitinib επαγόμενη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων που θα μπορούσαν να επηρεαστούν από την κατάσταση των διαφόρων κινασών, και διαφορετικές ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες μπορεί να είναι σημαντική σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων.

Ένας αριθμός περισσότερο επιλεκτικών αναστολέων VEGFR βρέθηκαν επίσης να επάγουν PUMA και απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποστηρίζοντας μια μη-αγγειογενετική ρόλο των θεραπειών αντι-VEGFR. Θα είναι σημαντικό να καθοριστεί αν sunitinib-επαγόμενη απόπτωση προκαλείται από PUMA ή άλλα ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες σε άλλους συμπαγείς όγκους, όπως καρκίνος του νεφρού και GISTs, και πιθανός ρόλος τους στην αποπτωτική αποκρίσεις σε άλλους αναστολείς VEGFR και PDGFR. Μειωμένη ευαισθησία σε sunitinib προτάθηκε να συνδέεται με μεταλλάξεις σε

KIT

ή

VEGFR /FDGFR

ή σε άλλες RTKs, καθώς και μειωμένη έκφραση των διαλυτών υποδοχέων VEGF (sVEGFs) [6], [7], το οποίο μπορεί να καταστείλει τον κυτταρικό θάνατο ή την προαγωγή της επιβίωσης [2], [5]. Επιπλέον, η αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου ή άλλων συστατικών στο μικροπεριβάλλον μπορούσε εμμέσως ενεργοποιούν οδούς κυτταρικού θανάτου [2]. Η χρήση των ισογονικών κυτταρικών σειρών, όπως κάναμε εδώ θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την κατανόηση φαρμακευτικών στόχων και των μηχανισμών [41].

Παρά τον ενθουσιασμό για την ανάπτυξη των παραγόντων στόχευσης ογκογόνο κινάσες, κλινικά δεδομένα δείχνουν ότι οι περισσότεροι από αυτούς τους παράγοντες είναι γενικά αποτελεσματική μόνο σε ένα μικρό κλάσμα των ασθενών [4], [5]. Μια σημαντική αλλαγή είναι να εντοπίσει βιοδείκτες για να βοηθήσει την επιλογή και τη διαστρωμάτωση των ασθενών. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η PUMA εμμένει σε 24-48 ώρες μετά τη θεραπεία με sunitinib. Σε αντίθεση, η αναστολή της AKT /FOXO3a είναι πιο παροδικές και ανακτά σε ώρες, πιθανόν αντανακλώντας τη δευτεροβάθμια και την επιβίωση προσπάθειες σε καρκινικά κύτταρα μετά την ενεργοποίηση των αποπτωτικών σηματοδότησης. Αυτά τα ευρήματα πιθανώς εξηγούν γιατί ανάντη μόρια σηματοδότησης είναι λιγότερο κατάλληλα ως βιοδείκτες, και να προτείνει διαμόρφωση της μιτοχονδριακής οδού θανάτου μπορεί να είναι ένα πιο χρήσιμο αναγνώσεως για τη συνολική θεραπευτική δράση των αντικαρκινικών παραγόντων.