Αφηρημένο

Φυτά στην οικογένεια Meliaceae είναι γνωστό ότι έχουν ενδιαφέρουσες βιολογικές δραστηριότητες, όπως antimalaral, αντιυπερτασικά και αντικαρκινική δραστηριότητα. Προηγουμένως, η ομάδα μας ανέφερε την ένωση φυτικής προέλευσης cycloart-24-ενο-26-ολ-3-όνη απομονώνεται από τα εκχυλίσματα εξανίου

Αγλαΐα exima

φύλλα, το οποίο δείχνει την κυτταροτοξικότητα προς διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου, ιδίως , κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου. Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι η περαιτέρω cycloart-24-ενο-26-ολ-3-όνη, από εδώ εμπρός γνωστή ως cycloartane, μειώνει τη βιωσιμότητα των καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και Caco-2 σε ένα από τη δόση και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω διαλεύκανση του μηχανισμού της ένωσης έδειξε ότι αυτό δεσμεύεται με παράγοντα νέκρωσης όγκων-υποδοχέα 1 (TNF-R1) που οδηγεί στην έναρξη της κασπάσης-8 και, μέσω της ενεργοποίησης της προσφοράς, στην ενεργοποίηση της κασπάσης-9. Αυτή η δραστηριότητα προκαλεί μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος-C. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και -9 τόσο δρουν για να δεσμεύουν τα καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση μέσω κατάντη της κασπάσης-3/7 ενεργοποίησης, διάσπαση PARP και της έλλειψης NFkB μετατόπιση εντός του πυρήνα. Μια μελέτη μοριακής σύνδεσης έδειξαν ότι η cycloartane συνδέεται με τον υποδοχέα μέσω μιας υδρόφοβης αλληλεπίδρασης με κυστεΐνη-96 και δεσμούς υδρογόνου με λυσίνη-75 και -132. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η περαιτέρω ανάπτυξη της cycloartane ως φάρμακο κατά του καρκίνου αξίζει

Παράθεση:. Leong KH, κατάλογο εκκρεμούντων ζητημάτων CY, Loong Χ-Μ, Cheah FK, Supratman U, Litaudon M, et al. (2016) Cycloart-24-ενο-26-ολ-3-όνη, μια νέα Cycloartane απομονώνεται από φύλλα

Αγλαΐα exima

Εναύσματα παράγοντα νέκρωσης όγκου-Υποδοχέα 1-Mediated κασπάση-Dependent Απόπτωση σε Colon Cancer Cell Γραμμή . PLoS ONE 11 (4): e0152652. doi: 10.1371 /journal.pone.0152652

Επιμέλεια: Ruby John Άντο, Rajiv Gandhi Κέντρο Βιοτεχνολογίας, ΙΝΔΙΑ

Ελήφθη: 26, Απρίλη του 2015? Αποδεκτές: 17 Μαρτίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 12 Απρ, 2016

Copyright: © 2016 Leong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο της Malaya [επιχορηγήσεων RP001 /2012A, RP001A-13BIO]? Η έρευνα των επιπτώσεων του Πανεπιστημίου Malaya Υψηλή [επιχορήγηση H-20001-E00002]? και το Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης της Μαλαισίας [χορηγήσει FP006-2011A]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια εξουθενωτική ασθένεια που επηρεάζει ένα σημαντικό τμήμα του παγκόσμιου πληθυσμού, και είναι πράγματι ένα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας. Ο ορθοκολικός καρκίνος παραμένει μια από τις πιο διαδεδομένες καρκίνους μεταξύ των ασθενών στις Ηνωμένες Πολιτείες, που αποτελούν το 8% και 9% όλων των περιπτώσεων καρκίνου για άνδρες και γυναίκες, αντίστοιχα. [1] Παρά τις πρόσφατες εξελίξεις στις θεραπείες καρκίνου, όπως η ανάπτυξη του στοχευμένη θεραπεία [2], οι σχετικές ποσοστά επιβίωσης για ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχουν βελτιωθεί σημαντικά [3]. Επιπλέον, η χημειοθεραπεία με συνθετικά φάρμακα συχνά προκαλεί παρενέργειες, όπως η απώλεια μαλλιών, αιμορραγία, διάρροια και μυελοτοξικότητας [4]. Οι ερευνητές συνεχίζουν την αναζήτηση για νέους θεραπευτικούς παράγοντες που είναι πιο επιλεκτικές κατά των καρκινικών κυττάρων και ότι παράγουν λιγότερες παρενέργειες.

Φυτά παραμένουν μία από τις μεγαλύτερες πηγές των φυσικών προϊόντων που χρησιμοποιούνται για να ανακαλύψουν νέα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [5-6 ]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μερικές νέες ενώσεις ανακαλύφθηκαν από φυτά που είχαν μοναδική μηχανισμούς δράσης, μεγαλύτερη δραστικότητα ή χαμηλότερη δυσμενείς επιπτώσεις από χρησιμοποιούνται σήμερα φάρμακα [7]. Σε συνεργασία με τους γαλλικούς φορείς για να ψάξετε νέα φάρμακα τα ναρκωτικά, θα πραγματοποιηθεί προκαταρκτική φυτοχημικές προφίλ του φυτού

Αγλαΐα exima

. Αγλαΐα είναι το μεγαλύτερο γένος της οικογένειας Meliaceae, και Αγλαΐα δέντρα συνήθως αναπτύσσονται σε τροπικά και υποτροπικά δάση στην ηπειρωτική Κίνα, Ινδο-Μαλαισίας και τα νησιά του Ειρηνικού. μέρη Αγλαΐα δέντρο (φύλλα, άνθη και καρπούς βρώσιμα) έχουν πολλές φαρμακευτικές ιδιότητες, όπως αντιφλεγμονώδη, αντικαρκινικά, αντι-διαβητικό ιδιότητες. Έξι τριτερπενοειδή και δύο στεροειδή προηγουμένως απομονώθηκαν από τα φύλλα του

Αγλαΐα exima

από την ομάδα μας. Προηγουμένως, δείξαμε ότι το νέο cycloartane εμφάνισε την υψηλότερη κυτταροτοξική επίδραση στο κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου ΗΤ-29 όλων των ενώσεων που απομονώνονται από

Αγλαΐα exima

από την ομάδα μας, με μια IC

50 11,5 μΜ [8]. Είναι ενδιαφέρον, προηγούμενη μελέτη ανέφερε cycloartane από

Αγλαΐα

ειδών εμφανίζεται 10 φορές μεγαλύτερη εκλεκτικότητα έναντι του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά ΗΤ-29 σε σύγκριση με το φυσιολογικό κύτταρο του παχέος εντέρου γραμμή CCD-112CoN [9].

Η πλειοψηφία των σημερινών φαρμάκων χημειοθεραπείας ενεργοποιούν την απόπτωση να προκαλέσει καρκίνο κυτταρικό θάνατο. Η απόπτωση είναι μια ενεργός διαδικασία προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που λαμβάνει χώρα με συγκεκριμένες μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές στα κύτταρα [10]. Αυτές οι μορφολογικές αλλαγές περιλαμβάνουν εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης επί της επιφανείας των κυττάρων, διόγκωση μεμβράνης, συμπύκνωση χρωματίνης και τον σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων [11]. Η πρόοδος στην κατανόηση της σηματοδότησης της απόπτωσης έχει οδηγήσει σε δύο μεγάλες πορείες για την έναρξη ευρέως αποδεκτή, δηλαδή την εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια απόπτωσης. Η εξωγενής οδός ενεργοποιείται μέσω υποδοχέων θανάτου παρών στην κυτταρική επιφάνεια, ενώ η ενδογενής οδός ενεργοποιείται από την απελευθέρωση του proapototic παράγοντες, όπως το κυτόχρωμα c, από μιτοχόνδρια του κυττάρου [12]. Όγκων υποδοχείς παράγοντα νέκρωσης, διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, είναι μεταξύ των γνωστών εξωτερικών υποδοχέων θανάτου. Αυτοί οι υποδοχείς περιλαμβάνουν δύο τύπους: παράγοντα νέκρωσης όγκων υποδοχέα-1 (TNF-R1) και -2 (TNF-R2). TNFR-1 εκφράζεται παντού στα περισσότερα κύτταρα, ενώ TNFR-2 βρίσκεται κυρίως σε ολιγοδενδροκύτταρα, αστροκύτταρα, κύτταρα Τ, μυοκύτταρα, θυμοκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα [13]. Η διαδικασία επιβίωση και το θάνατο ρυθμίζεται κυρίως από τον TNF-R1, όπως αυτός ο υποδοχέας περιέχει μια ενδοκυτταρική περιοχή θανάτου που δεν υπάρχει σε TNF-R2. Μόλις ενεργοποιηθεί, η περιοχή θανάτου στρατολογεί άλλα σήματα θανάτου, όπως TRADD, FADD και προ-κασπάσης-8, για να σχηματίσει ένα επάγει θάνατο σηματοδότηση-σύμπλοκο (DISC). Η απελευθέρωση της κασπάσης 8 σήματα προσφορά για να ενεργοποιήσετε Bax, Bad, και κυτόχρωμα C στα μιτοχόνδρια του κυττάρου. Η ενεργοποίηση του TNR-R1 πιστεύεται ότι προκαλούν την TACE μεταλλοπρωτεάση για να απελευθερώσει το εξωκυτταρικό συστατικό του υποδοχέα ως διαλυτός TNF-R1 (sTNF-R1), η οποία είναι μία κυτοκίνη η οποία είναι ικανή να ενεργοποιεί άλλα TNF-R1s για να αυξήσουν τα σήματα θανάτου [ ,,,0],14].

Ωστόσο, οι κύριες εκτελεστές των αποπτωτικών οδών είναι οι πρωτεάσες της οικογένειας κασπάσης που αποσυντίθενται πρωτεολυτικά τα κύτταρα με τη μορφή αποπτωτικών σωμάτων. Αυτή η οικογένεια των πρωτεασών διαιρείται σε κασπασών εκτελεστής, όπως κασπάσης 3 και 7, και εκκινητή κασπασών, όπως κασπάσης 8 και 9. Initiator κασπάσης-8 είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται μέσω των υποδοχέων θανάτου, ενώ η κασπάση-9 ενεργοποιείται από το κυτόχρωμα διαρροή c από τα μιτοχόνδρια. Αυτές οι κασπάσες έναρξης οδηγήσει σε κατάντη ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και 7, τη διάπραξη του κυττάρου σε αποπτωτικό θάνατο. Σε αντίθεση με νέκρωση, απόπτωση είναι μία μη φλεγμονώδης μονοπάτι κυτταρικού θανάτου, η οποία έχει το πλεονέκτημα της ελαχιστοποίησης των ανεπιθύμητων επιπτώσεων σε γειτονικά κύτταρα [15]. Ως εκ τούτου, οι επιστήμονες είναι συνεχώς σε αναζήτηση των μικρών μορίων που μπορούν να προκαλέσουν απόπτωση στη θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε το δυναμικό αντικαρκινικές του cycloartane στο ανθρώπινο κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου ΗΤ-29, με επίκεντρο τον αποπτωτικό μηχανισμό υποκείμενο αυτής της δραστηριότητας.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές κόλου (ΗΤ-29 και Caco-2) ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection (Rockville, MD). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη, 50 μg /ml γενταμυκίνη και 2,5 μg /ml αμφοτερικίνη Β (Gibco, Carlsbad, CA) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με μία ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Η κυτταροτοξικότητα της cycloartane αξιολογήθηκε έναντι 2 κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (ΗΤ-29 και Caco-2). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία συνεχώς με την ένωση (0,39 έως 200 μΜ) ή σισπλατίνη (3,9 – 2000 μΜ) ή 5-φθοριοουρακίλη (200- 8 x 10

-6 mM) για 24, 48 και 72 ώρες. Η σισπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη καθαρότητας άνω του 99,9% ελήφθη από τη Sigma-Aldrich. Φρεάτια ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05% ν /ν DMSO στο μέσο καλλιέργειας. Στο τέλος της θεραπείας, το μέσο απαλά ανανεώνεται, και (CellTiter 96 AQ

ueous® One Solution, Promega, Madison, WI) προστέθηκαν 20 μL του αντιδραστηρίου MTS. Οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες, και η απορρόφηση αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (άπειρη 200, Tecan, Männedorf, Ελβετία) στα 490 nm, με 690 nm σαν το μήκος κύματος φόντο. Το ποσοστό βιώσιμων κυττάρων υπολογίσθηκε σε σχέση προς τα φρεάτια, και IC

50 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την καμπύλη δόσης-απόκρισης προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας Prism 5.02 λογισμικού (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσοι όροι ± SD αριθμητική

Η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο αναλύσεων

Η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο αναλύσεις διεξήχθησαν ξεχωριστά χρησιμοποιώντας εμπορικές αννεξίνης V:. Ανίχνευση FITC απόπτωση Kit I και σετ αντιδραστηρίου CycleTest ™ Plus DNA, αντίστοιχα (BD Bioscience, San Jose, CA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες δώδεκα φρεατίων. Μετά από ολονύκτια προσκόλληση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ένωση στα 12,5, 25 και 50 μΜ για 24 ώρες για την ανάλυση απόπτωσης και σε 2,5 μΜ για 12, 24 και 48 ώρες για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ήπια θρυψινοποίηση και φυγοκεντρήθηκε στα 1500 χ g για 5 λεπτά. χρώση κυττάρων διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα κιτ DNA QC σωματιδίων χρησιμοποιείται για τη βαθμονόμηση της ροής FACSCanto II κυτταρομετρίας (BD Biosciences, San Jose, CA). πληθυσμοί κυττάρων υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρική ανάλυση, και τα τεταρτημόρια ορίστηκαν σύμφωνα με τον πληθυσμό των βιώσιμων κυττάρων στα μη επεξεργασμένα δείγματα. FacsDiva 5.0.3 λογισμικό (BD Biosciences, San Jose, CA) χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το ποσοστό των κυττάρων στις αντίστοιχες τεταρτημόρια για ανάλυση απόπτωσης, και Mod Fit LT λογισμικό (Verity Software House Inc., Topsham, ΜΕ) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση κυτταρικού κύκλου.

μεμβράνης μιτοχονδριακού δυναμικό Δѱm (ΜΜΡ), η ανάλυση του κυτοχρώματος απελευθέρωση c και NFkB μετατόπιση

Ένα Cellomics Multiparameter κυτταροτοξικότητα 3 Kit για ΜΜΡ και την απελευθέρωση κυτοχρώματος και Kit Nucleus Παράγοντα κάππα Β ενεργοποίησης (ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με ένωση για 24 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις (3,125 έως 50 μΜ). Ως προς τη δράση μετατόπισης NFkB, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε 12,5 μΜ μόνος cycloartane ή 10ng /ml ΤΝΡ-α μόνο του ή 12.5 μΜ cycloartane και 10 ng /ml ΤΝΡ-α σε συνδυασμένη θεραπεία. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS). Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΜΜΡ βαφή ή αποκλείστηκαν με 3% αλβουμίνη βόειου ορού ακολουθούμενη από NFkB πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού ή κυτόχρωμα c πρωτογενές αντίσωμα ποντικού και στη συνέχεια κατσίκας αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με DyLight

TM 488 ή κατσίκα αντι- δευτερεύον αντίσωμα ποντικού συζευγμένο με DyLight

TM 649 για 1 ώρα η κάθε μία. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης II (1 Χ PBS με 1% Tween-20). Οι πυρήνες βάφτηκαν με Hoechst 33258. Στη συνέχεια, τα χρωματισμένα κύτταρα έγιναν ορατά, και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας αναγνώστη Cellomics ArrayScan HCS ((ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ). Η μονάδα bioapplication υγεία των κυττάρων προφίλ χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού του κάθε χρωστική.

δραστικότητα κασπάσης και αναστολέα δοκιμασίες

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε λευκό πλάκες 96-φρεατίων σε 1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν. στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την ένωση (50 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους (1, 3, 6, 12, 18, 24 και 30 ώρες). δραστικότητα Caspase μετρήθηκε με προσθήκη 50 μΐ της κασπάσης-Glo® 3/7 (Ζ- DEVD-aminoluciferin), κασπάση-8 Glo® (Ζ-LETD-aminoluciferin) ή κασπάση-9 Glo® (Ζ-LEHD-aminoluciferin) (Promega, Madison, WI) και, στη συνέχεια, την ανάγνωση του φωταύγεια χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (άπειρη 200, Tecan, Männedorf, Ελβετία). Οι δραστηριότητες των επιμέρους κασπασών εκφράσθηκαν ως φορές αυξήσεις σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. για την δοκιμασία αναστολέα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-επεξεργασία με 10 μΜ κασπάσης 3 αναστολέα (Z-DEVD-FMK), κασπάσης 8 αναστολέα (Z-IETD-FMK), κασπάσης 9 αναστολέα (Z-LEHD-FMK) ή γενικής αναστολέα κασπάσης (Ζ VAD-FMK-) για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με την ένωση (50 μΜ) για 18 ώρες, και οι προσδιορισμοί κασπάσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από άλλες 6 ώρες επωάσεως με την ένωση, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου MTS, όπως περιγράφεται στην ενότητα κυτταρική καλλιέργεια και δοκιμασία κυτταροτοξικότητας.

εκχύλισης πρωτεΐνης, δέσμη πρωτεΐνης και κηλίδωση Western αναλύσεις

Ένα σύνολο 1 χ 10

6 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ένωση (50 μΜ) ή TNFa (10 ng /ml) ως θετικός έλεγχος για NFkB μετατόπιση, και οι αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης παρακολουθήθηκαν επί χρονικά διαστήματα των 6, 12, 18 και 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με παγωμένο PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Μ-PER περιέχουν Pierce 1χ αναστολέα πρωτεάσης Halt κοκτέιλ για σύνολο κυτταρικών εκχυλισμάτων ή ρυθμιστικό ΝΕ-PER για κυψελοειδή πυρηνικά εκχυλίσματα σε πειράματα NKkB ή Mem-PER Plus ρυθμιστικό για πρωτεΐνη κυτταρικής μεμβράνης εκχυλίσματα σε πειράματα TNF-R1 (ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ). Για την δέσμη πρωτεΐνης, τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών 43 απόπτωση στο προϊόν λύσης κυττάρου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Array G1 RayBio Ανθρώπινα απόπτωση, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή. Fold αλλαγές μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Array RayBio Antibody εργαλείο ανάλυσης (RayBiotech, Norcross, GA). Για στύπωμα western, λύματα κυττάρων (20 μg πρωτεΐνης /φρεάτιο) έβρασαν για 5 λεπτά και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε 12% δωδεκυλ νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.5% Tween 20 (TBST) για 1 ώρα και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα κιτ που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το κιτ δειγματολήπτη απόπτωσης αντίσωμα (# 9915), προ-απόπτωσης Bcl-2 οικογένεια κιτ δειγματολήπτη αντίσωμα (# 9942), και κιτ δειγματολήπτη υποδοχέα θανάτου (# 8356), και τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το πυρηνικό παράγοντα-kappa Β p65 (# 8242), β-ακτίνη (# 8457) και αντισώματα λαμίνη Β2 (# 13823) (Cell Signaling, Χορευτές, DA). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα TBST και επωάστηκαν με το κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (κατσίκας αντι-κουνελιού IgG) (# 7074). Μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας μια βελτιωμένη κιτ χημειοφωταύγειας (Super Signal West Dura, ThermoFisher Επιστημονική, Waltham, ΜΑ).

Η υπολογιστική μοριακή βάση σύνδεσης και στατιστικές αναλύσεις

Η κρυσταλλική δομή ακτίνων Χ του παράγοντα νέκρωσης όγκων υποδοχέα 1 (TNF-R1) ανακτήθηκε από την Τράπεζα δεδομένων Πρωτεϊνών (είσοδος ΠΣΠ 1NCF) και παρασκευάζεται χρησιμοποιώντας το πεδίο δύναμης CHARMM. Docking έγινε με τη χρήση της μονάδας C-DOCKER του Discovery Studio 4.1 του λογισμικού (Acceryls, San Diego, CA) για την προσομοίωση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ένωσης και TNF-R1. Η ενέργεια σύνδεσης αλληλεπίδραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το

in-situ

εργαλείο ελαχιστοποίησης να ενσωματώσει εύκαμπτο σύνδεσης στο αγκυροβολημένο θέση, ακολουθώντας μία προηγουμένως περιγραφείσα πρωτόκολλο [17]. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test του σπουδαστή ή ANOVA με Bonferroni post-test σε Prism 5.02 λογισμικού για να προσδιοριστούν σημαντικές διαφορές μεταξύ των πειραματικών και ελέγχου ομάδες (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA), και η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε ως Ρ ≤ 0,05 ή ρ ≤ 0,01.

Αποτελέσματα

κυτταροτοξική δράση του cycloartane επί ΗΤ-29 και του καρκίνου του CaCO-2 κόλου κυτταρικές σειρές

Η χημική δομή του cycloartane είναι φαίνεται στην Εικόνα 1. και οι δύο, ΗΤ-29 και Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές δοσολογίες 0,39 έως 200 μΜ της ένωσης για 24, 48 και 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η ένωση μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, τα IC

50 αξίες της cycloartane ήταν 3-30 φορές μικρότερη από εκείνη του προτύπου σισπλατίνης chemodrug (3,9 – 2000 μΜ) σε κάθε θεραπεία χρονικό σημείο, 42-862 φορές μικρότερη σε σύγκριση με 5-φθοριοουρακίλη σε 24 και 48 ώρες χρόνο σημεία αλλά 16-27 φορές πιο ισχυρή μετά από 72 ώρες θεραπείας (Πίνακας 1). Το IC

50 τιμές που ελήφθησαν χρησιμοποιηθεί ως οδηγός για τα επόμενα πειράματα.

Η ένωση έχει cyclopentano ανά υδροηλεκτρική φαινανθρένιο ικρίωμα με έναν δακτύλιο κυκλοπροπανίου μεταξύ C-9 και -10. Η πλευρική αλυσίδα που συνδέονται με C-17 έχει έναν υποκαταστάτη υδροξυλομάδα στο C-26.

Η

Για cycloartane (0,39 έως 200 μΜ) επί ΗΤ-29 (Α) και CaCO-2 (Β) των κυττάρων γραμμές, η σισπλατίνη (3,9-2000 μΜ) επί ΗΤ-29 (C) και γραμμές κυττάρων σε 24, 48 και 72 ώρες, 5-φθοριοουρακίλη (200-8 χ 10

-6 mM) επί CaCO-2 (Δ) ΗΤ-29 και Caco-2 κυτταρικές σειρές σε 24 (Ε), 48 (F) και 72 (G) ώρες. Οι σημαντικές διαφορές που αναφέρονται: * p & lt? 0,05? ** P & lt? 0.01.

Η

Cycloartane προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα ΗΤ-29

Για να αξιολογηθεί η λειτουργία του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την cycloartane, ΗΤ-29 κόλον καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ένωση για 24 ώρες. Στη συνέχεια, εκτελέσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων που υπέστησαν διπλή χρώση με Annexin-V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο (0,1% ν /ν DMSO

4) και είχε 99.4% βιωσιμότητα των κυττάρων, με το 0,6% των κυττάρων σε απόπτωση. Η θεραπεία με την ένωση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις, από 12,5 μΜ έως 50 μΜ, προκάλεσε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων από 68,6% έως 30,6% και μια ταυτόχρονη αύξηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων από 30,7% έως 59,6% και το ποσοστό των νεκρωτικών κυττάρων από 0,7% σε 9,8% (Σχήμα 3Α)

(Α) Ποσοστό κυττάρων που δείχνουν φωσφατιδυλοσερίνη μετατόπιση, όπως μετράται με κυτταρικής επιφάνειας δέσμευσης αννεξίνης V και δωρεάν PI:. κύτταρα αρνητικά για αννεξίνη V και θετικά για ΡΙ είναι νεκρωτικό (Q1 )? κύτταρα θετικά τόσο για αννεξίνη V και ΡΙ είναι στα τέλη της απόπτωσης (Q2)? κύτταρα αρνητικά τόσο για αννεξίνη V και PI (Q3) είναι βιώσιμα κύτταρα? και τα κύτταρα θετικά για αννεξίνη V και αρνητικά για PI είναι σε πρώιμη απόπτωση (Q4). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με 0.1% ν /ν DMSO

4 (έλεγχος οχήματος) ή το cycloartane σε συγκεντρώσεις 12,5, 25, ή 50 μΜ, όπως υποδεικνύεται. (Β) Η κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα που δείχνει την κατανομή των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G

1, S και G

2 /Μ) κατά την έναρξη του πειράματος (0 ώρα) και σε 12, 24 και 48 ώρες κατεργασίας με 2,5 μΜ του cycloartane. Το αποτέλεσμα είναι αντιπροσωπευτική ένα από τα τρία αντίγραφα που είχε ουσιαστικά παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των cycloartane έλαβαν ΗΤ-29 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση των κυττάρων σε G

1 φάση, με 45,6%, 56,8%, 64,3% και 76,2% των κυττάρων είναι σε G

1 φάση μετά από 0 , 12, 24 και 48 ώρες θεραπείας, αντίστοιχα.

Cycloartane επάγει ενεργοποίηση κασπασών 3/7, 8 και 9

Οι κασπάσες παίζουν κεντρικό ρόλο στην απόπτωση-επαγωγής, και όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ΗΤ-29 κύτταρα επεξεργασμένα με την ένωση έδειξε μια απότομη αύξηση των δραστηριοτήτων των κασπασών 3/7, 8 και 9 από το 6 έως 12 ώρες. Οι δραστηριότητές τους κορυφώθηκε στις 18 ώρες για κασπάσης 9 και 24 ώρες για το κασπάσης 3/7 και 8, την οποία ακολούθησε μια πτωτική τάση. Προ-θεραπεία με είτε κασπάσης 8 (Ζ-IED-FMK) ή ένας αναστολέας παν-κασπάσης (Ζ VAD-FMK-) ακολουθούμενη από την cycloartane οδήγησε σε υψηλότερες βιωσιμότητα των κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα χωρίς προκατεργασία. Ωστόσο, οι αναστολείς για κασπάσης 3 (Ζ-DEVD-FMK) και 9 (Ζ-LEHD-FMK) δεν διάσωση των κυττάρων από το cycloartane επαγόμενη απόπτωση (Σχήμα 4Β).

Φυσικά (Α) Χρόνος ( 0-30 ώρες) πλάσια αύξηση στην κασπάσης 3/7, 8 και 9 δραστηριότητες των ΗΤ-29 κυττάρων μετά την αγωγή με την cycloartane (50 μΜ). (Β) Επίδραση των αναστολέων κασπάσης σε επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ-29. Αλλαγές στην κασπάσης 3/7, 8 και 9 δραστηριότητες, και η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων προ-επεξεργασία με αναστολέα κασπάσης 3 (Ζ-DEVD-FMK), κασπάσης 8 αναστολέα (Z-IETD-FMK), κασπάσης αναστολέα 9 (Ζ-LEHD -FMK) ή γενικής αναστολέα κασπάσης (Ζ VAD-FMK-), ακολουθούμενη από επώαση με το cycloartane (50 μΜ). Στις 18 ώρες της θεραπείας, οι δραστηριότητες της κασπάσης προσδιορίστηκαν, και στις 24 ώρες της κυτταρικής βιωσιμότητας θεραπεία μετρήθηκε. Όλα τα αποτελέσματα είναι τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών με αυξήσεις φορές και βιωσιμότητες τοις εκατό των κυττάρων υπολογίζεται με βάση τον μη επεξεργασμένο έλεγχο. Σύμβολα υποδεικνύουν σημαντικά υψηλότερο σε σύγκριση με 0 ώρα ή χωρίς αναστολέα προ-επεξεργασία: * p & lt? 0,05? ** P & lt? 0.01.

Η

Επιδράσεις της cycloartane στην απόπτωση σηματοδότησης πρωτεΐνες

Στη συνέχεια, συλλέξαμε προϊόντα λύσης πρωτεΐνης σε 6, 12, 18, και 24 ώρες μετά την θεραπεία με την cycloartane και τους φορτώνονται στο RayBio Ανθρώπινα απόπτωση Array για την ανίχνευση των επιπέδων του 43 πρωτεΐνες που επάγουν απόπτωση. Η μεγαλύτερη αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε για κασπάσης 8, η οποία αυξήθηκε από 2 έως 4 φορές στις 12- και 18-ωρών χρονικά σημεία. Κασπάσης 3 και Bid αυξήθηκε μόνο μετά από 18 ώρες από την ένωση θεραπείας (Σχήμα 5Α και 5Β).

(Α) Προς τα πάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν σε συστοιχία ανθρώπινο απόπτωση αντισώματος. (Β) Διπλώστε μεταβολές απόπτωσης σηματοδότησης μορίων σε σύγκριση με τον έλεγχο με ένα όριο αποκοπής 1,5 φορές. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των αποπτωτικών πρωτεϊνών σε cycloartane αγωγή κύτταρα ΗΤ-29 και σηματοδότηση TNF-α-αντιμετωπίζονται ως θετικός έλεγχος για NFkB μετατόπισης σε διάφορα χρονικά διαστήματα (6, 12, 18 και 24 ώρες).

Η

Προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου από κύτταρα κατεργασμένα με τον cycloartane συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία και υποβλήθηκε σε ανάλυση Western blotting. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα δέσμης πρωτεΐνης (Σχήμα 5Α και 5Β), παρατηρήθηκαν εξαρτώμενες από το χρόνο αυξήσεις στην προσφορά και διασπασμένη κασπάση 3 και 8 πρωτεΐνες (Εικ 5C). Επίσης, TNF-R1, FADD, και TRADD εκφράσεις πρωτεΐνη ήταν πάνω ρυθμισμένα, υποδεικνύοντας ότι η ένωση προκάλεσε την εξωγενή οδό σηματοδότησης απόπτωσης μέσω του υποδοχέα TNF-R1 (Εικ 5C)? sTNF-R1 δείχθηκε επίσης να ρυθμίζεται προς τα πάνω από τα αποτελέσματα δέσμης πρωτεΐνης (Σχήμα 5Α και 5Β). Το μιτοχονδριακό σχετίζονται προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Bad αυξήθηκε επίσης σημαντικά από 6 έως 24 ώρες. Επιπλέον, δεν μετατόπιση του ΝΡκΒ από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα παρατηρήθηκε την πάροδο του χρόνου και το επίπεδο της διασπασμένη PARP αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου. Κύτταρα κατεργασμένα με 10 ng /ml ΤΝΡ-α χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα NFkB μετατόπισης (Σχήμα 5C).

Cycloartane μειώνει δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ), αυξάνει εκδηλώσεις κυτοχρώματος απελευθέρωσης C και NFkB μετατόπισης

για να εξεταστεί εάν η ένωση προκαλεί μιτοχονδριακή βλάβη και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, θα αντιμετωπίζονται ΗΤ-29 κυττάρων με την ένωση για 24 ώρες και στη συνέχεια πραγματοποιείται μια ανάλυση διαλογής κυττάρων υψηλής περιεκτικότητας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, ο cycloartane σε 6,25 μΜ και 12,5 μΜ μειώθηκε (ρ & lt? 0,01) ΜΜΡ. Επιπλέον, παρατηρήσαμε απελευθέρωση κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα των ΗΤ-29 κύτταρα επεξεργασμένα με 6,25 μΜ της ένωσης σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Εικόνα 6Β). Κατά την εξέταση του εάν η ένωση ανταγωνίζονται με το φυσικό συνδετήρα, ΤΝΡ-α, μετρήθηκε η κατάντη μετατόπιση NFkB στον πυρήνα. Στο Σχήμα 6C, η θεραπεία του ΤΝΡ-α (10 ng /ml) είχε ως αποτέλεσμα αύξηση NFkB ένταση φθορισμού (ρ & lt? 0,01) στον πυρήνα περιοχή. Ωστόσο, η θεραπεία με cycloartane (12,5 μΜ) δεν σημαντικά (ρ & gt? 0,05) αύξηση NFkB ένταση φθορισμού σε σύγκριση με το μάρτυρα. Η συνδυασμένη θεραπεία του cycloartane (12,5 μΜ) και TNF-α (10 ng /ml) είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική (ρ & lt? 0,05). μείωση στην ένταση φθορισμού NFkB σε σύγκριση με τον TNF-α θεραπεία μόνη

(Α) Εικόνες και μπαρ διάγραμμα του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) μείωση. (Β) Το κυτόχρωμα c εντοπισμού (κόκκινα βέλη) σε κύτταρα ελέγχου ή απελευθέρωση από cycloartane επεξεργασμένο ΗΤ29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. (Γ) NFkB ένταση φθορισμού στον πυρήνα περιοχή είναι παρόμοιες μεταξύ του ελέγχου και των κυττάρων cycloartane-θεραπεία, τη μείωση της έντασης σε συνδυασμό θεραπεία του cycloartane και TNF-α ή να αυξήσουν την ένταση σε ΤΝΡ-α μόνο. Εικόνες συνελήφθησαν σε μεγέθυνση 100Χ και οι σημαντικές διαφορές που αναφέρονται: * p & lt? 0,05? ** P & lt? . 0.01

Η

Μελέτη cycloartane σύνδεσης για TNF-R1

Η υπολογιστική μοριακή βάση σύνδεσης απεικονίζεται η πρόσδεση της ένωσης σε TNF-R1 (Εικόνα 7) και απεκάλυψε μία συνολική ενέργεια σύνδεσης του – 67.032 kcal. Η θέση δέσμευσης για το cycloartane επί TNF-R1 διαφέρει από τη δραστική θέση για το φυσικό πρόσδεμα, TNFa. Η ένωση δεσμεύεται με την εξωκυτταρική περιοχή κοντά στην κυτταρική μεμβράνη. Υδρόφοβη αλληλεπίδραση παρατηρήθηκε μεταξύ μία από τις ομάδες κυκλοεξανίου και κυκλοπεντανίου των ομολογιών ένωσης και κυστεΐνη-96, και το υδρογόνο που σχηματίζεται μεταξύ του υδροξυλίου στο C-26 και καρβονυλ ομάδες στο C-3 της ένωσης με λυσίνη-75 και -132 του υποδοχέα, αντίστοιχα.

μεγέθυνσης που δείχνει δεσμό υδρογόνου (πράσινο διακεκομμένες γραμμές) μεταξύ υδροξυλίου και ομάδες καρβονυλίου της ένωσης με λυσίνη-75 και -132 και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (μοβ διακεκομμένες γραμμές) μεταξύ του κυκλοεξανίου και κυκλοπεντανίου της ένωσης με κυστεΐνη-96 του υποδοχέα.

η

Συζήτηση

προηγούμενο κυτταροτοξική μας διαλογή ενός πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου έδειξαν ότι το cycloartane είναι πιο κυτταροτοξική προς το κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου HT- 29 [8]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε παρόμοια κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε άλλο ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, Caco-2. Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών MTS δείχνουν ότι η θεραπεία με την ένωση προκαλεί μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα σε δύο κύτταρα ΗΤ-29 και Caco-2. Καθώς το IC

50 της ένωσης ήταν χαμηλότερη για το ΗΤ-29 κυτταρικής γραμμής, περαιτέρω πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αυτή την κυτταρική σειρά.

φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευσης στην επιφάνεια του κυττάρου είναι ένα από τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης [15 ]. Η κυτταρομετρία ροής μελέτες έδειξαν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση σε πληθυσμούς κυττάρων αννεξίνης-ν FITC συγκριτικά με κυτταρικούς πληθυσμούς PI, υποδεικνύοντας ότι αυτή η ένωση διεγείρει απόπτωση μάλλον παρά νέκρωση. Επιπλέον, η συσσώρευση των κυττάρων σε G

1 στάδιο πάροδο του χρόνου ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά την επεξεργασία cycloartane. Φυσιολογική ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων απαιτεί σωστή ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Απελευθερωμένης έλεγχο του κυτταρικού κύκλου λόγω μετάλλαξης, διαγραφής και μεταγραφική καταστολή των γονιδίων, όπως FBXW7, pRB, και ρ53, έχει αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στην παχέος εξέλιξης του καρκίνου [18-20]. Έτσι, αναστέλλοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου θα μπορούσε να σταματήσει τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου και να τους αναγκάσει να εισέλθουν απόπτωση

Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης είναι η ενεργοποίηση των κασπασών, και υπάρχουν δύο καθιερωμένων μεθόδους με βάση τις κασπάσες έναρξης:. Η μονοπάτι θανάτου του υποδοχέα, η οποία περιλαμβάνει κασπάσης-8, και η μιτοχονδριακή οδό, η οποία περιλαμβάνει τη κασπάση-9 [16]. Έναρξη του ενός ή και των δύο κασπασών ενεργοποιεί το δήμιο κασπάσης (caspase 3/7), η οποία τελικά οδηγεί σε καλά οργανωμένη κυτταρική διάλυση. Η επώαση με την ένωση προκαλεί μία εξαρτώμενη από το χρόνο ενεργοποίησης της κασπάσης 3/7 από το 6

ου ώρες μετά. Η αύξηση της κασπάσης-8 ενεργοποίησης ήταν ταυτόχρονη με την αύξηση της ενεργοποίησης της κασπάσης-9, που υποδηλώνει την εμπλοκή των δύο υποδοχέων θανάτου και μιτοχονδριακή οδούς στην επαγωγή απόπτωσης από την cycloartane. Ωστόσο, δεν είναι σαφές ποια κασπάσης είναι η κύρια εκκινητή με βάση την τάση της ενεργοποίησης κασπάσης. Για τον προσδιορισμό αυτό, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα αναστολέα της κασπάσης. Η κασπάσης 8 αναστολέα (Z-IETD-FMK) ήταν σε θέση να καταστείλει κασπάσης 9 και 3/7 δραστηριότητες που οδηγούν σε αύξηση των βιώσιμων κυττάρων. Ως εκ τούτου, κασπάσης 8 είναι η κύρια εκκινητή, ενώ η κασπάση 9 είναι μια δευτερεύουσα μεσολαβητής που ενισχύει το αποπτωτικό σήμα.

Περαιτέρω διερεύνηση του αποπτωτικού μονοπατιού με ανάλυση δέσμης πρωτεΐνης κατέδειξε την απελευθέρωση διαλυτών νέκρωσης όγκου παράγοντα-υποδοχέα 1 ( sTNF-R1) από εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων. Η ενεργοποίηση του TNF-R1 πιστεύεται ότι προκαλούν την TACE μεταλλοπρωτεάση για να απελευθερώσει το εξωκυτταρικό συστατικό του υποδοχέα ως διαλυτός TNF-R1 (sTNF-R1) [14], οδηγώντας μας να πιστεύουμε ότι η TNF-R1 πυροδοτήθηκε στην ανάντη περίπτωση . Η ανάλυση στυπώματος Western εκχυλίσματος κυτταρικής μεμβράνης των κατεργασμένων κυττάρων επιβεβαίωσε την προς τα πάνω ρύθμιση του TNF-R1. TNF-R1 ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων θανάτου, και η κυτταροπλασματική ουρά του TNF-R1 περιέχει μία περιοχή θανάτου (DD), η οποία είναι απαραίτητη για την επαγωγή της απόπτωσης [21, 22]. Μελέτες αποκάλυψαν ότι ο TNF-R1 ενεργοποιεί το αποπτωτικό πρόγραμμα με διαδοχική πρόσληψη της πρωτεΐνης προσαρμογέα TRADD, η TRADD-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης προσαρμογέας FADD και το FADD-όπως πρωτεΐνη ICE (FLICE, που ονομάζεται επίσης προ-κασπάσης-8) για να σχηματίσει το επάγει θάνατο σηματοδότησης συγκρότημα (DISC) [23, 24]. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα TNF-R1 από φάρμακα έχει δειχθεί ότι αυξάνει αποτελεσματικότητας θεραπείας και στις δύο κυτταρικές σειρές ανθεκτικές στα φάρμακα και τα κύτταρα πρωτογενούς καρκινώματος [25].

ενεργοποίηση TNF-R1 περαιτέρω επάγει Bid, το οποίο ενεργοποιεί Bad και Bax , προκαλώντας δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης να μειώνεται, το κυτόχρωμα c για να απελευθερωθεί και κασπάσης 9 να ενεργοποιηθεί. Ο ρόλος της προσφοράς και Bad σε μεταγωγή σημάτων απόπτωσης από τους υποδοχείς θανάτου στην ενδογενή οδό μιτοχόνδρια εμπλέκει ενίσχυση των σημάτων απόπτωσης [26]. Bad και Bax ανήκουν στα μέλη της οικογένειας Bcl-2, που ρυθμίζουν τον κυτταρικό θάνατο και την επιβίωση. Για παράδειγμα, η ρύθμιση προς τα άνω του Βαχ έχει δειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση με τη μείωση της μιτοχονδριακής διαπερατότητας για απελευθέρωση του κυτοχρώματος c [27]. Η συνέπεια της απελευθέρωσης κυτοχρώματος c και ενεργοποίηση της κασπάσης 9 είναι η ενεργοποίηση των κασπασών κατάντη 3 και 7, η οποία προκαλεί διάσπαση της PARP και οδηγεί σε αποπτωτικό θάνατο χωρίς την μετατόπιση του ΝΡκΒ στον πυρήνα. Περαιτέρω επισήμανση φθορισμού του NFkB έδειξε η ένωση δεν σημαντικά (ρ & gt? 0,05) αύξηση NFkB μετατόπιση εντός του πυρήνα σε σύγκριση με το μάρτυρα.