Αφηρημένο

Σταθερή, παραφίνη-ενσωματωμένες (FPE) ιστοί είναι μια δυνητικά πλούσια πηγή για τη μελέτη του ρόλου του Notch 1 σε καρκίνο και άλλες παθολογίες, αλλά τεστ που αξιόπιστα ανίχνευση ενεργοποιηθεί Notch1 (NICD1) σε δείγματα FPE έχουν λείπει. Εδώ, θα γεφυρώσει το χάσμα αυτό με την ανάπτυξη ενός λεκέ ανοσοϊστοχημική (IHC) που ανιχνεύει ένα νεοεπίτοπος δημιουργείται από την πρωτεολυτική διάσπαση γεγονός που ενεργοποιεί Notch 1. Μετά την επικύρωση χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύτηκε καρκίνων και φυσιολογικών ιστών με γνωστά πρότυπα ενεργοποίησης του Notch1, εφαρμόσαμε αυτή τη δοκιμή σε όγκους που συνδέονται με απορυθμισμένη σηματοδότηση Notch από μελέτες μετάλλαξης. Όπως ήταν αναμενόμενο, η συχνή χρώση NICD1 παρατηρήθηκε σε Τ λεμφοβλαστική λευχαιμία /λέμφωμα, ένας όγκος στον οποίο ενεργοποίηση

Notch 1

μεταλλάξεις είναι κοινά. Ωστόσο, όταν IHC χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ενεργοποίηση Notch 1 σε άλλους ανθρώπινους καρκίνους, αρκετές μη αναμενόμενα ευρήματα προέκυψε. Μεταξύ όγκους Β κυττάρων, χρώση NICD1 ήταν πολύ πιο συχνή σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία από θα μπορούσε να προβλεφθεί με βάση τη συχνότητα του

Notch 1

μεταλλάξεις, ενώ λέμφωμα κυττάρων μανδύα και διάχυτο από μεγάλα Β κύτταρα λέμφωμα δεν έδειξε στοιχεία ενεργοποίησης Notch 1. NICD1 ανιχνεύθηκε επίσης στο 38% των περιφερικών λεμφωμάτων Τ κυττάρων. Ενδιαφέροντος, NICD1 χρώση στα κύτταρα χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας και του λεμφώματος αγγειοανοσοβλαστικό ήταν σταθερά περισσότερο εμφανείς στους λεμφαδένες από ό, τι στις γύρω μαλακών ιστών, εμπλέκοντας παράγοντες στο κομβικό μικροπεριβάλλον στην ενεργοποίηση Notch1 σε αυτές τις ασθένειες. Μεταξύ καρκινώματα, διάχυτη ισχυρή χρώση NICD1 παρατηρήθηκε στο 3,8% των περιπτώσεων τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού (3 από 78 όγκοι), αλλά ήταν απούσα από 151 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και 147 των ωοθηκών καρκινώματα. Η συχνή χρώση του φυσιολογικού ενδοθηλίου παρατηρήθηκε επίσης? σύμφωνα με αυτή την παρατήρηση, ισχυρή χρώση NICD1 παρατηρήθηκε επίσης σε 77% των αγγειοσαρκώματα. Τα ευρήματα αυτά συμπληρώνουν στοιχεία που προέκυψαν από τις μελέτες γονιδιωματικής αλληλουχίας και δείχνουν ότι η χρώση IHC είναι ένα πολύτιμο πειραματικό εργαλείο που μπορεί να είναι χρήσιμη στην επιλογή των ασθενών για τις κλινικές δοκιμές

Παράθεση:. Kluk MJ, Ashworth Τ, Wang Η, Knoechel Β, Mason EF, Morgan ΕΑ, et al. (2013) Gauging Notch1 ενεργοποίησης στον Καρκίνο Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. PLoS ONE 8 (6): e67306. doi: 10.1371 /journal.pone.0067306

Επιμέλεια: Jose Angel Martínez Climent, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Κέντρο Εφαρμοσμένης Ιατρικής Έρευνας, Ισπανία

Ελήφθη: 1 Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 16η του Μάη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 kluk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το ΝΙΗ και λευχαιμίας και λεμφώματος Κοινωνία (JCA) και το Τμήμα BWH Βραβείο Παθολογίας Robbins (MJK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Συν-συγγραφέας Τζον Aster είναι σύμβουλος για τηλέφωνα σηματοδοσίας Technologies, κατασκευάστρια του μερικά από τα αντιδραστήρια αντισώματος που περιγράφονται στο παρόν έγγραφο. Αλέξανδρος Stoeck, Sriram Sathayanrayanan, και ο Brian Haines είναι υπάλληλοι της Merck Ογκολογίας. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

υποδοχείς Notch συμμετάσχουν σε μια διατηρημένη σηματοδοτικό μονοπάτι που ρυθμίζει πολλές κυτταρικές φαινοτύπων, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής τύχης , κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων (για ανασκόπηση, δείτε [1]). Θηλαστικά έχουν τέσσερα γονίδια Notch (

Notch1

–

4

), το καθένα με διαφορετικά πρότυπα έκφρασης και διαφορετικών φαινοτύπων νοκ-άουτ σε ποντίκια. Κανονικού σηματοδότηση μέσω όλων των τεσσάρων υποδοχέων στηρίζεται σε μια σειρά από εξαρτώμενη από συνδετήρα πρωτεολυτικές διασπάσεις, η τελευταία των οποίων πραγματοποιείται από μια πρωτεάση πολλαπλών υπομονάδων ονομάζεται γ-σεκρετάσης, η οποία διασπά τους υποδοχείς Notch εντός του εσωτερικού ήμισυ διαμεμβρανική περιοχή του υποδοχέα. Αυτό απελευθερώνει το Notch ενδοκυττάρια περιοχή, NICD, το οποίο μετατοπίζεται στον πυρήνα και σχηματίζει ένα σύμπλοκο βραχύβια μεταγραφική ενεργοποίηση.

Αποτελέσματα παράγονται από σηματοδότηση Notch σε φυσιολογικά κύτταρα διαφέρουν δραματικά με κυτταρική έννοια, προφανώς επειδή επιγενετική σχηματοποίηση των γονιδιωμάτων οδηγεί σε ποικίλες επιδράσεις των NICD στο μεταγραφικό εξόδους. Γονοτυπικά δεδομένα από ανθρώπους και πειραματικά αποτελέσματα από ποντικούς δείχνουν ότι

Notch 1

έχει επίσης ποικίλους ρόλους στον καρκίνο, που ενεργεί ως είτε ενός ογκογονιδίου ή ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου ανάλογα με κυτταρικό περιβάλλον. Κέρδος-of-λειτουργία μεταλλάξεων του

Notch 1

είναι κοινά σε Τ λεμφοβλαστική λευχαιμία /λέμφωμα (Τ-LL) [2,3], και έχουν επίσης περιγραφεί σε υποσύνολα της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (CLL) [4- 6], λέμφωμα κυττάρων μανδύα (MCL) [7], διάχυτο από μεγάλα Β κύτταρα λεμφώματος [8], περιφερικής λεμφώματος Τ κυττάρων (PTCL) [9], του καρκίνου του μαστού [10], και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [ ,,,0],11]. Αυτές οι μεταλλάξεις ενεργοποίησης περιλαμβάνουν υποκαταστάσεις ποικίλες σημείο, διαγραφές, και οι μετατοπίσεις που παράγουν ανεξάρτητη συνδεσμικού Notch 1 πρωτεόλυση και την ενεργοποίηση, καθώς και μεταλλάξεις που καταργούν ένα Ο-τερματικό πεδίο PEST degron και έτσι να σταθεροποιηθεί NICD1. Επιπλέον, τα στοιχεία που προκύπτουν από τη βαθιά αλληλούχισης των γονιδιωμάτων του καρκίνου έχει εντοπιστεί συχνή μετάλλαξη των γονιδίων που κωδικοποιούν συνιστώσες της οδού Notch σε υψηλής ποιότητας ωοθηκών ορώδες καρκίνωμα [12], αν και οι λειτουργικές συνέπειες αυτών των μεταλλάξεων επί σηματοδότηση Notch είναι αβέβαιη. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι Notch 1 έχει σημαντικές λειτουργικές ρόλους σε ενδοθήλιο και άλλα στρωματικά στοιχεία που μπορούν να συμβάλλουν στην κακοήθη συμπεριφορά των καρκίνων [13,14]. Αντιστρόφως, απώλειας λειτουργίας μεταλλάξεων που διανέμονται σε ένα μεγάλο τμήμα του

Notch 1

τόπο είναι κοινά σε καρκινώματα πλακωδών κυττάρων του δέρματος [15] και κεφαλής και αυχένα [16,17] και επίσης να παρουσιαστεί σε μια μικρότερη υποσύνολο πλακωδών κυττάρων καρκινώματα του πνεύμονα [15,18]. Παρομοίως, η απώλεια του

Notch1

λειτουργία στο αγγειακό ενδοθήλιο οδηγεί σε αγγειοσάρκωμα-όπως πολλαπλασιασμούς σε ποντίκια [19,20].

Υπάρχει ενδιαφέρον για θεραπευτική στόχευση των Notch 1 σε καρκίνους στο οποίο έχει μια ογκογόνο ρόλο με ανταγωνιστές όπως ανασταλτικά αντισώματα και αναστολείς γ-σεκρετάσης (GSI) [21]. Στην ιδανική περίπτωση, τέτοιες μελέτες θα επικεντρωθεί στην αντιμετώπιση των ασθενών των οποίων οι όγκοι παρουσιάζουν ενδείξεις συνεχούς ενεργοποίησης Notch1. Λόγω του μεγάλου μεγέθους του

Notch1

τόπο και την ποικιλομορφία των γενετικών ανωμαλιών που παράγουν συνδέτη-ανεξάρτητη ενεργοποίηση του Notch 1 ή σταθεροποίηση NICD1, γενετικός έλεγχος για ογκογόνο

Notch1

αλλαγές είναι δύσκολο, ιδιαίτερα όταν εργάζονται με αρχειακό δείγματα FPE. Επιπλέον, υπάρχει η υποψία ότι προκαλούνται από συνδετήρα ενεργοποίηση Notch1 συμβάλλει επίσης στην αύξηση του όγκου των κυττάρων και την επιβίωση, και όπως οι όγκοι θα πάει απαρατήρητα από γενετικού ελέγχου.

Ένα ιδανικό τεστ βιοδείκτη θα ανιχνεύσει NICD1 μέσα καρκινικά κύτταρα άμεσα, ανεξάρτητα από το ο υποκείμενος μηχανισμός της ενεργοποίησης Notch1. Για το σκοπό αυτό, έχουμε αναπτύξει μια ισχυρή μέθοδο χρώσης, ειδικές ανοσοϊστοχημικές (IHC) που ανιχνεύει NICD1 σε αρχειακό δείγματα. Η δοκιμή βασίζεται σε ένα εμπορικό μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως μόνο σε αναλύσεις στυπώματος Western, ότι είναι ειδικό για ένα νεοεπίτοπος σε NICD1 δημιουργούνται από γ-εκκριτάσης μεσολάβηση πρωτεόλυση Notch 1, γεγονότος που ενεργοποιεί σηματοδότηση Notch 1. Μετά τη βελτιστοποίηση και επικύρωση της δοκιμής χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματα καρκίνου φέρουν ποικίλες

Notch1

εκτροπές και φυσιολογικούς ιστούς, θα προβληθεί μια μεγάλη σειρά ανθρώπινων καρκίνων άγνωστης

Notch1

κατάστασης μεταλλάξεων για ενεργού Notch1. Τα περισσότερα T-LLS και CLLs έδειξε απόδειξη της συνεχούς ενεργοποίησης Notch1, όπως έκανε και πολλές περιφερειακές λεμφώματα Τ κυττάρων και ένα μικρό υποσύνολο τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού. Η ενεργοποίηση του Notch 1 ανιχνεύθηκε επίσης στην πλειονότητα των αγγειοσαρκώματα, σύμφωνα με την παρατήρηση ότι NICD1 είναι ευκόλως ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα εντός στρώματος του όγκου. Αντίθετα, μικρή ή καθόλου ενεργοποίηση Notch 1 παρατηρήθηκε σε λεμφώματος κυττάρων του μανδύα, διάχυτο από μεγάλα Β κύτταρα λέμφωμα, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, και ωοθηκών. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η ενεργοποίηση Notch1 μεταξύ των Β κυττάρων όγκων είναι τόσο πιο έντονα περιορισμένη και πιο διαδεδομένη στην ΧΛΛ από ό, τι θα μπορούσε να προβλεφθεί από την προηγούμενη γονοτυπική δεδομένων, εγείρουν ερωτήματα σχετικά με τον προτεινόμενο ρόλο κατασταλτικό όγκου για Notch1 σε αγγειακές νεοπλάσματα, και δείχνουν ότι η δοκιμή IHC για NICD1 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επιλογή ασθενών για τις κλινικές δοκιμές των αναστολέων Notch μονοπατιού, ιδιαίτερα εκείνες που αφορούν ασθενείς με όγκους όπως τριπλά αρνητικούς καρκίνο του μαστού, στις οποίες η ενεργοποίηση Notch 1 περιορίζεται σε ένα μικρό υποσύνολο των όγκων.

Υλικά και μέθοδοι

χρήση ανθρώπινων ιστών

η

Ανθρώπινοι ιστοί δείγματα εγκριθεί για χρήση από Institutional Review Boards ως εξής. Όλοι οι ιστοί που εμπλέκονται με λεμφοειδείς νεοπλασίες (εκτός από ένα) συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς συγκατάθεση υπό Brigham και Γυναικών πρωτόκολλο Νοσοκομείο IRB 2010-P002736. Ένα μη-μικροκυτταρικό μικροσυστοιχιών καρκίνωμα του πνεύμονα κατασκευάστηκε με τους ιστούς που λαμβάνονται από ασθενείς χωρίς τη συγκατάθεσή κάτω Νοσοκομείου Brigham and Women της πρωτόκολλο IRB 2006-P001929. Μια ορώδες μικροσυστοιχιών καρκίνο των ωοθηκών κατασκευάστηκε με τους ιστούς που λαμβάνονται από ασθενείς χωρίς τη συγκατάθεσή κάτω Brigham και Γυναικών πρωτόκολλο Νοσοκομείο IRB 2006-P000321. Μια μικροσυστοιχία αγγειοσάρκωμα κατασκευάστηκε με τους ιστούς που λαμβάνονται από ασθενείς χωρίς τη συναίνεση στο πλαίσιο του Πανεπιστημίου του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου πρωτόκολλο IRB LAB04-0890. Σε κάθε μία από αυτές τις περιπτώσεις, οι μελέτες χορηγήθηκαν παραιτήσεις από συγκατάθεση με βάση τα ακόλουθα: 1) δείγματα συλλέχθηκαν αναδρομικά από αρχεία παθολογία και είχε ως αποτέλεσμα από τη ρουτίνα χειρουργικές διαδικασίες που εκτελούνται για διαγνωστικούς σκοπούς? 2) ταυτότητες των ασθενών ήταν ανώνυμες και πλήρως αποσυνδεθεί από μοναδικά αναγνωριστικά? και 3) δεν υπήρχε κανένας κίνδυνος για τους συμμετέχοντες (μόνο ανώνυμα ιστοί που χρησιμοποιούνται). Ένα T-λεμφοβλαστική δείγμα λέμφωμα που συλλέγονται στο πλαίσιο της δίκης της Merck GSI MK-0752 χρησιμοποιήθηκε με τη γραπτή συγκατάθεση του προσβεβλημένου ασθενή υπό Dana Farber /Συνεργάτες Κέντρο Καρκίνου πρωτοκόλλου 2004-P002170. Μια μικροσυστοιχία καρκίνο του μαστού που περιέχει τριπλό αρνητικούς όγκους (αρνητικά για υποδοχέα οιστρογόνου, υποδοχέας προγεστερόνης, και

HER2

ενίσχυση) κατασκευάστηκε με τους ιστούς που λαμβάνονται από ασθενείς οι οποίοι παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση υπό Dana Farber Cancer Institute πρωτόκολλο IRB 93-085.

Χρήση των ποντικών σε ξενομοσχεύματος μελέτες

Η

REC-1 και KOPT-Κ1 κυττάρων του υποδόριου ξενομοσχεύματος μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο Dana Farber Cancer Institute IACUC 04-111. HCC1599, HCC1587, και MB-157 κυττάρων του υποδόριου ξενομοσχεύματος μελέτες διεξήχθησαν κάτω από ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την IACUC στη Merck Ογκολογίας. εργασίας των ζώων έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του ΝΙΗ. Όλα τα ζώα που φέρουν ξενομοσχεύματα παρακολουθούνται καθημερινά από το κτηνιατρικό προσωπικό για μη φυσιολογικές συμπεριφορές /συνθήκες που ενδέχεται να απαιτούν την προσοχή για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία. Τα ζώα θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία σύμφωνα με τις υποδείξεις της Αμερικανικής Κτηνιατρικής Medical Association. Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε CO

2 για τουλάχιστον 5 λεπτά μετά την παύση της αναπνευστικής κινήσεις.

Οι κυτταρικές σειρές

Η

Οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection (REC-1, Maver-1, HCC1599, HCC1587, και MB-157 κύτταρα) ή ο Leibniz-Institute DSMZ-γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και Κυτταρικών γραμμών (KOPT-Κ1).

μελέτες ανάπτυξης δοκιμών και επικύρωσης

η

οι μελέτες που επικαλείται: 1) κυτταρικές σειρές με μεταλλάξεις στο

Notch1

που είτε παράγουν κέρδος ή απώλεια της λειτουργίας του Notch1, που αναπτύχθηκαν ως ξενομοσχεύματα σε ποντίκια ? 2) φυσιολογικό ανθρώπινο πλακώδες βλεννογόνων και θύμο, με τις οποίες είναι γνωστές οι ανατομικές κατανομές των κυττάρων με ενεργοποιημένα Notch 1? και 3) ένα πρωτογενή ανθρώπινα Τ-ALL γνωστής

Notch 1

γονότυπο (περιγράφεται παρακάτω). Ξενομοσχεύτηκε κυτταρικές σειρές και συνδέονται

Τα Notch 1

γενότυποι δίνονται στον Πίνακα 1. Όλα τα ξενομόσχευμα όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 10% φορμαλίνη ή 4% παραφορμαλδεΰδη (καρκινώματα πλακωδών κυττάρων) και ενσωματωμένα σε παραφίνη, και ανασύρθηκαν από τα αρχεία του ιστού των επιμέρους εργαστήρια στα οποία οι μελέτες ξενομοσχεύματος έγιναν ως μέρος των άλλων μελετών. Οστά απασβεστωμένες παρακάτω φορμόλη μονιμοποίηση χρησιμοποιώντας RDO Λύση Rapid απασβέστωση (Sigma, St. Louis, ΜΟ).

Κυτταρική Γραμμή

όγκων Τύπος

Notch1 Μετάλλαξη

Επίδραση στην Notch1 Σηματοδοσίας

Αναφορά

KOPT-K1T-LLL1600P /del (P) * Gain [3] REC-1MCLdel (ECN1) /del (P) * χαρτί Gainthis /[7] Maver-1MCLNoneN.A. [7] HCC1599Breast Carcinomadel (ECN1) Κέρδος [10] MB-157Breast Carcinomadel (ECN1) GainUnpublished dataHCC1587Breast CarcinomaNoneN.A. [10] Πίνακας 1. ξενομοσχευμάτων Καρκίνου και σχετιζόμενη αύξηση του κύκλου λειτουργίας μεταλλάξεων σε Notch1.

* Χ /Υ υποδεικνύει σε συνδυασμό μεταλλάξεων που δημιουργήθηκε από εκτροπές στο

cis

στο ίδιο

Notch1

alleledel (ECN1) υποδεικνύει την παρουσία μίας διαγραφής που αφαιρεί την κωδικοποιητική αλληλουχία για το εξωκυτταρικό πεδίο του NOTCH1del (Ρ) δείχνει την παρουσία του πλαισίου ή κωδικόνιο στοπ μεταλλάξεις που καταργούν το ο-τερματικό Notch 1 PEST degron domainT-LL, Τ λεμφοβλαστική λευχαιμία /λέμφωμα? MCL, λέμφωμα μανδύα? Ν.Α., δεν ισχύει CSV Λήψη CSV

Αρχειακές δείγματα ανθρώπινων καρκινικών

Η

Όλα τα δείγματα FPE χρησιμοποιήθηκαν μετά την έγκριση των θεσμικών πίνακες αξιολόγησης (βλ ηθική δηλώσεις). Ένα βασικό T-ALL δείγμα είναι γνωστό ότι φέρουν την ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

Notch1

συλλέχθηκαν ως μέρος μιας κλινικής δοκιμής του αναστολέα γ-σεκρετάσης ΜΚ-0754 σε ασθενείς με υποτροπή /ανθεκτικό T-ALL [22]. Αρχειακή «απορρίπτεται» T-LL, CLL, MCL, αγγειοσάρκωμα, και δείγματα φυσιολογικού ιστού επιλέχθηκαν από τους ιστούς παραφίνης αρχεία του Νοσοκομείου Brigham and Women της βασίζεται αποκλειστικά στη διαθεσιμότητα των ιστών που καθορίζεται στο 10% φορμόλη ή στο Β +, ένα ρυθμιστικό παγιωτικός περιέχει 3,7% φορμαλδεΰδη και χλωριούχου ψευδαργύρου που χρησιμοποιείται ευρέως για τους ιστούς που εμπλέκονται με λεμφοειδή νεοπλάσματα. FPE μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [23], διάχυτο από μεγάλα Β κύτταρα λεμφώματος [24], αγγειοσάρκωμα [25], και τον καρκίνο των ωοθηκών [26] δείγματα μελετήθηκαν με χρώση προηγουμένως περιγράφηκε μικροσυστοιχίες ιστού. Μια νέα μικροσυστοιχίες ιστό που περιέχει ένα σύνολο 78 τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού συγκροτήθηκε ως εξής. Αρχειακό φορμόλη-σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες καρκίνου του μαστού συλλέχθηκαν και προσδιορίστηκαν καλύτερο μπλοκ και καλύτερες περιοχές για αποσπάσεις και επιλέγονται από έναν παθολόγο του μαστού (DD). Αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικές μελέτες για οιστρογόνου (ER) και υποδοχέα προγεστερόνης (PR) και HER2 και αποτελέσματα της ανάλυσης FISH για HER2 εκχυλίστηκαν από τις αναφορές παθολογία. Εβδομήντα οκτώ τριπλά αρνητικό (ER PR αρνητικό //HER2) διηθητικού καρκίνου του μαστού εντοπίστηκαν με επαρκή ιστό του όγκου για μικροσυστοιχίες ιστού (ΤΜΑ) η κατασκευή, η οποία διεξήχθη στο Dana Farber /Harvard Κέντρο Καρκίνου ιστών μικροσυστοιχιών πυρήνα Διευκόλυνσης. Τρεις 0.6 πυρήνες mm ελήφθησαν από την ένδειξη περιοχές και τοποθετούνται σε ένα μπλοκ δέκτη χρησιμοποιώντας ένα εγχειρίδιο arrayer (Beecher Instruments).

Η ανοσοϊστοχημεία

Η

Πρότυπο 4-micron ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστού τομές χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Benchmark XT Ventana (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ.) με εκτεταμένη θερμότητα που προκαλείται από ανάκτησης επιτόπου (CC1 Buffer). Τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-NICD1 μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (κλώνος D3B8, κατάλογος # 4147, Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ? Τελική συγκέντρωση, 8.5microgram /mL). Σήματα μετά ενισχύθηκαν (Ventana Amplification Kit, # 760-080) και οπτικοποιήθηκε (κιτ ανίχνευσης Ventana Ultraview καθολική DAB, # 760-500) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα χρώση τρέχει περιλαμβάνονται δύο θετικά δείγματα ελέγχου (ξενομόσχευμα REC-1 κυττάρων και αμυγδαλών βλεννογόνο). Η βαθμολόγηση έγινε από δύο παθολόγους (MJK, JCA). αποτελέσματα χρώσης επίσης αναθεωρηθεί με παθολόγους με εμπειρία υποειδικότητα στην αιματοπαθολογία (MJK, JCA, GP, DD, ΕΑΜ, EFM), πνευμονική παθολογία (LC), γυναικολογική παθολογία (ΜΗ), παθολογία του μαστού (DD), και παθολογίας μαλακών ιστών (JH , AL), όλα εκ των οποίων συνέβαλε επίσης στην επιλογή των περιπτώσεων.

Notch1

αλληλουχίας

DNA παρασκευάζεται από φρέσκο-κατεψυγμένα δείγματα με χρήση του κιτ QIAamp DNA Mini (Qiagen, Valencia, CA). Sanger αλληλούχισης του

Notch1

μεταλλάξεων hotspots σε μια υπόθεση Τ-λεμφοβλαστική λέμφωμα εκτελέστηκε όπως περιγράφεται [3]? αλληλουχίας ίχνη με αναλύονται με μετάλλαξη Surveyor λογισμικό (Softgenetics, State College, PA). Βαθιά αλληλούχιση του

Notch 1

μεταλλάξεων hotspots διεξήχθη ως εξής. Εκκινητές σχεδιάζονται και επικυρώνονται από Fluidigm (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA) για εξώνια 25-28 και 34 του

Notch1

ανά συνιστώμενη κατευθυντήριες γραμμές για την αλληλούχιση Roche τιτανίου (Roche, Mannheim, Germany). Ένα σύνολο 2304 αμπλικονίων που αντιπροσωπεύουν 48 μοναδικά δείγματα ενισχύθηκαν με ειδικούς στόχους 48 ζεύγη εκκινητών παρήχθησαν σε κάθε κύκλο προσδιορισμού αλληλουχίας. Κάθε αστάρι περιλαμβάνονται ακολουθίες bar code αστάρι και τον προσαρμογέα δείγμα ειδικά Fluidigm 454. Οι αντιδράσεις περιείχαν 50 ng γονιδιακού DNA, εμπρός και πίσω ετικέτα εναύσματα ενίσχυσης (1microM), εμπρός και όπισθεν αστάρια γραμμωτού κώδικα (400ηΜ), Αντιδραστήριο Array Φόρτωση 1x πρόσβαση, 1x FastStart High Fidelity Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, 4.5mm MgCl

2, 5% DMSO , Blend 0,05 U FastStart High Fidelity ενζύμων και PCR-grade νουκλεοτιδίων μείγμα (200microM, Roche). Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε στο Fluidigm FC1 Cycler σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι προκύπτουσες βιβλιοθήκες συλλέχθηκαν και συλλέχθηκαν σε μία πλάκα μικροτιτλοδότησης, όπου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το dsDNA Qubit® BR Assay Kit με Qubit® 2,0 Fluorometer (Invitrogen, UK). Βιβλιοθήκες ομαλοποιήθηκαν και ομαδοποιούνται πριν από καθαρισμό χρησιμοποιώντας σύστημα Agencourt AMPure XP (Beckman, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. συστατικά βιβλιοθήκη κλωνικά ενισχυμένο χρησιμοποιώντας το GS Νέων emPCR Lib-ένα κιτ (Roche) με την εισαγωγή ενός μορίου του DNA βιβλιοθήκης ανά σύλληψη χάντρα. Pyrosequencing πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος GS Τζούνιορ (Roche /454 Life Sciences).

Για την ανίχνευση επιλεκτικά το κωδικόνιο 2514 del (CT) μετάλλαξη στο

Notch1

, αναπτύχθηκε ένας προσδιορισμός Pyrosequencing. Εν συντομία,

Notch 1

εξώνιο 34 αλληλουχίας στόχου ενισχύθηκε σε ένα PCR που περιέχει 30ng του γενωμικού DNA, ένα βιοτινυλιωμένο εμπρός εκκινητή (5′-CTCCTCGCCTGTGGACAA) και αντίστροφο εκκινητή (5′-GGGACGAGCTGGACCACT) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους ποδηλασία: 94 ° C χ 2 λεπτά, ακολουθούμενη 94 ° C χ 30 δευτερόλεπτα 62 ° C χ 30 δευτερόλεπτα 72 ° C χ 30 δευτερόλεπτα 45 κύκλους, που ακολουθείται από μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Το προϊόν ενίσχυσης PCR συνελήφθη επί στρεπταβιδίνη σφαιρίδια sepharose μετουσιωμένα, μεταφέρθηκε σε μια πλάκα Pyrosequencing, ανοπτήθηκαν σε αντίστροφο εκκινητή προσδιορισμού αλληλουχίας (5 ‘CACTGGTCAGGGGACT 3’), και η αλληλουχία ανά ένα πρότυπο πρωτόκολλο (PyroMark Q96 MD, Qiagen, Germantown, MD) . Η απόφαση να χρησιμοποιηθεί ένα αντίστροφο έναυσμα προσδιορισμού αλληλουχίας βασίστηκε στην τυχαία παρουσία μιας παρτίδας 3 υπολείμματα G αμέσως 3 ‘του ανάστροφου ΔG κωδικόνιο 2514 μετάλλαξη, η οποία ενεργεί για την αύξηση της ευαισθησίας της δοκιμασίας περίπου 3-φορές. Σύμφωνα με αυτή την πρόβλεψη, μελέτες ελέγχου με τη χρήση της κυτταρικής γραμμής KOPT-Κ1, μία κυτταρική σειρά Τ-LL με ένα ετερόζυγο del (CT) κωδικόνιο 2514 μετάλλαξη [3], έδειξε αξιόπιστη ανίχνευση αυτής της παραλλαγής αλληλουχίας όταν αραιωθεί κάτω σε ένα επίπεδο 2,5% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα με το DNA που περιέχουν άγριου τύπου

Notch1

αλληλόμορφα.

Μοριακός Χαρακτηρισμός ενός ενδογονικοί Notch1 Διαγραφή στο REC-1 κύτταρα

Η

5 ‘ ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (RACE) πραγματοποιήθηκε σε RNA που παρασκευάζεται από REC-1 κύτταρα και ελέγχου DND-41 Τ-ALL κύτταρα όπως περιγράφεται [27]. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από κύτταρα REC-1 χρησιμοποιώντας το γενωμικό DNA κιτ απομόνωσης QIAamp (Qiagen, Valencia, CA). Exon1 αίσθηση (5′-CCTGCTCTGCCTGGCGCTG) και εξόνιο 28 (5’-CCACGAAGAACAGAAGCACA) αντινόημα εναρκτήρες χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν το ενδογονικοί Notch1 διαγραφή από 100 ng γενωμικού DNA χρησιμοποιώντας το σύστημα Long Template PCR Expand (Roche, Branford, CT). Οι συνθήκες ενίσχυσης PCR ήταν 94 ° C χ 2 λεπτά, που ακολουθείται από 94 ° C χ 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C χ 30 δευτερόλεπτα και 68 ° C χ 45 δευτερόλεπτα για 30 κύκλους, που ακολουθείται από μια προέκταση 68 ° C για 7 λεπτά. Το προκύπτον PCR προϊόν καθαρίστηκε, κλωνοποιήθηκε μέσα στο πλασμίδιο pCR2.1-ΤΟΡΟ (Invitrogen, Carlsbad, CA), και η αλληλουχία Sanger.

Ανάλυση Western Blot

Η

Σύνολο κυτταρολύματα απορρυπαντικού κυτταρικών σειρών που παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται [27] βάφτηκαν για NICD1 (κατάλογος # 4147), το σύνολο των Notch 1 (κατάλογος # 4380), ή ακτίνης (κατάλογος # 4970) χρησιμοποιώντας αντισώματα που λαμβάνονται από τη Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ).

ξενομοσχεύματος Μελέτες

Η

REC-1 κύτταρα και κύτταρα Maver-1 εμβολιάστηκαν υποδορίως σε 6 εβδομάδων SCID /μπεζ ποντίκια (Charles River Laboratory, Wilmington, ΜΑ) (1×10

7 κύτταρα ανά ποντικό) σε 30% Matrigel μήτρα βασικής μεμβράνης (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε με μετρήσεις της εσωτερικής διαμέτρου. Όταν οι όγκοι έφθασαν έναν όγκο της τάξης των 100-200 mm

3, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα διαμινοβενζιδίνη γ-εκκριτάσης (DBZ) σε 10microM /kg με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ή με φορέα (DMSO) για 3 ημέρες. Οι ιστοί συλλέχθηκαν 2 ώρες μετά την τελευταία δόση του φαρμάκου. κύτταρα KOPT-Κ1 μεταχθέντα με ένα φακοϊό που εκφράζει λουσιφεράση πυγολαμπίδας ενέθηκαν με φλέβα της ουράς σε NOD /SCID /γ-αλυσίδας (NSG) ποντίκια εκτράφηκαν στο Κέντρο Imaging Lurie Οικογένειας (Dana Farber Cancer Institute). Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη της λευχαιμίας με βιοφωταύγεια και στη συνέχεια κατεργάζεται με DBZ ή DMSO ως ανωτέρω. HCC1587 και HCC1599 ανθρώπινου καρκίνου του μαστού ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς αναπτύχθηκαν σε ποντίκια CB17 όπως περιγράφεται [10], ενώ ξενομοσχεύματα MB157 κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκαν σε ελβετικά nu /nu (γυμνών) ποντικών, όλα σε Merck Oncology. Οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη ενός Ανοσοϊστοχημική Stain για Ενεργοποιημένο Notch1

η

Αν και κανονικά σηματοδότηση Notch βασίζεται στην πυρηνική μετατόπιση της ενδοκυτταρικής περιοχής του (NICD), η ανίχνευση των πυρηνικών NICD

in situ

σε ανθρώπινους ιστούς ήταν δύσκολη. Τα πολύκλωνα αντισώματα που ανιχνεύουν την νεοεπίτοπος δημιουργούνται στο αμινο-τελικό άκρο της NICD1 με διάσπαση του Notch 1 σε διατηρούμενες θέση εντός διαμεμβρανική περιοχή του έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση NICD1 σε προϊόντα λύσης των κυττάρων, αλλά δεν έχουν αποδώσει αξιόπιστα IHC δοκιμές. Πρόσφατη ανάπτυξη ενός μονοκλωνικού αντισώματος κουνελιού έναντι του νεοεπίτοπος NICD1 μας ενθάρρυνε να επανεξετάσουμε τη δυνατότητα χρήσης IHC για τον εντοπισμό NICD1 στους ιστούς FPE. Για να περιορίσετε run-to-τρέξιμο διακύμανση χρώση και να καταστήσουν δυνατή την κλινική μετάφραση, αξιολογήσαμε χρώση σε δύο ευρέως χρησιμοποιούμενη αυτοματοποιημένη πλατφόρμες ανοσοχρώση, το Ventana Discovery ΧΤ και τη Leica Bond. Τόσο πραγματοποιήθηκε όμοια, αλλά σημειώσαμε ότι η χρώση ερμηνευθεί ως ειδικές (όπως ανά κάτω) εμφανίστηκε εντονότερη στην πλατφόρμα Ventana (τα δεδομένα δεν φαίνονται), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για όλες τις μελέτες που αναφέρονται στο παρόν.

Για να αναπτυχθεί μία αξιόπιστη μέθοδος χρώση για NICD1, κάναμε χρήση ιστών FPE ελέγχου από ποντικούς ξενο-μεταμόσχευσις ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών που φέρουν ογκογόνο

Notch 1

μεταλλάξεις που οδηγούν σε ανεξάρτητη από πρόσδεμα γενιάς NICD1 (Πίνακας 1). Οι όγκοι που μελετήθηκαν με κέρδος-of-λειτουργία

Notch 1

μεταλλάξεις περιλάμβανε κυτταρική γραμμή Τ-LL, KOPT-Κ1, η οποία έχει ένα σημείο υποκατάσταση ενεργοποίησης αρνητική ρυθμιστική περιοχή Notch 1 ευθυγραμμίζεται σε

cis

με ένα κωδικόνιο 2514 del (CT) μετάλλαξη που έχει σαν αποτέλεσμα τη διαγραφή του Ο-τερματικού Notch 1 PEST degron τομέα [3]? το MCL κυτταρική γραμμή REC-1, το οποίο φέρει ένα

Notch 1

αλληλόμορφο με ένα προηγουμένως μη χαρακτηρισμένο ενεργοποίησης διαγραφή απομάκρυνση του μεγαλύτερου μέρους της ακολουθίας κωδικοποίησης για τον εξωτερικό τομέα Notch 1 ευθυγραμμίζονται σε

cis

με μια μετάλλαξη στο κωδικόνιο ανοησίες 2428 (που περιγράφεται παρακάτω) που έχει επίσης ως αποτέλεσμα τη διαγραφή του Ο-τερματικού PEST degron τομέα? και δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, HCC1599 και ΜΒ-157, τα οποία φέρουν

Notch 1

αλληλόμορφα με διαγραφές που αφαιρούν τις περισσότερες των αλληλουχιών που κωδικοποιούν Notch 1 εξωτομέα ([10]? και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Φορμόλης FPE τμήματα των τεσσάρων ξενομοσχευμάτων που φέρουν την ενεργοποίηση

Notch 1

μεταλλάξεις έδειξαν ισχυρή διάχυτη πυρηνική αντίδραση όταν βάφονται με την NICD1-ειδικό αντίσωμα (Σχήμα 1Α-D). Αξίζει να σημειωθεί ότι, NICD1 χρώση σε KOPT-Κ1 και REC-1 ξενομοσχευμάτων ήταν σημαντικά μειωμένη με κατεργασία των ζώων με την GSI DBZ (Σχήμα 1Ε, F), το οποίο αποκλείει την παραγωγή του NICD1 ([3]). Επιπλέον, δεν χρώση NICD1 παρατηρήθηκε σε τμήματα της MCL κυτταρική σειρά Maver-1 (Σχήμα 1G), η οποία έχει άγριου τύπου

Notch1

αλληλόμορφα και στερείται NICD1 [7], ή ο καρκίνος του μαστού κυττάρων γραμμή HCC1587 (Σχήμα 1), η οποία έχει άγριου τύπου

Notch1

αλληλόμορφα και αντί να έχει μια ενεργοποίηση διαγραφή συμμετοχή

Notch2

[10].

οι τομές χρωματίστηκαν για NICD1 χρησιμοποιώντας ένα μέθοδος IHC που παράγει ένα καφέ πυρηνική χρώση και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Α) KOPT-K1 T-ALL κύτταρα. Β) κύτταρα REC-1 λεμφώματος κυττάρων μανδύα. C) κύτταρα καρκινώματος HCC1599 μαστού. Δ) MB-157 κύτταρα καρκινώματος του μαστού. E, F) KOPT-Κ1 και χρώση των κυττάρων REC-1, αντίστοιχα, σε ιστούς που συλλέχθηκαν από ζώα που υπέστησαν αγωγή με το GSI DBZ. G) Maver-1 μανδύα κύτταρα λεμφώματος κυττάρων. H) καρκίνου του μαστού HCC1587 κύτταρα. Οι γονότυποι αυτών των κυτταρικών γραμμών δίνονται στον Πίνακα 1.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η ευαισθησία της μεθόδου και τη σταθερότητα του νεοεπίτοπος NICD1 σε αρχειακό ιστούς, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία για NICD1 σε τομές που παρασκευάζονται από Τ -Ι_Ι_ δείγμα που λαμβάνεται κατά το έτος 2004 από έναν ασθενή που εγγράφονται σε μια δίκη της Merck GSI MK-0754 [22]. Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας του DNA που απομονώθηκε από αυτό το δείγμα αποκάλυψε ένα ετερόζυγο σημειακή μετάλλαξη που έχει σαν αποτέλεσμα μία υποκατάσταση L1574P, καθώς και δύο επιπλέον μεταλλάξεις subclonal σημείο ευθυγραμμισμένα σε

cis

με την υποκατάσταση L1574P που δημιουργούν L1600P και F1592S υποκαταστάσεις (Σχήμα 2Α ). Όλες αυτές οι μεταλλάξεις εμπίπτουν στο εξόνιο 26 του

Notch 1

και αντιστοιχούν στην προηγουμένως χαρακτηρισμένες μεταλλάξεις κέρδος-of-λειτουργία με την αρνητική ρυθμιστική περιοχή Notch 1 [28], ένα τμήμα του εξωτομέα Notch 1 που πρέπει να είναι άθικτη για να κρατήσει το υποδοχέα στην κατάσταση εκτός λειτουργίας απουσία συνδέτη [29]. Tandem μεταλλάξεις ευθυγραμμισμένα σε

cis

στον εξωτερικό τομέα Notch1 έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [3] και είναι πιθανό μια εκδήλωση συνεχίστηκε επιλογή για αυξημένη σηματοδότηση Notch 1 κατά τη διάρκεια της T-ALL εξέλιξη. IHC σήμανσης αυτού του T-ALL παράγεται ισχυρό διάχυτη πυρηνική θετικότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το επιτόπιο NICD1 ανιχνεύεται από το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού είναι σταθερό για μια περίοδο αρκετών ετών, συνήθως αποθηκευμένα δείγματα FPE (Εικόνα 2Β).

Α) Αναγνώριση της ενεργοποίησης μεταλλάξεων που περιλαμβάνουν το εξόνιο 26 του

Notch1

. Από 24 μεμονωμένα κλωνοποιημένα προϊόντα PCR, 13 έδωσαν αλληλουχίες άγριου τύπου, 9 έδειξαν μία μετάλλαξη που παράγει μια υποκατάσταση L έως Ρ σε υπόλειμμα 1574, 1 έδειξε την μετάλλαξη L1574P σε

cis

με μια μετάλλαξη που παράγει μια υποκατάσταση F σε S σε υπόλειμμα 1592, και 1 έδειξε την μετάλλαξη L1574P στο

cis

με μια παραλλαγή που παράγει ένα L στην υποκατάσταση Ρ στο υπόλειμμα 1600. Β) χρώση IHC για NICD1 με τον ίδιο όγκο, ένα φορμόλη σταθερό παραφίνη-ενσωματωμένες βιοψία μια μεσοθωρακίου μάζα. Υπάρχει φλερτ τεχνούργημα, αλλά ισχυρή πυρηνική χρώση παρατηρείται σε ακέραια κύτταρα.

Η

Σημειώνεται επίσης στα τμήματα ξενομοσχευμένου όγκων που ποντικού ενδοθηλιακά κύτταρα και διάσπαρτα στρωματικά κύτταρα έδειξαν πυρηνική αντίδραση με το αντίσωμα NICD1 (φαίνεται καλύτερα στο Σχήμα 1G και Η). Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σύμφωνες με τα δεδομένα δείχνουν ρόλους για Notch 1 σε αγγειακό ενδοθήλιο [30] και περιφερειακών Τ κυττάρων [31], και πρότεινε ότι η μέθοδος μας IHC μπορεί να ανιχνεύσει φυσιολογικά επίπεδα του NICD1. Για την αξιολόγηση αυτή, μπορούμε χρώση τομές φυσιολογικού ανθρώπινου πλακώδους επιθηλίου, το δέρμα, και θύμος (Σχήμα 3). Πριν εργασία έχει δείξει ότι Notch 1 παροδικά ενεργοποιείται σε suprabasilar κύτταρα σε πλακώδη επιθήλια [32], με το οποίο προάγει την έξοδο του κυτταρικού κύκλου και την διαφοροποίηση [33], μια δραστηριότητα που μπορεί να συμβάλει σε όγκο κατασταλτικών ρόλους Notch 1 στο πλακωδών κυττάρων καρκινώματα του δέρματος και κεφάλι και το λαιμό. Όπως ήταν αναμενόμενο, NICD1 χρώση σε πλακώδη επιθήλια περιοριζόταν σε suprabasilar κύτταρα (Σχήμα 3Α, Β). Σε θυμοκύτταρα, ενεργοποίηση Notch 1 αυξάνεται σε ένα μέγιστο σε CD4 /CD8 κύτταρα διπλό αρνητικό υποβάλλονται σε βήτα-επιλογής [34], τα οποία βρίσκονται εντός του θυμικού φλοιού ακριβώς βαθιά στο θυμικό κάψουλα [35]. Στην προηγούμενη εργασία, παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα σε αυτή την περιοχή του θύμου έχουν το υψηλότερο επίπεδο ανοσοαντιδραστικότητας με αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν σύνολο Notch 1, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη την κατάσταση ενεργοποίησης του [36]. Όπως προβλέπεται από την αναφερόμενη πρότυπο ενεργοποίησης Notch 1 σε θυμοκύτταρα, NICD1 χρώση σε ανθρώπινο θύμο ήταν περισσότερο εμφανής σε φλοιώδη θυμοκύτταρα που βρίσκεται αμέσως κάτω από την κάψουλα (Σχήμα 3C, D). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η μέθοδος IHC μας είναι αρκετά ευαίσθητος για την ανίχνευση φυσιολογικά επίπεδα των ενεργοποιημένων Notch 1 σε τουλάχιστον μερικούς φυσιολογικούς ιστούς. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ενεργοποίηση Notch 1 σε φυσιολογικούς λεμφοειδείς ιστούς, χρώση αμυγδαλών διεξήχθη επίσης. Σημειώσαμε ότι βλαστικά κέντρα που περιέχουν αντιδραστικά Β κύτταρα στερούνται ανοσοαντιδραστικότητας, ενώ γύρω από τις ζώνες μανδύα έδειξε ασθενή χρώση για NICD1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) Στοματοφαρυγγική πλακώδους επιθηλίου. Β) του δέρματος. C, D) Thymus.

Η

Ανίχνευση Notch1 ενεργοποίησης στον Καρκίνο Αρχειακή Δείγματα

Η

Με βάση αυτές τις μελέτες επικύρωσης, χρησιμοποιήσαμε την επόμενη IHC για την εξέταση μιας σειράς FPE ανθρώπινων καρκίνων για την απόδειξη της ενεργοποίησης του Notch1, εστιάζοντας σε τύπους όγκων στους οποίους

έχουν Notch1

κέρδος-of-λειτουργία μεταλλάξεις έχουν περιγραφεί. Μελετήσαμε επίσης αγγειοσάρκωμα, με βάση την παρατήρηση ότι τα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα συχνά χρωματίζονται θετικά για NICD1 και προγενέστερες μελέτες που υποδηλώνει ότι

Notch 1

έχει μια λειτουργία κατασταλτική του όγκου σε αγγειακό ενδοθήλιο του ποντικού [19,20]? ως εκ τούτου, ήμασταν περίεργοι να δούμε εάν η ενεργοποίηση Notch1 μπορεί να χαθεί σε ανθρώπινο αγγειοσαρκώματα. Χρησιμοποιήσαμε NICD1 χρώση των φυσιολογικών ενδοθηλιακών κυττάρων ως ένας εσωτερικός έλεγχος για να κριθεί η διατήρηση της ανοσοαντιδραστικότητας στους ιστούς που μελετήθηκαν. Σε διερευνητικές μελέτες, διαπιστώσαμε ότι αρχειακό δείγματα μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα Zenker, μια υδραργύρου στερεωτικό που χρησιμοποιείται στο ίδρυμά μας για να decalcify βιοψίες μυελού των οστών, αναιρείται NICD1 ανοσολογική αντίδραση στο ενδοθήλιο. Απώλεια ανοσοαντιδραστικότητα δεν προκλήθηκε από απασβέστωση

per se

, αφού του μυελού των οστών που εμπλέκονται με ξενομόσχευμα κύτταρα KOPT-Κ1 που μονιμοποιήθηκε σε φορμόλη και στη συνέχεια ταχέως απασβεστωμένες με ένα ισχυρό οξύ που διατηρούνται ανοσοαντιδραστικότητα (Σχήμα 1Α). Λόγω αυτού του περιορισμού, θα περιορίζεται μελέτες μας σε όγκους που περιλαμβάνουν μαλακούς ιστούς για τους οποίους τα δείγματα FPE ήταν διαθέσιμα. Μερικά λεμφαδένες από δείγματα CLL μονιμοποιήθηκαν σε Β +, ένα σταθεροποιητικό που περιέχει φορμαλδεΰδη και χλωριούχο ψευδάργυρο. Δείγματα που καθορίζονται στο Β + διατηρούνται χρώση NICD1 σε φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα και έτσι συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση.