Abstract

Ιστορικό

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) υπερεκφράζεται στο 80% των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και συνδέεται με κακή επιβίωση. Τα τελευταία χρόνια, οι αναστολείς που στοχεύουν EGFR έχουν δοκιμαστεί στην κλινική για NSCLC. Παρά την εμφάνιση νέων θεραπευτικών και την εφαρμογή τους στη θεραπεία του καρκίνου, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα παραμένει 15%. Να αναπτύξουν πιο αποτελεσματικές θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα έχουμε συνδυάσει την αντι-EGFR αντίσωμα (Κλώνος 225) ως ένα μοριακό θεραπευτικές με υβριδικά plasmonic μαγνητικά νανοσωματίδια (NP) και δοκιμάστηκε σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με trypan-blue δοκιμασία. έκφραση Cellular πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. C225-NPs ανιχνεύθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και συνεστιακή μικροσκοπία, και η έκφραση του EGFR χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημεία. C225-ΝΡ παρουσίασαν ισχυρή και επιλεκτική του όγκου αποτέλεσμα επί EGFR κύτταρα που εκφράζουν NSCLC με αναστολή EGFR-μεσολαβούμενη μεταγωγή σήματος και επάγεται αυτοφαγία και την απόπτωση σε κύτταρα όγκου. Οπτικές εικόνες έδειξαν εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ C225-NP και EGFR-κυττάρων που εκφράζουν NSCLC. Δεν δέσμευση του C225-NP παρατηρήθηκε για τα κύτταρα NSCLC EGFR-null. C225-ΝΡ παρουσίασαν υψηλότερη απόδοση σε επαγωγή θανάτωσης κυττάρων, σε σύγκριση με την ίδια ποσότητα του ελεύθερου αντισώματος C225 σε καρκινικά κύτταρα με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης EGFR. Επιπλέον, σε αντίθεση με C225-NP, ελεύθερο αντίσωμα C225 δεν επάγουν αυτοφαγία στα κύτταρα. Ωστόσο, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα των C225-ΝΡ πλησίασε σταδιακά το επίπεδο των ελεύθερων αντισωμάτων ως η ποσότητα του C225 αντισώματος συζευγμένου ανά νανοσωματιδίων μειώθηκε. Τέλος, επισυνάπτοντας C225 για να NP ήταν σημαντικό για την παραγωγή της ενισχυμένης θανάτωση των καρκινικών κυττάρων ως προσθήκη μίγματος των ελεύθερων C225 και ΝΡ δεν έδειξε τον ίδιο βαθμό δραστηριότητας θανάτωσης κυττάρων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Δείξαμε για πρώτη φορά ο μοριακός μηχανισμός του C225-ΝΡ που επάγεται κυτταροτοξικά αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα που δεν είναι χαρακτηριστικές για δωρεάν μοριακού θεραπευτικά αυξάνοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της θεραπείας έναντι NSCLC

Παράθεση:. Yokoyama Τ, Tam J, Kuroda S, Scott AW, Aaron J, Larson T, et al. (2011) στοχεύει EGFR Hybrid plasmonic μαγνητικά νανοσωματίδια συνεργιστικά Προκαλέστε Autophagy και την απόπτωση στα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 6 (11): e25507. doi: 10.1371 /journal.pone.0025507

Επιμέλεια: Sujit Basu, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9, Αυγ, 2011? Αποδεκτές: 5 Σεπτέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 7, Νοέμ του 2011

Copyright: © 2011 Yokoyama et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγεί R01CA103830, RO3EB009182, P50CA070907 (SPORE στον καρκίνο του πνεύμονα), CA16672, και η Joans Legacy: United κατά του καρκίνου του πνεύμονα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) υπερεκφράζεται στο 80% των NSCLC και συνδέεται με κακή επιβίωση [1]. Τα τελευταία χρόνια, οι αναστολείς που στοχεύουν EGFR έχουν δοκιμαστεί στην κλινική για NSCLC [2] – [6]. Ωστόσο, οι αναδυόμενες μοριακή θεραπευτική παρήγαγε μέτριες αυξήσεις στην επιβίωση των ασθενών πάνω από την επιβίωση των ασθενών που λάμβαναν τυπική μη-στοχευμένες θεραπείες. Ως αποτέλεσμα, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα παραμένει λιγότερο από το 16% [7]. Έτσι, εξακολουθεί να υπάρχει κίνητρο για την ανάπτυξη και τη δοκιμή νέων θεραπειών. Η προσέγγισή μας για να ξεπεραστεί ο περιορισμός των υφιστάμενων θεραπειών ήταν να συνδυάσει το μοριακό θεραπευτικά με την αναδυόμενη τομέα της νανοτεχνολογίας και των δοκιμών κατά του καρκίνου του πνεύμονα.

Έχει δείξει πειστικά ότι η νανοτεχνολογία μπορεί να προσφέρει μοναδικές λύσεις για να ξεσηκώσει τη διάγνωση και τη θεραπεία της πολλές καταστροφικές ασθένειες όπως ο καρκίνος [1], [8] – [11]. Ένα συγκεκριμένο πεδίο μεγάλου ενδιαφέροντος είναι η ανάπτυξη νανοσωματιδίων για τη μοριακή συγκεκριμένη απεικόνιση, θεραπεία και σε συνδυασμό απεικόνισης /θεραπεία [12] – [13]. Πολυπλεξία διαφορετικούς τύπους νανοσωματιδίων (NPS) και μόρια στόχευσης παρέχει μια κοινή πλατφόρμα για πολλαπλές εφαρμογές απεικόνισης με υψηλό βαθμό ευελιξίας [14] – [15]. Αν και η θεραπεία απεικόνισης και φωτοθερμικών με plasmonic και υβριδικά plasmonic NPs έχουν αρκετά εκτεταμένα μελετηθεί, οι μοριακοί μηχανισμοί της ΝΡ αλληλεπιδράσεων με ζωντανά κύτταρα δεν είναι πλήρως κατανοητός. Πρόσφατα, καταδείχθηκε ότι NPs αλληλεπιδρούν με κύτταρα σε ένα μέγεθος που εξαρτάται από τον τρόπο με 40-50 nm NPs δείχνει την μεγαλύτερη κυτταρική πρόσληψη [16]. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη τα αποτελέσματα μοριακής σηματοδότησης παρακάτω ΣΔ πρόσληψη δεν ερευνήθηκε.

Στην παρούσα μελέτη συνδυάσαμε την αντι-EGFR αντίσωμα (Κλώνος 225) ως ένα μοριακό θεραπευτικές με υβριδικά plasmonic μαγνητική ΣΔ και μελέτησε τη μοριακή αλληλεπιδράσεις μεταξύ στοχεύουν EGFR NP (225-ΝΡ) στην περιοχή μεγέθους των 40-50 nm και ανθρώπινα κύτταρα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Το 225-ΝΡ αποτελείται από ένα παραμαγνητικό πυρήνα σιδήρου που περιβάλλεται από ένα στρώμα χρυσού και είναι λειτουργοποιημένο με μονοκλωνικά αντισώματα αντι-ΕΟΡΚ (Κλώνος 225). Χρησιμοποιήσαμε τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης EGFR και άλλαξε η σύνθεση επιφάνεια του ΝΡ για τη διαλεύκανση των μηχανισμών αυτών των αλληλεπιδράσεων. Η αρχική μας στόχος ήταν να χρησιμοποιήσει C225-ΝΡ ως ένας παράγοντας απεικόνισης στοχεύουν EGFR που υπερεκφράζουν καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι η C225-ΝΡ επιλεκτικά κυτταροτοξική για EGFR που υπερεκφράζει καρκινικά κύτταρα πνεύμονα πέρα ​​από αυτό που θα αναμενόταν από το μη συζευγμένο αντίσωμα. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια νέα κατεύθυνση προς την αύξηση της δραστικότητας της μοριακής ειδικών θεραπευτικών μέσω τρισδιάστατη διάταξή τους σε νανοκλίμακα, χρησιμοποιώντας ΣΔ ως πρότυπα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

225-NP-θεραπεία ρυθμίζει EFGR- μονοπάτι σηματοδότησης και να σκοτώσει το πνευμονικά κύτταρα όγκου πιο αποτελεσματικά από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα

Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε EGFR (φωσφορυλιωμένου και σύνολο) έκφραση σε αρκετές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC που είναι άγριου τύπου (H1229), μεταλλαγμένα και υπερεκφράζεται (HCC827, H1975 , H3255), ενισχύεται (H1819), ή null (H520) για EGFR και σε σύγκριση με την έκφραση του EGFR σε φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα (MRC-9 και WI38) και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ) με κηλίδωση Western. Τόσο σύνολο και φωσφορυλιωμένο EGFR (pEGFR) έκφραση ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν, εκτός από H520 κυττάρων τα οποία είναι μηδενική για EGFR. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης pEGFR ποικίλει μεταξύ των κυτταρικών γραμμών με υψηλή έκφραση ανιχνεύθηκε σε HCC827, H1819 και H3255 κύτταρα (Σχήμα 1α). κύτταρα Η1299 είχαν ένα ενδιάμεσο επίπεδο έκφρασης της pEGFR. Αντίθετα, τα φυσιολογικά κύτταρα (ΝΗΒΕ, MRC-9, και WI38) και H1975 κύτταρα εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα pEGFR. Η θεραπεία με C225-ΝΡ σημαντικά (Ρ = & lt? 0,05) μείωσε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων EGFR θετικά HCC827, Η1299, και H1819 σύγκριση με τη θεραπεία με έλεγχο IgG-ΝΡ (Εικόνα 1β.). Οι C225-NP-μεσολάβηση ανασταλτικά αποτελέσματα ωστόσο μεταβάλλεται μεταξύ των καρκινικών κυτταρικών γραμμών δοκιμάστηκε και ήταν ανεξάρτητο της κατάστασης μεταλλάξεων EGFR. Δεν ανασταλτικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε C225-NP-αγωγή H520 κύτταρα σε σύγκριση με IgG-NP-κατεργασμένα κύτταρα. Μεταξύ των φυσιολογικά κύτταρα, MRC-9 αλλά δεν ΝΗΒΕ κύτταρα έδειξαν κάποια ανασταλτικά αποτελέσματα όταν κατεργάζεται με C225-ΝΡ και συγκρίθηκε με τη θεραπεία IgG-ΝΡ (Εικόνα 1Β). Ωστόσο, τα ανασταλτικά αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε C225-NP-αγωγή MRC-9 (9%) των κυττάρων ήταν χαμηλότερα από τα ανασταλτικά αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε C225-NP-αγωγή καρκινικών κυττάρων (14-18%).

(α ) Έκφραση του φωσφορυλιωμένου και συνολικού EGFR σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Β) θανάτωση κυττάρων σε απάντηση EGFR-στοχευμένες C225-NP για NSCLC και φυσιολογικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P-value & lt?. 0.05 vs IgG-NP για Η1299, HCC827 και H1819 κυττάρων

Η

Στη συνέχεια, εκτιμήσαμε την πρωτεΐνη έκφραση φωσφορυλιωμένη EGFR και EGFR-μόρια που συνδέονται σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα σηματοδότησης μετά επεξεργασία με το IgG- ή C225-ΝΡ. Μειωμένη έκφραση του φωσφορυλιωμένου-EGFR, -Akt, -p38MAPK, και ρ44 /42MAPK μετά τη θεραπεία C225-ΝΡ παρατηρήθηκε σε HCC827 και Η1299 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο IgG-ΝΡ (Εικόνα 2). Σε κύτταρα H520 η έκφραση όλων των πρωτεϊνών αυτών παρέμεινε αμετάβλητος όταν θεραπεύτηκαν με 225-ΝΡ και συγκρίθηκε με κύτταρα επεξεργασμένα με IgG-ΝΡ (Εικόνα 2). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε έκφραση pEGFR ήταν σημαντικά μειωμένη (35%?

P

& lt? 0,05) σε HCC827 κύτταρα σε 30 και 60 λεπτά μετά την αγωγή με C225-ΝΡ σε σύγκριση με την έκφραση pEGFR σε IgG-NP-κατεργασμένα κύτταρα (8 -12%? Σχήμα S1). Σε φυσιολογικά κύτταρα (MRC-9 και ΝΗΒΕ), δεν υπήρξε αισθητή μείωση pEGFR ή οι συνδεδεμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν από IgG-NP-και C225-NP-αγωγή (Σχήμα 2).

Ανασταλτικά αποτελέσματα των C225- NP για φωσφορυλιωμένη EGFR και κατάντη μόρια σηματοδότησης στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα και φυσιολογικά κύτταρα. θεραπεία C225-ΝΡ μείωσε την έκφραση της φωσφορυλιωμένης (ρ) μορφές EGFR, ΑΚΤ, ρ38 ΜΑΡΚ, και Ρ44 /42 ΜΑΡΚ σε κύτταρα όγκων EGFR θετικά αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα. Δεν υπήρξε καμία επίδραση στα καρκινικά κύτταρα H520 EGFR-null.

Η

225-NP-επεξεργασία παράγει μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση από C225 και NP θεραπεία μόνο

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η συμβολή της μεμονωμένα συστατικά που αποτελούν το C225-ΝΡ στα παρατηρούμενα ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα. HCC827 καρκινικά κύτταρα κατεργασμένα με AuFe μόνο, και δωρεάν C225-αντίσωμα μόνο μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα κατά 12-14% σε σχέση με μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου, ενώ ο συνδυασμός της θεραπείας με δωρεάν C225-αντισώματος συν AuFe μειωμένους αριθμούς κυττάρων κατά 22% (Σχήμα 3α). Περιέργως, C225-ΝΡ μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων (48%? Ρ & lt? 0,05) που ήταν σημαντικά υψηλότερη από την ανασταλτική δράση που παράγεται από τα επιμέρους συστατικά (225 αντίσωμα, AuFe) υποδεικνύοντας σύζευξη C225 αντισώματα για ΝΡ ενισχύει την αντικαρκινική δράση του C225- ΣΔ. Για την επικύρωση περαιτέρω τα ευρήματά μας συγκρίναμε τις ανασταλτικές επιδράσεις του C225 αντισώματος με Clone 29.1 αντίσωμα. Αμφότερες κλώνος 225 και Clone 29.1 αντισώματα δεσμεύονται με EGFR. Ωστόσο, σε αντίθεση με Clone 29.1 Κλώνος 225 συνδέεται προς ένα υπόλειμμα υδατάνθρακα επί του εξωτερικού τμήματος του EGFR και δεν αναστέλλει EGF μεσολάβηση EGFR σηματοδότησης [17]. Κατεργασία HCC827 κυττάρων με C225-ΝΡ παράγεται το μεγαλύτερο ανασταλτικό αποτέλεσμα (~42%? Ρ & lt? 0,05? Σχήμα 3β) που ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με την ανασταλτική δράση που παράγεται από τον κλώνο 29.1-ΝΡ (~ 14%) και άλλες θεραπείες ελέγχου (~ 7% -15%). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σύζευξη Κλώνος 225 αντισωμάτων να AuFe NP παρέχει μια μοναδική ιδιότητα που ενισχύει την αντικαρκινική δράση εναντίον EGFR- θετικά καρκινικά κύτταρα. Παρόμοια με τα ευρήματά μας, η σύζευξη του αντισώματος αντι-ErbB2 σε σφαιρικές χρυσό NP έδειξαν αυξημένη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε σύγκριση με αντι-ΕτοΒ2 και ΝΡ μόνος [18]. Σε αυτή τη μελέτη η κυτταροτοξικότητα ερευνήθηκε ως συνάρτηση του μεγέθους ΝΡ. Ωστόσο, η μελέτη δεν ασχολήθηκε καθόλου με το μοριακό μηχανισμό για την ενίσχυση της θανάτωσης των καρκινικών κυττάρων. Η σημασία της επιφανειακής πυκνότητας των αντισωμάτων που συνδέονται με τα νανοσωματίδια, επίσης, δεν αναλύθηκε.

(α) HCC827 κύτταρα επεξεργασμένα με C225-ΝΡ επέδειξαν σημαντική όγκου θανάτωση δράση σε σύγκριση με τη θεραπεία με AuFe, 225 αντίσωμα και AuFe συν C225 αντίσωμα. * Τιμή P είναι & lt? 0,05. (Β) Σύγκριση των ανασταλτικών αποτελεσμάτων που παράγονται από 29,1-ΝΡ με C225-ΝΡ επί HCC827 κύτταρα. C225-ΝΡ θεραπεία παρήγαγε μια μεγαλύτερη θανάτωση επίδραση από ό, τι θεραπεία 29,1-ΝΡ σε σύγκριση με άλλες ομάδες θεραπείας. * P τιμή είναι & lt?. 0.05

Η

225-NP-θεραπεία προκαλεί αυτοφαγία και την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα EGFR-θετικός, αλλά όχι σε καρκινικά κύτταρα EGFR-αρνητικούς

Εδώ για να προσδιοριστεί η μοριακός μηχανισμός του C225-NP-διαμεσολαβούμενη αναστολή αύξησης όγκου πραγματοποιήσαμε αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής επί C225-NP-αγωγή HCC827 και -H520 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4α, ο πληθυσμός sub-G1, το οποίο δείχνει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων, αυξημένη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από αγωγή με C225-ΝΡ (9% -20%) επί HCC827 κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο IgG-NP- κατεργασμένα κύτταρα (4% -8%). θεραπεία C225-ΝΡ αύξησε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων σε πληθυσμό υπο-G1 από ό, τι η θεραπεία με Κλώνο 225 αντίσωμα μόνο σε ισομοριακή συγκέντρωση (Εικόνα S2). Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν υπήρξε αύξηση στον αριθμό των κυττάρων του πληθυσμού υπο-G1 σε C225-NP-αγωγή H520 κυττάρων σε σύγκριση με άλλες θεραπείες (Σχήμα 4α). Έτσι, C225-ΝΡ επαχθεί αποτελεσματικά την απόπτωση σε έκφραση EGFR HCC827 κύτταρα αλλά όχι σε EGFR κύτταρα null H520.

(α) Ποσοστό κυττάρων NSCLC αγωγή με διαφορετικές δόσεις (0,6, 1,2 και 2,4 × 10

10 σωματίδια) της IgG-ΝΡ ή C225-NP για 72 ώρες, που ήταν στην υπο-G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Το ποσοστό αυτό προσδιορίστηκε με την ανάλυση του DNA με κυτταρομετρία ροής. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και κύτταρα επεξεργασμένα με C225 αντίσωμα μόνο χρησίμευσαν ως έλεγχος. Μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση στον αριθμό των κυττάρων σε HCC827 subG1 φάση παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις επεξεργασίες IgG-ΝΡ και C225-ΝΡ. Ωστόσο, η αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε subG1 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην θεραπεία C225-ΝΡ σε σχέση με IgG-ΝΡ (

* Ρ & lt? 0,05). Δεν υπήρξε καμία σημαντική αύξηση στη φάση subG1 σε H520 κύτταρα μεταξύ IgG-NP-και C225-NP-θεραπείες. (Β) Ανίχνευση των κουκκίδων GFP-LC3 ενδεικτική της αυτοφαγία στα κύτταρα NSCLC που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή ή υπέστησαν αγωγή με C225 αντίσωμα, IgG-ΝΡ ή C225-ΝΡ (3 χ 10

9 σωματίδια) για 72 ώρες σε πλακίδια θαλάμου.

Κλίμακα ράβδου = 50 μm

(γ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός του αριθμού των κυττάρων με κουκκίδες GFP-LC3 σε μη κατεργασμένα και κατεργασμένα κύτταρα NSCLC. Ο αριθμός των κυττάρων με κουκκίδες GFP-LC3 ήταν υψηλότερη σε C225-NP-αγωγή HCC827 κυττάρων σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας. Σε H520 κύτταρα δεν υπήρξε αύξηση στον αριθμό των κουκκίδων GFP-LC3 όταν θεραπεύτηκαν με C225-ΝΡ και σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Τιμή Ρ & lt?. 0.05 vs μάρτυρας χωρίς θεραπεία, C225 αντίσωμα και IgG-ΝΡ επί HCC827 κύτταρα

Η

Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι η κβαντική τελείες επάγουν μέγεθος που εξαρτάται από αυτοφαγία σε ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα [19]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν αυτοφαγία συνέβη στα κύτταρα NSCLC μετά τη θεραπεία με C225-NP. Η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) σημασμένο με επισύναψη φορέα έκφρασης της LC3 είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την ανίχνευση αυτοφαγία [20]. Στις μικροσκοπία φθορισμού, GFP-LC3-επιμολυσμένα κύτταρα HCC827 έδειξαν διάχυτη κατανομή του GFP-LC3 για μη επεξεργασμένα κύτταρα και κύτταρα επεξεργασμένα με τον κλώνο 225 αντίσωμα μόνο και με IgG-ΝΡ, ενώ τα κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία με C225-ΝΡ έδειξε τελείες στικτή GFP-LC3 ενδεικτικό της αυτοφαγικά κενοτοπίων (Εικόνα 4Β). Το ποσοστό των κυττάρων με τελείες στικτή GFP-LC3 αυξήθηκε μετά από αγωγή με C225-ΝΡ για HCC827 κύτταρα (Σχήμα 4c? Ρ & lt? 0,05). Επαγωγή autophagy προσδιορίζεται με GFP-LC-3 τελείες επίσης σημαντικά αυξημένη σε C225-NP-αγωγή Η1299 κυττάρων σε σύγκριση με άλλες ομάδες θεραπείας (Σχήμα S3). Σε αντίθεση, η ποσότητα των κουκκίδων στικτή GFP-LC3 δεν ήταν διαφορετική στις C225-ΝΡ αγωγή H520 κύτταρα και ομάδες ελέγχου (Σχήμα 4b, c).

Στη συνέχεια εξετάσαμε τα κύτταρα σε επεξεργασία με C225-ΝΡ για την παρουσία και το χρονοδιάγραμμα των πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση και LC3 έκφρασης, τα οποία είναι μοριακοί δείκτες ενδεικτικές κυττάρων που υφίστανται απόπτωση και autophagy αντίστοιχα. διάσπαση PARP ήταν εμφανής στις 24 ώρες μετά την αγωγή με IgG-NP-και C225-ΝΡ του HCC827, αλλά όχι H520 κύτταρα? Ωστόσο, η διάσπαση PARP ήταν υψηλότερη με C225-ΝΡ από ότι με τον έλεγχο-ΝΡ σε HCC827 κύτταρα (Σχήμα 5α). Η πρωτεΐνη LC3 υπάρχει σε δύο κυτταρικών μορφών, LC3-Ι και LC3-II. LC3-Ι μετατρέπεται σε LC3-ΙΙ με σύζευξη σε φωσφατιδυλαιθανολαμίνη, και η ποσότητα της LC3-ΙΙ συσχετίζεται στενά με τον αριθμό των αυτοφαγοσώματα [21]. Σε HCC827 κύτταρα, η θεραπεία με C225-ΝΡ αύξησε σημαντικά το ποσό του LC3-ΙΙ με τρόπο που εξαρτάται χρόνου (Σχήμα 5α). Επιπλέον, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η συσσώρευση LC3-ΙΙ με μεγαλύτερη ακρίβεια εκπροσωπείται σε αυτοφαγικά ροή υπό την παρουσία αναστολέων λυσοσωμικού [22]. Με την παρουσία των αναστολέων πρωτεάσης E-64-d και πεπστατίνη Α, ενδογενής LC3-ΙΙ αυξήθηκε μετά από αγωγή με IgG-ΝΡ και C225-ΝΡ σε HCC827 κύτταρα (Σχήμα 5β). Ωστόσο, η αύξηση σε LC3-ΙΙ ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα κατεργασμένα με C225-ΝΡ από IgG-ΝΡ. Αύξηση LC3-ΙΙ παρουσία αναστολέων πρωτεάσης παρατηρήθηκε επίσης σε C225-NP-αγωγή Η1299 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση, η ποσότητα της LC3-ΙΙ δεν αυξήθηκε σε H520 κύτταρα κατά τη διάρκεια 72 ώρες θεραπείας με C225-ΝΡ σε σύγκριση με τη θεραπεία με IgG-ΝΡ (Εικόνα 5α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι C225-NP προκάλεσε τόσο απόπτωση και αυτοφαγία ταυτόχρονα σε EGFR-εκφράζεται κύτταρα NSCLC. Απροσδόκητα, autophagy παρατηρήθηκε επίσης σε IgG-NP-κατεργασμένων κυττάρων αν και μικρότερη από αυτή που παρατηρήθηκε σε C225-NP-κατεργασμένα κύτταρα και είχαν λιγότερη επίδραση επί των καρκινικών κυττάρων θανάτωσης. Υποθέτουμε ότι το κατώτατο όριο autophagy σε C225-NP-κατεργασμένα κύτταρα είναι ισχυρότερη λόγω της παρουσίας των αντι-EGFR αντισώματα και δρα ως ενεργοποιητής θάνατος οδηγεί στην ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Αντίθετα, η αυτοφαγία των IgG-NP-επεξεργασμένα κύτταρα πιθανόν χρησιμεύει ως ένα σήμα επιβίωσης και προστατεύει από τον κυτταρικό θάνατο. Πρόσθετες διαφορές μπορεί να υπάρχουν και επί του παρόντος διερευνά το μηχανισμό στο εργαστήριο.

(α) Οι κυτταρικές πρωτεΐνες λύθηκαν στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά τη θεραπεία με σωματίδια IgG-NP ή C225-NP (0,6 × 10

10 σωματίδια) και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western. Σε HCC827 αλλά όχι σε κύτταρα H520, αυξημένη διάσπαση PARP και LC3-ΙΙ παρατηρήθηκε στις 48 ώρες και 72 ώρες μετά την αγωγή με C225-ΝΡ και σε σύγκριση με τη θεραπεία με IgG-ΝΡ και χωρίς θεραπεία ελέγχου. Οι εντάσεις του ποσού των ζωνών LC3-ΙΙ ημι-ποσοτικά με λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (β) κύτταρα HCC827 υποβλήθηκαν σε αγωγή με IgG-ΝΡ ή C225-NP για 68 ώρες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν περαιτέρω με ή χωρίς αναστολείς πρωτεάσης [10 μg /ml Ε-64-ά και 10 μg /ml πεπστατίνη Α (ΒΙΟΜΟΕ Διεθνής LP, Plymouth Meeting, ΡΑ)] επί 4 ώρες. Cellular πρωτεΐνες λύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα αντι-LC3. επίπεδα πρωτεΐνης LC3-ΙΙ αυξήθηκαν με την παρουσία αναστολέων πρωτεάσης σε όλες τις ομάδες που υποδεικνύει εμφάνιση αυτοφαγία. Οι εντάσεις του ποσού των ζωνών LC3-II ήταν ημι-ποσοτικά με το λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health).

Η

Για να αναλυθεί η σχέση μεταξύ C225-NP και αυτοφαγία, προσδιορίσαμε τον εντοπισμό του C225 -NP και αυτοφαγικά κενοτόπια, χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (ΤΕΜ). HCC827 κύτταρα κατεργασμένα με τον κλώνο 225 αντίσωμα ή IgG-ΝΡ παρουσίασαν πολύ λίγες αυτοφαγικά χαρακτηριστικά, ενώ παρατηρήθηκαν πολλές αυτοφαγικά κενοτόπια μετά την αγωγή με C225-ΝΡ (Εικόνα 6?

P

& lt? 0,05). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ τα περισσότερα από τα C225-ΣΔ παρατηρήθηκαν μέσα αυτοφαγικά και άδειο κενοτόπια, μερικοί ΣΔ παρατηρήθηκαν επίσης στο εσωτερικό των πυρήνων. Παρόμοια την ΤΕΜ ανάλυση, συνεστιακή μικροσκοπία αποκάλυψε επίσης κάποιες NPs μέσα πυρήνες σε C225-NP-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 7). Αν και θα μπορούσε να αποδείξει την παρουσία της NPS στον πυρήνα των κυττάρων δεν είχαμε τον ποσοτικό προσδιορισμό του αριθμού των NPs παρόν μέσα στον πυρήνα του κυττάρου. Αυτό είναι λόγω της μερικούς από τους περιορισμούς που υπάρχουν με ΤΕΜ και συνεστιακή μικροσκοπία τεχνικές. Για παράδειγμα, η ποσοτικοποίηση του ποσοστού των πυρηνικού εντοπισμού θα απαιτούσε αναλύσεις πολλαπλών κυττάρων μέσω ολικό κυτταρικό όγκο που είναι ανέφικτο χρησιμοποιώντας τέτοια τεχνική υψηλής ανάλυσης ως ΤΕΜ. Τρισδιάστατη εντοπισμός της NPS με συνεστιακή μικροσκοπία περιπλέκεται από το γεγονός ότι μετά την κυτταρική πρόσληψη των NPs συσσωρεύονται στο περιπυρηνική χώρο. Ως εκ τούτου, η οπτική ανάλυση δεν επαρκεί για το διαχωρισμό NPs τα οποία βρίσκονται σε στενή γειτνίαση της πυρηνικής μεμβράνης στην κυτταροπλασματική και για τις πυρηνικές πλευρές. Επιπλέον, συνεστιακή μικροσκοπία από πολύ φωτεινά αντικείμενα όπως ΣΔ μπορεί να οδηγήσει σε μια ισχυρή έξω σήματος εστίασης που μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη ερμηνεία των τρισδιάστατων κατανομή των νανοσωματιδίων. Οι περιορισμοί των τρισδιάστατων εντοπισμό της NPS χρησιμοποιώντας ομοεστιακό οπτικό μικροσκόπιο αποδείχθηκε πρόσφατα στην [23], όπου συνεστιακή μικροσκοπία χονδροειδώς υπερεκτιμήσει την κυτοσολική πρόσληψη των κβαντικών κουκίδων.

Electron μικροφωτογραφίες που δείχνουν την υπερδομή ενός κυττάρου, συμπεριλαμβανομένης της πυρήνα (Ν), από HCC827 κύτταρα κατεργασμένα με αντίσωμα C225 (0.065 μg /ml), IgG-ΝΡ, ή C225-ΝΡ (0.6 × 10

10 σωματίδια) για 72 ώρες. (I) μη επεξεργασμένα κύτταρα (ii) C225 αντίσωμα κύτταρα επεξεργασμένα (iii) IgG-NP-κατεργασμένα κύτταρα (iv) C225-NP-κατεργασμένα κύτταρα (ν) μια μεγεθυμένη άποψη της περιοχής στο κουτί (iv). Το βέλος δείχνει NP, και το βέλος υποδεικνύει αυτοφαγοσώματα που περιλαμβάνει υπολειμματικό υλικό και ΝΡ στο κυτταρόπλασμα (vi) C225-ΝΡ ανιχνεύεται μέσα στον πυρήνα. Το βέλος δείχνει NP στον πυρήνα.

Κλίμακα ράβδου = 1 μm.

(Vii) αυτοφαγοσώματα ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. * P-value & lt?. 0.05 vs ελέγχου, C225 αντίσωμα και IgG-NP για 48 και 72 ώρες

Η

(Επάνω σειρά) Ομοεστιακή εικόνες δείχνουν DAPI χρώση των πυρήνων (μπλε) και C225-NP (κόκκινο ). Βέλη στην «μέση» το σημείο της στήλης για να C225-NP εντοπίζεται σε έναν πυρήνα. Τα βέλη στις στήλες με την ένδειξη «κορυφή» και «κάτω» σημείο στην ίδια περιοχή σε επίπεδο xy του πυρήνα αλλά σε θέσεις πάνω και κάτω από τη μέση του πυρήνα, αντίστοιχα. Τόσο στην «κορυφή» και εικόνες «κάτω», τα βέλη δεν είναι πλέον δείχνει σε κόκκινες κηλίδες που δείχνουν ότι οι κόκκινες κηλίδες στο «μέση» εικόνα είναι πράγματι μέσα στον πυρήνα. (Κάτω σειρά) γελοιογραφία δείχνει τη θέση z της κάθε εικόνας μέσα στον πυρήνα, όπου η κόκκινη οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει τη σχετική θέση βάθος εντός του πυρήνα που οι εγκάρσιες εικόνες σταυρό (πάνω σειρά) ελήφθησαν σε.

Κλίμακα bar = 10 μm

.

Η

Σε μελλοντικές μελέτες σκοπεύουμε να ποσοτικοποιηθεί το ποσοστό της ΣΔ που υπάρχουν στο πυρήνα από τρισδιάστατο X-ray τομογραφική απεικόνιση ολόκληρων κυττάρων με επαρκή μέγεθος του δείγματος και την ανάλυση [24] και να καθορίσει τη συμβολή της πυρηνικής ΣΔ σε εκδηλώσεις κυτταρικής σηματοδότησης.

C225-NP είναι ειδική για καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν EGFR και προεπεξεργασίας με C225 αντίσωμα καταργεί C225-NP-μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων θανάτωσης

Χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία ανάκλασης σκοτεινού πεδίου για να χαρακτηρίσει την ιδιαιτερότητα των αλληλεπιδράσεων C225-ΝΡ και τη σκοπιμότητα της οπτικής ανίχνευσης του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. εικόνες ανάκλασης σκοτεινού πεδίου έδειξαν υψηλή συγκέντρωση και εσωτερικοποίηση του C225-ΝΡ σε HCC827 κύτταρα μετά από θεραπεία 24 ωρών (Σχήμα 8). Αντίθετα, μικρή ή καθόλου πρόσληψη παρατηρήθηκε σε HCC827 κύτταρα κατεργασμένα με IgG-ΝΡ. Σε H520 κύτταρα, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στο NP δέσμευσης και η πρόσληψη παρατηρήθηκε μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με C225-ΝΡ και IgG-ΝΡ (Εικόνα 8).

HCC827 και H520 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλακίδια θαλάμου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με IgG-ΝΡ ή C225- NP (0,2 × 10

10 μόρια). Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως έλεγχος. Σε 24 ώρες μετά την θεραπεία τα κύτταρα πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και εικόνες ελήφθησαν υπό μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου. μπαρ κλίμακα είναι 50 micron. Επιλεκτικής σύνδεσης και η πρόσληψη των C225-NP, αλλά δεν παρατηρήθηκε IgG-NP στην HCC827 κύτταρα. Σε H520 κύτταρα δεν υπήρχε καμία δέσμευση και η πρόσληψη των C225-NP, σε σύγκριση με IgG-NP.

Η

Για να προσδιορίσετε την ειδικότητα του C225-NP δεσμευτικές και πρόσληψης, τα πειράματα αποκλεισμού διεξήχθησαν. HCC827 κύτταρα προ-αγωγή με περίσσεια ελεύθερου αντισώματος Κλώνος 225 πριν από τη θεραπεία με IgG-ΝΡ ή C225-ΝΡ. εικόνες ανάκλασης σκοτεινού πεδίου έδειξαν ότι η πρόσδεση και εσωτερικοποίηση του C225-ΝΡ ειδικώς αποκλειστεί με την παρουσία του ελεύθερου Κλώνος 225 αντίσωμα σε σύγκριση με τα κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με το αντίσωμα (Σχήμα 9α). Είμαστε αποφασισμένοι περαιτέρω αν η δέσμευση των υποδοχέων EGF επηρεάζει C225-NP-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Εξασθένηση της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από C225-ΝΡ παρατηρήθηκε στην παρουσία του ελεύθερου αντισώματος Κλώνος 225 που συνοδεύτηκε από αισθητή μείωση της C225-NP-απόπτωση και autophagy (εικόνα 9b, 9c). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης όταν τα κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με C225-ΝΡ υπό την παρουσία του κλώνου 225 αντισώματος (Σχήμα S4 α-γ). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι C225-NP αλληλεπιδρά επιλεκτικά με EGFR κύτταρα που εκφράζουν NSCLC, και παράγουν μοριακής συγκεκριμένη ενισχυμένο θεραπευτικό αποτέλεσμα επί EGFR κύτταρα που εκφράζουν NSCLC.

(α) Η δεξιά στήλη δείχνει εικόνες των κυττάρων HCC827 προ-αγωγή με αντίσωμα C225 (2 μg /ml) για 15 λεπτά πριν από την επώαση με είτε IgG-ΝΡ (μεσαία σειρά) ή C225-ΝΡ (κάτω σειρά). Κύτταρα που φαίνεται στην αριστερή στήλη δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή με ελεύθερα αντισώματα C225. Τα πλακίδια πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου. Η δέσμευση και η πρόσληψη του C225-ΝΡ ανεστάλη πλήρως με την παρουσία του C225 αντισώματος. Σε IgG-NP-κατεργασμένα κύτταρα C225 αντίσωμα δεν είχε καμία επίδραση. μπαρ κλίμακα είναι 50 micron. (Β) επίδραση Παρεμπόδιση στην κυτταροτοξικότητα του C225-ΝΡ με προ-κατεργασία με ελεύθερο αντίσωμα C225. Μετά τη θεραπεία με /χωρίς αντίσωμα C225 (0.065 μg /ml) επί 6 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με μη-συζευγμένο NP (χρυσό-σιδήρου: AuFe), IgG-ΝΡ ή C225-NP για επιπλέον 66 ώρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P-value & lt? 0,05 vs AuFe μόνο, C225 αντίσωμα μόνο, IgG-NP ή C225 αντισώματος συν C225-NP. (Γ) Αναστολή επιδράσεις επί C225-NP-επαγόμενη απόπτωση και autophagy με προ-αγωγή με C225 αντίσωμα. Cellular πρωτεΐνες λύθηκαν μετά από κατεργασία με C225-ΝΡ (0.6 × 10

10 σωματίδια) για 66 ώρες παρουσία ή απουσία του ελεύθερου αντισώματος C225 (0.065 μg /ml). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 7,5% ή 15% SDS-PAGE, και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα αντι-PARP και αντι-LC3. Το αντίσωμα αντι-β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωση και τη μεταφορά. Οι εντάσεις του ποσού των ζωνών LC3-II ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health). C225-NP-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της απόπτωσης και autophagy όπως υποδεικνύεται με διάσπαση του Capase-3, PARP και LC3-ΙΙ αντίστοιχα αξιοσημείωτα καταργήθηκε με την παρουσία του ελεύθερου αντισώματος C225. Όλες οι εικόνες σκοτεινού πεδίου αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Leica, DM6000 μικροσκόπιο εξοπλισμένο με 20 × σκοτεινού πεδίου αντικειμενική και Xe-λαμπτήρα λευκού φωτός φωτισμού.

Η

Η πυκνότητα των 225 αντισωμάτων που συνδέονται με NP είναι σημαντική για 225-NP μεσολάβηση των κυττάρων του όγκου θανάτωση

για να διερευνηθεί η εξάρτηση του θεραπευτικού αποτελέσματος της NPS με την πυκνότητα του κλώνου 225 αντισωμάτων στην επιφάνεια NP έχουμε συν-συζευγμένο κλώνος 225 και μη-ειδικό αντίσωμα IgG σε αναλογίες μία η ώρα, 1:01, 1:03, 1:10, 1:40 και 0:1. Το μέσο συνολικό ποσό των αντισωμάτων ανά ΝΡ διατηρήθηκε η ίδια, ως εκ τούτου, η πυκνότητα του κλώνου 225 αντισωμάτων μειώθηκαν σταδιακά καθώς η σχετική ποσότητα του μη ειδικού IgG αυξήθηκε. Για παράδειγμα, η αναλογία μία η ώρα αντιστοιχούσε στις αρχικές συζυγών C225-ΝΡ που είχε την υψηλότερη πυκνότητα του κλώνου 225 αντισωμάτων ενώ ο δείκτης 0:1 αντιστοιχούσε NPs με μόνο μη-ειδικά αντισώματα IgG. Η σχετική πυκνότητα των αντισωμάτων στην επιφάνεια των NPs επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον δοκιμασίας (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Η θεραπεία με C225-NPs (μία η ώρα αναλογία) σημαντικά (

P

& lt ? 0,05) μειωμένη βιωσιμότητα του EGFR που εκφράζεται HCC827 και Η1299 κύτταρα. Ωστόσο, με την αλλαγή της αναλογίας του C225 αντισώματος για τον έλεγχο αντισωμάτων από 1:0 να 1:40 οδήγησε σε εξασθένιση της κυτταροτοξικότητας και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 10α). Δυνατότητα να αναστέλλουν την έκφραση και επάγουν pEGFR autophagy ήταν επίσης μειωμένη σε κύτταρα HCC827 και Η1299 με μείωση της σχετικής ποσότητας του κλώνου 225 αντισωμάτων στην επιφάνεια ΝΡ (Εικόνα 10b, c). Η παρατηρούμενη μείωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας του συμπλόκου NP-αντισώματος με μειούμενη πυκνότητα του θεραπευτικού αντισώματος στην επιφάνεια ΝΡ μπορεί να αποδοθεί σε αλλαγές στην πολλαπλό σθένος του ΝΡ συμπλόκου αντισώματος /. Προηγούμενες αναφορές στη βιβλιογραφία έχουν δείξει ότι η αύξηση της σθένος ενός μακρομορίου μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη συγγένεια πρόσδεσης για τη στόχευση μορίων [25], [26]. Αυτή η πολυσθενής επίδραση βελτίωση αξιοποιήθηκε για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της αναστολής της τοξίνης μέσω της σύνθεσης πολυσθενών αναστολέων [27], [28]. Αποδείχθηκε επίσης ότι η βέλτιστη πυκνότητα συνδέτες στόχευσης στην επιφάνεια των πολυμερών μπορεί να αυξήσει την εσωτερικοποίηση των προσδεμάτων σε κύτταρα [29]. κύτταρα H520 έδειξε μικρή έως καθόλου κυτταροτοξικότητα όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΣΔ με διάφορες αναλογίες των αντισωμάτων (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

(α) αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων σε απόκριση σε θεραπεία με ΝΡ που είχαν διαφορετικό λόγο (μία η ώρα?. 1 :1? 1:03? 1:10? 1:40? 0:1) του C225 και IgG συν-συζευγμένο στην επιφάνεια NP. Κύτταρα (HCC827, Η1299 και Η520) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΣΔ (0,6 × 10

10 σωματίδια) για 72 ώρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P-value & lt? 0,05 για C225-NP (1:00) vs NP με 1:01-1:40 και 0:1 ΝΡ σε κύτταρα HCC827 και Η1299. κύτταρα H520 δεν έδειξε καμία ανασταλτική επίδραση όταν θεραπεύτηκαν με ΝΡ της διαφορετικές αναλογίες. (Β) Ο αριθμός των κουκκίδων GFP-LC3 που προκαλείται από C225-NP (1:00) -Θεραπεία για HCC827 και τα κύτταρα Η1299 μειώθηκε με τις αλλαγές στην αναλογία αντισώματος C225:IgG. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P-value & lt? 0,05 για C225-NP (1:00) vs 1:01-1:40 και 0:1 ΝΡ σε κύτταρα HCC827 και Η1299. (Γ) C225-NP (1:00) μεσολάβηση μείωση του φωσφορυλιωμένη EGFR και ρ44 /έκφραση 42MAPK καταργήθηκε στα κύτταρα HCC827 και Η1299 όταν αντιμετωπίζεται με ΝΡ του 1:01 και 1:40 αναλογία.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι οι NPs παράγεται το μεγαλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα όταν ήταν επικαλυμμένα μόνο με το αντίσωμα C225. Αντικατάσταση του αριθμού των C225 αντισώματος με μη ειδικό αντίσωμα ελέγχου επί της επιφανείας του ΝΡ οδήγησε σε μειωμένη αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, η μελέτη αυτή δείχνει επίσης την ιδιαιτερότητα των 225-NP-μεσολάβηση των καρκινικών κυττάρων θανάτωσης.

Εν κατακλείδι, έχουμε αποδείξει ότι EGFR-στοχευμένες C225-ΣΔ επιλεκτικά λαμβάνονται από EGFR-κύτταρα που εκφράζουν NSCLC και παράγονται ενισχυμένη κατά του όγκου δραστηριότητα με την πρόκληση τόσο απόπτωση και αυτοφαγία. Η ενισχυμένη δραστικότητα θανάτωσης κυττάρων όγκου που παράγεται από C225-ΝΡ αποδίδεται σε μοναδικές ιδιότητες που προσδίδονται από την σύζευξη του Κλώνου 225 αντισώματος με AuFe ΝΡ. Για τις γνώσεις μας δείξαμε για πρώτη φορά ότι η σύζευξη του plasmonic νανοϋλικά με βιολογικών όπως Clone 225 καταλήγει σε συνεργιστικές ιδιότητες κατά των όγκων που συνοδεύεται από επαγωγή αυτοφαγία και την απόπτωση. Η έρευνα αυτή ανοίγει ένα νέο παράδειγμα για την ανάπτυξη θεραπευτικών παραγόντων που κατευθύνεται προς την ικανότητα να ελέγχει την διευθέτηση των πολλαπλών νανοκλίμακας Abs επί της επιφάνειας των σωματιδίων για βελτιωμένη στόχευση και θεραπεία.

Πρόσφατες προκλινικές μελέτες έδειξαν ότι ο συνδυασμός στοχεύουν EGFR τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.