σε διάφορους καρκίνους αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς εκτός από κύτταρα του βλαστικής σειράς. Παρά το γεγονός ότι το DNA απομεθυλίωση προαγωγού-εγγύς CpGs του CT γονιδίων συνδέεται με την έκφρασή τους στον καρκίνο, οι μηχανισμοί που οδηγούν στην απομεθυλίωση είναι άγνωστες. Για τη διαλεύκανση των μηχανισμών αυτών που επιλέξαμε να μελετήσουμε την κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου Caco-2 κατά τη διάρκεια της αυθόρμητης διαφοροποίησης του

in vitro

, όπως βρήκαμε CT γονίδια, ιδίως

ΣΕΛ2, 2Β

και

Spanx-Β

, να ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας. Διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων οδήγησε σε μεσεγχυματικά-to-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ) όπως αποδεικνύεται από την αύξηση των επιθηλιακών δεικτών CDX2, κλαουδίνης-4 και Ε-καδερίνης, και κατά συνέπεια απώλεια δεικτών μεσεγχυματικών βιμεντίνης, ινωδονεκτίνη 1 και Transgelin. PAGE2 και SPAN-X πάνω ρύθμιση συνοδεύτηκε από αύξηση της Ten-έντεκα μετατόπιση-2 (TET2) έκφραση και κυτοσίνη 5-υδροξυμεθυλίωση καθώς και την αποσύνδεση των πρωτεϊνών ετεροχρωματίνη 1 και το Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 πρωτεΐνη ΕΖΗ2 από προαγωγού-εγγύς περιοχές αυτών των γονιδίων. Αντιστροφή της διαφοροποίησης οδήγησε σε ρύθμιση προς τα κάτω των

ΣΕΛ2, 2Β

και

Spanx-Β

, και επαγωγή των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) δείκτες, γεγονός που αποδεικνύει τη δυναμική φύση της CT γονιδιακή ρύθμιση σε αυτό το μοντέλο

Παράθεση:. Yilmaz-Ozcan S, Sade Α, Β Kucukkaraduman, Kaygusuz Υ, Senses KM, Banerjee S, et al. (2014) Επιγενετική μηχανισμών που διέπουν τη δυναμική έκφραση του Καρκίνου-Όρχεων γονίδια,

ΣΕΛ2

,

2Β

και

Spanx-Β

, κατά τη διάρκεια της μεσεγχυματικά-to-Επιθηλιακός μετάβαση. PLoS ONE 9 (9): e107905. doi: 10.1371 /journal.pone.0107905

Επιμέλεια: Keping Xie, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 17, 2014? Αποδεκτές: 22, Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 17, Σεπτέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Yilmaz-Ozcan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από nr επιχορήγησης. 112S023 από το The Επιστημονικής και Τεχνολογικής Έρευνας του Συμβουλίου της Τουρκίας (TUBITAK) σε ΑτΕ, ένα Νέων Ερευνητών βραβείο από την Ακαδημία Επιστημών της Τουρκίας στην SB, και από TUBITAK-BIDEP υποτροφίες σε υλικό σύο στρωμάτων και ΒΚ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος-όρχεων (CT) ή καρκίνο βλαστικής σειράς γονιδίων εκφράζονται σε όγκους που προέρχονται από διάφορους ιστούς, καθώς επίσης και σε φυσιολογικά βλαστικής σειράς και τροφοβλάστης κύτταρα, αλλά είναι γενικά σιωπηλή σε άλλους φυσιολογικούς ιστούς του ενήλικου [1] – [3]. Περισσότερα από 100 διαφορετικά γονίδια CT μπορούν να ομαδοποιηθούν σύμφωνα με την ομολογία σε οικογένειες [2]. Παρά την έλλειψη ομοιότητας αλληλουχίας μεταξύ CT γονίδια από διαφορετικές οικογένειες, επανέκφραση όλων των γονιδίων CT σε όγκους έχει συσχετιστεί με απομεθυλίωση υπολειμμάτων CpG εντός περιοχές προαγωγέα-εγγύς τους [4]. Αυτή η κοινή μηχανισμός ρύθμισης έκφρασης είναι πιθανότατα η αιτία για τους συντεταγμένη έκφραση στον καρκίνο [5] – [7]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο το DNA απομεθυλίωση εμφανίζεται σε γονίδιο περιοχές προαγωγέα-εγγύς CT σε καρκίνους είναι άγνωστη. CT γονίδια δείχνουν ως επί το πλείστον ένα ετερογενές πρότυπο έκφρασης σε όγκους [8] – [10]? σε αντίθεση με την έκφρασή τους σε όρχεις, το οποίο οριοθετείται και ομαλή [11]. Μια μελέτη στην οποία πηγάζουν-όπως και μη βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με καρκίνο του μαστού είχαν επιλεκτικά σκοτώθηκαν, αποκάλυψε ότι η έκφραση του γονιδίου CT είναι γενικά ένα χαρακτηριστικό του πιο διαφοροποιημένα, μη-βλαστικών κυττάρων [12]. Ομοίως, το μελάνωμα, μια υποομάδα των κυττάρων με περισσότερα επιθηλιακά χαρακτηριστικά εκφράζουν CT γονίδια, όταν τα κύτταρα με χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά δεν [13] κάνει. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα του μελανώματος μπορεί να εναλλαγή μεταξύ αυτών των δύο τάξεων

in vivo

, υποδηλώνοντας ότι η ετερογένεια του όγκου, όπως ορίζεται από την έκφραση του γονιδίου CT, μπορεί να αποτελέσει μια μεταβατική φάση παρόμοια με την εναλλαγή μεταξύ επιθηλιακών και μεσεγχυματικών φαινοτύπων. Πράγματι, μεσεγχυματικά-to-επιθηλιακά μετάβασης (ΜΕΤ) σχετίζεται με την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου CT [14]. Να καθορίσει μηχανισμούς που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης CT στον καρκίνο και κατά τη διάρκεια της ΚΟΑ, επιλέξαμε να μελετήσουμε την αυθόρμητη μοντέλο διαφοροποίησης Caco-2, το οποίο δείχνει χαρακτηριστικά της ΚΟΑ και EMT κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης και de-διαφοροποίηση, αντίστοιχα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η δυναμική ρύθμιση των δύο CT γονίδια,

ΑΡΧΙΚΗ

και

Spanx-Β

σε αυτό το μοντέλο του συστήματος, περιλαμβάνει μεταβολές των Polycomb κατασταλτικά συγκρότημα 2 (PRC2) και της πρωτεΐνης ετεροχρωματίνη 1 ( Θ1) πληρότητας εντός των περιοχών προαγωγού-εγγύς τους, με σύμφωνη αλλαγές στο ΤΕΤ έκφρασης και κυτοσίνη υδροξυμεθυλίωση (επίπεδα HMC).

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, επαγωγή της διαφοροποίησης και της απο-διαφοροποίηση

Η κυτταρική σειρά Caco-2 λήφθηκε από την SAP Enstitusu (Άγκυρα, Τουρκία). HCT116 (ορθοκολικό) και Mahlavu (ηπατοκυτταρικό) κυτταρικές γραμμές καρκίνου ελήφθησαν από LGC Πρότυπα, Middlesex, UK. Ο καρκίνος του πνεύμονα γραμμή (SK-LC-17) ήταν από το Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ. κύτταρα Caco-2 αναπτύχθηκαν σε ΕΜΕΜ και άλλοι σε RPMI, συμπληρωμένο με 20% FBS, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 0,1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα, 1,5 g /L διττανθρακικό νάτριο και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο. Όλα τα μέσα καλλιέργειας κυττάρων και τα συμπληρώματα αγοράστηκαν από Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία. Οι πρώτες ημέρες τα κύτταρα έφθασαν σε συρροή ορίστηκε ημέρα 0. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε παράλληλες καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό φαινοτυπικές αλλαγές στις ημέρες 0, 5, 10, 20 και 30, μετα-συρροή. Επιπρόσθετες μέτρα διαφοροποίησης για κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έχουν αναφερθεί αλλού [15]. Για την πρόκληση αποδιαφοροποίηση, τα κύτταρα κατά τη 20η ημέρα της διαφοροποίησης αποσπάστηκαν και απλώνονται εκ νέου σε περίπου 50% συρροή και RNA και πρωτεΐνης συλλέχθηκαν 5 ημέρες μετά από επαναφόρτωση.

Στο silico

ανάλυση των CT και EMT έκφραση

Τα δεδομένα έκφρασης γονιδίων που περιέχονται μέσα GSE1614 [16] ήταν GC-RMA ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GeneSpring v. 11.0. έκφραση του γονιδίου CT αναλύθηκε με βάση 31 probesets στη αντιστοιχεί σε 23 CT γονίδια από 7 οικογένειες (Εικόνα S2). Μια ερμηνεία δημιουργήθηκε με μια λίστα οντότητα που αποτελείται από σχετίζεται EMT γονιδίων όπως ορίζεται από Loboda et al. [17], σε τρία διαφορετικά χρονικά σημεία. Γονίδια για την επικύρωση επελέγησαν μεταξύ εκείνων για τις οποίες σημαντικές διαφορές της έκφρασης (ρ & lt? 0,05) παρατηρήθηκε με έναν τρόπο δοκιμή ANOVA και διόρθωση Bonferroni FWER, όταν πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα σε σύγκριση με αυτές της ημέρας 15.

Ποσοτική RT- PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Ambion, Foster City, CA, USA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝΑση Ι (Ambion, Foster City, CA, USA). 200 ng του RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Επαναφορά βοηθειών κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου cDNA (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA). Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός ΑΒΙ 7500 θερμικό κυκλοποιητή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. TaqMan Gene Expression Δοκιμασίες (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τα εξής: GAPDH (4352934E), Spanx-Β (Hs02387419_gH), PAGE2 και 2Β (Hs03805505_mH), GAGE ​​(Hs00275620_m1), SSX4 (Hs023441531_m1), NY-ESO-1 (Hs00265824_m1), και MAGE-A3 (Hs00366532_m1). SYBR Green κύριο μείγμα με χρωστική αναφοράς ROX (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί

Cdh1, CDX2, CLDN4, VIM, FN1

και

TAGLN

έκφραση (Πίνακας S1) . Οι συνθήκες κύκλων για αυτούς τους προσδιορισμούς ήταν 50 ° C για 2 λεπτά., 95 ° C για 10 λεπτά., που ακολουθείται από 40 κύκλους των 94 ° C για 15 sec., 60-65 ° C για 1 λεπτό. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε με τη μέθοδο ΔΔCt [18]. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

Ανάλυση

Promoter μεθυλίωση

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε με επεξεργασία πρωτεϊνάσης Κ, ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Διθειώδες θεραπεία των 200 ng γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Zymo μεθυλίωσης του DNA Gold Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Διθειώδες τροποποιημένο DNA αποθηκεύτηκε στους -20 ° C και χρησιμοποιήθηκαν για την PCR εντός 2 μηνών. Δύο γύροι ενίσχυσης του DNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μία Taq Hot Start DNA πολυμεράση (New England Bioscience /ΝΕΒ, Ipswich, MA, USA) χρησιμοποιώντας ένα Perkin Elmer 9700 θερμικό κυκλοποιητή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν δίνονται στον Πίνακα S1. PCR προϊόντα γέλη εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πηκτής QIAGEN (Qiagen, Hilden, Germany) και κλωνοποιήθηκε σε pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το πλασμιδιακό DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το ΟΙΑρΓβρ Spin Miniprep κιτ (Qiagen, Hilden, Γερμανία) από τουλάχιστον δέκα κλώνους, και η αλληλουχία αναλύεται από IONTEK (Κωνσταντινούπολη, Τουρκία).

5-υδροξυ ανάλυση κυτοσίνη

Caco-2 γονιδιωματικού DNA (gDNA) διατμήθηκε με διερευνητή υπερήχων (30 sec. επί 30 δευτ. off, 5 κύκλοι) για να ληφθεί 200-600 bp. θραύσματα αξιολογείται από 1% πηκτή αγαρόζης ηλεκτροφορητική ανάλυση. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ hMEDIP (Abcam, Cambridge, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 5 pg του DNA ελέγχου εμβολιάστηκε σε 500 ng gDNA για να χρησιμοποιηθεί ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι του κιτ συμπεριλήφθηκαν σε όλα τα πειράματα. 2 μΙ από εκλουσμένο DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας 2 Χ SYBR Green κύριο μείγμα με χρωστική αναφοράς ROX (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) με τους εκκινητές δίδονται στους Πίνακες S1 και S2. Primer αποδόσεις ελέγχθηκαν. Οι συνθήκες κύκλων ήταν 50 ° C για 2 λεπτά., 95 ° C για 10 λεπτά. που ακολουθείται από 40 κύκλους των 94 ° C για 15 sec., 60 ° C για 1 λεπτό. Κοινό γονιδιωματικό DNA είχε συμπεριληφθεί στην ποσοτική RT-PCR για τον υπολογισμό των εισροών%.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

κύτταρα προσκολλημένα σε υάλινα πλακίδια με φυγοκέντρηση χρησιμοποιώντας το Shandon CytoSpin3 (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) αμέσως σταθεροποιούνται σε 2% φορμαλδεΰδη /PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Σταθερή κύτταρα διαπερατά σε 0.2% Triton Χ-PBS για 10 λεπτά. και ακολούθησε αποκλεισμός με 1% BSA σε 0.1% PBS-Tween για 1 ώρα. Οι επωάσεις με το πρωτογενές αντίσωμα, αραιωμένο σε 1:50, διεξήχθησαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Δευτερογενής αντίσωμα προστέθηκε σε 1:200, μετά από πλύσιμο σε 0.1% PBS-Tween επί 5 λεπτά. για 3 φορές, και επωάστηκαν με κύτταρα για 45 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου (βλέπε πίνακα S3 για την πλήρη λίστα αντίσωμα). Βιτρώ δείγματα τοποθετούνται με μέσο στερέωσης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) περιέχει διάλυμα DAPI. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι ήταν Mahlavu (PAGE-2, 2Β και SPANXB), ΜΟΑ-ΜΒ 231 (VIM), MCF-7 (TAGLN) και SW620 (CDX2, FN1). Οι αρνητικοί έλεγχοι ήταν συνδυασμούς των πρωτογενών αντισωμάτων με δευτερογενή αντισώματα un σχετίζονται. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή καταγραφής εικόνας AxioCam MRC5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία).

Δυτική ανάλυση

Τα κυτταρικά λύματα (εκχυλίζεται με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ) ​​διαχωρίστηκαν σε 4-12% Νονβχ δις -Τρις SDS πηκτώματα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) μεταφέρθηκαν σε Immobilon-PSQ μεμβράνες (Millipore Corp. Bedford, ΜΑ, USA) με ένα Invitrogen κηλίδωση Western σύστημα (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA). Μετά από αποκλεισμό με 5% σκόνη γάλακτος σε 0,02% PBS-Τ, τα στυπώματα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C. Πρωτοβάθμια αραιώσεις αντισωμάτων ήταν 1:1000 για CDX2, φιμπρονεκτίνη, βιμεντίνη και transgelin, 1:2500 για β-ακτίνη και 1:100 για Spanx-Β και ΣΕΛΙΔΑ-2, 2Β αντισώματα. HRP δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (Abcam, Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:5000 και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία φωταύγειας ECL (BioRad, Hercules, CA, USA).

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [15]. Εν συντομία, η φορμαλδεΰδη διασυνδεδεμένη συστατικά κυττάρων καταβυθίστηκαν με proten Α Sepharose συζευγμένη με αντισώματα έναντι ΕΖΗ2, ΗΡ-1 ή H3K27m3 (Abcam, Cambridge, UK), καθώς και ισότυπου-ειδικού ελέγχου. Το καταβυθισμένο DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για

PAGE2

,

-2

ή

Spanx-Β

αλληλουχίες υποκινητή (Πίνακες S1 και S2), ακολουθώντας de-διασταύρωσης.

Αποτελέσματα

γονιδιακής έκφρασης CT κατά τη διάρκεια Caco-2 αυθόρμητη διαφοροποίηση (Caco-2 SD)

Η αδιαφοροποίητη καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά Caco-2 υποβάλλεται enterocytic διαφοροποίηση μετά την επίτευξη συρροής

in vitro

[19], [20]. Σταδιακή διαφοροποίηση έχει παρατηρηθεί μέχρι και 30 ημέρες μετά τη συρροή, όπως αποδεικνύεται από την αυξητική ρύθμιση διαφόρων γονιδίων διαφοροποίησης που σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων σακχαράσης-ισομαλτάσης, αλκαλική φωσφατάση και carcinoembryogenic αντιγόνο (CEA), (Σχήμα S1) [15]. Ένα

in silico

ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης CT, όπως ορίζεται από την 31η probesets στο σύνολο δεδομένων GSE1614, το οποίο περιέχει δεδομένα γονιδιακής έκφρασης για το μοντέλο Caco-2 SD που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης (που πολλαπλασιάζονται (2

ου ημέρα), μετα-πολλαπλασιασμό-αδιαφοροποίητο (8

ης ημέρας), και μετά τον πολλαπλασιασμό διαχωριζόμενες (15

ης ημέρας)) [16], αποκάλυψε μέτρια έως ρύθμιση όλων σχεδόν των CT γονιδίων κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης (Εικόνα S2). Επιλέξαμε να επικυρώσει την αλλαγή στην έκφραση των οικογενειών γονιδίων /γονιδιακής έξι CT με ποσοτική RT-PCR σε διαφοροποιούμενα κύτταρα Caco-2

in vitro

.

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1

και

SSX4

μεταγραφές ήταν μη ανιχνεύσιμα κατά την πρώτη ημέρα της συρροής, καθώς και σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του

ΣΕΛ2

(

2 και 2Β

), και

Spanx-Β

γονίδια ήταν εμφανής (Σχήμα 1).

σχετική έκφραση του mRNA της CT γονιδίων (

ΣΕΛ2

,

2Β

και

SPANXB

) (Α), επιθηλιακά γονίδια (

E-cadherin (Cdh1)

,

κλαουδίνης 4 (CLDN4)

,

CDX2

) (Β), και τα γονίδια μεσεγχυματικά (

φιμπρονεκτίνη 1 (FN1), βιμεντίνη (VIM)

,

transgelin (TAGLN)

) (C) όπως προσδιορίζεται με ποσοτική PCR στις ημέρες 0, 10, 20 και 30 μετά τη συρροή. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο δύο πειραμάτων. Αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων μεταξύ των ημερών 0 και 30 είναι στατιστικά σημαντική (P & lt? 0,0001, με αμφίδρομη ANOVA με δοκιμή post hoc κατά Tukey)

Η

ΣΕΛ2

και em

Spanx-Β

έκφραση ακολουθούν MET στο μοντέλο Caco-2 SD

η αυθόρμητη διαφοροποίηση των Caco-2

in vitro

έχει αναφερθεί να έχει ως αποτέλεσμα ΚΟΑ [21], [22 ]. Για να προσδιορίσετε αν αυτό συνέβη παράλληλα με την ανοδική ρύθμιση του

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

, αναλύσαμε το σύνολο δεδομένων GSE1614 για την έκφραση των γονιδίων που αντιπροσωπεύουν EMT σε καρκίνο του παχέος εντέρου [17], και επιλεγμένα 6 γονίδια που πρέπει να επικυρωθεί στο μοντέλο μας. Ανάλυση των mRNA και πρωτεΐνης έκφραση αυτών έδειξε μία μείωση των γονιδίων μεσεγχυματικά (

βιμεντίνη, φιμπρονεκτίνη 1

και

transgelin

) με ταυτόχρονη αύξηση στην έκφραση των επιθηλιακών γονιδίων (

CDX2, κλαουδίνης -4

και

E-cadherin

), όπως τα κύτταρα διαφοροποιούνται, αποδεικνύοντας ότι η αύξηση στην έκφραση του γονιδίου CT συμβαίνει ταυτόχρονα με την ΚΟΑ σε αυτό το μοντέλο (Σχήμα 1 & amp?. Σχήμα S3)

ΣΕΛ2, Spanx-Β και η έκφραση του γονιδίου EMT

in situ

η

Για να μελετήσουμε εάν οι αλλαγές στην έκφραση πρωτεΐνης των CT και EMT γονιδίων εμφανίστηκαν ταυτόχρονα στα ίδια κύτταρα, που πραγματοποιήθηκε διπλή χρώση ανοσοφθορισμού κατά τη διάρκεια της διάκριση. Μια σταδιακή απώλεια των δεικτών μεσεγχυματικών παρατηρήθηκε ως κύτταρα διαφοροποιούνται, με ταυτόχρονη αύξηση των επιθηλιακών γονιδίων και CT γονίδια. Spanx-Β και ΣΕΛΙΔΑ-2 ήταν συχνά συν-εκφράζεται με την επιθηλιακά CDX2 δείκτη στα ίδια κύτταρα, αλλά σχεδόν ποτέ με VIM ή FN1 (Σχήματα 2, 3 και στα Σχήματα S4, S5, S6, S7).

χρώση ανοσοφθορισμού της διαφοροποίησης Caco-2 κυττάρων με DAPI αντιχρωματισμός αποκαλύπτει μια σταδιακή αύξηση στην πυρηνική Spanx-Β (πράσινο) με ταυτόχρονη μείωση στην κυτταροπλασματική έκφραση vimentin (κόκκινο)? (20 × μεγέθυνση) (Α). Λιγότερο από το 1% των Spanx-Β θετικά κύτταρα παρουσίασαν χρώση για vimentin την ημέρα 0 (Β).

Η

χρώση ανοσοφθορισμού της διαφοροποίησης Caco-2 κυττάρων με DAPI αντιχρωματισμός αποκαλύπτει επικάλυψη Spanx-B (Alexa Fluor 488 : πράσινο) και CDX2 (Alexa Fluor 568: κόκκινο) έκφραση? (20 × μεγέθυνση) (Α). Περισσότερα από 60 έως 80% των κυττάρων δείχνουν διπλή επισήμανση όταν αναλυθούν ποσοτικά (Β).

Η

έκφραση ΣΕΛ2 και Spanx-Β συσχετίζεται με αυξημένη HMC και 10-11 μετατόπιση μεθυλκυτοσίνη διοξυγονάσης (ΤΕΤ) έως -Κανονισμός

η έκφραση όλων των γονιδίων CT μελετηθεί μέχρι σήμερα, συμπεριλαμβανομένων

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

έχουν συσχετιστεί με την απομεθυλίωση των υπολειμμάτων CpG μέσα σε περιοχές κοντά στην έναρξη της μεταγραφής περιοχή [1], [2], [23] – [26]. Σε αυτή τη γραμμή, τόσο

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω από 5-αζα θεραπεία 2′-δεοξυκυτιδίνη (Σχήμα S8). Ωστόσο, διθειώδες αλληλούχιση των περιοχών προαγωγού-εγγύς των δύο

PAGE2

και

Spanx-Β

δεν απεκάλυψε διαφορές στα διάφορα στάδια της Caco-2 SD (Σχήμα 4). Όπως θειώδους αλληλουχίας δεν είναι σε θέση να διακρίνει μεθυλο κυτοσίνη (MC) από HMC, ρωτήσαμε αν η αλλαγή στην έκφραση του γονιδίου CT θα μπορούσε να σχετίζεται με αλλαγμένη αναλογίες HMC /mC μέσα υποστηρικτές τους. Στην πραγματικότητα, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) με ένα ειδικό αντίσωμα HMC αποκάλυψε μια αύξηση των HMC κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης τόσο

PAGE2

και

Spanx-B2

υποκινητές (Σχήμα 5). Είμαστε δίπλα ρώτησε αν η αύξηση του HMC σχετιζόταν με αύξηση της TET1, -2 και -3 έκφρασης όπως αυτές τις πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για τη μετατροπή MC για να HMC [27], [28]. Πράγματι, η αύξηση της HMC του

ΣΕΛ2

και

υποστηρικτές Spanx-Β2 συσχετίστηκαν με up-ρύθμιση του

TET2

έκφραση του mRNA, σε συνδυασμό με μετριοπαθείς αυξήσεις στα em

TET1

και

3

(Σχήμα 6Α). Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού αποκάλυψε ότι η πλειονότητα των κυττάρων που εκφράζουν PAGE2 ή Spanx-Β ήταν θετικά για χρώση TET2? υποδεικνύοντας αυτά τα δύο γεγονότα συνέβησαν στα ίδια κύτταρα (Σχήμα 7). Επομένως, είναι πιθανό ότι η αύξηση των TET2 προκαλεί έκφραση αυξήθηκε HMC σε αυτά τα γονίδια. Είναι ενδιαφέρον, μόνο ένα προϊόν χαμηλής μοριακού βάρους μετάφραση (~ 25 kD) του TET2 αυξήθηκε στα διαφοροποιούμενα κύτταρα, όταν δεν υπάρχει σαφής διαφορά στα επίπεδα της πρωτεΐνης TET2 πλήρους μήκους παρατηρήθηκε (Σχήμα 6Β & amp? C). Το πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για την παραγωγή των εμπορικών αντισωμάτων TET2 μπορούσε να αναστείλει ειδικά την αναγνώριση του προϊόντος 25 kD που επιβεβαιώνουν την ταυτότητα του με TET2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). TET2 έχει πρόσφατα δειχθεί ότι υφίστανται πρωτεολυτική διάσπαση με καλπαΐνη 1 και 2, δημιουργώντας ένα προϊόν kD 25

in vitro

[29]. Για να δοκιμαστεί εάν ένα κατιόν εξαρτώμενη πρωτεάση είναι υπεύθυνη για την παραγωγή της πρωτεΐνης 25 kD, υποβάλλαμε σε αγωγή διαφοροποίηση κυττάρων με ένα ενδοκυτταρικό Ca

2+ χηλικοποιητή (ΒΑΡΤΑ-ΑΜ). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα σε μια μέτρια μείωση της kD TET2 πρωτεΐνη 25 με την ταυτόχρονη παραγωγή ενός μεγαλύτερου προϊόντος μοριακού βάρους (περίπου 50kD), υποδεικνύοντας ότι η 25 kD πρωτεΐνη είναι TET2 ένα Ca

2 εξαρτώμενο προϊόν διάσπασης πρωτεάσης με 50 kD ενδιάμεσο (Σχήμα 6D).

Γεμάτο και άδειο κύκλοι αντιπροσωπεύουν μεθυλιώνονται και μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες, αντίστοιχα. ενδείκνυται% μεθυλίωσης σε κάθε αναλύθηκαν περιοχή, με βάση τα 10 κλώνους αλληλουχία. CpG κατάλοιπα κοντά στο

ΣΕΛ2, 2Β

και

Spanx-Β

υποψηφίους κατά Caco2 διαφοροποίηση στις ημέρες 0, 10 και 30 αποκαλύπτει καμία στατιστικά σημαντική μεταβολή (από μονόδρομη ANOVA).

πειράματα CHIP χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-HMC και εκκινητών που αντιστοιχεί σε 31-182 και 68-184 bp από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του

ΣΕΛ2

και

Spanx -Β γονίδια

, αντίστοιχα. τιμές P (one-way ANOVA) είναι 0,001 και 0,07 για PAGE2 και Spanx-Β, αντίστοιχα.

Η

mRNA και των τριών

ΤΕΤ

γονίδια αυξάνουν σταδιακά κατά τη διάρκεια Caco-2 SD ( ΈΝΑ). Μια αύξηση μόνο 25 kD εκδοχή (Β), αλλά όχι η πρωτεΐνη TET2 πλήρους μήκους (Γ) λαμβάνει χώρα ταυτόχρονα με την αύξηση του mRNA. ΒΑΡΤΑ-ΑΜ αποτελέσματα της θεραπείας σε μια μέτρια μείωση στην kD TET2 πρωτεΐνη 25, με την παραγωγή ενός έκδοσης μεγαλύτερου mw (D). τιμές P, όπως καθορίζεται από μονόδρομη ANOVA, είναι 0,03, 0,01 και 0,07, για Tet1, TET2 και Tet3, αντίστοιχα

Η

Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού για TET2 (Alexafluor 568: κόκκινο). και Spanx-Β ή PAGE2 (Alexafluor 488: πράσινο) με DAPI αντικηλίδωση 20 ημέρες μετά τη συμβολή δείχνουν αλληλοεπικάλυψη Μεγέθυνση πυρηνική έκφραση: 40 × (Α). Περισσότερο από το 95% των κυττάρων που εκφράζουν PAGE2 ή Spanx-Β ήταν επίσης θετικά για χρώση TET2 (Β).

Η

ΕΖΗ2 και HP-1 πληρότητας του

ΣΕΛ2

και

Spanx -Β

εγγύς υποκινητή περιοχές μειώνονται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης

υδροξυμεθυλίωση έχει αναφερθεί να επικρατήσει σε υποστηρικτές με διπλή H3K4 και H3K27 trimethylation που δεσμεύουν επίσης πρωτεΐνες PRC2 [30]. Η PRC2 συγκρότημα πρωτεΐνη ΕΖΗ2 έχει υπονοηθεί στην καταστολή της GAGE, μια άλλη CT γονιδίου [31]. Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν αυξηθεί HMC εντός υποκινητές γονιδίων CT ως αποτέλεσμα αλλαγμένη ΕΖΗ2 δέσμευση στις ίδιες θέσεις. Πράγματι, πειράματα απέδειξαν ChIP μια μείωση στην ΕΖΗ2 πληρότητας, καθώς και μια μείωση στο H3K27m3 τόσο

PAGE2

και

Spanx-Β

προαγωγούς κατά την διάρκεια Caco-2 SD (Σχήμα 8). Το συστατικό PRC2 SUZ12 έχει αναφερθεί για τη ρύθμιση H3K9 μεθυλίωση και με τη σειρά του, ετεροχρωματίνη πρωτεΐνη 1 (HP1α) σύνδεση. Στην πραγματικότητα, παρατηρήσαμε μια ταυτόχρονη μείωση στις ΗΡ1 δεσμευτική τόσο για

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

υποστηρικτές κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, που συσχετίζονται με το

ΣΕΛ2

και

SPANX- Β

αυξορρύθμιση (Σχήμα 8). Έτσι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι τόσο PRC2 και HP-1 συμβάλλουν στη διατήρηση

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

σε μεταγραφικά σιωπηλή κατάσταση, όταν τα κύτταρα έχουν φαινότυπο μεσεγχυματικά, και ότι η αυξημένη έκφραση TET2 και HMC μεσολάβηση μεταγραφική ενεργοποίηση σχετίζονται με PRC2 και HP-1 αποσύνδεση από τους υποστηρικτές αυτών των γονιδίων CT κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης.

ανάλυση CHIP του

ΣΕΛ2, 2Β

και

SPAN-X

μεταγραφή εκκίνησης τοπο-εγγύς περιοχές αποκαλύπτει μειώθηκε ΕΖΗ2 πληρότητα και H3K27m3 (Α), καθώς και μειωμένη HP-1 σύνδεση κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης (Β). τιμές P (one-way ANOVA) υπολογίζεται για

PAGE2B, PAGE2

, και

Spanx-Β

, είναι & lt? 0,001, 0,02, και 0,001 για ΕΖΗ2? 0.003, & lt? 0.001, και & lt? 0,0001 για H3K27m3? και 0.001, & lt? 0.001, και & lt?. 0.001, για ΗΡ1, αντίστοιχα

Η

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

up-ρύθμιση αντιστρέφεται κατά τη διάρκεια της EMT

Υποθέσαμε ότι εάν οι επιγενετικές αλλοιώσεις που διέπουν την έκφραση του γονιδίου CT συνέβη παράλληλα με την ΚΟΑ, ότι αυτή η διαδικασία θα μπορούσε να αντιστραφεί εάν τα κύτταρα εισήλθε EMT. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2 αποσπάστηκαν και αφέθηκαν να πολλαπλασιαστούν για 5 ημέρες. Αυτό οδήγησε σε ταχεία απο-διαφοροποίηση τους, όπως αποδεικνύεται από τα κάτω ρύθμιση του SI. De-διαφοροποιημένα κύτταρα κάτω-ρυθμίζονται

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

, καθώς και

CDX

, όπως ρυθμίζεται προς τα πάνω

TAGLN

, σε σύμφωνα με τις εν εξελίξει EMT (Σχήμα 9). Παρά το γεγονός ότι η μεταγραφή των τριών

ΤΕΤ

γονιδίων μειώθηκε κατά de-διαφοροποίηση (Σχήμα 9), δεν παρατηρήσαμε μείωση της HMC κατά την περίοδο αυτή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς, ως εκ τούτου, καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου CT είναι αναστρέψιμη σε αυτό το μοντέλο.

De-διαφοροποίηση που προκαλείται από την ανάπτυξη υπό μη συρρέουσες συνθήκες που υποδεικνύονται από μειωμένη

σακχαρόζη ισομαλτάσης

(SI ) mRNA επίπεδα (Α), οδηγεί σε ρύθμιση προς τα κάτω των

CDX2

,

ΣΕΛ2, 2Β

και

Spanx-Β

, με ταυτόχρονη up-ρύθμιση του

TGLN

(Β).

TET1

και

-2

mRNAs επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια de-διαφοροποίηση (C).

Η

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι γονιδιακής έκφρασης CT συσχετίζεται με ένα επιθηλιακό αντί ενός φαινοτύπου μεσεγχυματικών, και έδειξε την ανιούσα ρύθμιση των γονιδίων κατά τη διάρκεια CT ΜΕΤ [12], [14]. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά περιγράφει μεταβολές σε αρκετές επιγενετικές μηχανισμούς εντός υποκινητές δύο CT γονιδίων κατά τη διάρκεια της MET-σαν διαφοροποίηση σύμφωνη με μια δυναμική αλλαγή στην έκφραση γονιδίου. Όπως θειώδους αλληλουχίας του

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

υποστηρικτές αποκάλυψε καμία αλλαγή κατά τη διαφοροποίηση, η αυξημένη HMC πρέπει αυστηρά να περιλαμβάνει μεθυλιωμένα υπολείμματα CpG. Αυτό είναι σύμφωνο με το γεγονός ότι ΤΕΤ ένζυμα είναι υπεύθυνα για τη μετατροπή των 5-μεθυλ κυτοσίνη σε 5-υδροξυμεθυλ κυτοσίνη [27], [28]. Μετατροπή της HMC να MC είναι μια πολύ πιο σύνθετη διαδικασία και δεν μπορεί να συμβεί με παρόμοιες κινητικές [32], [33]. Αυτό είναι πιθανόν ο λόγος που δεν παρατηρούμε μια αλλαγή στο HMC κατά τη διαδικασία de-διαφοροποίηση 5 ημερών των κυττάρων Caco-2 παρά τη μείωση που παρατηρείται σε παγκόσμιο επίπεδο ΤΕΤ. εύρημα μας ότι

ΣΕΛ2

,

Spanx-Β

και

TET2

επαγωγή είναι αναστρέψιμη είναι παρόμοια με μια άλλη μελέτη σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα όπου η βιταμίνη C έχει αποδειχθεί ότι επάγει την έκφραση TET2, η οποία με τη σειρά της, οδήγησε σε πάνω ρύθμιση του CT γονιδίων. Και τα δύο γεγονότα ήταν αναστρέψιμα αμέσως μετά την απόσυρση Βιταμίνη C [34].

Αν και υδροξυμεθυλίωση εντός των προαγωγών γονιδίου έχει αναφερθεί να μειώνεται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των φυσιολογικών κυττάρων, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι περίπου το 20% όλων των τροποποιημένων κυτοσίνες στα περισσότερα γονίδια CT στον ανθρώπινο εγκέφαλο, όπου δεν εκφράζονται, αποτελούνται από HMC [35]. Up-ρύθμιση της έκφρασης TET2 στον καρκίνο έχει συσχετισθεί με ΜΕΤ [36], [37]? και ως εκ τούτου, μια πιο διαφοροποιημένη κατάσταση [30]. Παρόμοια με την αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ ΕΖΗ2 και CT έκφραση /TET2 αναφέρουμε εδώ, άλλοι έχουν δείξει ΕΖΗ2 και ΤΕΤ ένζυμα για να καταστείλει και να προκαλεί διαφοροποίηση των νευρωνικών πρόδρομων ουσιών, αντίστοιχα [38]. CT γονίδια είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω κατά τη διάρκεια των αρχικών σταδίων της ανάπτυξης του ανθρώπινου εμβρύου, αλλά μειώνεται καθώς οι ιστοί διαφοροποιούνται περαιτέρω [39]. Καθώς ιστός ενήλικα παχέος εντέρου δεν εμφανίζει PAGE2 ή Spanx-B έκφραση (δεδομένα που δεν φαίνονται), είχε Caco-2 κύτταρα την ικανότητα να διαφοροποιούνται περαιτέρω, και τα δύο γονίδια μπορεί να ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω εντελώς. Από την άλλη πλευρά, το γεγονός ότι δεν θα μπορούσαμε να αποδείξει τα πάνω ρύθμιση του

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1

ή

SSX4

έκφραση σε αυτό το μοντέλο μπορεί να συμβαίνει επειδή αυτά τα γονίδια εκφράζονται σε προγενέστερα στάδια της διαφοροποίησης. Πιστεύουμε ότι αυτό επειδή η έκφραση Spanx-Β είναι κατά κύριο λόγο στην μετα-μειωτική κύτταρα των όρχεων (δηλ σπερματοκύτταρα, σπερματίδια, ή σπέρμα), ενώ GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1 ή έκφραση SSX είναι κατά κύριο λόγο σε σπερματογόνια [11] .

Τα στοιχεία μας και των πολλών άλλων αναφέρει ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν CT γονίδια έχουν περισσότερα του ενός επιθηλιακού παρά ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά. Προτείνουμε ότι CT γονίδια

PAGE2

και

Spanx-Β

επάγονται κατά την διάρκεια ενός παραθύρου της διαφοροποίησης που συσχετίζεται με τα επάνω ρύθμιση των επιθηλιακών δείκτες διαφοροποίησης. Το μοντέλο Caco-2 SD κατέστησε δυνατό να παρατηρηθεί η αλλαγή ενεργά επιγενετικών τοπίο εντός των υποκινητών των γονιδίων αυτών CT. Ωστόσο, όπως την έκφραση του γονιδίου CT σε όγκους έχει στενά έχουν σχέση με την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή τους, διαδικασία που οδηγεί στην επαγωγή του γονιδίου CT i

n vivo

θα μπορούσε τελικά να οδηγήσει σε «καθορισμό» της επιγενετικής κράτους που θα με τη σειρά του να οδηγήσει σε CpG μεθυλίωσης. Ωστόσο, μέσω της δυναμικής ΚΟΑ σε όγκους [40], είναι κατανοητό ότι ακόμα και αυτό μπορεί να αλλάξει κατά τη διάρκεια της ασθένειας.

Από κλινική άποψη, τα δεδομένα από το εργαστήριο μας, καθώς και από τους άλλους αποκαλύπτουν ότι η υπο- ομαδοποίηση των όγκων με βάση τα προφίλ της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να προσδιορίσει με σαφήνεια κυττάρων με διαφορετικά προφίλ χημειο-ευαισθησία [12], [41], [42]. Σε αυτή τη γραμμή, έχουμε προβλέψει μελλοντικές μελέτες θα αποκαλύψουν διακριτά προφίλ ευαισθησίας των ναρκωτικών για τον ορθοκολικό καρκίνο υποτύπους όπως ενδεχομένως ορίζεται από το

ΣΕΛ2

και

Spanx-Β

έκφρασης, για την οποία το μοντέλο Caco-2 SD θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

μετά συμβολή διαφοροποίηση των Caco-2

in vitro

. Up-ρύθμιση του

σακχαράσης-ισομαλτάσης

(Α), και καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) (Β) σε κύτταρα που συλλέγονται στην υποδεικνυόμενη ημέρες μετά τη συρροή (DPC) όπως προσδιορίζεται με ποσοτική RT-PCR, και ανάλυση Western, αντιστοίχως . έκφραση της αλκαλικής φωσφατάσης είναι επίσης ρυθμίζεται αυξητικά όπως προσδιορίζεται με ανοσοϊστοχημεία αποκαλύπτοντας διαφοροποίησης (C). Άλλα μέτρα της διαφοροποίησης για τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έχουν αναφερθεί προηγουμένως (παραπ. 17). * P & lt? 0.001 (ANOVA με δοκιμή hoc θέση του Tukey)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107905.s001

(DOCX)

Εικόνα S2.

Up-ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της CT Caco-2 αυθόρμητη διαφοροποίηση

in vitro

. χάρτης θερμότητας με βάση 31 probesets σε GSE1614 που αντιστοιχεί στο 23 CT γονίδια από 7 οικογένειες. Σε σύγκριση με πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, γονιδιακή έκφραση αυξάνει σταδιακά σε συρροή (8

ης ημέρας) και περαιτέρω κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης μετα-συρροή (15

ης ημέρας)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107905. S002

(DOCX)

Εικόνα S3.

ανάλυση Western των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων κατά τη διάρκεια Caco-2 SD. Μια σταδιακή αύξηση της Spanx-Β και CDX2 παράλληλα σε μείωση στην έκφραση των FN, VIM και TGLN μέχρι την ημέρα 30 μετά την συρροή. Τα αποτελέσματα από 3 ανεξάρτητα πειράματα διαφοροποίηση παρουσιάζεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107905.s003

(DOCX)

Εικόνα S4.

Spanx-Β και Ινονεκτίνης δείχνουν έκφραση περιορισμένη επικάλυψη στη διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2. χρώση ανοσοφθορισμού της διαφοροποίησης Caco-2 κυττάρων με DAPI αντιχρωματισμός αποκαλύπτει μια σταδιακή αύξηση στην πυρηνική Spanx-B (Alexa Fluor 488: πράσινο) με ταυτόχρονη μείωση στην κυτταροπλασματική έκφραση φιμπρονεκτίνης (Alexa Fluor 568: κόκκινο)? (20 × μεγέθυνση) (Α). Λιγότερο από το 10% των κυττάρων που εκφράζουν Spanx-Β βάφονται για ινωδονεκτίνη κατά την ημέρα 0 (Β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107905.s004

(DOCX)

Εικόνα S5.

ΣΕΛ2, 2Β και της έκφρασης βιμεντίνης αλληλοαποκλείονται στη διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2. χρώση ανοσοφθορισμού της διαφοροποίησης Caco-2 κυττάρων με DAPI αντιχρωματισμός αποκαλύπτει μια σταδιακή αύξηση στην πυρηνική ΣΕΛ2, 2Β (Alexa Fluor 488: πράσινο) με ταυτόχρονη μείωση στην κυτταροπλασματική έκφραση vimentin (Alexa Fluor 568: κόκκινο)? (20 × μεγέθυνση) (Α). Λιγότερο από 10% των κυττάρων έδειξαν διπλό φθορισμό όταν χρώση αναλύθηκε ποσοτικά κατά την ημέρα 0. Σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, κανένα από τα κύτταρα έδειξαν διπλή χρώση (Β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107905.s005

(DOCX)

Εικόνα S6.

ΣΕΛ2, 2Β και της έκφρασης φιμπρονεκτίνη αλληλοαποκλείονται στη διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2. χρώση ανοσοφθορισμού της διαφοροποίησης Caco-2 κυττάρων με DAPI αντιχρωματισμός αποκαλύπτει μια σταδιακή αύξηση στην πυρηνική ΣΕΛ2, 2Β (Alexa Fluor 488: πράσινο) με ταυτόχρονη μείωση στην κυτταροπλασματική έκφραση φιμπρονεκτίνης (Alexa Fluor 568: κόκκινο)? (20 × μεγέθυνση) (Α). Λιγότερο από το 15% των κυττάρων έδειξαν διπλό φθορισμό όταν χρώση αναλύθηκε ποσοτικά κατά την ημέρα 0 (Β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107905.s006

(DOCX)

Εικόνα S7.

Πυρηνική συν-εντοπισμός των CDX2 και PAGE2, 2Β στη διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2. χρώση ανοσοφθορισμού της διαφοροποίησης των κυττάρων Caco-2 με DAPI αντιχρωματισμός αποκαλύπτει επικάλυψη PAGE2. 2Β (Alexa Fluor 488: πράσινο) και CDX2 (Alexa Fluor 568: κόκκινο) έκφραση?