Αφηρημένο

Ιστορικό

Είμαστε αξιολόγησε τα θεραπευτικά αποτελέσματα του αναστολέα απακετυλασών PXD101 μόνη της και σε συνδυασμό με τα συμβατικά χημειοθεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Μελετήσαμε οκτώ κυτταρικές σειρές από τέσσερις τύπους του καρκίνου του θυρεοειδούς (θηλώδες, θυλακιώδες, αναπλαστικό και μυελώδη). Η κυτταροτοξικότητα μόνο και σε συνδυασμό με τρία συμβατικά χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη και ντοσεταξέλη) PXD101 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία LDH. έκφραση κηλίδα αξιολογηθεί Western των ακετυλίωση της ιστόνης Η3, Η4 ιστόνης και τουμπουλίνης, πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση, RAS /RAF /ERK και PI3K /AKT /mTOR σηματοδότηση μονοπατιών, βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση. Η απόπτωση και ενδοκυτταρικά δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ποντικοί που φέρουν πλευρό αναπλαστικό καρκίνους του θυρεοειδούς (ATC) σε καθημερινή αγωγή με ενδοπεριτοναϊκή ένεση PXD101 για 5 ημέρες την εβδομάδα. PXD101 ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. PXD101 που προκαλείται από τη συσσώρευση των ROS και ανέστειλε RAS /RAF /ERK και PI3K μονοπάτια /mTOR σε ευαίσθητα κύτταρα. Δίκλωνο βλάβης του DNA και απόπτωση που επάγεται από PXD101 τόσο ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών. PXD101 καθυστερημένη ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος 8505C ATC με ελπιδοφόρα ασφαλείας. Η συνδυασμένη θεραπεία της PXD101with δοξορουβικίνη και πακλιταξέλη επέδειξε συνεργική δράση κατά τέσσερις γραμμές ATC

στο

vitro

.

Συμπεράσματα

PXD101 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του θυρεοειδούς και έχει συνεργιστική επιδράσεις σε συνδυασμό με δοξορουβικίνη και πακλιταξέλη για τη θεραπεία ATC. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν τις κλινικές δοκιμές χρησιμοποιώντας PXD101 για τους ασθενείς με αυτή την θλιβερή ασθένεια

Παράθεση:. Lin SF, Lin JD, Chou TC, Huang YY, Wong RJ (2013) Χρησιμότητα ενός αναστολέα απακετυλασών (PXD101) για Θυρεοειδούς θεραπεία του καρκίνου. PLoS ONE 8 (10): e77684. doi: 10.1371 /journal.pone.0077684

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 16 Ιούνη 2013? Αποδεκτές: 3 Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Οκτωβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Shu-Fu Lin. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Chang Gung Memorial Hospital και Chang Gung Πανεπιστήμιο (CMRPG3A0161, CMRPG3A0162, CMRPG3A0163, CMRPG370581, CMRPG370582 και CMRPG370583) (https://www.cgmh.org.tw/. https://www.cgu.edu.tw/bin /home.php). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του θυρεοειδούς έχει αυξηθεί κατά τις τελευταίες τρεις δεκαετίες σε όλο τον κόσμο [1]. Αυξημένη ανίχνευση μικρών όγκων (≤ 1 cm) αντιπροσωπεύει το ήμισυ της αύξησης, αν και άλλες αιτίες για την αύξηση αυτή μένει να καθοριστεί [2,3]. Οι πιο κοινές παθολογικές μορφές του καρκίνου του θυρεοειδούς προέρχονται από ωοθυλακίων (θηλώδη, θυλακιώδη, κακώς διαφοροποιημένο και αναπλαστικό καρκίνο) και παραθυλακοκύτταρα κύτταρα του θυρεοειδούς (μυελοειδούς καρκίνου). Οι ασθενείς με καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του θυρεοειδούς (θηλώδες και θυλακιώδες καρκίνος) έχουν συνήθως ευνοϊκή πρόγνωση. Ωστόσο, υπάρχει περιορισμένη θεραπεία για ασθενείς οι οποίοι αναπτύσσουν μεταστατικό και ραδιενεργό ιώδιο-ανθεκτικό καρκίνο του θυρεοειδούς, η οποία είναι συχνά ανίατη [4]. ATC είναι μια σπάνια και συνήθως θανατηφόρα κακοήθεια, με διάμεση επιβίωση μόνο έξι μήνες. Μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς (MTC) αντιπροσωπεύει περίπου το 4% των κακοηθειών του θυρεοειδούς στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2012. Αν και τα δύο αναστολείς κινάσης βανδετανίμπη και cabozantinib βελτίωση της επιβίωσης χωρίς εξέλιξη της MTC και έχουν εγκριθεί από το FDA πρόσφατα, δεν ιάσιμη θεραπείες είναι διαθέσιμες για μεταστατικό MTC [ ,,,0],5]. Συνολικά, η θνησιμότητα από καρκίνο του θυρεοειδούς έχει ελαφρά αύξηση ετησίως από το 1992 [1]. Τα νέα θεραπείες για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων των ασθενών με ανθεκτικό καρκίνο του θυρεοειδούς.

αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) απομάκρυνση ακετυλομάδες από τα υπολείμματα λυσίνης σε ιστόνης και μη-ιστόνης υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων μεταγραφής και πρωτεϊνών που ελέγχει κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού και την απόπτωση. Οι HDACs χωρίζονται σε 4 κατηγορίες ανάλογα με την ομολογία τους με ορθόλογα ζύμη τους και ως φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου [6-8]. Αναστολή της HDACs χρήση μικρών μορίων προκαλεί πολλαπλές βιολογικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της συσσώρευσης ROS, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, βλάβη του DNA και την απόπτωση που μπορεί να οδηγήσει σε κυτταροτοξικές επιδράσεις. Τα κακοήθη κύτταρα θεωρούνται ότι είναι πιο επιρρεπή σε αναστολείς HDAC από καλοήθη κύτταρα [6]. FDA έχει εγκρίνει δύο HDAC αναστολείς σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) και δεψιπεπτίδιο στη θεραπεία του λεμφώματος δερματικών κυττάρων Τ.

Σε δείγματα του θυρεοειδούς, ATC έχει μεγαλύτερη αναλογία HDAC1 και 2 υπερέκφραση (80% και 92%), ακολουθούμενη από θηλώδους καρκίνου (61% και 53%) και του ιστού της κανονικής θυρεοειδούς (0% για τα δύο), προτείνοντας HADC1 και 2 συμβάλλουν στην ογκογένεση του καρκίνου του θυρεοειδούς και αποδιαφοροποίηση [9]. Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, Na

+ /I

– έκφραση συμμεταφορέα και συσσώρευση ιώδιο μπορεί να προκαλείται από τους αναστολείς HDAC σε φτωχά διαφοροποιημένο και αδιαφοροποίητο καρκίνου του θυρεοειδούς [10,11]. Εκτός από την προώθηση κύτταρο εκ νέου διαφοροποίηση, οι αναστολείς HDAC είναι ικανοί να επάγουν απόπτωση στον καρκίνο του θυρεοειδούς [12-14]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς HDAC έχουν το δυναμικό για τη θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς μέσω επαγωγής κυττάρων καρκίνου εκ νέου διαφοροποίηση και απόπτωση. Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία αναστολέα HDAC με χημειοθεραπεία μπορεί να ενισχύσει θεραπευτική αποτελεσματικότητα έναντι ATC [14-16]. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς HDAC είναι πιθανοί παράγοντες στη θεραπεία των ασθενών με ανθεκτική καρκίνο του θυρεοειδούς.

PXD101 (belinostat) είναι ένας αναστολέας παν-HDAC με ισχυρή κυτταροτοξική αποτελέσματα εναντίον μιας ποικιλίας τύπων καρκίνου μέσω επαγωγής απόπτωσης, ανεξάρτητα από κληρονόμο αντίσταση της χημειοθεραπείας [17,18]. Ο συνδυασμός της PXD101 με docetaxel έδειξε ευεργετικά αποτελέσματα στη θεραπεία των ωοθηκών και του προστάτη καρκινικών κυττάρων [19,20]. Κλινικά, συνδυασμένη θεραπεία του PXD101, πακλιταξέλη και καρβοπλατίνη οδήγησε σε μερική απόκριση σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους σε μία δοκιμή φάσης Ι [21]. PXD101 σε συνδυασμό με doxorubicin έχει επίσης ευνοϊκά αποτελέσματα στη θεραπεία του σαρκώματος μαλακών μορίων σε μια φάση Ι /ΙΙ μελέτη [22]. Αυτά τα στοιχεία μας ώθησε να διερευνήσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των PXD101 στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Αξιολογήσαμε επίσης τα αποτελέσματα συνδυασμό PXD101 και τη χημειοθεραπεία για τη θεραπεία ATC, την πιο επιθετική μορφή καρκίνου του θυρεοειδούς.

Αποτελέσματα

κυτταροτοξικότητα και η ακετυλίωση των ιστονών Η3, Η4 ιστόνης και τουμπουλίνης από PXD101

PXD101 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε οκτώ γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Αυτές οι κυτταρικές σειρές περιλάμβαναν θηλώδες (BHP7-13), ωοθυλάκιο (WRO82-1), ωοθυλάκιο αδιαφοροποίητο (FRO81-2), τέσσερις αναπλαστικό (8305C, 8505C, KAT18, KAT4C) και ένα μυελοειδές (ΤΤ) ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς. PXD101 στο 1,25 μmol /L καταστέλλεται τουλάχιστον 45% της κυτταρικής ανάπτυξης σε 7 από 8 κυτταρικές γραμμές την ημέρα 4. PXD101 στα 10 mmol /L ανέστειλε περισσότερο από το 70% της κυτταρικής ανάπτυξης σε θυλακιώδη κύτταρα καταγόμενες γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς και το 95% σε παραφολλιδωτά μυελοειδούς καρκίνου (ΤΤ). Η μέση δόση επίδραση (DM) της PXD101 την ημέρα 4 υπολογίστηκε για κάθε κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Β). Μεταξύ των θυλακιωδών κυττάρων καταγόμενες καρκίνο του θυρεοειδούς, τέσσερις γραμμές ATC ήταν πιο ευαίσθητα σε PXD101 από θυλακιώδη αδιαφοροποίητο καρκίνου και καλά διαφοροποιημένο καρκίνο (DM? 8305C = 0,59 μmol /L, 8505C = 0,93 μmol /L, KAT18 = 0,87 μmol /L, KAT4C = 1.13 μmol /L, FRO81-2 = 1,71 μmol /L, WRO82-1 = 1,33 μmol /L, BHP7-13 = 1,49 μmol /L). Το DM της MTC γραμμή καρκίνου του ΤΤ ήταν 0,33 mmol /L. Ερευνήσαμε τις επιδράσεις της PXD101 σε τρεις θυλακιώδη κύτταρα που προέρχονται από σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς στα ακόλουθα μελέτες

Α, καμπύλες δόσης-απόκρισης λήφθηκαν κατά την ημέρα 4 από κύτταρα που κατεργάζονται με μια σειρά από έξι. 1: 1 αραιώσεις PXD101. Β, Dm του PXD101 την ημέρα 4 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό CompuSyn για κάθε κυτταρική γραμμή. Μεταξύ των επτά θυλακιώδη κύτταρα που προέρχονται από τις γραμμές του καρκίνου του θυρεοειδούς, των κυττάρων ATC γραμμές (8305C, 8505C, KAT18 και KAT4C) είχαν τη χαμηλότερη Dm, που ακολουθείται από καλά διαφοροποιημένο ωοθυλακίων (WRO82-1) και θηλώδες (BHP7-13) τον καρκίνο, και θυλακιώδη αδιαφοροποίητο καρκίνο του θυρεοειδούς (FRO81-2). Μυελοειδούς καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα (ΤΤ) είχαν επίσης χαμηλή Dm. C, PXD101 προκαλούμενη ακετυλίωση της ιστόνης Η3 και ιστόνη Η4 σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. PXD101 αύξησε επίσης την ακετυλίωση της τουμπουλίνης σε BHP7-13, WRO82-1 και 8505C.

Η

ιστόνης Η3, Η4 ιστόνης και τουμπουλίνης μπορεί να ακετυλιωθεί από την αναστολή των HDAC. Τα αποτελέσματα της PXD101 να επάγουν ακετυλίωση των πρωτεϊνών αυτών αξιολογήθηκαν στις 48 ώρες σε 3 κυτταρικές γραμμές που αντιπροσωπεύουν θηλώδες (BHP7-13), θυλακιώδες (WRO82-1) και αναπλαστικό (8505C) του καρκίνου του θυρεοειδούς (Σχήμα 1 C). PXD101 ≥ 0,625 μmol /L που επάγεται σημαντικά ακετυλίωση ιστόνης Η4 και τουμπουλίνης σε όλες τις κυτταρικές σειρές. PXD101 ≥ 1,25 mmol /L αυξημένη ακετυλίωση της ιστόνης Η3 στην WRO82-1 και 8505C. Σε BHP7-13, ακετυλιωμένο ιστόνης Η3 εμφανίστηκε όταν εφαρμόσθηκε υψηλότερη δόση PXD101 (2,5 μmol /L). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν PXD101 είναι σε θέση να καταστείλει HDACs.

Επιδράσεις της PXD101 στην απόπτωση

BHP7-13, WRO82-1 και 8505C εκτέθηκαν σε PXD101 για 48 και 72 ώρες και τα κύτταρα υπο-G1 αξιολογήθηκαν (Σχήμα 2Α). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, PXD101 στο 1,25 και 2,5 μmol /L σημαντικά την απόπτωση που επάγεται όπως προσδιορίζεται από την αναλογία των κυττάρων υπο-G1 στις 48 και 72 ώρες σε όλες τις κυτταρικές σειρές.

Α, η απόπτωση αναλύθηκε με μετρήσεις του DNA περιεχόμενο χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής στις 48 και 72 ώρες. Αυξανόμενες δόσεις του PXD101 επαγόμενης υψηλότερη αναλογία των κυττάρων υπο-G1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Β, ανοσοστύπωμα έδειξε PXD101 αποικοδομείται δήμιος κασπάσης-3 σε τρεις κυτταρικές γραμμές.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η αποπτωτική δράση, κασπάσης-3 αξιολογήθηκε με στύπωμα Western μετά από 48 ώρες αγωγής (Εικόνα 2Β). Υψηλότερες δόσεις PXD101 προκάλεσε περισσότερους υποβάθμιση των αποπτωτικών δήμιος της κασπάσης-3 σε BHP7-13 και 8505C. Η αποδόμηση της κασπάσης-3 παρατηρήθηκε επίσης σε WRO82-1 όταν θεραπεύτηκαν με PXD101 κατά 2,5 μmol /L. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζει απόπτωση είναι ο μηχανισμός για την κυτταροτοξικότητα της PXD101 στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα.

Επιδράσεις της PXD101 σε ROS συσσώρευση

θεωρείται συσσώρευση των ROS από αναστολείς HDAC ένας από τους μηχανισμούς που αντιπροσωπεύει κυτταροτοξικότητα (6). Αξιολογήσαμε αυτό το αποτέλεσμα με τη χρησιμοποίηση 2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin διοξεικό (DCFH-DA) δοκιμασίες για την ανίχνευση ενδοκυτταρικών ROS στα κύτταρα που εκτίθενται σε PXD101 για 16 ώρες (Σχήμα 3Α). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, PXD101 σε 0.625 μmol /L αύξησε σημαντικά DCFH-DA φθορισμού σε WRO82-1 (163,1 ± 0,8 και 124,3 ± 2,4, P & lt? 0.001) και 8505C (135,6 ± 0,9 και 117,1 ± 0,5, P & lt? 0.001). Υψηλότερες δόσεις PXD101 επάγεται περισσότερο συσσώρευση ROS στα κύτταρα αυτά. Ωστόσο, αυτή η επίδραση δεν παρατηρήθηκε σε BHP7-13 η οποία είναι λιγότερο ευαίσθητη σε PXD101. Μακρύτερη έκθεση του PXD101 απέτυχε ακόμη να επάγει συσσώρευση ROS σε BHP7-13 (24 και 48 ώρες, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δύο αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές αποδείξει την ικανότητά της να επάγει PXD101 συσσώρευση ROS (Σχήμα 3Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν συσσώρευση ROS δεν μπορούν να εξηγήσουν κυτταροτοξικότητα PXD101 σε ανθεκτικούς θυρεοειδούς καρκινική κυτταρική σειρά.

Α, DCFH-DA φθορισμός χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί ROS με κυτταρομετρία ροής στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα κατεργασμένα με PXD101 για 16 ώρες . Αυξανόμενες δόσεις του PXD101 παρήγαγε περισσότερο ROS σε WRO82-1 και 8505C, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε BHP7-13. Β, δύο κυτταρικές γραμμές αντιπροσωπεύουν την ικανότητα του PXD101 να συσσωρεύονται ROS. C, ανοσοκηλιδώσεως εμφανίζει PXD101 καταστέλλεται ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ρ-ΑΚΤ (Ser473), ρ-4E-BP1 (Thr37 /46) και ριβοσωμική πρωτεΐνη ρ-S6 (Ser235 /236) σε 8505C. Οι ανασταλτικές επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν όταν χαμηλή δόση PXD101 (0,625 μmol /L) που εφαρμόζεται στο BHP7-13 και WRO82-1. D, αυξανόμενες δόσεις PXD101 αυξημένη αποικοδόμηση των Κιι70, KU80 και RAD51, και αυξημένη έκφραση του ρ-Η2ΑΧ (Ser139), RAD52 και ERCC1 σε BHP7-13, WRO82-1 και 8505C.

Η

Modulation των πρωτεϊνών που σχετίζονται με RAS /RAF /ERK και PI3K /AKT /mTOR οδών σηματοδότησης από PXD101

RAS /RAF /ERK και PI3K /AKT /mTOR μεταγωγής σηματοδότησης είναι σημαντικά για την ανάπτυξη και την επιβίωση του καρκίνου του θυρεοειδούς (4 ). Μια προηγούμενη έκθεση δείχνει ότι ένας αναστολέας HDAC μπορεί να αναστείλει αυτές τις οδούς σε κύτταρα λευχαιμίας [23]. Ερευνήσαμε τις επιδράσεις της PXD101 σε αυτά τα μονοπάτια σε BHP7-13, WRO82-1 και 8505C (Σχήμα 3C). PXD101 κατασταλεί σταθερά ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ρ-ΑΚΤ (Ser473), ρ-4E-BP1 (Thr37 /46) και ριβοσωμική πρωτεΐνη ρ-S6 (Ser235 /236) σε 8505C, η οποία είναι η ευαίσθητη κύτταρο γραμμή. PXD101 είχε ελάχιστες επιπτώσεις στο π-ΑΚΤ στην BHP7-13 και WRO82-1. Απροσδόκητα, χαμηλή PXD101 δόση (0.625 μmmol /L) ενεργοποιείται ρ-ERK1 /2 και ριβοσωμική πρωτεΐνη ρ-S6 σε BHP7-13 και WRO82-1. p-4E-BP1 ήταν επίσης αυξημένη σε WRO82-1. Ως εκ τούτου, PXD101 αναστέλλει RAS /RAF /ERK και PI3K /AKT /mTOR καταρράκτες σηματοδότησης σε έναν ευαίσθητο γραμμή κυττάρων.

Επιδράσεις της PXD101 για βλάβες στο DNA και επισκευή

Οι αναστολείς HDAC είναι σε θέση να προωθήσουν διπλό -stranded διαλείμματα του DNA (DSBs) και οδηγούν σε απόπτωση [24,25]. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί να συμβάλλει στην κυτταροτοξικότητα του PXD101 στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Αξιολογήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση σε κύτταρα επεξεργασμένα με PXD101 για 48 ώρες (Σχήμα 3D). ρ-Η2ΑΧ (Ser139), ένας δείκτης παραδοσιακό DSBs ήταν σημαντικά αυξημένη με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε όλες τις κυτταρικές σειρές, υποστηρίζοντας PXD101 μπορεί να προκαλέσει DSBs στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Πριν εκθέσεων δείχνει αναστολείς HDAC μπορούν να καταστείλουν τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του DNA που συμβάλλει στην DSBs [24-26]. Μελετήσαμε τη δυνατότητα αυτή και βρέθηκε PXD101 μειώθηκε σημαντικά μη-ομόλογο τέλος ενώνει (NHEJ) πρωτεΐνης επιδιόρθωσης του DNA Ku70 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Ένα άλλο KU80 πρωτεΐνη NHEJ επίσης καταστέλλεται σε κάποιο βαθμό. Υποβάθμιση της είτε Ku70 ή KU80 μπορεί να οδηγήσει σε βλάβη της επισκευής NHEJ. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) Επισκευή είναι ένα άλλο σημαντικό μονοπάτι ϋδΒδ επισκευής. Προχωρήσαμε να μελετήσει την έκφραση μιας πρωτεΐνης περιστροφική επισκευή HR RAD51 και RAD51 βρέθηκε ήταν κυρίως καταστέλλεται από PXD101 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι PXD101 μπορεί να αναστείλει την επισκευή ΥΕ. Όταν το κεντρικό μηχανήματα ϋδΒδ επισκευής ΝΗΕΙ και HR τέθηκε σε κίνδυνο, η ανόπτηση μονή έλικα του DNA (SSA) οδός μπορεί να είναι ένας εναλλακτικός μηχανισμός για την επισκευή DSBs [27]. Η δυνατότητα αυτή εξετάστηκε σε αυτή τη μελέτη, καθώς και οι πρωτεΐνες SSA RAD52 και ERCC1 αυξάνεται με την έκθεση σε έκθεση PXD101 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D).

Αλληλεπίδραση PXD101 και χημειοθεραπεία σε κύτταρα ATC

Η επίδραση του συνδυασμού PXD101 με διαφορετικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες εναντίον κυττάρων ATC αξιολογήθηκε. Τρεις κλινικές σχετικές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη και ντοσεταξέλη) χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη [28]. Το DM αυτών των παραγόντων σε κάθε κυτταρική σειρά ATC είχε αναφερθεί στο παρελθόν [29]. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ PXD101 και δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη και δοκεταξέλη αξιολογήθηκαν. Ο συνδυασμός των PXD101 και κάθε χημειοθεραπευτικό παράγοντα αποδειχθεί ευνοϊκό θεραπευτικό αποτέλεσμα σε όλες τις γραμμές του καρκίνου ATC (Σχήμα S1).

Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ PXD101 και χημειοθεραπευτικών παραγόντων εκτιμήθηκαν με υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) από την εξίσωση Chou-Talalay ( Εικόνα 4Α), όπου CI & lt? 1 δείχνει συνέργεια, CI = 1 δείχνει μια εθιστική δράση, και CI & gt? 1 δείχνει ανταγωνισμό [30,31]. Συνεργιστικά αποτελέσματα αναγνωρίστηκαν για το συνδυασμό των PXD101 με doxorubicin και PXD101 με πακλιταξέλη σε όλες τις γραμμές ATC (CI? 8305C = 0,52 – 0,98 και 0,68 – 0,91, 8505C = 0,32 – 0,39 και 0,03 – 0,58, KAT18 = 0,61-0,76 και 0.18- 0,94, 0,51 – 0,69 KAT4C = 0,68 έως 0,71 και, αντίστοιχα). Ο συνδυασμός των PXD101 με docetaxel ήταν συνεργιστική σε 8305C, 8505C και KAT4C (CI? 8305C = 0,83 – 0,84, 8505C = 0,04 – 0,42, KAT4C = 0,42 – 0,76). Ο συνδυασμός των PXD101 με docetaxel κυμαίνονταν από συνεργιστική σε ανταγωνιστή σε KAT18 (CI? 0,1 έως 1,2). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός του PXD101 με δοξορουβικίνη και πακλιταξέλη έχει συνεργιστικές επιδράσεις έναντι όλων των γραμμών ATC, και ο συνδυασμός του με PXD101 docetaxel είναι συνεργιστική σε τρεις από τις τέσσερις γραμμές. Υπολογίσαμε το δείκτη μείωση της δόσης (DRI) του κάθε χημειοθεραπευτικού παράγοντα? ο DRI υποδεικνύει την πτυχή της μείωσης της δόσης φαρμάκου παρουσία του PXD101 (Σχήμα 4Β). Σύμφωνα με την έκθεση σε PXD101, οι δόσεις της δοξορουβικίνης, paclitaxel και docetaxel μπορεί να μειωθεί (όλα DRI & gt? 1,0).

Α, CI του PXD101 με κάθε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό CompuSyn για κάθε κυτταρική σειρά ATC. PXD101 συν δοξορουβικίνη και πακλιταξέλη επέδειξε συνεργική δράση σε όλες τις κυτταρικές σειρές, με CI & lt? 0.8 σε περισσότερες συνθήκες. PXD101 συν docetaxel ήταν συνεργιστική σε 8305C, 8505C και KAT4C, και συνεργιστική να ανταγωνιστική στην KAT18. Οι οριζόντιες διακεκομμένες γραμμές στο CI = 1 σύρθηκαν. Β, οι τυπικές περιοχές τιμών DRI για χημειοθεραπεία σε συνδυασμό με PXD101. Με την παρουσία του PXD101, δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη και ντοσεταξέλη όλα είχαν ευνοϊκή DRI. Το χαμηλότερο DRI της δοξορουβικίνης, πακλιταξέλη και ντοσεταξέλη όλα εμφανίστηκε σε KAT18 (1.8, 1.5 και 1.6, αντίστοιχα). Οι οριζόντιες διακεκομμένες γραμμές στο DRI = 1 σύρθηκαν.

Η

θεραπεία PXD101 όγκων πλευρό του ποντικού

Τα θεραπευτικά αποτελέσματα και την ασφάλεια των PXD101

in vivo

αξιολογήθηκαν σε αθυμικά γυμνά ποντίκια που έφεραν 8505C πλευρό ATC και ξενομοσχευμάτων ΤΤ. Ποντικοί με καθιερωμένους όγκους πλευρό υποβλήθηκαν σε αγωγή με ενδοπεριτοναϊκή PXD101 (40 mg /kg) ή φορέα ημερησίως για 5 δόσεις ανά εβδομάδα μέχρι 14 ημέρες (Σχήμα 5Α). PXD101 σημαντικά κατασταλεί η ανάπτυξη του όγκου 8505C σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου την ημέρα 7 (1,7 ± 0,1-φορές και 3,4 ± 0,5-φορές, Ρ = 0,004) και την ημέρα 14 (3.6 ± 0.3 φορές και 6.6 ± 1.0 φορές, Ρ = 0,014). PXD101 δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις για την αλλαγή του σωματικού βάρους κατά τη διάρκεια της περιόδου της μελέτης (Εικόνα 5Β). Εμείς δεν τήρησε καμία νοσηρότητα σε αυτά τα ζώα.

Ένα, καθημερινή ενδοπεριτοναϊκή ένεση PXD101 για 5 ημέρες την εβδομάδα κατασταλεί η ανάπτυξη του όγκου 8505C. Οι διαφορές της αύξησης του όγκου του όγκου μεταξύ PXD101 και την ομάδα ελέγχου πέτυχε στατιστική σημαντικότητα τις ημέρες 7 και 14. Β, PXD101 δεν προκάλεσε σημαντική απώλεια βάρους σε ποντικούς (Ρ & gt? 0,05). C, μέσα σε 3 ώρες, PXD101 αυξημένη φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ και ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4, και καταστέλλεται ρ-ΑΚΤ, RAD51, κασπάσης-3 και PCNA. Οι μεταβολές αυτών των πρωτεϊνών μειώνονται από 6-16 ώρες.

Η

Οι πρωτεΐνες που μπορούν να επηρεαστούν από PXD101 αξιολογήθηκαν σε αυτούς τους όγκους των ζώων (Σχήμα 5C). Μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή ένεση PXD101 (40 mg /kg) αύξησε ρ-Η2ΑΧ (Ser139) και ακετυλίωση ιστόνης Η3 και Η4 από 3 ώρες και τα αποτελέσματα μειώθηκαν κατά 6 ώρες. RAD51 καταστάλθηκε από 3 ώρες και επανεμφανίστηκαν σε 6 έως 24 ώρες (Σχήμα 5C, Εικόνα S2). ρ-ΑΚΤ (Ser473) βαθμιαία καταστέλλεται στους 3 και 6 ώρας και αυτή η ανασταλτική επίδραση απουσιάζει από 16 ώρες. Το πυρηνικό αντιγόνο δείκτης πολλαπλασιασμού πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) μειώθηκε ελαφρά από 3 έως 6 ώρες. PXD101 αποικοδομείται σημαντικά κασπάσης-3 σε 3 έως 6 ώρες. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι PXD101 είχε ισχυρές αλλά παροδικές επιδράσεις σε ξενομοσχεύματα ATC, και δείχνουν ότι η πιο συχνή χορήγηση της PXD101 μπορεί να ενισχύσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα.

Συζήτηση

PXD101 αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυτταρικών σειρών οκτώ θυρεοειδούς που προέρχεται από τέσσερις μεγάλες ιστολογικών τύπων. Μεταξύ επτά σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς, ATC ήταν πιο ευαίσθητη από θυλακιώδη και καλά διαφοροποιημένα καρκίνων. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ATC εξαρτάται πιθανόν σε HDACs περισσότερο από τους άλλους τύπους καρκίνου. ΤΤ έχει επίσης ένα χαμηλό Dm, υπονοώντας HDACs είναι σημαντικές για καρκίνο του θυρεοειδούς παραθυλακοκύτταρα κύτταρα. PXD101 αναστέλλει ένα ευρύ φάσμα των HDAC, συμπεριλαμβανομένων κατηγορίας Ι, ΙΙα και ΙΙβ που αποτρέπει να συνάψει η οποία HDAC είναι πιο σημαντικό για την επιβίωση των καρκίνων του θυρεοειδούς.

Ένα θεραπευτικό μηχανισμό των αναστολέων HDAC στη θεραπεία κακοήθειας είναι μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. PXD101 προκάλεσε αποπτωτικά αποτελέσματα σε μια δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο με BHP7-13, WRO82-1 και 8505C, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός αυτός αντιπροσωπεύει θεραπευτική αποτελεσματικότητα των PXD101.

Πριν εκθέσεις δείχνουν αναστολείς HDAC τη μείωση της δραστηριότητας θειορεδοξίνη, συσσωρεύονται ROS και να οδηγήσει σε απόπτωση σε μετασχηματισμένα κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα [6,32]. Ως εκ τούτου, ROS συσσώρευση σε κακοήθη κύτταρα μπορεί να είναι ένας μηχανισμός του καρκίνου ειδικότητας κυτταροτοξικότητα των αναστολέων HDAC. Σε αυτή τη μελέτη, PXD101 συσσωρευτεί ROS σε ένα εξαρτώμενο από την δόση τρόπο σε WRO82-1 και 8505C, αλλά όχι στην ανθεκτική κυτταρική γραμμή BHP7-13. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με αυτόν τον μηχανισμό της ευαισθησίας σε αναστολείς HDAC.

RAS /RAF /ERK και PI3K /AKT /mTOR σηματοδότηση μονοπατιών είναι σημαντικές στην ογκογένεση του καρκίνου του θυρεοειδούς, την εξέλιξη και την επιβίωση [4,33]. Η διακοπή αυτών των οδών σηματοδότησης είναι μια στρατηγική για την αντιμετώπιση του θυρεοειδούς κακοήθειας [29,34]. Σε αυτή τη μελέτη, PXD101 ανέστειλε αυτές τις οδούς στην ευαίσθητη κυτταρική γραμμή 8505C, αλλά όχι σε WRO82-1 και BHP7-13. Τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ικανότητα της PXD101 να αναστέλλει RAS /RAF /ERK και PI3K /AKT /mTOR οδοί μπορεί να προσδώσει ευαισθησία.

p-H2AX είναι ένα κλασικό δείκτη της ϋδΒδ, ένα σοβαρό είδος της βλάβης του DNA [35 ]. PXD101 επάγεται σημαντικά ρ-Η2ΑΧ σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς τρία, υποστηρίζοντας DSBs ως ένας μηχανισμός που αντιπροσωπεύουν το κυτταροτοξικότητα PXD101. Δείχνουμε ότι PXD101 μειώνει πρωτεΐνες επισκευής DSBs στο ΝΗΕΙ (Ku70 και KU80) και HR (RAD51) μονοπάτια. Για NHEJ, το ετεροδιμερές Ku70-KU80 αναγνωρίζει ϋδΒδ, και προσλαμβάνει ένα σύνθετο πρωτεϊνική κινάση DNA. Η μειωμένη έκφραση του Ku70 ή KU80 μπορεί να βλάψει την οδό επιδιόρθωσης ΝΗΕΙ [27,36]. Για ΥΕ, RAD51 δεσμεύεται με την εκτομή τέλος του μονόκλωνου DNA (RAD51-ssDNA νουκλεοπρωτεΐνη νήμα), επιτρέποντας για σύνθεση εξαρτώμενη από ανόπτηση σκέλος για την DSB επισκευάσει [37]. Μια ανάλυση της έκτασης της συμβολής των επιμέρους πρωτεϊνών HR για την επιδιόρθωση του DNA και διαπίστωσε ότι η εξάντληση των RAD51 προκαλεί την πιο σημαντική HR ελάττωμα [37,38]. Η οδός SSA είναι ένας εναλλακτικός μηχανισμός για ϋδΒδ επισκευή όταν ΝΗΕΙ και ΥΕ είναι ελαττωματικά [27,39]. PXD101 αυξημένη RAD52 και ERCC1, γεγονός που υποδηλώνει η οδός SSA ενεργοποιήθηκε. Ωστόσο, όταν το ρ-Η2ΑΧ είναι αυξημένη, η ενεργοποίηση του SSA φαίνεται ανεπαρκής να DSBs επισκευή [40]. Εκτός από PXD101, άλλοι αναστολείς HDAC είναι σε θέση να καταστείλει τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DSB [41-43]. Μερικά HDACs είναι υπεύθυνα για την επιδιόρθωση του DNA? HDAC1 και 2 προώθηση ΝΗΕΙ, και HDAC 9 και 10 απαιτούνται για HR [44,45].

θεραπεία PXD101 σημαντικά καταπιεσμένη ανάπτυξη 8505C όγκου κατά τη διάρκεια της περιόδου της μελέτης. PXD101 αυξήθηκε παροδικά ακετυλίωση της ιστόνης Η4 που είναι συνεπής με την προηγούμενη έκθεση [17]. Αύξηση του p-H2AX προτείνει PXD101 που προκαλείται DSBs σε ξενομοσχεύματα 8505C. Η επίδραση κατά των όγκων των PXD101 μπορεί να είναι μέσω απόπτωσης και αναστολή του πολλαπλασιασμού αφού κασπάσης-3 και PCNA μειώθηκαν. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική απώλεια βάρους ή τοξικότητα που παρατηρήθηκε σε αυτήν την μελέτη, υποδεικνύοντας ένα ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας. Εξετάσαμε επίσης τα θεραπευτικά αποτελέσματα των PXD101 σε ποντικούς που φέρουν ΤΤ όγκους. Ημερήσια ενδοπεριτοναϊκή ένεση PXD101 (40 mg /kg) για 5 δόσεις ανά εβδομάδα απέτυχε να καταστείλει την ανάπτυξη ΤΤ ξενομοσχευμάτων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι πιθανό ότι μια πιο εντατική θεραπευτική αγωγή PXD101 μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του ΤΤ ξενομοσχεύματα.

ATC είναι ο πιο επιθετικός καρκίνος του θυρεοειδούς και είναι τυπικά μοιραία, με ένα ποσοστό επιβίωσης 1-χρόνου από μόλις 20% [28] . Οι νέες θεραπείες που απαιτούνται για να βελτιωθεί η μελαγχολική αποτελέσματα. Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός των PXD101 με doxorubicin και PXD101 με paclitaxel είχε συνεργική δράση κατά τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC. Πριν έκθεση παρουσιάζει ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων εμφανίζεται ακόμη και σε μια ενιαία όγκου [46]. Ως εκ τούτου, η θεραπευτική αγωγή σε συνδυασμό με συνεργική δράση κατά πολλαπλές κυτταρικές σειρές ATC που έχουν ποικίλη γενετικό υπόβαθρο μπορεί να είναι κλινικής σημασίας. Η δοξορουβικίνη αναστέλλει την τοποϊσομεράση II και προκαλεί σπασίματα στο γονιδιακό DNA [47]. PXD101 ανέστειλε δίκλωνο μηχανήματα επιδιόρθωσης του DNA που μπορεί να ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα της δοξορουβικίνης. Η πακλιταξέλη έχει δείξει ένα ποσοστό ανταπόκρισης 53% κατά ATC σε μια δοκιμή φάσης ΙΙ [48]. Οι ευνοϊκές επιδράσεις συνδυασμό PXD101 με αντάλλαγμα την υποστήριξη πακλιταξέλη της χρήσης αυτής της θεραπείας σε ασθενείς με ATC.

Πρόσφατα, Chan et al. Αναφέρεται επίσης ότι PXD101 επιβραδύνει την ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος PTC [49]. Ως εκ τούτου, PXD101 έχει την ικανότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη τόσο καλά διαφοροποιημένο και αδιαφοροποίητο καρκίνου του θυρεοειδούς

in vivo

. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πιθανότητα ότι PXD101 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία ασθενών με αυτό το θανατηφόρο ασθένεια. Σε αντίθεση με τα ευρήματά μας, PXD101 καταστέλλονται με συνέπεια ρ-ΑΚΤ (Ser473) και ρ-ΕΚΚ στην προηγούμενη μελέτη. Μια πιθανή εξήγηση αυτής της ασυνέπειας μεταξύ των δύο μελετών είναι η πολύ υψηλή δόση PXD101 (≥ 20 φορές) που εφαρμόστηκε στην προηγούμενη μελέτη, σε σύγκριση με την τρέχουσα μελέτη μας. Τέτοιες υψηλές δόσεις PXD101 είναι πιο πιθανό να καταστέλλει ρ-ΑΚΤ και π-ERK. Η μελέτη μας δείχνει επιπλέον ότι οι πολλαπλές μοριακών γεγονότων που προκαλείται από PXD101 μπορεί να προκαλέσει κυτταροτοξικότητα, και δείχνει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού χρησιμοποιώντας PXD101 με συμβατική χημειοθεραπεία που χρησιμοποιούνται σήμερα για αναπλαστικό καρκίνο του θυρεοειδούς. Είναι σημαντικό, έχουμε αποδείξει συνεργιστικά αποτελέσματα του συνδυασμού PXD101 με δοξορουβικίνη και πακλιταξέλη, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή κλινική σημασία στη θεραπεία ασθενών με ATC.

Εν κατακλείδι, PXD101 επέβαλε σημαντική κυτταροτοξικότητα σε τέσσερις μεγάλες ιστολογικές μορφές του καρκίνου του θυρεοειδούς. Γυμνοί ποντικοί που φέρουν όγκους ξενομοσχεύματος 8505C καταδείξει τα θεραπευτικά προφίλ αποτελεσματικότητας και ασφάλειας της PXD101. Σημαντικά, PXD101 βελτιώνει συνεργιστικά την θεραπευτική δράση της δοξορουβικίνης και της πακλιταξέλης έναντι τεσσάρων κυτταρικών σειρών ATC. Αυτά τα ευνοϊκά στοιχεία για την υποστήριξη του σχεδιασμού των μελλοντικών κλινικών δοκιμών μελέτη της χρησιμότητας του PXD101 ως παράγοντας για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Οκτώ καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς μελετήθηκαν, συμπεριλαμβανομένης μιας θηλώδες (BHP7-13), ένα ωοθυλακίων (WRO82-1), θυλακιώδες αδιαφοροποίητο (FRO81-2), τέσσερις αναπλαστικό (8305C, 8505C, KAT18, KAT4C) και ένα μυελοειδές (ΤΤ) ανθρώπινου καρκίνου του θυρεοειδούς [29,50-52]. Όλες οι κυτταρικές σειρές εκτός KAT4C είχαν πιστοποιηθεί χρησιμοποιώντας DNA (σύντομη διαδοχικές επαναλήψεις) προφίλ και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο πριν από τη χρήση [29,53]. BHP7-13, WRO82-1, FR081-2, KAT4C και KAT18 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με όξινο ανθρακικό νάτριο (2.0 g /L). 8505C και 8305C διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ με πυροσταφυλικό νάτριο (1 mmol /L) και όξινο ανθρακικό νάτριο (2,2 g /L). ΤΤ διατηρήθηκε σε Ρ12Κ. Όλα τα μέσα περιείχαν 10% FCS, 100.000 μονάδες /L πενικιλλίνη και 100 mg /L στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C.

Φαρμακευτικοί παράγοντες

PXD101 είναι ένα παν-HDAC αναστολέα που περιγράφηκε προηγουμένως [17], και ελήφθη από Σέλεκ Chemicals. PXD101 διαλύθηκε σε DMSO (10 mmol /L για το

in vitro

και 100 mg /ml για

in vivo μελέτες

? Sigma) και αποθηκεύεται στους -30 ° C μέχρι πειράματα. Για

in vivo μελέτες

, PXD101 αραιώθηκε περαιτέρω με PBS σε μια τελική συγκέντρωση των 8.6 mg /ml. Η δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη και ντοσεταξέλη ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co. δοξορουβικίνη (5 mmol /L) διαλύθηκε σε PBS, πακλιταξέλη (320 μmol /L) και docetaxel (640 μmol /L) διαλύθηκαν σε DMSO και αποθηκεύεται στους -30 ° C μέχρι τη χρήση.

Αντισώματα

Τα αντισώματα που στοχεύουν ακετυλο. ιστονών Η3 και Η4 ιστόνης ήταν από EMD Millipore. Ακετύλιο. τουμπουλίνης και α-τουμπουλίνης αντισώματα ήταν από τη Sigma. Caspase-3, ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ρ-ΑΚΤ (Ser473), ρ-4E-BP1 (Thr37 /46), ρ-S6 ριβοσωμικής πρωτεΐνης (Ser235 /236), ρ-Η2ΑΧ (Ser139) , Ku70, KU80, RAD52, ERCC1 και PCNA αντισώματα ήταν από την Cell Signaling. αντίσωμα RAD51 ήταν από την Invitrogen.

δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 2 χ 10

3 έως 2 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24-φρεατίων σε 1 κ.εκ. μεσα ΜΑΖΙΚΗΣ ενημέρωσης. Μετά από ολονύκτια επώαση, PXD101 ή όχημα προστέθηκαν στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση. Έξι σειριακό 1: 1 αραιώσεις PXD101 είχαν δοκιμαστεί ξεκινούν από 10 μmol /L σε μια πορεία της θεραπείας 4 ημερών. Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε την ημέρα 4. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με Triton Χ-100 (1,35%, Sigma) για την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), η οποία προσδιορίστηκε ποσοτικά με ένα κιτ Cytotox 96 (Progmega) στα 490 nm με φασματοφωτομετρία (BT-MQX200R, Bio-Tek Instruments). Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως το ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν προσδιορίζεται με σύγκριση της LDH κάθε δείγμα σε σχέση με τον έλεγχο δειγμάτων που θεωρούνται 100% βιώσιμα. Dm την ημέρα 4 υπολογίστηκαν για κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας λογισμικό CompuSyn [30,31].

Για τα πειράματα της θεραπείας συνδυασμού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ATC με PXD101 και ένα χημειοθεραπευτικό φάρμακο (δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη ή ντοσεταξέλη) σε σταθερή δόσης αναλογία. Τα κύτταρα επωάστηκαν με όχημα, PXD101, χημειοθεραπευτικό παράγοντα, ή και τα δύο ταυτόχρονα για μια πορεία 4 ημερών και κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε. Έξι έως επτά σειριακές 1: 1 αραιώσεις εξετάστηκαν στις ακόλουθες αρχικές δόσεις για 8305C, 8505C, KAT18 και KAT4C: PXD101 σε 2,4, 3,6, 3,6 και 4,4 μmol /L, δοξορουβικίνη σε 0,64, 0,16, 0,22, 0,27 μmol /L, paclitaxel στα 50,8, 22,4, 17,6 και 13,2 nmol /L, docetaxel σε 34,4, 6,8, 5,2 και 7,6 nmol /L, αντίστοιχα. Οι δόσεις που επιλέχθηκαν με βάση το DM καθορίζεται σε αυτό και προηγούμενες μελέτες [29].

Δυτική κηλίδες

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 x 10

6 κύτταρα σε 10-cm τρυβλία Petri σε 10 ml μέσου επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PXD101 ή όχημα για 48 ώρες. Τα κυτταρικά ιζήματα διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα προσδιορισμού ραδιο-ανοσοκαταβύθιση και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, στροβιλίζεται και διαυγάζεται με φυγοκέντρηση. Η συνολική πρωτεΐνη (20-50 μα) ηλεκτροφορήθηκε σε 10-12% Τπδ-ΗΟΙ πηκτές, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου, μπλοκάρει, και εκτέθηκαν σε πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Σήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας μια βελτιωμένη κιτ χημειοφωταύγειας (Bionovas Biotechnology). α-τουμπουλίνης χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης.

Απόπτωση και ROS εκτίμηση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων σε 2 ml μέσου επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με εικονικό φάρμακο ή PXD101 στην υποδεικνυόμενη δόσεις για 48 και 72 ώρες. Επιπλέοντα κύτταρα και επεξεργασία με θρυψίνη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή αιθανόλη 70% και επωάστηκαν με RNase Α (100 μg /mL? Sigma) και ιωδιούχο προπίδιο (5 μg /mL? Sigma) στους 37 ° C για 15 λεπτά . Τα αποπτωτικά κύτταρα υπο-G1 ανιχνεύθηκαν με περιεκτικότητα ϋΝΑ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (BD κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur, Βϋ Biosciences).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων σε 2 mL μέσων για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με εικονικό φάρμακο ή PXD101 στην υποδεικνυόμενη δόσεις για 16 ώρες. Θρυψίνη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με 10 mmol /L DCFH-DA (Sigma) στους 37 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά.