Αφηρημένο

Ιστορικό

ανώμαλο μεταβολισμό one-άνθρακα μπορεί να οδηγήσει σε γενική γονιδιωματική (παγκόσμια) υπομεθυλίωση, η οποία μπορεί να προδιαθέτουν ένα άτομο για την ανάπτυξη του παχέος νεοπλασίας.

Μέθοδοι

Αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των προ-διαγνωστικών λευκοκυττάρων επίπεδο γονιδιώματος μεθυλίωσης του DNA και του κινδύνου ορθοκολικού καρκίνου σε μια ένθετη ασθενών-μαρτύρων μελέτη 358 παχέος περιπτώσεις καρκίνου και 661 μάρτυρες στο πλαίσιο του all-female ομάδα της μελέτης Nurses ‘Health (NHS). Ανάμεσα στα άτομα ελέγχου, εξετάσαμε περαιτέρω κύρια συστατικά του πλάσματος στην οδό μεταβολισμό ενός άνθρακα σε σχέση με το γονιδιωματικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA. Υγρή χρωματογραφία /διαδοχική φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση των λευκοκυττάρων γονιδιωματικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA. Υπολογίσαμε αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (95% ΠΙ) με τη χρήση της λογιστικής παλινδρόμησης.

Αποτελέσματα

Συνολικά επίπεδο γονιδιώματος μεθυλίωσης του DNA δεν σχετίστηκε με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου (

σ

για τάση, 0,45). Σε σύγκριση με τις γυναίκες στο χαμηλότερο πεμπτημόριο της μεθυλίωσης, η πολυμεταβλητή OR του παχέος τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου ήταν 1,32 (95% CI, 0,82 έως 2,13) ​​για όσους το υψηλότερο πεμπτημόριο. Δεν βρήκαμε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των κύριων συστατικών του πλάσματος του μεταβολισμού ή παράγοντες κινδύνου ενός άνθρακα για καρκίνο του παχέος εντέρου και γονιδιώματος επίπεδο μεθυλίωσης του DNA (όλα

σελ

για τάση & gt? 0,05). Επίσης, ούτε το μεταβολισμό που σχετίζονται με συστατικά πλάσματος ενός άνθρακα ούτε καλά-γνωστούς παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου τροποποιημένων τη συσχέτιση μεταξύ γονιδιωματικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA και του κινδύνου του καρκίνου του παχέος εντέρου (όλα

σ

για αλληλεπίδραση & gt? 0,05).

Συμπεράσματα

δεν βρήκαμε κανένα στοιχείο ότι υπομεθυλίωση των λευκοκυττάρων γονιδιακού DNA αυξάνει τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου στις γυναίκες. Πρόσθετες μελέτες για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ των προ-διαγνωστικό επίπεδο γονιδιώματος μεθυλίωσης του DNA και του παχέος κίνδυνο καρκίνου μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών

Παράθεση:. Nan Η Giovannucci EL, Wu Κ, Selhub J, Paul L, Rosner Β, et al. (2013) Προ-Διαγνωστική λευκοκυττάρων Γονιδιωματική μεθυλίωσης του DNA και του κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου στις γυναίκες. PLoS ONE 8 (4): e59455. doi: 10.1371 /journal.pone.0059455

Επιμέλεια: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Γαλλία

Ελήφθη: 6 Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 14η, Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 1η Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Nan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις έρευνας CA136950 και CA55075 από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μεταβολισμό One-άνθρακα, ή το μεταβολισμό μεθυλο-ομάδα, είναι ένα κρίσιμο μονοπάτι στην επιγενετική καρκίνου [1]. Αποτελείται από ένα δίκτυο αλληλένδετων βιοχημικών αντιδράσεων εμπλέκονται στη μεταβίβαση των ομάδων μεθυλίου από μία ένωση σε ένα άλλο, το οποίο μεταξύ άλλων επιδράσεων μπορεί επίσης να επηρεάσει το επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA. Ανώμαλο μεταβολισμό ενός άνθρακα μπορεί να οδηγήσει σε γενική γονιδιωματική (παγκόσμια) υπομεθυλίωση, η οποία μπορεί να προδιαθέτουν ένα άτομο για την ανάπτυξη νεοπλασίας [2]. Λίγες επιδημιολογικές μελέτες έχουν εξετάσει προ-διαγνωστικά γενωμικού κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των λευκών αιμοσφαιρίων σε σχέση με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Μια συγχρονική μελέτη διαπίστωσε ότι τα υψηλότερα γονιδιωματική μεθυλίωση του DNA λευκοκυττάρων συνδέεται με μειωμένο κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος, ένα πρόδρομο για παχέος εντέρου [3].

αξιολόγησε την επίδραση των λευκοκυττάρων γενωμικού κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και του αλληλεπίδραση με τα θρεπτικά συστατικά ενός άνθρακα του μεταβολισμού που σχετίζονται με γενετικούς πολυμορφισμούς, και άλλων παραγόντων σχετικά με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου σε μια μελέτη ένθετη-μαρτύρων στο πλαίσιο μελέτης Nurses ‘Health (NHS).

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης

Το NHS είναι εγγεγραμμένοι 121.700 θηλυκό νοσηλευτές ηλικίας 30-55 ετών το 1976? Για περισσότερες λεπτομέρειες, ανατρέξτε στο [4]. Έχουμε στείλει ερωτηματολόγια παρακολούθησης με την ομάδα ανά διετία για να ενημερώσετε τις πληροφορίες σχετικά με τους παράγοντες του τρόπου ζωής και να εξακριβώσει νέες διαγνώσεις σοβαρών ασθενειών. Το ποσοστό παρακολούθησης για αυτή την ομάδα παραμένει πάνω από το 90% [5]. Το 1989-90, συλλέξαμε δείγματα αίματος από 32.826 συμμετέχοντες σε αυτή την ομάδα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε σωλήνες με ηπαρίνη και που μας έστειλε η υπηρεσία ταχυμεταφοράς στη διατηρημένα με απλή ψύξη δοχείων. Κατά την παραλαβή, τα αίματα φυγοκεντρήθηκαν, να διαχωρίζονται και αποθηκεύονται στους -70 ° C.

Οι διαδικασίες και τα πρωτόκολλα της μελέτης έχει εγκριθεί από τις Institutional Review Boards στο Νοσοκομείο Brigham and Women ».

Επιλογή του παχέος Κρούσματα καρκίνου και έλεγχοι

Ζητήσαμε άδεια από τα μέλη της ομάδας που αναφέρθηκε καρκίνο του παχέος εντέρου σε διετή ερωτηματολόγια μας για την απόκτηση ιατρικά αρχεία και εκθέσεις παθολογίας. Εμείς εντοπίστηκαν θανατηφόρα κρούσματα από τον Εθνικό Δείκτη Θάνατος και από την επόμενη-of-kin [6]. γιατροί, τυφλή μελέτη με τα στοιχεία της έκθεσης επανεξετάζονται όλα τα ιατρικά αρχεία για να επιβεβαιώσει περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου. Εμείς περιλαμβάνονται νέες περιπτώσεις καρκίνου παχέος εντέρου που είχε παράσχει ένα δείγμα αίματος πριν από τη διάγνωση του καρκίνου. Αποκλείσαμε τον μικρό αριθμό των καρκίνων που δεν είχαν αδενοκαρκινώματα, καθώς και καρκινώματα in situ. Έχουμε επιλέξει τυχαία έναν ή δύο ελέγχους εντός της ίδιας ομάδας από συμμετέχοντες που είχαν επίσης δείγματα αίματος αλλά ήταν ελεύθερα ορθοκολικού καρκίνου κατά τον χρόνο όταν η υπόθεση είχε διαγνωστεί. Έλεγχοι αντιστοιχήθηκαν σε κάθε περίπτωση, ανάλογα με την ηλικία (εντός 3 ετών από τη γέννηση), μήνας /έτος δειγματοληψία αίματος (95% των περιπτώσεων και οι έλεγχοι ήταν συμφωνημένα εντός ενός μηνός από τη δειγματοληψία αίματος), και την κατάσταση νηστείας (& lt? 8 έναντι ≥8 ωρών από το τελευταίο γεύμα). Συνολικά, 358 περιστατικό περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου διαγιγνώσκονται μετά τη συλλογή του αίματος του 1990 μέχρι τον Οκτώβριο του 2008 και 661 μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυσή μας.

Τεκμηρίωση της Ζωής στιλ και γενετικών δεδομένων

Για τις περιπτώσεις και τους ελέγχους, διατροφικές δεδομένα έχουν συλλεχθεί. Εν συντομία, ένα ερωτηματολόγιο ημιποσοτική συχνότητας κατανάλωσης τροφίμων (FFQ) με περίπου 60 είδη εστάλη σε όλη την ομάδα του ΕΣΥ, το 1980. Μία διευρυμένη FFQ με περίπου 130 είδη διατροφής χορηγήθηκε για τις γυναίκες το 1984, το 1986, και κάθε 4 έτη. Οι συμμετέχοντες κλήθηκαν πόσο συχνά, κατά μέσο όρο είχαν καταναλώσει κάθε είδος τροφίμων ή ποτών, ακόμη και κατά το παρελθόν έτος αλκοολούχα ποτά (μπύρα, κρασί και λικέρ). Μερίδες ήταν καθορίζεται για κάθε φαγητό στο FFQ. Το ερωτηματολόγιο είχε εννέα πιθανών απαντήσεων, που κυμαίνονται από ποτέ ή λιγότερο από μία φορά το μήνα για έξι ή περισσότερες φορές ανά ημέρα. Οι απαντήσεις στις συχνότητες ενός συγκεκριμένου μεγέθους μερίδας για κάθε στοιχείο τροφίμων μετατράπηκαν σε μέση ημερήσια πρόσληψη. Ποσότητες των θρεπτικών συστατικών από τις τροφές υπολογίστηκαν πολλαπλασιάζοντας την αναφερόμενη συχνότητα του κάθε τροφίμου από το διατροφικό περιεχόμενο μιας μερίδας του τροφίμου κυρίως βάσει του Τμήματος Γεωργίας Θρεπτικά Database ΗΠΑ [7]. Για κάθε θρεπτικό συστατικό, πρόσληψη ενέργειας προσαρμόστηκε για τη χρήση της σε θρεπτικά συστατικά υπολειμματική μέθοδο [8].

Επίσης, nondietary δεδομένα έχουν επίσης συλλέχθηκαν προοπτικά και για τις δύο περιπτώσεις και τους ελέγχους. Εν συντομία, πληροφορίες σχετικά με το βάρος, τη σωματική δραστηριότητα, τη χρήση ασπιρίνης, την ιστορία της ενδοσκόπησης, και η χρήση ορμονών μετά την εμμηνόπαυση ενημερώθηκε περίπου κάθε 2 χρόνια. Πληροφορίες σχετικά με το οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου σε γονείς ή αδέλφια ελήφθη στο ερωτηματολόγιο του 1982 και ενημερώθηκε το 1988, 1992, 1996, και 2000. Ο μέσος αριθμός των τσιγάρων που καπνίστηκαν ανά ημέρα όταν τα υποκείμενα άρχισαν να καπνίζουν, ο μέσος αριθμός των τσιγάρων που καπνίστηκαν την ημέρα στα πρώτα 5 χρόνια το κάπνισμα, η ηλικία όταν τα θέματα τελευταία καπνιστά, και το ύψος αξιολογήθηκαν κατά την έναρξη.

Για ένα υποσύνολο των περιπτώσεων και ελέγχων σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επίσης αξιολογούνται τα επίπεδα του πλάσματος κύρια συστατικά στην οδό μεταβολισμό ενός άνθρακα, συμπεριλαμβανομένων φυλλικό οξύ, βιταμίνη Β

6, βιταμίνη Β

12, και ομοκυστεΐνης [9]. Εν συντομία, οι συγκεντρώσεις φολικού και βιταμίνης Β στο πλάσμα

12 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ραδιοπροσδιορισμό (Bio-Rad, Richmond, CA), η οποία χρησιμοποιεί έναν προσδιορισμό ανταγωνιστικής δέσμευσης πρωτεϊνών διπλής ραδιοϊσότοπο. Το κιτ μετρά ταυτόχρονα πλάσματος φυλλικού οξέος και βιταμίνης Β

12. Χρησιμοποιήσαμε συγκεντρώσεις 5′-φωσφορικής πυριδοξάλης (PLP) πλάσματος για τον προσδιορισμό της βιταμίνης Β

6 επίπεδα, επειδή PLP είναι η κύρια δραστική μορφή της βιταμίνης Β

6. Οι συγκεντρώσεις PLP προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια ενζυματική διαδικασία που βασίζεται σε ραδιενεργό τυροσίνης και αποκαρβοξυλάση της τυροσίνης αποενζύμου, όπως περιγράφεται από Shin et al. [10]. Οι συνολικές συγκεντρώσεις ομοκυστεΐνης πλάσματος και κυστεΐνη μετρήθηκε με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανίχνευση φθορισμού όπως περιγράφεται από τους Araki και Sako [11]. Οι μέσες συντελεστές διακύμανσης για 75 ζεύγη των επαναληπτικών δειγμάτων πλάσματος στο ΕΣΥ ήταν 6,5% για το φυλλικό οξύ, 7,2% για τη βιταμίνη Β

6, 7,3% για τη βιταμίνη Β

12, και 7,9% για την ομοκυστεΐνη [12].

μεθυλενίου-τετραϋδροφολικό αναγωγάσης (MTHFR) είναι ένα κρίσιμο ένζυμο στον μεταβολισμό ενός άνθρακα. Δύο nonsynonymous πολυμορφισμών μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNPs) στο

MTHFR

γονίδιο (C677T [rs1801133] και A1298C [rs1801131]) έχουν αναφερθεί προηγουμένως για να αλλάξει δραστηριότητα MTHFR, και συνδέονται επίσης με τον κίνδυνο του παχέος νεοπλασία [13] , [14], [15]. Γι ‘αυτούς τους δύο SNPs στο

MTHFR

γονίδιο, έχουμε διαπιστώσει στο παρελθόν γονότυπους τους σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων και ελέγχων σε αυτή τη μελέτη [16]. Εν συντομία, οι δύο αυτές SNPs γονότυπος με την δοκιμασία 5 ‘νουκλεάσης (TaqMan®), χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ PRISM 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA). TaqMan® εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό v2.0 Primer Express® Ολίγο Σχεδιασμού (ΑΒΙ PRISM). Το προσωπικό του εργαστηρίου δεν γνώριζαν την κατάσταση ασθενών-μαρτύρων, και εισήχθησαν τα δείγματα 10% τυφλωμένοι ποιοτικού ελέγχου (διπλές δείγματα) για την επικύρωση των διαδικασιών προσδιορισμού του γονότυπου? συμφωνία για τις τυφλωμένοι δείγματα ελέγχου ποιότητας ήταν 100%. Εκκινητές, ανιχνευτές, και οι προϋποθέσεις για τον προσδιορισμό του γονότυπου είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Επιβεβαιώσαμε ότι αυτές οι δύο SNPs ήταν σε ισορροπία Hardy-Weinberg μεταξύ των ελέγχων.

Γονιδιωματικό DNA Δοκιμασία μεθυλίωσης

Το προσωπικό του εργαστηρίου δεν γνώριζαν την case-control κατάστασης και χειρισμού των συμφωνημένα περιπτώσεις και έλεγχοι πανομοιότυπα και μαζί, αποστέλλονται στην ίδια παρτίδα, και προσδιορίστηκαν με τον ίδιο αναλυτικό γύρο. Επιπλέον, η σειρά σε κάθε ζεύγος-μαρτύρων ήταν τυχαία.

Μια φασματομετρία μάζας υγρής χρωματογραφίας /tandem (/MS /MS LC) μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό του καθεστώτος του λευκοκυττάρων γονιδιωματική μεθυλίωση του DNA [17] χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ 3200 QTRAP LC /MS /MS από την Applied Biosystems. Εν συντομία, 100 νανογραμμάρια ΟΝΑ ενζυματικά υδρολυθεί με διαδοχική πέψη με τρία νουκλεάσες. προϊόντα υδρόλυσης DNA στη συνέχεια εγχύθηκαν πάνω σε μία αναλυτική στήλη και στη συνέχεια διαχωρίζονται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης σε ισοκρατικό τρόπο. Οι τέσσερις κύριες βάσεις του DNA και 5-μεθυλ-2′-δεοξυκυτιδίνη επιλύθηκαν και εκλούστηκαν σε σύντομο χρόνο εκτέλεσης. 5-μεθυλ-2′-δεοξυκυτιδίνη ταυτοποιήθηκε με φασματική ανάλυση των χρωματογραφικών κορυφών με ραδιοεπισημασμένες ενώσεις ως εσωτερικό πρότυπο. Η απόλυτη ποσότητα (σε νανογραμμάρια) 5-μεθυλ-2′-δεοξυκυτιδίνη (mCyt) ανά 100 νανογραμμάρια DNA προσδιορίστηκε. Ποσοστό κατάσταση μεθυλίωσης γονιδιωματικού DNA ορίστηκε ως το ποσοστό των mCyt συνολικά Cyt και χρησιμοποιήθηκε για τις στατιστικές αναλύσεις. Για το ποσοστό γονιδιωματική επίπεδο μεθυλίωσης του DNA, ο συντελεστής διακύμανσης (CV) ήταν 4% και εσωτερικός συντελεστής συσχέτισης (ICC) ήταν 0,34.

Στατιστικές Αναλύσεις

Έχουμε κατηγοριοποιούνται οι συμμετέχοντες σε πεμπτημόρια με βάση τοις εκατό επίπεδο γονιδιωματική μεθυλίωση του DNA, χρησιμοποιώντας το πρώτο (χαμηλότερη) πεμπτημόριο ως ομάδα αναφοράς. Χρησιμοποιήσαμε όρους λογιστικής παλινδρόμησης για την εκτίμηση αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (95% ΚΠ) για τη σύνδεση μεταξύ της γονιδιωματικής κατάσταση μεθυλίωσης και το συνολικό κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου. Πολυμεταβλητή ΕΑΠ ελήφθησαν από τα υπό όρους μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης, προσαρμογή για γνωστά ή ύποπτα παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου. Δοκιμές για τάση διεξήχθησαν αναθέτοντας τη μέση τιμή της κάθε πεμπτημόριο της κατάστασης μεθυλίωσης μεταξύ των ελέγχων σε δύο περιπτώσεις και τους ελέγχους σε κάθε κατηγορία και μοντελοποίηση ως συνεχή μεταβλητή.

Για να καθοριστεί αν η σχέση μεταξύ γονιδιωματικής κατάσταση μεθυλίωσης και κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου του διέφερε από τα επίπεδα του φυλλικού οξέος στο πλάσμα ή ομοκυστεϊνης, η συνολική πρόσληψη φυλλικού οξέος ή κατανάλωση αλκοόλ, το κάπνισμα, το οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου, την ηλικία κατά κλήρωση αίμα, χρόνος από τη διάγνωση, καθώς και δύο SNPs στο

MTHFR

γονίδιο (C677T [rs1801133] και A1298C [rs1801131]), πραγματοποιήσαμε αναλύσεις με στρωματοποίηση από αυτές τις μεταβλητές. Η στατιστική σημαντικότητα της αλληλεπίδρασης εκτιμήθηκε με την προσθήκη όρων πολλαπλής προϊόν από αυτές τις μεταβλητές και την κατάσταση μεθυλίωσης στο μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης, προσαρμογή για το ταίριασμα παράγοντες, καθώς και παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου.

Ανάμεσα στα άτομα ελέγχου, μια γραμμική μοντέλο παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ γονιδιωματικής κατάσταση μεθυλίωσης και σημαντικοί παράγοντες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ενός άνθρακα και γνωστά και ύποπτα παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου (πλάσματος φυλλικού οξέος, βιταμίνης Β

6, βιταμίνη Β

12, ομοκυστεΐνη, συνολικού φολικού οξέος ή κατανάλωση αλκοόλ, το κάπνισμα, οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου, ηλικία κατά την κλήρωση του αίματος, καθώς και οι δύο SNPs στο

MTHFR

γονίδιο). μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης προσαρμόστηκαν για το ταίριασμα παράγοντες, καθώς και παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου. Για να μετριάσει την επίδραση των ακραίων τιμών των συστατικών, υπολογίσαμε το γεωμετρικό μέσο όρο των επιπέδων μεθυλίωσης και των αντίστοιχων επιπέδου 95% για κάθε επίπεδο των μεταβλητών και μοντελοποιούνται ως συνεχή μεταβλητή. Για κάθε συστατικό ενός άνθρακα, δοκιμασίες για την τάση διεξήχθησαν με την μοντελοποίηση της μέσης τιμής της κάθε πεμπτημόριο ως συνεχής μεταβλητή. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις ήταν δύο όψεων και διεξάγονται χρησιμοποιώντας SAS V9.2 (SAS Institute, Cary, NC). Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Τα αρχικά χαρακτηριστικά των 358 παχέος περιπτώσεις καρκίνου και 661 ελέγχων που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η μέση ηλικία κατά τη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. περιπτώσεις ήταν 68,3 χρόνια. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ορθοκολικό καρκίνο περιπτώσεις ήταν περισσότερο πιθανό να έχουν οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου, πιο πιθανό να καπνίζουν, καταναλώνονται μεγαλύτερες ποσότητες αλκοόλ, και είχαν χαμηλότερη πρόσληψη ασβεστίου, βιταμίνης D, και φολικού οξέος, και ήταν λιγότερο δραστήριοι. Μεταξύ των ελέγχων, το επίπεδο αυτών των ορθοκολικού καρκίνου που σχετίζονται με παράγοντες που δεν μεταβλήθηκε σημαντικά ανάλογα με τα πεμπτημόρια της γονιδιωματικής επίπεδο μεθυλίωσης του DNA (Πίνακας 2).

Η

Σε γενικές γραμμές, τα επίπεδα μεθυλίωσης τοις εκατό γονιδιακού DNA δεν ήταν σχετίζονται με τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου (Πίνακας 3). Σε σύγκριση με τις γυναίκες στο χαμηλότερο πεμπτημόριο της μεθυλίωσης, η πολυμεταβλητή OR του παχέος τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου ήταν 1,32 (0,82 – 2,13) ​​για όσους το υψηλότερο πεμπτημόριο (

σ

για τάση, 0,45). Ομοίως, δεν βρήκαμε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης και τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου από δευτερεύουσες τοποθεσίες (δηλαδή, του παχέος εντέρου, του ορθού, του παχέος εντέρου εγγύς και άπω του παχέος εντέρου) (Πίνακας S1).

Η

Η συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης κατάσταση και κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου δεν διέφεραν είτε με παράγοντες του μεταβολισμού που σχετίζονται με ένα-άνθρακα ή γνωστούς παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου (όλα

σελ

για αλληλεπιδράσεις & gt? 0,05). (Πίνακας S2)

Εξετάσαμε περαιτέρω τη σύνδεση των κύριων συστατικών του μεταβολισμού ενός άνθρακα και του παχέος εντέρου που σχετίζονται με παράγοντες με γονιδιωματική κατάσταση μεθυλίωσης του DNA (Πίνακας S3). Καμία από αυτές τις μεταβλητές συνδέθηκε με την κατάσταση μεθυλίωσης (όλα

σελ

για τις τάσεις & gt? 0,05).

Σε ορθοκολικό καρκινικό ιστό από ένα υποσύνολο των παχέος περιπτώσεων καρκίνου [18], [19] , εκτιμήσαμε τα επίπεδα της μακράς διάσπαρτες νουκλεοτιδίου στοιχείο-1 (LINE-1) μεθυλίωση, η οποία μπορεί να συσχετιστεί με την παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης του DNA. Αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των λευκοκυττάρων γονιδιωματικού επίπεδα μεθυλίωσης του DNA και τα επίπεδα μεθυλίωσης γραμμή όγκου-1 μεταξύ των περιπτώσεων με LINE-1 τιμές? ο συντελεστής συσχέτισης Pearson ήταν 0,11 (

σ

= 0,19) σε 141 δείγματα.

Συζήτηση

Η μεθυλίωση του DNA παίζει κρίσιμο μηχανιστικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων και την κυτταρική διαφοροποίηση. Διατήρηση τα πρότυπα της μεθυλίωσης του DNA είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην επιγενετική έλεγχο των γονιδιωματικών σταθερότητα και τη ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής [20], [21]. Σε ευκαρυωτικά κύτταρα, μεθυλίωση του DNA παρουσιάζεται στην θέση άνθρακα-5 της κυτοσίνης, δηλαδή, μία ομάδα μεθυλίου μεταφέρεται από τη δότης μεθυλίου S-αδενοσυλομεθειονίνη την κυτοσίνη-5 του άνθρακα κατά μεθυλοτρανσφεράσες DNA. Αυτές οι μεθυλτρανσφεράσες αναγνωρίζουν κατά κύριο λόγο την ακολουθία κυτοσίνης-γουανίνης (CpG) και πάνω από το 70% των υπολειμμάτων κυτοσίνης σε CpG δινουκλεοτίδια γενωμικού DNA θηλαστικών είναι μεθυλιωμένα [22].

Ένα αλλαγμένο προφίλ γονιδιωματικού μεθυλίωσης του DNA απαντάται συχνά σε καρκίνους. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA είναι κοινή σε νεοπλασματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων διαδεδομένη γονιδιωματική υπομεθυλίωση και υπερμεθυλίωση των συστάδων CpG γνωστή ως νησίδες CpG, ως επί το πλείστον κατοικούν στο γονιδιακές περιοχές προαγωγέα [22]. Τέτοιες αλλαγές στο DNA μεθυλίωση μπορεί να συμβάλει στην καρκινογένεση με την προώθηση της έκφρασης των ογκογονιδίων και μεταγραφική αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων ή /και κάνοντας κρίσιμο ογκοκατασταλτικά γονίδια πιο επιρρεπή σε βλάβες στο DNA [2], [23], [24].

το γονιδιακό DNA υπομεθυλίωσης είναι ένα πρώιμο και συνεπής εκδήλωση του ορθοκολικού καρκινογένεση [25], [26]. Για παράδειγμα, μια μελέτη ελέγχου 35 περιπτώσεις ορθοκολικού αδενώματος (α προκακοήθη κατάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου) διαπιστώθηκε ότι τόσο του παχέος και λευκοκυττάρων υπομεθυλίωσης DNA σχετίζονταν σημαντικά με αυξημένο κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος [27]. Ομοίως, χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο LC /MS χρησιμοποιείται εδώ για δοκιμασία μεθυλίωσης, μια συγχρονική μελέτη που διεξήχθη από Lim et al. διαπίστωσε ότι υπομεθυλίωση λευκοκυττάρων γενωμικού DNA συνδέθηκε με αυξημένο κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος [3]. Σε σύγκριση με εκείνες στο υψηλότερο τριτημόριο της γονιδιωματικής μεθυλίωσης, οι συμμετέχοντες στο χαμηλότερο τριτημόριο είχαν Ή από 5,88 (95% CI, 2,04 έως 16,67) για τον κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος. Αντίθετα, για καρκίνο του παχέος εντέρου, μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων των 28 περιπτώσεις και 76 έλεγχοι δεν βρίσκουν σύνδεσης είτε με παχέος εντέρου ή λευκοκυττάρων γονιδιακού DNA επίπεδο μεθυλίωσης [27]. Βρήκαμε επίσης καμία συσχέτιση μεταξύ των προ-διαγνωστικών κατάσταση γονιδιωματική μεθυλίωση του DNA και του παχέος τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Ομοίως, χρησιμοποιώντας ουσιαστικά την ίδια μέθοδο LC /MS, Huang et al. δεν διαπίστωσε καμία σαφή σχέση μεταξύ του επιπέδου των λευκοκυττάρων μεθυλίωση και κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου [28]. Σημειώνουμε, ωστόσο, ότι τα στοιχεία σχετικά με γονιδιωματικής υπομεθυλίωσης του DNA και του κινδύνου καρκίνου είναι αμφιλεγόμενη, διότι η περιφερειακή υπερμεθυλίωση μπορεί επίσης να σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου [22], [29], [30], [31].

Ένα ζήτημα να συζητηθεί είναι ο λόγος για τα αποτελέσματά μας διαφέρουν από εκείνες των Lim et al. [3]. Χρησιμοποιήσαμε την ίδια δοκιμασία, και αν και τα απόλυτα επίπεδα μεθυλίωσης ήταν ελαφρώς χαμηλότερα στη μελέτη μας, οι περιοχές ήταν πολύ παρόμοια. Έτσι, η κατάταξη των θεμάτων θα πρέπει να είναι η ίδια. Είναι ενδιαφέρον, Lim et al. [3] ανιχνεύονται με τη σύνδεση με το επίπεδο μεθυλίωσης μόνο σε μη προχωρημένο αδενώματα, αν και είχαν περιορισμένο αριθμό προηγμένων αδενωμάτων. Συνεπώς, είναι εύλογο ότι γονιδιωματικής υπομεθυλίωσης μπορεί να είναι πιο σχετικές για μια υπο-ομάδα των αδενωμάτων λιγότερο πιθανό να εξελιχθεί σε κακοήθεια.

Γενικά γονιδιωματικής υπομεθυλίωσης του DNA θα μπορούσε σε κάποιο βαθμό να προέρχονται από ανώμαλο μεταβολισμό ενός άνθρακα [2] . Ένα από τα κεντρικά στοιχεία στην οδό μεταβολισμό μεθυλ-ομάδα είναι το φυλλικό οξύ, το οποίο δωρίζει ένα μόνο άνθρακα για να ομοκυστεΐνης για να σχηματίσουν μεθειονίνη, η οποία στη συνέχεια μετατρέπεται σε S-αδενοσυλομεθειονίνη, στην οποία το DNA μεταφέρει την ομάδα μεθυλίου [32], [33], [34]. Μέχρι σήμερα, το φυλλικό οξύ και άλλοι σημαντικοί παράγοντες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ενός άνθρακα συμπεριλαμβανομένης της βιταμίνης Β

6, βιταμίνη Β

12, ομοκυστεΐνη, και MTHFR (μείζον φολικού μεταβολικού ενζύμου) έχουν συσχετιστεί με αρκετές θέσεις καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου, του μαστού, του παγκρέατος, του τραχήλου της μήτρας, των βρόγχων, και λευχαιμία [35]? τα αποδεικτικά στοιχεία μιας σύνδεσης με καρκίνο του παχέος εντέρου είναι πιο συναρπαστικό, τόσο των ζώων και ανθρώπινες μελέτες [36].

Μη φυσιολογικά επίπεδα σημαντικά συστατικά του μεταβολισμού ενός άνθρακα μπορεί να μεταβάλλει την κατάσταση της γονιδιωματικής μεθυλίωσης του DNA και την περαιτέρω επιρροή του παχέος καρκινογένεση [2], [36]. Για παράδειγμα, μια προηγούμενη μελέτη των 33 ηλικιωμένων γυναικών διαπίστωσε ότι η μέτρια φυλλικό οξύ εξάντληση μειώνει λευκοκυττάρων επίπεδο γονιδιώματος μεθυλίωσης του DNA [37]. Επιπλέον, δύο SNPs στο

MTHFR

γονίδιο (C677T και A1298C) έχουν συσχετιστεί με γονιδιωματική επίπεδα μεθυλίωσης του DNA [13], [38], [39]. Οι μεταφορείς του γονότυπου 677TT είχαν χαμηλότερα λευκοκυττάρων γονιδιωματικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA από αυτούς με το 677CC άγριου τύπου γονότυπο, και το επίπεδο μεθυλίωσης γονιδιωματικού ϋΝΑ συσχετίστηκε επίσης με αυξημένο κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος και καρκίνου, ειδικά σε άτομα με χαμηλότερα επίπεδα φολικού οξέος [14] , [38], [39]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη από τον Huang et al. [28] ανέφεραν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των φυσικών πρόσληψη φυλλικού οξέος και του παχέος εντέρου μεταξύ των ατόμων με το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης (

σ

για την αλληλεπίδραση, 0,003). Στη μελέτη μας, τα βασικά συστατικά του μεταβολισμού ενός άνθρακα, συμπεριλαμβανομένων του φολικού οξέος δεν βρέθηκαν να επηρεάζουν λευκοκυττάρων γονιδιωματικής κατάσταση μεθυλίωσης του DNA ή τη σχέση μεταξύ γονιδιωματικής επίπεδο μεθυλίωσης του DNA και του παχέος τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι ορισμένοι από τους δείκτες στο μεταβολισμό ενός άνθρακα εμπλέκονται όχι μόνο στη μεθυλίωση του DNA, αλλά και σε πολλές άλλες οδούς [40].

Η LC /MS μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη να αξιολογήσει παγκόσμιο επίπεδο μεθυλίωσης του DNA στα λευκοκύτταρα του αίματος διαφέρει από την αξιολόγηση της LINE-1 κατάσταση μεθυλίωσης σε ένα επιμέρους δείγμα του παχέος καρκινικών ιστών [19]. LINE-1 CpG το νησιωτικό μεθυλίωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA, χρησιμοποιώντας PCR και επακόλουθη Pyrosequencing. επίπεδα μεθυλίωσης του LINE-1 υπολογίστηκε από τις ποσότητες των «C» σε σχέση με το άθροισμα των ποσοτήτων των «C» και «Τ» σε κάθε θέση CpG. Σημειώνουμε ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης στο αίμα σε σχέση με τα δείγματα ιστού έχουν διαφορετικές επιπτώσεις. Η κατάσταση μεθυλίωσης στο αίμα μπορεί να αντιπροσωπεύει συστημικό κατάσταση μεθυλίωσης του σώματος και όχι την κατάσταση σε ένα συγκεκριμένο όργανο. Δεν βρήκαμε μια σημαντική σχέση μεταξύ παγκόσμιο επίπεδο μεθυλίωσης του DNA στο αίμα και το επίπεδο μεθυλίωσης LINE-1 σε ορθοκολικό ιστό του όγκου. Μια πρόσφατη μελέτη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [41] διαπιστώθηκε ότι η μέση επί τοις εκατό LINE-1 επίπεδο μεθυλίωσης μετρήθηκε σε λευκής στιβάδας συσχετίστηκε με ότι στον ορό, αλλά όχι με αυτό στον ιστό του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το επίπεδο μεθυλίωσης που μετράται στο αίμα δεν μπορεί να αντανακλά το επίπεδο των ιστών .

Αναγνωρίζουμε ότι υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για την αξιολόγηση της γονιδιωματικής κατάσταση μεθυλίωσης του DNA στο αίμα. Ωστόσο, η τρέχουσα μελέτη, καθώς και οι άλλες δύο μελέτες [3], [28] που έγινε μέχρι σήμερα, για τη σύνδεση μεταξύ γονιδιωματικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA σε λευκοκυττάρων του αίματος και του κινδύνου ορθοκολικού αδενώματος ή του παχέος εντέρου έχουν χρησιμοποιηθεί ουσιαστικά η ίδια LC /MS μέθοδος για τη μέτρηση παγκόσμιο επίπεδο μεθυλίωσης του DNA. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο, ούτε μελέτη μας, ούτε την μελέτη που διεξήχθη από Huang et al. [28] βρήκαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των προ-διαγνωστικό επίπεδο γονιδιώματος μεθυλίωσης του DNA και του παχέος τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου, ενώ η μελέτη που διεξήχθη από Lim et al. [3] εντοπίζονται σύνδεσης μεταξύ της τριτοβάθμιας γονιδιωματική μεθυλίωση των λευκοκυττάρων DNA και μειωμένο κίνδυνο ορθοκολικού αδενώματος.

Η μελέτη μας έχει πολλές αντοχές. Πρώτον, μετρήσαμε προ-διαγνωστικό λευκοκυττάρων επίπεδο μεθυλίωσης γονιδιωματικού DNA μεταξύ των ατόμων από μια μεγάλη προοπτική κοόρτη, διασφαλίζοντας ότι το μέτρο του επιπέδου μεθυλίωσης του DNA προηγείται ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου έως 32 ετών. Δεύτερον, μελέτη ασθενών-μαρτύρων μας ήταν ένθετα μέσα σε ένα μεγάλο καλά χαρακτηρίζεται ομάδα στην οποία επελέγησαν μάρτυρες από την ίδια ομάδα, ελαχιστοποιώντας την πιθανότητα διαστρωμάτωση του πληθυσμού ή μεροληψία επιλογής [42]. Τρίτον, επαναλαμβανόμενες μετρήσεις τόσο των διατροφικών και μη διατροφικών παραγόντων μας επέτρεψε να χρησιμοποιήσουμε επανειλημμένες και επικαιροποιημένες πληροφορίες σχετικά με τις εν λόγω συγχυτικούς παράγοντες, μειώνοντας την πιθανότητα σφάλματος μέτρησης.

Ένας πιθανός περιορισμός της μελέτης αυτής είναι η έλλειψη της γενίκευσης της ο πληθυσμός της μελέτης, επειδή οι συμμετέχοντες μας είναι ένα παλαιότερο, μη τυχαίο δείγμα των ΗΠΑ γυναίκες. Ωστόσο, είναι απίθανο ότι η βιολογική σχέση μεταξύ του επιπέδου της μεθυλίωσης του DNA και του παχέος κίνδυνο καρκίνου σε ομάδα μας θα διαφέρουν αισθητά από τις γυναίκες των ΗΠΑ γενικότερα. Σε προηγούμενες αναλύσεις από το NHS, ανιχνεύσαμε ενώσεις για τον ορθοκολικό καρκίνο και άλλες ασθένειες που είναι πολύ παρόμοια με εκείνα που βρέθηκαν σε άλλους πληθυσμούς ΗΠΑ ευρεία βάση. Αν υπολειπόμενη συγχυτική δράση είναι μια ανησυχία σε μελέτες παρατήρησης, προσαρμογή για πολυμεταβλητή παχέος παράγοντες κινδύνου καρκίνου μόνο ελάχιστα επηρέασε τα ευρήματά μας, γεγονός που υποδηλώνει μικρή πιθανότητα για υπολειμματική ή ανεξέλεγκτη σύγχυση. Η στατιστική ισχύ για τις υπο-ομάδες αναλύσεις ήταν μέτρια? Οι πρόσθετες μελέτες δικαιολογείται να επιβεβαιώσετε τις συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν στην παρούσα μελέτη.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας δεν υποστηρίζει την υπόθεση ότι η προ-διαγνωστική υπομεθυλίωση των λευκοκυττάρων γονιδιακού DNA αυξάνει τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου. Πρόσθετες μελέτες για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ των προ-διαγνωστικό επίπεδο γονιδιώματος μεθυλίωσης του DNA και του παχέος κίνδυνο καρκίνου μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

σύνδεσης μεταξύ γονιδιωματικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA και του κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου, σύμφωνα με δευτερεύουσες τοποθεσίες του παχέος εντέρου.

doi: 10.1371 /journal.pone.0059455.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου, σύμφωνα με γενωμική κατάσταση μεθυλίωσης του DNA, στρωματοποιημένη από παράγοντες του μεταβολισμού που σχετίζονται με ένα-άνθρακα.

doi: 10.1371 /journal.pone.0059455.s002

(DOCX)

Πίνακα S3.

σύνδεσης του μεταβολισμού ενός άνθρακα και του παχέος εντέρου συνδέονται με παράγοντες με επίπεδα μεθυλίωσης τοις εκατό γονιδιωματικού DNA ανάμεσα σε ελέγχους.

doi: 10.1371 /journal.pone.0059455.s003

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε κυρία Rong Chen για την υποστήριξη του προγραμματισμού της. Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε τους συμμετέχοντες και το προσωπικό της μελέτης Nurses ‘Health για την πολύτιμη συμβολή τους, καθώς και τα ακόλουθα μητρώα καρκίνου του κράτους για τη βοήθειά τους: AL, AZ, AR, CA, CO, CT, DE, FL, GA, ID, IL, IN, ΙΑ, KY, LA, ME, MD, ΜΑ, MI, NE, ΝΗ, NJ, NY, NC, ND, OH, OK, Ή, PA, RI, SC, TN, TX, VA, WA, WY.