Αφηρημένο

Prohibitin 1 (PHB1) είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη που μαζί με το ομόλογο prohibitin του 2 (PHB2) εντοπίζεται κυρίως στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Παρόλο που αρχικά αναγνωρίζονται από την ικανότητά της να αναστέλλει G1 /S εξέλιξη σε ανθρώπινες ινοβλάστες, ο ρόλος της ως ογκοκατασταλτικό συζητείται. Για να προσδιοριστεί η λειτουργία του prohibitins στη διατήρηση της ομοιόστασης των κυττάρων, δημιουργήσαμε κυτταρικές σειρές καρκίνου εκφράζουν prohibitin κατευθυνόμενη Τα siRNAs. Δείχνουμε ότι prohibitin πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Down-ρύθμιση της έκφρασης prohibitin μειωθεί δραστικά το ρυθμό της κυτταρικής διαίρεσης. Επιπλέον, μιτοχονδριακό μορφολογία δεν επηρεάστηκε, αλλά η απώλεια του prohibitins οδήγησε στην αποδόμηση της πρωτεΐνης σύντηξης OPA1 και, σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε μία μειωμένη ικανότητα να επιδεικνύουν ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα επίσης εμφάνισαν μειωμένη προσκόλληση στο εξωκυτταρικό πλέγμα. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν prohibitins διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στις διαδικασίες προσκόλλησης στο κύτταρο και επομένως διατηρώντας πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση

Παράθεση:. Sievers C, Billig G, Gottschalk Κ, Rudel T (2010) Prohibitins είναι που απαιτούνται για τον Καρκίνο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της πρόσφυσης. PLoS ONE 5 (9): e12735. doi: 10.1371 /journal.pone.0012735

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 15 Ιούλ 2010? Αποδεκτές: 6 Αυγούστου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Sievers et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το με τη χρηματοδότηση στο πλαίσιο του έκτου προγράμματος-πλαισίου έρευνας της Ευρωπαϊκής Ένωσης, το Project ΔΕΞΙΑ (LSHB-CT-2004 έως 005.276) για να TR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Prohibitins (PHB1 και PHB2) είναι εξαιρετικά ομόλογες πρωτεΐνες που είναι συντηρημένες σε όλη την εξέλιξη και εκφράζονται παντού [1] – [3]. Prohibitins εντοπίζονται κυρίως στα μιτοχόνδρια, αλλά βρίσκονται επίσης στον πυρήνα και εντός λιπιδικών σχεδιών της κυτταροπλασματικής μεμβράνης [1], [4] – [7]. Εντοπισμού για να λιπιδίων σχεδίες είναι επίσης ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των άλλων μελών της οικογένειας στοματίνη /prohibitin /flotilin /HflK /C-τομέα (SPFH) των πρωτεϊνών [8].

Οι μέχρι τώρα μελέτες έχουν συσχετίσει PHB1 με διαφορετικούς ρόλους στην η διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης. Οι αρχικές εργασίες πρότειναν λειτουργεί ως αναστολέας της σύνθεσης του DNA, ένας ρόλος που αργότερα ανατεθεί 3’UTR της [9], [10]. Μια μορφή έκφρασης Τ-αλληλόμορφη PHB1 συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του μαστού [11]? Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή δεν επιβεβαιώθηκε σε κλινικό περιβάλλον [12], [13]. PHB1 συνεντοπίζεται με παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας Ε2Ρ στον πυρήνα των κυττάρων του καρκινώματος του μαστού [14], και αλληλεπιδρά με την Rb ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη pRB στον πυρήνα με αποτέλεσμα την αναστολή του κυτταρικού κύκλου [15]. Αντίστοιχα, siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση της έκφρασης PHB1 βρέθηκε να αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του μαστού [16]. Παρά αυτές τις ενδείξεις ογκοκατασταλτικών δραστηριότητα, πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης καταδείξει μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά την απώλεια της έκφρασης PHB1 σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού και άλλα πρωτογενή κύτταρα? . Και η διάσωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά την υπερέκφραση του μιτοχονδριακού στοχευμένες PHB2 [17]

πρόσφατη εργασία μας δείχνει PHB1 παίζει επίσης ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση: Παροδικές αποσιώπηση των PHB1 από siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν οδήγησε σε φαινότυπο συσσώρευση σε κύτταρα HeLa, συγκρίσιμη με εκείνη ενός Her2 /ErbB2 ή Rac ελάττωμα, δηλαδή συσσωμάτωμα κύτταρα έδειξαν χρώση αξιοσημείωτη μεμβράνη για παν-καντερίνης και β-κατενίνης. Οι συγγραφείς πρότειναν επαφή μεταξύ κύτταρα διασπάστηκαν σε κύτταρα όγκου λόγω της απώλειας του PHB1 [6]. Μελέτες σε ζυμομύκητες έχουν δείξει ότι PHB1 και PHB2 ενεργούν ως μιτοχονδριακό συνοδοί στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη [3], [18] – [20]. PHB1 και PHB2 είναι αλληλεξαρτώμενες στο επίπεδο πρωτεΐνης και απώλεια ενός οδηγεί ταυτόχρονα στην απώλεια του άλλου [21]. Αλληλεπιδρούν με μιτοχονδριακή πρωτεάσες, ιδιαίτερα mAAA, η οποία απαιτείται για τη συναρμολόγηση των συμπλοκών αναπνευστικής αλυσίδας [22], [23]. Ένα νοκ-άουτ από prohibitins στο ζυμομύκητα οδήγησε σε μειωμένη αντιγραφική διάρκεια ζωής και ένα ελάττωμα στην μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό [18], [24]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν ασχοληθεί επίσης τη μιτοχονδριακή λειτουργία των prohibitins σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές: Υπερέκφραση του PHB1 βρέθηκε να προστατεύσει από το οξειδωτικό στρες [25]? Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση knockdown του PHB2 οδήγησε στην υποβάθμιση της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης σύντηξης OPA1 [17] και τον κατακερματισμό της μιτοχονδριακής δικτύου [21]. Ωστόσο, δεν είναι ακόμα σαφές εάν η έκφραση prohibitin σταθεροποιεί το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) [17], [26], [27].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε prohibitins παίζουν ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης και της διάδοσης σε καρκινικά κύτταρα και πρωτογενή κύτταρα. Εξάντληση των prohibitins δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στη λειτουργία των μιτοχονδρίων, αλλά επηρέασε την προσκόλληση των κυττάρων στην εξωκυττάρια μήτρα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

ΗΕΚ293 και HeLa κύτταρα ελήφθησαν από τη γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ). HT1080wt, Jurkat και CapanI κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). κύτταρα IF6 ήταν ένα δώρο από τον U. Rapp, Würzburg. κύτταρα HeLa ελέγχθηκαν και επικυρώνονται από DSMZ μέσω STR-δακτυλικών αποτυπωμάτων. ΗΕΚ293 κύτταρα και τα κύτταρα HT1080wt καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FCS, 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη, 10 mM HEPES ρΗ 7.4 και 4 mM L-γλουταμίνη. κύτταρα HeLa, κύτταρα IF6 και τα κύτταρα Jurkat καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% FCS, 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. ΗΤ29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy συμπληρωμένο με 10% FCS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. κύτταρα Capan Ι καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 20% FCS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO2.

Δημιουργία knockdown κυτταρικών γραμμών shRNA

shRNA που εκφράζουν οι φορείς κατασκευάστηκαν με κλωνοποίηση διαφορετικών Τα siRNAs στο pLL3.7 ή φορέα pLVTHM. Για να δημιουργηθεί ένα επαγώγιμο σύστημα φορέα, τα Τα siRNAs από το σύστημα έκφρασης συστατική pLVTHM υποκλωνοποιήθηκαν στο σύστημα επαγώγιμου φορέα pLVPT, μεταφέροντας την κασέτα που περιέχει το shRNA και τον προαγωγέα Η1 μέσω των θέσεων περιορισμού XhoI /XbaI. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων των στόχων shRNA που χρησιμοποιούνται είναι οι εξής: shLuci, 5′-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ‘? PHB1-0, 5’-GCGGAGAGAGCCAGATTTG-3 ‘? PHB1-3, 5’-GACACATCTGACCTTCGGGAA-3 ‘? και PHB2-0, 5’-GACAGAGAGGGCCAAGGAC-3 ‘. Σταθερή μεταγωγή, συστατική ή επαγόμενη knockdown κυτταρικές γραμμές κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]? βλέπε επίσης https://tronolab.epfl.ch/). Εν συντομία, κύτταρα HeLa υπέστησαν μεταγωγή με τον αντίστοιχο φορέα λεντοϊού παρουσία Polybrene (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA). Για την μεταγωγή των pLVPT φορείς φακοϊού, η έκφραση shRNA προκλήθηκε με αγωγή με 1 μg /ml δοξυκυκλίνης (Sigma) για 3 ημέρες και κύτταρα ταξινομήθηκαν ως προς την έκφραση eGFP με το Κυτταρόμετρο Ροής MoFlo® (Dako Denmark A /S, Glostrup, Denmark) . Για την επικύρωση των knockdown επιπέδων, RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη QuantiTect SYBR Green PCR πραγματικού χρόνου Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλοι οι φορείς ελήφθησαν από D. Trono, Ομοσπονδιακή Πολυτεχνική Σχολή της Λωζάννης, Γαλλία.

Soft δοκιμασία άγαρ

Τα κύτταρα (2 × 10

3) εμβολιάστηκαν σε χαμηλή θερμοκρασία τήξης 0,3% αγαρόζης (Sigma) σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FCS, και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 2-4 εβδομάδες επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου ανάλυση

για τη χρώση CFSE, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, στη συνέχεια χρωματίζονται με 5 μΜ CFSE για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Υπολειμματική CFSE απομακρύνθηκε με έκπλυση δύο φορές με PBS και τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Η ένταση φθορισμού CFSE μετρήθηκε με ανάλυση FACS κάθε 24 ώρες για 5 ημέρες. δοκιμασίες BrdU διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού ELISA, BrdU (χημειοφωταύγειας)

κιτ (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 3.5 × 10

3 σε ένα άσπρο rimmed πλάκας 96-φρεατίων. BrdU προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ για 1 ώρα. Υπεροξειδάση συζευγμένο αντίσωμα αντι-BrdU προστέθηκαν σε κύτταρα για 30 έως 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και η φωταύγεια μετρήθηκε μετά από επώαση 3 έως 10 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο μικροπλάκας Monolight 3096 (BD Bioscience).

TMRE χρώση

για να αναλυθεί το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, 100 ηΜ TMRE προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας και τα κύτταρα περαιτέρω επωάστηκαν για 30 λεπτά κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. Ενσωμάτωση μετρήθηκε με FACS. Για τον έλεγχο για την πλήρη απώλεια του δυναμικού της μεμβράνης, 1 μΜ CCCP προστέθηκε για 5 λεπτά.

ATP επίπεδα

Κυτταρική σύνθεση ΑΤΡ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΤΡ

Η βιοφωταύγεια Assay Kit HSII

(ROCHE), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10

5 έως 10

7 κύτταρα /25 μΙ ανά φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων λύθηκαν στον ίδιο όγκο του αντιδραστηρίου λύσης κυττάρου με επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πενήντα μικρολίτρα του ανασυσταθέντος αντιδραστηρίου λουσιφεράσης προστέθηκε στο καλά με αυτοματοποιημένη έγχυση (BD Bioscience, Monolight φωτόμετρο). Μετρήσεις (διάρκεια 2 δευτερολέπτων) ελήφθησαν μετά από μία καθυστέρηση 1 δευτερολέπτου.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν εντός ρυθμιστικού διαλύματος 2 χ δείγματος που περιέχει 200 ​​mM DTT και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 10% SDS- ΣΕΛΊΔΑ. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε ένα φθορίδιο πολυβινυλιδενίου μικροπορώδη μεμβράνη και ανοσοανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι OPA1 (BD Biosciences), PHB1 και PHB2 (NeoMarkers) και ακτίνη (Sigma). OPA1 κατακερματισμός ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό AIDA.

ανοσοφθορισμού χρώση

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν με 4% paraformadehyde για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά σε 0.5% Triton Χ-100. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ανοσοβαφή χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-Tom20 (BD Biosciences) (1:100 αραίωση, 2 h RT), ποντικού αντι-παξιλλίνη-1 (BD Transduction) (1:100), φαλλοειδίνη-Alexa 488 ( MoBiTec) (1:200) και γαϊδάρου αντι-ποντικού, Cy ™ 3 (1:100). Η ποσοτικοποίηση του μιτοχονδριακού δικτύου έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Η μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Τα κύτταρα εξαντλούνται από prohibitins με διέγερση έκφρασης shRNA για 10 ημέρες μονιμοποιήθηκαν με 2,5% γλουταραλδεΰδη, σταθεροποιήθηκαν με 0,5% τετροξείδιο οσμίου και σε αντίθεση με τη χρήση ταννικό οξύ και οξικό ουρανύλιο. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης και ενσωματώνονται σε Polybed. Εξαιρετικά λεπτές τομές αναλύθηκαν σε Leo 906E ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Leo GmbH).

Πρόσφυση δοκιμασία

Για να μετρηθεί προσκόλληση των κυττάρων, μικροπλάκες επικαλύφθηκαν με 1 mg /ml ινωδονεκτίνης, 2 mg /ml κολλαγόνο ή 3 mg /ml BSA, αντίστοιχα. έκφραση GFP ήταν κάτω από την ευαισθησία του φθοριομέτρου (στα 488 nm), ως εκ τούτου έχουμε χρώση κυττάρων με CFSE πριν από την σπορά. Τα κύτταρα επωάστηκαν επί επικαλυμμένα φρεάτια για 30 λεπτά στους 37 ° C.

Για να αναλύσουμε την κυτταρική μετανάστευση και προσκόλληση, τα κύτταρα επάγονται με δοξυκυκλίνη για 8 ημέρες σπάρθηκαν κάτω από συνθήκες ταπήτιο, σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας ή καλυπτρίδες, επί 20 ώρες που ακολουθείται από 4 ώρες ασιτία ορού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ φορσκολίνης για 20 λεπτά για να επάγει την ενεργοποίηση cAMP /ΡΚΑ και έτσι ελασματοπόδια και το σχηματισμό εστιακών προσκόλλησης. νημάτια ακτίνης και εστιακών συμφύσεων απεικονίστηκαν μέσω ανοσοκυτταροχημεία και το εστιακό συμφύσεις μετρήθηκαν με το χέρι.

Αποτελέσματα

Η επιλεκτική απώλεια PHB1 απεμπλουτισμένου κυττάρων

Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει συναίνεση σχετικά με τη λειτουργία των PHB1 έχει επιτευχθεί? σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, PHB1 έχει αναφερθεί ότι δρα ως καταστολέας όγκου [15], [16], ενώ σε πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα εξάντληση των PHB1 οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό [26]. Να καθορίσει το ρόλο της PHB1 σε κύτταρα HeLa, μια κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος, δημιουργήσαμε σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν PHB1-σκηνοθεσία Τα siRNAs χρησιμοποιώντας το συστατική σύστημα έκφρασης shRNA pLL3.7 λεντοϊού [29]. Έκφραση των τριών διαφορετικών Τα siRNAs, shPHB1-2, shPHB1-3 και shPHB1-0, με στόχο την περιοχή κωδικοποίησης της PHB1 προκάλεσε την εξάντληση του PHB1 με παρεμβολή RNA (RNAi) στο mRNA (Σχ. 1Α) και σε πρωτεΐνες (Εικ. 1Β) επίπεδο. Η εξάντληση των PHB1 συσχετίζεται με την ταυτόχρονη έκφραση της πρωτεΐνης δείκτη eGFP (Εικ. 1 C), υποδεικνύοντας την επιτυχή λεντοϊού μεταγωγή αυτών των κυττάρων. Στη συνέχεια αυξήθηκε τις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές και να παρακολουθείται η σύνθεση του πληθυσμού κυττάρων χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσκοπίας και FACS. Μια επιλεκτική αναγωγή του shPHB κυττάρων που εκφράζουν από την πισίνα κύτταρο παρατηρήθηκε, ορατή από τη μείωση του πληθυσμού eGFP-θετικών κυττάρων (σχ. 1D). Αυτή η απώλεια δεν οφείλεται σε αυξημένη απόπτωση των shRNA-κύτταρα που εκφράζουν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά ταχύτερη ανάπτυξη των μη-μετατραπέντων, PHB1 κύτταρα που εκφράζουν πρωτεΐνη, και ως εκ τούτου eGFP-αρνητικά κύτταρα, τα οποία έδειξαν κανονική πολλαπλασιασμό.

(Α, Β) PHB1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αποτελεσματικά μειώνεται σε κύτταρα που εκφράζουν shPHB1-0, shPHB1-2 και shPHB1-3 χρησιμοποιώντας την συστατική λεντοϊού pLL3.7 σύστημα έκφρασης, όπως δείχθηκε με qRT-PCR και στυπώματα Western, αντιστοίχως. (Γ) Μετά την μεταγωγή λεντοϊού σταθερή ενσωμάτωση υποδεικνύεται από την έκφραση GFP. (Δ) Με την έκφραση του θετικώς επικυρωμένων Τα siRNAs που στοχεύουν PHB1 mRNA το κλάσμα του GFP κυττάρων που εκφράζουν μειώθηκε εντός δέκα ημερών από μεταγωγή από μία δεξαμενή σε μεταγωγή κυττάρων μέσα, όπως φαίνεται με ανάλυση FACS. κύτταρα (Ε) μετατραπέντα HeLa που εκφράζουν το φορέα ελέγχου ή τη στόχευση PHB1 Τα siRNAs σπάρθηκαν σε μαλακό άγαρ. Μόνο τα κύτταρα ελέγχου αυξήθηκαν υπό ανεξάρτητο από αγκύρωση συνθήκες και σχηματίζονται αποικίες.

Η

Για να ελεγχθεί αν αυτή η παρατήρηση ήταν ειδικό για κύτταρα HeLa, ένα αριθμό διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων Capan1, HT1080wt, Jurkat Τ κύτταρα , IF6 και ΗΤ29 κύτταρα, υπέστησαν μεταγωγή με την ίδια λεντοϊού κατασκεύασμα shRNA και την ανάπτυξή τους παρακολουθείται όπως πριν. Η ανάλυση στυπώματος Western απεκάλυψε την έκφραση του shPHB1-0 οδήγησε σε εξάντληση των PHB1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Εικ. S1 Α). Επιπλέον, παρόμοια με τα κύτταρα HeLa, παρατεταμένη καλλιέργεια οδήγησε σε απώλεια της eGFP-θετικών κυττάρων (Εικ. S1B), αποκλείοντας μία κυτταρική γραμμή-ειδικό αποτέλεσμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε σε πολλαπλασιαζόμενα πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) μετά την μεταγωγή shPHB1-0 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του PHB1 παρεμβαίνει με πολλαπλασιασμό.

Από ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων [30], αξιολογήσαμε επίσης αυτό το φαινότυπο σε κυτταρικές σειρές μας συστατικά που εκφράζουν Τα siRNAs που στοχεύουν PHB1. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μαλακό άγαρ και την ανάπτυξη τους παρακολουθείται όπως πριν. Έλεγχος και μη μεταχθέντα κύτταρα παρουσίασαν φυσιολογική χαρακτηριστικά ανάπτυξης, σχηματίζοντας αποικίες και πολλαπλασιαζόμενα, ενώ PHB1-knockdown κύτταρα παρέμειναν ως απλά κύτταρα (Σχ. 1Ε), υποδεικνύοντας PHB1 παίζει ρόλο στην αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη.

PHB1 /PHB2 απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

από όρους αποσιώπηση της έκφρασης PHB1 οδήγησε σε απώλεια του πολλαπλασιασμού και, κατά συνέπεια, την υπερανάπτυξη από μη μεταδιηγερμένα κύτταρα, μακροχρόνιες μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις της μειωμένης έκφρασης PHB1 σε μοριακό επίπεδο δεν ήταν δυνατόν. Ως εκ τούτου, εξέφρασε την ίδια επικυρωμένη Τα siRNAs για τη λειτουργική knockdown του PHB1 σε ένα βραδέος ιού φορέα υπό τον έλεγχο ενός δοξυκυκλίνης-επαγόμενο υποκινητή [28]. Να αναλύσει το ρόλο της PHB2 και την αλληλεπίδρασή του με PHB1, σχεδιάσαμε ένα επιπλέον shRNA που στοχεύουν ειδικά PHB2 mRNA (για λεπτομέρειες βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Οι μειώσεις στην έκφραση PHB1 και πρωτεΐνες PHB2 παρατηρήθηκαν 3 έως 4 ημέρες μετά την η προσθήκη της δοξυκυκλίνης, να γίνει σημαντικά μειωμένη σε 5-6 ημέρες και στη συνέχεια παραμένει σταθερά μειώνεται για έως και 10 ημέρες (Εικ. 2Α, Β). Η εξάντληση του ενός πρωτεΐνης prohibitin οδήγησε στην απώλεια του άλλου (Σχ. 2C). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν πιθανόν να οφείλεται σε πρωτεΐνη αποσταθεροποίηση καθώς τα επίπεδα mRNA του μη αθόρυβη γονίδιο παρέμεινε σταθερό (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Όπως παρατηρήθηκε στο παρελθόν κατά την συστατική αποσιώπηση των PHB1 (Εικ. 1D), επαγώγιμα αποσιώπηση των prohibitins οδήγησε σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. δοκιμασίες ενσωμάτωσης BrdU αποκάλυψε μειωμένη σύνθεση DNA 5 ημέρες μετά την επαγωγή της PHB1 και εξάντληση PHB2 (Σχ. 2D). Για την εκτίμηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού σε επίπεδο μονού κυττάρου, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Καρβοξυ φθορισμού succinidylester (CFSE)? Αυτή η κηλίδα είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμα και στοιχειομετρικά διανέμονται σε θυγατρικά κύτταρα κατά την κυτταρική διαίρεση. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σαφώς μειώθηκε σε PHB1- ή κύτταρα PHB2 εξαντλημένο σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2Ε). Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα έδειξαν μειωμένη αγκυροβόλιο ανεξαρτησία και απέτυχε να αναπτυχθεί σε μαλακό άγαρ (Σχ. 2F). Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνει ότι prohibitins παίζουν ένα ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

(Α, Β) Μεταγωγή με το σύστημα λεντοϊού pLVPT επιτρέπει δοξυκυκλίνη επαγώγιμη έκφραση shRNA. Εντός της υποδεικνυόμενο χρόνο επαγωγής PHB1 και η έκφραση πρωτεΐνης PHB2 ήταν αποτελεσματικά μειωθεί. (Γ) Η επαγώγιμη έκφραση είτε PHB1 στοχευμένες ή PHB2 στοχευόμενο mRNA οδήγησε σε μειωμένη έκφραση και των δύο πρωτεϊνών, όπως φαίνεται από κηλίδα Western. (Δ) Ανάλυση ενσωμάτωσης BrdU δείχνει κύτταρα HeLa που εκφράζουν shPHB1-0, shPHB1-3 ή shPHB2-0 για 10 ημέρες εμφανίζουν μειωμένο συντελεστή πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο shRNA (shLuci). (Ε) ένταση CFSE όπως μετρήθηκε με FACS στους 0 h (1), 24 ώρες (2), 48 ώρες (3), 72 ώρες (4), και 96 ώρες (5) είναι υψηλότερη σε prohibitin knockdown κυττάρων υποδεικνύοντας μειωμένη αραίωση CFSE για γρήγορη αντιγραφή θυγατρικά κύτταρα. (F) Ένταση CFSE μετρήθηκε με FACS κάθε 24 ώρες για 5 ημέρες και η διάμεση τιμή της κάθε κορυφής σχεδιάστηκε έναντι του άλλου. (G) επαγώγιμη έκφραση Τα siRNAs είχε ως αποτέλεσμα την ίδια φαινότυπο μειωμένης /απώλειας ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε PHB1 (shPHB1-0, shPHB1-3) και PHB2 (shPHB2-0) knockdown κυττάρων όπως παρατηρήθηκε με το σύστημα συστατική έκφραση.

Απώλεια prohibitins οδηγεί σε κατακερματισμό των μιτοχονδρίων

Δεδομένου ότι οι prohibitins εντοπίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια [1], αποφασίσαμε να ελέγξετε αν η εξάντληση των prohibitins επηρέασε την ακεραιότητα των μιτοχονδρίων. Χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ανοσοφθορισμού παρατηρήσαμε μια σαφή κατακερματισμό της μιτοχονδριακής δίκτυο σε κύτταρα που εκφράζουν shPHB1-3, η οποία αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου (Σχήμα 3Α, Β.)? Έκφραση shPHB2-0 απέτυχαν να επάγουν μια σημαντική αύξηση στην κατάτμηση της μιτοχονδριακής δικτύου (Σχ. 3Α, Β). Επιπλέον, η έκφραση του shPHB1-3 είχε ως αποτέλεσμα μια πιο αποτελεσματική knockdown των δύο prohibitins.

(Α, Β) Τα μιτοχόνδρια από prohibitin knockdown κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-Tom 20 και μιτοχονδριακή κατακερματισμό ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Μια εκτεταμένη επαγωγή με δοξυκυκλίνη οδήγησε σε αυξημένο κατακερματισμό shPHB1-3 κύτταρα που εκφράζουν. (Γ) κηλίδες Western που δείχνει ότι η παρατεταμένη δοξυκυκλίνη επαγόμενη shPHB1-3 έκφραση οδήγησε σε μια ισχυρότερη prohibitin knockdown από έκφραση shPHB2-0, συσχετίζοντας με αυξανόμενη κατακερματισμό της αρμόδιας θραυσμάτων σύντηξης α και β του OPA1. (D) Ποσοτικός έδειξε ότι οι αρμόδιες μορφές σύντηξης αποικοδομήθηκαν σε μικρότερα θραύσματα c και e. (Ε) Ποσοτικοποίηση των OPA1 σχηματοποίησης σε κύτταρα ελέγχου (shLuci), κύτταρα PHB1-εξαντλημένο (shPHB1-3) και κύτταρα επεξεργασμένα με 60 μΜ CCCP για 80 λεπτά (CCCP) για να προκληθεί απώλεια ΔΨm. Το μοτίβο OPA1 σε κύτταρα CCCP επεξεργασμένα διέφερε από shPHB1-3 εκφράζοντα κύτταρα, ως θραύσματα Α και Β ήταν εντελώς χαθεί, ενώ τα μικρότερα θραύσματα d και e αυξήθηκαν. (F) εικόνες ΤΕΜ των κυττάρων με ένα knockdown prohibitin επάγεται για 10 ημέρες εμφάνισαν μια πιο πυκνή εμφάνιση των μιτοχονδρίων από shLuci εκφράζουν κύτταρα ελέγχου, αλλά η μορφολογία της δομής ακρολοφίες δεν άλλαξε.

Η

Μεταξύ πολλές άλλες πρωτεΐνες, OPA1 παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο των μιτοχονδριακών σύντηξης [31] και ληκυθοφόρους ακεραιότητα [32]. Από προηγούμενες δημοσιεύσεις έχουν δείξει ότι prohibitins είναι αναγκαία για σταθερή έκφραση OPA1 [17], [21], αναλύσαμε την επίδραση της PHB1 και εξάντληση PHB2 στα επίπεδα του μιτοχονδριακού πρωτεΐνης σύντηξης OPA1. Οι OPA1 πρωτεΐνες εκφράζονται ως επτά παραλλαγές ματίσματος, ορατή ως πέντε ζώνες (α-ε) σε Western blot, που αποδίδεται εν μέρει στην δράση συγχωνεύσεως των OPA1 [33]. Παρατηρήσαμε υποβάθμιση της OPA1 στα κύτταρα εξαντλούνται από prohibitins, η οποία συσχετίζεται με την αποτελεσματικότητα της εξάντλησης prohibitins. Ειδικότερα, η αρμόδια θραύσματα σύντηξης α και β χάθηκαν και ο μικρά θραύσματα c-e είναι αυξημένο μετά την εξάντληση PHB1 για μεγαλύτερες χρονικές περιόδους (Σχ. 3C, D). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κύτταρα που εκφράζουν shPHB2-0 ζώνες Α και Β παρέμεινε άθικτο, και αυξάνει μόνο σε ζώνη e παρατηρήθηκαν (Εικόνα Σχ. 3C). Η επίδραση ήταν ειδική για OPA1 αφού αποδόμηση άλλων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων Hsp60, ΑΤΡ συνθάσης και δεν παρατηρήθηκε Tims και Toms (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την επιλεκτική δράση της shPHB1-3 στο μιτοχονδριακό κατακερματισμό και την υποβάθμιση OPA1.

Από προηγούμενες μελέτες ήταν γνωστό ότι απαγωγή της ΜΜΡ προκαλεί υποβάθμιση OPA1 και μιτοχονδριακή κατακερματισμό [33]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν το πρότυπο του κατακερματισμού OPA1 που προκαλείται από την εξάντληση PHB1 και ΜΜΡ ήταν παρόμοια. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την απόζευξη καρβονυλ αντιδραστήριο κυανιούχο

m

χλωροφαινυλ υδραζόνη (CCCP) και οι ζώνες OPA1 ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωμα. OPA1 μοτίβα πρωτεΐνης ήταν σαφώς διαφορετική σε κύτταρα χωρίς ΜΜΡ σε σύγκριση με εκείνες του εξαντλημένο PHB1 (Σχ. 3Ε). Οι αρμόδιες θραύσματα σύντηξης OPA1 αποικοδομήθηκαν και έκφραση θραυσμάτων c, d και e αυξήθηκε σε απουσία ΜΜΡ. Σε κύτταρα prohibitin εξαντλημένο, η έκφραση του συγκροτήματος d έκφραση έντονα μειωμένη, ενώ ζώνη Β ήταν μόνο ελαφρώς μειωμένη, γεγονός που υποδηλώνει ότι διαφορετικοί μηχανισμοί ευθύνονται για τις παρατηρούμενες επιδράσεις. Σε ένα πείραμα χρονικής πορείας, παρατηρήσαμε ότι CCCP προκαλεί κατακερματισμό μιτοχόνδρια πριν από την υποβάθμιση OPA1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας ότι η υποβάθμιση OPA1 μπορεί να είναι συνέπεια του μιτοχονδριακού κατακερματισμού σε αυτή την περίπτωση.

Για να ελέγξετε αν αποσιώπηση της PHB1 προκαλεί απώλεια του ΜΜΡ, εμείς χρώση shPHB1-3 κυττάρων που εκφράζουν με tetramethylrhodamine υπερχλωρικό αιθυλεστέρα (TMRE), ένα κύτταρο-διαπερατό χρωστική ουσία που διαχωρίζεται από την ενεργό μιτοχόνδρια. TMRE ένταση χρώσης ήταν παρόμοια στον έλεγχο και PHB1 εξαντλημένο κύτταρα (Σχ. S2A), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μιτοχονδριακή μεμβράνη παραμένει άθικτη, παρά τον κατακερματισμό των μιτοχονδρίων στα κύτταρα αυτά. Σύμφωνα, τα επίπεδα ATP παρέμεινε αμετάβλητη στα κύτταρα εξαντλούνται από prohibitins (Εικ. S2B). Δεδομένου ότι η υποβάθμιση OPA1 έχει επίσης δειχθεί να οδηγήσει σε αλλαγές στη μορφολογία ακρολοφίες [32], διερευνήσαμε την δομή ακρολοφίες των μιτοχονδρίων στα κύτταρα εξαντλούνται από prohibitins χρησιμοποιώντας Ηλεκτρονική Μικροσκοπία (ΤΕΜ). Σε PHB1-φιμώνονται και τον έλεγχο των κυττάρων, τη δομή ακρολοφίες παρέμεινε άθικτη (Εικ. 3F), ενδεικτικό μιας κανονικής μιτοχονδριακού φυσιολογία.

κύτταρον to-επαφής των κυττάρων αναστέλλεται σε prohibitin εξαντλημένα κύτταρα

Κατά τη διάρκεια της αρχικές μας μελέτες σχετικά με τις prohibitin knockdown κυτταρικές γραμμές, παρατηρήσαμε ότι η απώλεια των κυττάρων prohibitin-εξαντλημένο εξηρτάτο από την πυκνότητα στην οποία τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας. Σε υψηλές πυκνότητες κυττάρων, η απώλεια του knockdown κυττάρων μειώθηκε αλλά όχι εμποδίζεται (Σχ. 4Α). Επιπλέον, η απώλεια της έκφρασης prohibitins προκάλεσε μια αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία, σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές: κύτταρα HeLa, ειδικά όταν εμβολιάζονται σε χαμηλή πυκνότητα έτειναν να παραμένουν ως απλά κύτταρα με μία επιμήκη μορφολογία, που θυμίζει ινοβλαστών (Εικόνα 4Β).. Ένας παρόμοιος φαινότυπος δεν παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα HeLa διατηρήθηκαν κάτω από συνθήκες αναστολής με σπορά τους σε πιάτα καλλιέργειας κυττάρων αγαρόζης-καλύπτονται: ελέγχει μόνο τα κύτταρα που σχηματίζονται αποικίες, ενώ prohibitin-σιγήσει κύτταρα απέτυχαν να σχηματίσουν σε κύτταρα σε κύτταρο επαφές και αποικίες (Σχ 4C. ).

(Α, Β) Σίγαση prohibitin έκφρασης για 10 ημέρες οδήγησε σε τεντωμένο μορφολογία των κυττάρων με τον πυρήνα ελαφρώς αυξημένα. (Α) Όταν σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα prohibitin knockdown κύτταρα παρέμειναν ως απλά κύτταρα με ελάχιστη επαφή κυττάρου-κυττάρου. (Β) Σε υψηλότερη πυκνότητα σπόρων, prohibitin-knockdown κυττάρων έδειξε ακόμη μια επιμηκυμένη μορφολογία αλλά είτε σχηματίζονται συμπλέγματα (shPHB1-3) ή παρέμειναν κατά κύριο λόγο ως μεμονωμένα κύτταρα με μειωμένη επαφή κυττάρου-κυττάρου. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων prohibitin knockdown ήταν επίσης αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε φυσιολογικά. (Γ) πρόληψη αγκυροβόλιο με εμβολιασμό κυττάρων σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας επικαλυμμένες με άγαρ έντονα μειωμένο συντελεστή πολλαπλασιασμού και σχηματισμό αποικίας σε prohibitin knockdown κύτταρα, ενώ τα κύτταρα ελέγχου (shLuci εκφράζοντα κύτταρα) που σχηματίζονται μεγάλα συσσωματώματα κυττάρων. (D) Prohibitin-εξαντλημένο και κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CFSE να αυξήσουν την ένταση του φθορισμού και σπάρθηκαν σε πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας κολλαγόνου ή ινονεκτίνη, ή σε BSA για 30 λεπτά. Μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν μακριά και μετρήθηκε η ένταση φθορισμού. Prohibitin knockdown μείωσε σημαντικά την πρόσφυση. (Ε) Η δοξυκυκλίνη επαγόμενη κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες για 20 ώρες ακολουθούμενο από ασιτία ορού για 4 ώρες. Μετά την επεξεργασία με 50 μΜ φορσκολίνης για 20 λεπτά, φωτεινού εικόνες έδειξε σχηματισμό ελασματοπόδια σε κύτταρα ελέγχου αλλά όχι στο prohibitin- εξαντληθεί κύτταρα. Επιπλέον, prohibitin-εξαντλημένο κύτταρα έδειξαν μειωμένο σχηματισμό εστιακών συμφύσεων, όπως φαίνεται με χρώση ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας φαλλοϊδίνης και αντι-παξιλλίνη αντισώματα. (F) για την ποσοτικοποίηση των συμφύσεων στον έλεγχο και prohibitin νοκ ντάουν κύτταρα, α-παξιλλίνη 1 χρωματισμένο κηλίδες μετρήθηκαν σε 30 κύτταρα ανά συνθήκη.

Η

Για να μελετηθεί ο σχηματισμός επαφή κυττάρου-μήτρας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με την εξωκυττάρια μήτρα πρωτεΐνες ινωδονεκτίνης και κολλαγόνου. Η προσκόλληση των κυττάρων PHB1- και PHB2 εξαντλημένο σε αυτές τις πρωτεΐνες μήτρας ανεστάλη σημαντικά (Εικ. 4D). Για την περαιτέρω ποσοτικοποίηση προσκόλληση κυττάρου-μήτρας, σχηματισμός εστιακών προσκόλληση προκλήθηκε με φορσκολίνη μετά ασιτία ορού. Ανοσοφθορισμός μικροσκοπία αποκάλυψε μειωμένη εξάπλωση και τον σχηματισμό νηματίων ακτίνης (Εικ. 4Ε), συν τη μείωση του αριθμού των εστιακών συμφύσεων (Σχ. 4Ε, F). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι prohibitins παίζουν επίσης ένα ρόλο στην αλληλεπίδραση κυττάρου-μήτρας.

Συζήτηση

Από την ανακάλυψη της αντι-πολλαπλασιαστική δράση τους, prohibitins έχουν εμπλακεί σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες [10] , [18], [34]. Ωστόσο, αρκετές γραμμές έμμεσες ενδείξεις, όπως η υπερέκφραση τους σε πολυάριθμες καρκινικά κύτταρα [35], ανέφεραν ότι prohibitins δεν λειτουργούσαν ως κλασικός καταστολέας όγκου. Εδώ, δείχνουμε prohibitins είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση. Χρησιμοποιήσαμε φακοϊό μεσολάβηση έκφραση shRNA για τη μείωση των επιπέδων ειδικά PHB1 και PHB2 mRNA και πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το συστατική pLL3.7 σύστημα έκφρασης, αποδείξαμε ότι, σε όλες τις ελεγχόμενες καρκινικές κυτταρικές σειρές, αριθμούς κυττάρων, που εκφράζουν ένα mRNA PHB1 στόχευσης shRNA μειώθηκαν από το εσωτερικό ενός πισίνα μεταγωγή και μη μεταχθέντα κύτταρα. Επιπλέον, PHB1-εξαντλημένο κύτταρα ήταν σε θέση να αναπτυχθούν υπό ανεξάρτητο από αγκύρωση συνθήκες. Τα αποτελέσματά μας είναι σύμφωνα με δύο πρόσφατες μελέτες που αποδεικνύουν ότι η RNAi μεσολάβηση σίγαση PHB1 ή PHB2, αντίστοιχα, οδηγεί σε μειωμένη πολλαπλασιασμό σε πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα και τα εμβρυϊκά ινοβλάστες ποντικού [17], [26]. Αυτά τα δεδομένα είναι σε πλήρη αντίθεση με μια προηγούμενη μελέτη που δείχνει αυξημένο πολλαπλασιασμό στην κυτταρική σειρά μελανώματος καρκίνου του μαστού MCF-7 κατά siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση του PHB1 [16]. Είναι δυνατόν prohibitins παίζουν διαφορετικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού κύτταρα σε σύγκριση με άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων.

Σε συμφωνία με την αρχική διαπίστωση ότι το RNA του 3’UTR του PHB1 ασκεί κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί καρκινικών κυττάρων [9] , [10], η έκφραση ενός Τ-αλληλικές PHB1 3’UTR έχει συνδεθεί με αυξημένη ευαισθησία σε καρκίνο του μαστού [11]: ωστόσο, αρκετές κλινικές μελέτες έχουν αντικρουστεί αυτά τα ευρήματα [12], [13]. Επιπλέον, προσδιορισμός της αλληλουχίας του PHB1 3’UTR διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των MCF-7, αποκάλυψε μια υψηλότερη συχνότητα της συνολικής παραλλαγής αλληλουχίας σε σύγκριση με πρωτογενή μη-καρκινικά κύτταρα και όχι μια κυρίαρχη έκφραση ενός ειδικού Τ-αλληλόμορφο (CS και TR, αδημοσίευτο). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι prohibitins παίζουν ένα ρόλο στην καρκινογένεση, αλλά το επίπεδο στο οποίο ασκείται η επίδραση, δηλαδή 3’UTR RNA ή πρωτεΐνης, παραμένει ασαφής: Η σίγαση του είτε PHB1 ή PHB2 mRNA με RNAi είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του αντίστοιχου 3 ‘ UTR αλλά και σε ένα knockdown και των δύο πρωτεϊνών prohibitin. Δεδομένου ότι η έκφραση όλων των δοκιμαστεί Τα siRNAs οδήγησαν σε επιβραδυμένη ρυθμός πολλαπλασιασμού, αυτό φαινότυπος είναι πιθανότατα ένα αποτέλεσμα της απώλειας των πρωτεϊνών prohibitin.

Για να εκτιμηθεί η μακροπρόθεσμη επίδραση της εξάντλησης prohibitin, δημιουργήσαμε κυτταρικές σειρές HeLa με επαγόμενη έκφραση shRNA. Σε αυτά τα κύτταρα PHB1 και PHB2 mRNAs ήταν αποτελεσματικά και επιλεκτικά τα κάτω ρυθμισμένα κατά την επαγωγή των γονιδίων-ειδικές πρωτεΐνες shRNA και prohibitin ήταν αναστρέψιμα καταστέλλεται. Παρόμοια με την συστατική αποσιώπηση του PHB1 ή PHB2, επαγωγή της έκφρασης shRNA μείωσε το πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών εμπόδισαν επί πλακών μαλακό άγαρ, ενδεικτική ενός ελαττώματος σε ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Αυτές οι γραμμές κυττάρων μας επέτρεψε να τελειοποιήσουν PHB1 και PHB2 σίγηση υπό τυποποιημένες συνθήκες και να διερευνήσουν τον μηχανισμό βασίζεται η ισχυρή φαινότυπο που σχετίζεται με την εξάντληση prohibitin. Αναλύσαμε πρώτα το αποτέλεσμα της εξάντλησης αυτών στον τα επίπεδα των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών σύντηξης OPA1 ως προηγούμενες δημοσιεύσεις έχουν δείξει ότι prohibitins είναι αναγκαία για σταθερή έκφραση OPA1 [17], [21]. Θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι η έκφραση OPA1 εξαρτάται από τα επίπεδα των prohibitins. Μια μικρή μείωση των prohibitins, παρατηρείται νωρίς μετά την επαγωγή της παραγωγής shRNA, οδήγησε σε μερική κατακερματισμό της αρμόδιας OPA1 σύντηξης θραύσματα a και b. Σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία της επαγωγής και κατά συνέπεια ισχυρότερη εξάντληση των prohibitins, OPA1 κατακερματισμό αυξήθηκαν και τα μιτοχόνδρια εμφανίστηκε κατακερματισμένη. Μια ελλιπής μείωση των πρωτεϊνών prohibitin, όπως φαίνεται με την έκφραση των Τα siRNAs shPHB1-0 και shPHB2-0, οδήγησε μόνο σε ήπια κατακερματισμό OPA1 και όχι ο κατακερματισμός του μιτοχονδριακού δικτύου. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι ακόμη και ισχυρή και μακροχρόνια μείωση των PHB1 π.χ. σε κύτταρα που παράγουν shPHB1-3, δεν προκάλεσε την απαγωγή της MMP

Μέχρι σήμερα, οι επιπτώσεις της απώλειας prohibitin σε κύτταρα θηλαστικών είναι ακόμα ασαφής:. Schleicher et al. [26] και Ross et al.