Αφηρημένο

Ιστορικό

Oct4 και Survivin είναι σημαντικοί παράγοντες για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την ανανέωση και αποδιαφοροποίηση, και συσχετίζονται με αντίσταση στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία σε πιο ανθρώπινους καρκίνους, αλλά και των ρυθμιστικών μηχανισμών τους είναι δεν είναι καλά γνωστή.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, 50 ασθενείς με καρκίνωμα του οισοφάγου από πλακώδες επιθήλιο (ESCC) έχουν αναδρομική ανάλυση. Oct4 εκφράστηκε σε 13 περιπτώσεις (26%), και survivin θετικά εκφράστηκε σε 31 περιπτώσεις (62%), που εξετάστηκε από ανοσοχημείας. Oct4 βρέθηκε να είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας πρόβλεψης για διάμεσο χρόνο επιβίωσης, και οι ασθενείς από την υποομάδα με τόσο υψηλή έκφραση του Oct4 και Survivin είχε τη χειρότερη πρόγνωση διερευνήθηκε με δοκιμασία log-rank. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό ρύθμισης μεταξύ Oct4 και Σουρβιβίνη, κατασκευάσαμε το συγκεκριμένο

μικρές

φουρκέτα RNA (shRNA) εκφράζοντα φορείς που στοχεύουν Oct4 ή /και Σουρβιβίνης και χειραγωγείται την έκφραση των Oct4 και Σουρβιβίνης. Με κηλίδωση Western και RT-PCR, βρήκαμε ότι Oct4 μπορούσε ρυθμίζουν την έκφραση Σουρβιβίνης στις καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές σειρές Eca109 και ΤΕ1. knockdown Ταυτόχρονα των Oct4 και Survivin επαγόμενη έκφραση κυτταρικής απόπτωσης και G2-φάση μείωση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής, και, τέλος, εξασκείται μία ενισχυμένη δραστικότητα αντι-πολλαπλασιασμού σε κυτταρικές σειρές Eca109 και ΤΕ1 με δοκιμασία ΜΤΤ.

Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη δείχνει ότι Oct4 και της έκφρασης Σουρβιβίνης συσχετίστηκαν με κακή επιβίωση σε ασθενείς με ESCC. Oct4 και Survivin μπορεί να θεωρηθεί ως στόχοι στο ESCC βιοθεραπεία

Παράθεση:. Li C, Yan Υ, Ji W, Bao L, Qian Η, Chen L, et al. (2012) Oct4 Ρυθμίζει Θετικά έκφρασης Σουρβιβίνης να προάγει τον καρκίνο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και οδηγεί σε κακή πρόγνωση σε οισοφάγου πλακώδες καρκίνωμα. PLoS ONE 7 (11): e49693. doi: 10.1371 /journal.pone.0049693

Επιμέλεια: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Κέντρο Καρκίνου, Αυστραλία

Ελήφθη: 11 Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 11 του Οκτωβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Νοέμβρη του 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (30801106, 81172308, 30973469). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) είναι μία από τις πιο κακοήθεις όγκους με υψηλή θνησιμότητα [1], [2]. Παρά το γεγονός ότι κάποιοι νέοι μοριακοί στόχοι έχουν βρεθεί και να χρησιμοποιηθεί σε ESCC βιοθεραπεία, οι μοριακοί μηχανισμοί της ESCC υποτροπής και μετάσταση δεν είναι ακόμη κατανοητό. Ένα αυξανόμενο σώμα αποδείξεων πρότεινε ότι μόνο ένα μικρό κλάσμα του καρκίνου του κίνηση κύτταρα έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση, καθώς και για την οδήγηση έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου, και παρουσίασε αντοχή σε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [3], [4] , το οποίο μας δίνει μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής βάσης της ESCC.

οκταμερές δέσμευσης μεταγραφικού παράγοντα 4 (Oct4) είναι ένας από τους παράγοντες μεταγραφής που σχετίζονται με στέλεχος, που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των όγκων και αυτο-ανανέωση. Τα κακώς έχουν διαφοροποιημένα ή μη διαφοροποιημένα κύτταρα καρκίνου χαρακτηρίζεται από πολλές φαινοτυπικά χαρακτηριστικά παρόμοια με αδιαφοροποίητα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι Oct4 μπορεί να εκφραστεί σε συμπαγείς όγκους ως καρκίνος έναρξη κύτταρο βιοδείκτη [5]. Oct4 ανήκει στην οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων POU-τομέα, συμπεριλαμβανομένου ενός ομοπεδίου το οποίο είναι σημαντικό στην εμβρυϊκή ανάπτυξη [6], [7]. Έχει αποδειχθεί ότι Oct4 υπερεκφράζεται σε πολλά σωματικά καρκίνων, όπως ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του προστάτη, το μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, του στόματος πλακώδες καρκίνωμα, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο του οισοφάγου [8] – [14]. έκφραση Oct4 διαδραματίζει έναν κεντρικό σύνδεσμο στην ογκογένεση και συντήρηση των καρκινικών κυττάρων.

Survivin είναι μέλος των αναστολέων της αποπτωτικής οικογένειας γονιδίων, και παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου με αναστολή της απόπτωσης των κυττάρων, τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης , και η επαγωγή της αγγειογένεσης [15]. Η υπερέκφραση Σουρβιβίνης προτάθηκε σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου ESCC [16], [17], αλλά σπάνια υπάρχουν σε φυσιολογικούς ιστούς ενήλικα. έκφραση Σουρβιβίνης σε κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με ESCC ανιχνεύθηκε και παρέχονται πολύτιμες πληροφορίες για την πρόβλεψη της υποτροπής του καρκίνου και φτωχή πρόγνωση [18], [19]. Εκτός αυτού, η υπερέκφραση Σουρβιβίνης σε ESCC παρουσίασε αντίσταση στη χημειοθεραπεία και βραχύτερη επιβίωση [20], και υπήρχαν παρόμοια αποτελέσματα σε άλλους καρκίνους [21].

Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι knockdown της έκφρασης Σουρβιβίνης σε μια σειρά ανθρώπινου καρκίνου κυτταρικές σειρές, όπως Α549, HeLa και κύτταρα MCF-7, οδήγησε σε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων, και ο συνδυασμός του Survivin κατευθυνόμενη στρατηγική σίγηση με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες αποτελούσε μια πολύτιμη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου με ένα ενισχυμένο αντικαρκινική αποτελεσματικότητα [21], [22]. Ωστόσο, ο καρκίνος του νέου ανάπτυξη είναι ίσως το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό, επειδή ο καρκίνος κύτταρα έναρξης αντιστέκονται στις συμβατικές θεραπείες καρκίνου και είναι πιθανόν να παίζουν σημαντικό ρόλο στην υποτροπή του καρκίνου [23]. Ως εκ τούτου, η στόχευση του καρκίνου κύτταρα έναρξης έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά αποτελέσματα για τους ασθενείς με καρκίνο. Oct4 είναι ένας κύριος γονίδιο που παίζει καθοριστικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία των βλαστικών κυττάρων. Όντας εκφράζεται επιλεκτικά σε ιστούς όγκων, στοιχεία έδειχναν ότι Oct4 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στόχο για την ανάπτυξη αντικαρκινικών στρατηγικών για την εξάλειψη του καρκίνου κύτταρα έναρξης [24].

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι η έκφραση Σουρβιβίνης μειώθηκε δραματικά σε Oct4 knockdown ποντικού εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων [25], υποδηλώνοντας ότι υπάρχει σχέση μεταξύ Oct4 και Σουρβιβίνης. Αλλά οι μοριακές ρυθμιστικών μηχανισμών μεταξύ Oct4 και Survivin δεν είναι ακόμη σαφές σε καρκίνους. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε Oct4 και της έκφρασης Σουρβιβίνης και ανέλυσε την προγνωστική σημασία αυτών των δύο γονιδίων με τα δείγματα ESCC. Εν τω μεταξύ, ο ρυθμιστικός μηχανισμός της έκφρασης Oct4 και Σουρβιβίνης και τη λειτουργία τους στην κυτταρική απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή κυτταρικό κύκλο διερευνήθηκαν σε κυτταρικές σειρές ESCC.

Αποτελέσματα

Oct4 και Survivin ήταν υπερ-εκφράζεται σε ESCC

Η έκφραση των Oct4 και Σουρβιβίνης ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε δείγματα του ESCC και γειτονικό φυσιολογικό οισοφαγικό ιστούς. Oct4 εκφράστηκε σε 13 (26%) της ESCC αλλά μόνο 2 (4%) της κανονικής οισοφάγου ιστών. Survivin εκφράστηκε σε 31 (62%) του ESCC αλλά μόνο 11 (22%) της κανονικής οισοφάγου ιστών. Υπήρχαν διαφορές μεταξύ ESCC και φυσιολογικό οισοφαγικό ομάδες (

σ

= 0,0051 για Oct4?

σ

= 0,0001 για Σουρβιβίνης). Ο Oct4-θετική ανοσολογική αντίδραση κατανεμήθηκε κυρίως στο ESCC κυτταρικοί πυρήνες και Survivin ήταν κυρίως διανέμονται σε ESCC κυτταρόπλασμα. Τα κύτταρα OCT4- και Survivin-θετικά ήταν κατά κύριο λόγο βρίσκονται στο βασικό τμήματα του επιθηλίου (Εικ. 1). έκφραση Σουρβιβίνης δεν σχετίζονται με την έκφραση Oct4 σε αυτά τα δείγματα ESCC (R = 0.276,

σ

= 0,052? Πίνακας 1).

Οι ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική εξέταση με το πρωτογενές ποντικού αντι-ανθρώπου Oct4 και αντισώματα κουνελιού αντι-ανθρώπινης Σουρβιβίνης σε συγκέντρωση 1:100 εργασίας, και η διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση της θετικής αντίδρασης. Το αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), αντί των πρωτογενών αντισωμάτων, χρησιμοποιήθηκε για αρνητικό έλεγχο. Τα ποσοστά των θετικών κυττάρων μετρήθηκαν μέσα σε 5 πεδία υψηλής ισχύος, αρχική μεγέθυνση × 200.

Η

Η στατιστική συσχέτιση μεταξύ Oct4 ή έκφραση Σουρβιβίνης και ESCC κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά (φύλο, ηλικία, διαφοροποίηση των κυττάρων, όγκου βάθος εισβολή, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες) αναλύθηκε και δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των OCT4- ή Σουρβιβίνης θετικών και OCT4- ή Survivin-αρνητικών περιπτώσεων ESCC (Πίνακας 2).

η

Oct4 και Σουρβιβίνης Συσχετισμένη με κακή πρόγνωση της ESCC ασθενείς

παρακολούθηση δεδομένων των 50 ασθενών που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier για την εκτίμηση καμπύλες επιβίωσης. Η διάμεση συνολική επιβίωση ήταν 34,5 μήνες. Η διάμεση επιβίωση των ασθενών με ESCC Oct4 θετική έκφραση ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη των ασθενών με Oct4 αρνητική έκφραση (

ρ

& lt? 0.001). Το παρόμοιο αποτέλεσμα προέκυψε μεταξύ Σουρβιβίνης θετικών και -αρνητικοί περιπτώσεις ESCC (

σ

= 0,009). Μεταξύ των τριών υποομάδων (Oct4-θετικών /Survivin-θετικό, Oct4-αρνητικό /Survivin-θετικό, Oct4-αρνητικό /Survivin-αρνητικά), οι ασθενείς με Oct4-θετικών /Survivin θετικά ESCC είχαν ένα σημαντικά φτωχότερη πρόγνωση (

p

& lt? 0.001), και η μακρύτερη OS τεκμηριώθηκε σε Oct4-αρνητική /Survivin-αρνητικών υποομάδα (Σχήμα 2Α).. Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε μεταξύ οποιωνδήποτε δύο υποομάδες από δοκιμασία log-rank, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Oct4 και της έκφρασης Σουρβιβίνης έντονα σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών ESCC (Εικ. 2Β).

(Α) Πενήντα ασθενείς με ESCC εντάχθηκαν στη μελέτη, και η OS ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα από την ημερομηνία λειτουργίας μέχρι την ημερομηνία του θανάτου ή από την ημερομηνία λήξης της παρακολούθησης. Οι καμπύλες επιβίωσης υπολογίστηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και η σημαντική διαφορά ελέγχθηκε με τη χρήση δοκιμασία log-rank. (Β) κάθε δύο υποομάδες συγκρίθηκαν με δοκιμασία log-rank.

Η

Η ανάλυση των δεδομένων με το μοντέλο αναλογικών κινδύνων του μονοπαραγοντική Cox αποκάλυψε ότι Oct4 και Σουρβιβίνης ήταν σημαντικοί προγνωστικοί παράγοντες των ασθενών ESCC. Ωστόσο, η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι Oct4 ήταν μια ανεξάρτητη προγνωστική αξία σε ασθενείς ESCC, αλλά Survivin δεν ήταν (

σ

= 0,168? Πίνακας 3).

Η

ανασταλτική επίδραση του shRNA διανύσματα στόχευση Oct4 και Survivin σε ESCC Γραμμές κυττάρων

Για να εντοπίζεται κατά πόσο το συγκεκριμένο

μικρές

φουρκέτα RNA (shRNA) με στόχο Oct4

(Oct4-shRNA),

Survivin

( sur-shRNA)

, ή διπλό Τα siRNAs (Dual-shRNA) που στοχεύουν τόσο Oct4 και Σουρβιβίνη, επηρέασαν οισοφάγου πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη για να ανιχνεύσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προφανώς μειώθηκε στα κύτταρα Eca109 και ΤΕ1 επιμολυσμένα με Oct4-shRNA και Sur-shRNA, σε σύγκριση με τα πατρικά ή Ctr-shRNA επιμολυσμένων κυττάρων. Dual-shRNA εξασκείται μια ενισχυμένη ανασταλτική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τον φορέα στόχευσης shRNA το μοναδικό παράγοντα. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία διαφορά στην βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ Oct4-shRNA και ομάδες Sur-shRNA (Σχ. 3Α).

πλάκες (Α) των γονικών και shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Eca109 και ΤΕ1 καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων σε πυκνότητα 8 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο για 48 h. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με methylthiazoletetrazolium (ΜΤΤ) σε μήκος κύματος 490 nm,

#

σ

& lt? 0,01? Dual-shRNA: φορέας που περιέχει διπλή Τα siRNAs που στοχεύουν τόσο Oct4 και Σουρβιβίνης. (Β) Μετά από κύτταρα Eca109 διαμολύνθηκαν με φορείς shRNA, 5 × 10

6 κύτταρα /ml συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα ποσοστά της πρόωρης απόπτωσης παρουσιάστηκαν σε ιστογράμματα, τα δεδομένα ήταν εκπρόσωποι των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και ποσοτική ιστογράμματα συλλέχθηκαν τα δεδομένα, γραμμές σφάλματος είναι τυπική απόκλιση (SD), *

σ

& lt? 0,05?

#

σ

& lt? 0,01. κύκλου (C) των κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα του κυτταρικού κύκλου παρουσιάστηκαν σε ιστογράμματα, *

σ

& lt?. 0.05

Η

Η απόπτωση των κυτταρικών σειρών ESCC μετρήθηκε με FCM με Anexin V-FITC και ΡΙ χρώση. Μετά τη θεραπεία με shRNA φορείς για 48 ώρες, τα ποσοστά της πρόωρης απόπτωσης των κυττάρων αυξήθηκαν σε Oct4-shRNA (13,4 ± 2,76%), Sur-shRNA (10,89 ± 2,21%) και Dual-shRNA (17,79 ± 3,89%) ομάδες, σε σύγκριση με ότι στα γονικά κύτταρα (1,20 ± 1,01%) και Ctr-shRNA ομάδα (0.87 ± 0.64%), ειδικά σε υψηλότερες Dual-shRNA ομάδα (Σχ. 3Β). Σε σύγκριση με τις γονικές και Ctr-shRNA ομάδες, τα ποσοστά των κυττάρων G2-φάση ήταν σημαντικά μειωμένες στην Oct4-shRNA, Sur-shRNA και Dual-shRNA επιμολυσμένα ομάδες, αλλά δεν υπήρχε σημαντικά διαφορές για τα κύτταρα φάση G1 και S ( Σχ. 3C).

Survivin έκφραση σχετίστηκε με Oct4 στο ESCC κύτταρα

Για να διερευνήσει την αλληλεπίδραση και τη ρύθμιση μεταξύ Oct4 και Σουρβιβίνη, το Oct4-shRNA, Sur-shRNA και φορείς Dual-shRNA σχεδιάστηκαν για να χειραγωγήσουν την έκφραση του γονιδίου-στόχου σε κυτταρικές σειρές ESCC. Με κηλίδα Western και ανάλυση RT-PCR, Oct4 και Survivin θετικά εκφράζεται στα γονικά κύτταρα Eca109 και ΤΕ1. Οι φορείς Oct4-shRNA και Sur-shRNA θα μπορούσε να αναστείλει την ειδική έκφραση του γονιδίου-στόχου, και το Dual-shRNA φορέα θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση και των δύο γονιδίων Oct4 και Σουρβιβίνης. Ο Oct4-shRNA θα μπορούσε επίσης να ρυθμίζουν προς τα κάτω την Σουρβιβίνης έκφραση σε Eca109 και τα κύτταρα ΤΕ1 (Εικ. 4Α), αλλά η Sur-shRNA δεν επηρέασε την έκφραση Oct4 (Εικ. 4Β).

(Α) η γονικής και shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Eca109 και ΤΕ1 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 8 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο για 48 ώρες, και η έκφραση του Oct4 και Σουρβιβίνης στα συλλεγμένα κύτταρα ESCC εξετάστηκε με Western blotting . Αφυδρογονάση 3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η σχετική ένταση της ζώνης αναλύθηκε με πυκνομετρία μετά κανονικοποιούνται με περιεχόμενο GAPDH, *

σ

& lt? 0,05?

#

σ

& lt? 0,01. (Β) Oct4 και έκφραση Σουρβιβίνης mRNA εξετάστηκαν με αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής (RT-PCR). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η σχετική ένταση της ζώνης αναλύθηκε με πυκνομετρία μετά την ομαλοποίηση με το περιεχόμενο GAPDH, *

σ

& lt? 0,05?

#

σ

& lt? 0,01. Όλα τα δεδομένα ήταν εκπρόσωποι από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτική ιστογράμματα συλλέχθηκαν τα δεδομένα. Οι ράβδοι σφάλματος: τυπική απόκλιση (SD)? Dual-shRNA:. Διάνυσμα που περιέχει διπλά Τα siRNAs που στοχεύουν τόσο Oct4 και Survivin

Η

Δυναμική Εντοπισμός των Oct4 και Σουρβιβίνης Έκφραση σε ESCC κύτταρα

Ερευνήσαμε περαιτέρω την δυναμική μεταβολή της έκφρασης Oct4 και Σουρβιβίνης στα κύτταρα ESCC από ομοεστιακό δοκιμασία. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης με Oct4-shRNA, έκφραση Σουρβιβίνης ήταν κυρίως κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο κυτταρικό κυτταρόπλασμα, μαζί με τη μείωση της έκφρασης Oct4 σε κυτταρικούς πυρήνες. Ωστόσο, μετά από επιμόλυνση με Sur-shRNA, το επίπεδο έκφρασης Oct4 δεν ήταν μεταβάλλεται μαζί με τη μείωση της έκφρασης Σουρβιβίνης (Εικ. 5).

γονικών και shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Eca109 και ΤΕ1 καλλιεργήθηκαν σε 96- φρεατίων σε πυκνότητα 8 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο για 48 ώρες, και τα συλλεχθέντα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη, τότε εξετάζεται Oct4 και έκφραση Σουρβιβίνης με ανοσο fl uorescent συνεστιακή ανάλυση και παρατηρήθηκε κάτω από ένα λέιζερ σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο .

η

Συζήτηση

Oct4, ως ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες μεταγραφής, διαδραματίζει καίριο ρόλο στην πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα [26]. Oct4, μαζί με SOX2 και Nanog, διατηρεί βλαστικών κυττάρων πλειοδυναμίας, αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [27]. Έχει καταστεί σταδιακά μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης όγκων για τη διάγνωση των γεννητικών κυττάρων όγκων [28]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι Oct4 μπορούσε να ανιχνευθεί σε πολλούς καρκίνους σωματικών κυττάρων από τον οισοφάγο, την ουροδόχο κύστη, πνεύμονα, και το ήπαρ, και έχει μια ισχυρή επιρροή στην πρόγνωση των ασθενών. Η λειτουργία του Oct4 μπορεί να διαμορφώσει μια σειρά οδών σήματος, όπως η Wnt /β-κατενίνης, ΤΟΡ-β, μονοπάτια σήματος /STAT3 JAK [29], [30], για την ενεργοποίηση ή να περιορίζουν την προς τα κάτω γονιδίων στόχων. Εκτός αυτού, η έκφραση Oct4 σε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού είναι αναγκαία για την προστασία από την απόπτωση και αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να σχετίζεται με STAT3 /Survivin μονοπάτι [25].

Σουρβιβίνη, ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο μέλος των αναστολέων της πρωτείνης απόπτωσης (ΙΑΡ ) οικογένεια, ρυθμίζει την απαραίτητη κυτταρική διαδικασία, συμπεριλαμβανομένης της καταστολής της απόπτωσης, τον έλεγχο της κυτταρικής διαίρεσης, και την προώθηση της αγγειογένεσης [31]. Ως ένα από τα πιο εξέχοντα γονιδίων του καρκίνου, Σουρβιβίνης εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους όγκους, αλλά δεν ανιχνεύεται στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς ενηλίκων [32]. Survivin θεωρήθηκε ως γονίδιο στόχος στη θεραπεία του καρκίνου, και ρύθμιση προς τα κάτω του Survivin θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου και τη βελτίωση της ευαισθησίας των κυττάρων του όγκου στην ακτινοβολία και χημειοθεραπεία, με την προώθηση της απόπτωσης και αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων. Ναρκωτικά των LY2183108 [33] και YM155 [34] με στόχο Survivin τέθηκαν σε χρήση σε κλινικές δοκιμές σε διάφορα στάδια και το αποτέλεσμα ήταν πολλά υποσχόμενη. Παρά το γεγονός ότι η ταχύτητα ανάπτυξης του όγκου επιβραδύνθηκε με τη δύναμη των φίμωση Survivin, οι όγκοι εξακολουθούν να έχουν τη δυνατότητα ανάπτυξης και επέκτασης και να στερηθεί της ζωής των ασθενών, γεγονός που υποδηλώνει ότι Survivin δεν ήταν ένα μόνο παράγοντα για την πρόγνωση. Παραμένει ένας άγνωστος μηχανισμός ρύθμισης μεταξύ Oct4 και Σουρβιβίνης.

Η υπερέκφραση του Oct4 ή Σουρβιβίνης σε ESCC έχει συνδεθεί σταθερά με την εξέλιξη της νόσου, μεταστατική διάδοση, την αντοχή σε θεραπεία [14], [18]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να ανιχνεύεται τόσο Oct4 και έκφραση Σουρβιβίνης σε δείγματα όγκων ESCC, και διαπίστωσαν ότι Oct4 και Σουρβιβίνης ήταν στενά συνδεδεμένη με την χειρουργική έκβαση των ασθενών ESCC. Ασθενείς με Oct4-θετικών ή Survivin-θετικούς όγκους παρουσιάζονται πολύ χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με Oct4-αρνητικό ή Survivin-αρνητικούς όγκους. Μεταξύ των υποομάδων, οι ασθενείς με Oct4-θετικών /Survivin-θετικούς όγκους έδειξε την συντομότερη συνολικό χρόνο επιβίωσης. Με πολυπαραγοντική και μονοδιάστατες αναλύσεις, τόσο Oct4 και Survivin συνδέονται με τους ασθενείς »πρόγνωση, και Oct4 θεωρείται ως ανεξάρτητος παράγοντας για forcasting ασθενών συνολικό χρόνο επιβίωσης. Από τη μελέτη μας, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι Oct4 και Σουρβιβίνης είχαν από κοινού που σχετίζονται με την κακή πρόγνωση των ασθενών ESCC, αλλά οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί μεταξύ Oct4 και Σουρβιβίνης στην ESCC δεν είναι ακόμη σαφείς.

Η αναστολή της έκφρασης του Oct4 ή Σουρβιβίνης στην κυτταρικές γραμμές ESCC με τον Oct4-shRNA ή φορείς Sur-shRNA ως αποτέλεσμα τη μείωση σε κύτταρα G2-φάση και την αύξηση των κυττάρων απόπτωσης, και συν-καταστολή των Oct4 και Survivin με Dual-shRNA φορέα είχε ως αποτέλεσμα μια ενισχυμένη επίδραση. Μερικές μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της Σουρβιβίνης που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G2-M [35], [36], αλλά η μελέτη μας διαπίστωσε ο αριθμός των κυττάρων G2-φάση μειώθηκε δραματικά μετά την καταστολή της έκφρασης Σουρβιβίνης. G1-S φάσης, καθώς και φάση G2-M, ήταν η σημαντική σημείο ελέγχου στο κυτταρικού κύκλου, η οποία ελέγχει και διατηρεί την ακρίβεια της διαδικασίας των κυττάρων. Έχει αναφερθεί ότι η υπερέκφραση Σουρβιβίνης μπορεί να βοηθήσει τα καρκινικά κύτταρα να περάσουν G2-M σημείο ελέγχου [37], [38]. Ταυτόχρονα, Survivin διαθέτει την ικανότητα να ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση της κυκλίνης D1 και εξασφαλίζει τα καρκινικά κύτταρα να περάσουν G1-S σημείου ελέγχου με ευχέρεια και να αποκτήσει την ικανότητα της επίμονης πολλαπλασιασμού [38], [39].

πρώιμη απόπτωση αυξήθηκε με την ρύθμιση προς τα κάτω της survivin σε πολλές εκθέσεις. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό του Oct4-εμπλέκονται κυττάρου απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε Eca109 και ΤΕ1 κύτταρα, βρήκαμε ότι τα κύτταρα εξέφρασαν ESCC χαμηλότερα επίπεδα Oct4 και Survivin πρωτεΐνης μετά επιμολύνθηκαν με Oct4-shRNA, αλλά Sur-shRNA μόνο κατάντη ρυθμισμένη έκφραση Σουρβιβίνης και δεν υπήρχε μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης Oct4. Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι Oct4 μπορεί να ρυθμίζει την κυτταρική απόπτωση και την κυτταρική διαίρεση μέσω της λειτουργίας Σουρβιβίνης. Oct4 μπορούσε να ενεργοποιήσει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης για τον έλεγχο Σουρβιβίνη έκφρασης, όπως η STAT3, myc και τις οδούς ΝΡκΒ [30], [40] – [42]., Η οποία είναι κρίσιμη για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και αντιαποπτωτικές

ο παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι η υπερέκφραση του Oct4 και Survivin είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό στην εξέλιξη της ESCC, και η έκφραση Oct4 συσχετίζεται στενά με Σουρβιβίνης έκφραση στη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης καρκίνο και πολλαπλασιασμό. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί μεταξύ Oct4 και Survivin είναι πολύ περίπλοκη. Θα πρέπει να εκτελούν τις εργασίες για την αποσαφήνιση των γενετικών χαρακτηριστικών των Oct4 και Survivin, και το σχεδιασμό πιο αποτελεσματική θεραπεία κατά του όγκου για ESCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Πενήντα ασθενείς με ESCC είχαν εγγραφεί στη μελέτη σε Changhai Νοσοκομείο (Σαγκάη, Κίνα) από την 1 Ιαν – 31 Δεκ, 2005. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής του δευτέρου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Οι ασθενείς που αποτελούνταν από 37 άνδρες και 13 γυναίκες. Η ηλικία κυμαινόταν 47-72 ετών, και η διάμεση ηλικία ήταν 62 χρονών. Όλοι οι ασθενείς υπό την προϋπόθεση ότι ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση. Οι εκτομή αλλοιώσεις διαγνώστηκαν παθολογικά ως ESCC μετά την επέμβαση. Η παρακολούθηση των ασθενών που ξεκίνησε από την ημερομηνία λειτουργίας για Αυγ 31, 2011. Η συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα από την ημερομηνία έναρξης της παρακολούθησης μέχρι την ημερομηνία του θανάτου ή από την ημερομηνία λήξης της παρακολούθησης .

γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ESCC, Eca109 και ΤΕ1, αγοράστηκαν από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν ως μονοστιβάδα σε RPMI-1640 με 10% FBS (ορός εμβρύου βοός), 100 IU /ml πενικιλλίνη G και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 επωαστήρα.

ανοσοϊστοχημική χρώση

τα φρέσκα όγκων και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από τα δείγματα εκτομή κατά τη λειτουργία. Οι διαδοχικές τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική εξέταση για έκφραση Oct4 και Σουρβιβίνης χρησιμοποιώντας τα πρωτογενή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων αντι-ανθρώπινης Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA) και κουνελιού αντι-ανθρώπινης Σουρβιβίνης (RD Systems Inc, Minneapolis, MN, USA), και η υπερευαίσθητη στρεπταβιδίνης υπεροξειδάσης Kit (Fuzhou Maixin Βιοτεχνολογία Ανάπτυξης Co, Fuzhou, Κίνα). Το ποσοστό των θετικών κυττάρων μετρήθηκε μέσα σε 5 πεδία υψηλής ισχύος, και η αξιολόγηση της χρώσης αντίδραση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την ανοσοαντιδραστική πρότυπο βαθμολογίας προτείνει Friedrichs [43].

Κατασκευή και επιμόλυνση των shRNA διανύσματα

Οι αλληλουχίες shRNA για ανθρώπινη Oct4 (Oct4-shRNA: 5′-CCCTCACTTCACTGCACTG-3 ‘) και Survivin (Sur-shRNA: 5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′) συντέθηκαν και κλωνοποιηθεί, αντίστοιχα, μέσα σε φορέα pGenesil (Wuhan Genesil Βιοτεχνολογία, Ltd, Wuhan, Κίνα), στην οποία οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν ελέγχονταν από τον υποκινητή U6. Το Dual-shRNA φορέα που περιέχει διπλή Τα siRNAs που στοχεύουν τόσο Oct4 και Σουρβιβίνης και εικονικές φορέα ελέγχου shRNA (Ctr-shRNA, 5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3 ‘) ήταν ταυτόχρονα κατασκευάστηκαν.

κύτταρα ESCC σε λογαριθμική φάση ήταν επιμολυσμένα με shRNA φορείς σε συγκέντρωση 4 μg /10

5 κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation Shanghai Γραφείο Αντιπροσωπείας, Σαγκάη, Κίνα). Τα επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν συνεχώς στους 37 ° C σε CO

2 επωαστήρα για ακόμη 48 ώρες, μετά συλλέχθηκαν για την προετοιμασία για να εξετάσει την έκφραση του γονιδίου.

Western Blotting Ανάλυση

Τα συλλεγέντα κύτταρα λύθηκαν σε φθοριούχο φαινυλμεθανοσουλφονυλ διάλυμα (PMSF), και η απομονωμένη πρωτεΐνη ηλεκτροφορήθηκε σε ηλεκτροφόρηση επί πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και εξετάστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας την αντι-Σουρβιβίνης και αντι-Oct4 αντισώματα. Οι κηλίδες visualled από την ενισχυμένη αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (PerkinElmer Inc., Σαγκάη, Κίνα).

ποσοτικαί Αντίστροφη Μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση, το ολικό RNA εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) από τις κυτταρικές γραμμές που συγκομίζονται Eca109 και ΤΕ1, και διαλύθηκε σε diethylpyrocarbonatetreated (DEPC) νερό. Η έκφραση του Oct4 και Survivin εξετάστηκε χρησιμοποιώντας την Takara Reverse Transcription Kit System (Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, Κίνα) με τους εκκινητές Oct4 (νόημα: 5′-CAG TCGTCAGCGTCGTCGTTGTAAGCTGCGGCCC-3 ‘, αντινόημα: 5’-ACGCGTCG ACTCAGTTTGAATGCATGGGAG -3 ‘, τα προϊόντα 480-bp) και οι εκκινητές Survivin (νόημα: 5′-CGGAATTCACCATGGGTGCCCCGACG-3′, αντινόημα: 5’-GAAGATC TTCAATCCATGGCAGCCAG-3 ‘, τα προϊόντα 448-bp). Αφυδρογονάση 3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης από τους εκκινητές (νόημα: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘, αντινόημα: 5′-TCCACCACCCTGT TGCTTGTA-3’, τα προϊόντα 120-bp). Συγκροτήματα των προϊόντων σε ηλεκτροφόρηση σε βρωμιούχο αιθίδιο (EB) -αγαρόζης gel αναλύθηκαν ημιποσοτικά με αποχρώσεις του γκρι ανάλυση πυκνομετρίας.

Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής (FCM)

Μετά από 48 ώρες διαμόλυνση, τα συλλεγέντα κύτταρα πλένονται με διάλυμα (PBS) και επαναιωρήθηκαν 0,1 Μ φωσφορικό κύτταρα με 0.1 Μ PBS σε συγκέντρωση 10

6 κύτταρα /ml. Ένα μέρος του κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 1 ml προ-ψυχθέν 70% αλκοόλη επί μία νύκτα στους 4 ° C που ακολουθείται από επώαση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διάλυμα σε συγκέντρωση 50 μg /ml και ΚΝάση Α σε συγκέντρωση 20 μg /ml για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Η κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με FCM (FACS420, BD Biosciences, San Jose, CA). Ένα άλλο μέρος της κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΐ αννεξίνης V-FITC σε 195 μΐ ρυθμιστικό σύνδεσης στο σκοτάδι για 10 λεπτά. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 g για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε 190 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος και 10 μΐ ΡΙ πρόσδεσης, που ακολουθείται από ανάλυση fl uorescence.

Methylthiazoletetrazolium Δοκιμασία

Eca109 και ΤΕ1 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες σε μια πυκνότητα 8000 κύτταρα /φρεάτιο και επιμολύνθηκαν με τον φορέα shRNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 48 h, 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-Z-Y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide (ΜΤΤ) στα 5 mg /ml προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν συνεχώς για 4 ώρες. Μετά προστέθηκαν 150 μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) σε κάθε φρεάτιο, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm.

Immuno fl uorescent Ομοεστιακή Δοκιμασία

Τα καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου, μετά πλύθηκαν σε 0.1 Μ PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,3% Triton Χ-100, που ακολουθείται από επώαση με την υποδεικνυόμενη Oct4 (1:100) και Survivin (1:100) πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα και τα δευτερογενή αντισώματα, fl uorescein ισοθειοκυανικό (FITC), συζευγμένης IgG αντι-κουνελιού ή κυανίνης-3 (Cy3), γίδινη αντι-ποντικού IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), σε θερμοκρασία δωματίου για 40 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα βάφονται με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) και ανιχνεύονται κάτω από ένα λέιζερ σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Στατιστική Ανάλυση

Το τεστ chi-square και Spearman του βαθμού συσχέτισης χρησιμοποιήθηκαν για να αναλυθεί η σχέση και συσχέτιση μεταξύ της σχετικής γονιδιακής έκφρασης και της κλινικής παθολογικά δεδομένα. OS εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και η σημαντική διαφορά στην OS ήταν υπολογίζονται δοκιμασία log-rank. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο αναλογικών κινδύνων του Cox. Τα πειραματικά δεδομένα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και αναλύθηκαν στατιστικώς με αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού PASW Statistics 18.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές για

σ

& lt?. 0.05