Abstract

Ιστορικό

φαρμακολογική παρέμβαση ισορροπίας οξειδοαναγωγής σε καρκινικά κύτταρα συχνά οδηγεί σε οξειδωτικό στρες απόπτωση που διαμεσολαβείται, προσελκύοντας πολλή προσοχή για την ανάπτυξη μιας νέας γενιάς στοχευμένης θεραπείας στον καρκίνο. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που διέπουν τη μετατροπή από την οξειδωτική σηματοδότησης σε μεταγενέστερους δραστηριότητες που οδηγούν τα κύτταρα στο θάνατο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εμείς εδώ αναφέρετε μια συστηματική ανίχνευση των αλλαγών μεταγραφικό ως απάντηση στην οξειδωτική σήματα που παράγονται σε κύτταρα λευχαιμίας μετά από θεραπεία φενρετινίδη, εμπλέκοντας την εμφάνιση πολλών άγχος ανταποκρίνεται γεγονότα κατά τη διάρκεια της επαγόμενης φενρετινίδη απόπτωση, όπως αντίδραση οξειδοαναγωγής, ενδοπλασματικό δίκτυο άγχος /εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνη, μεταφραστική καταστολή και την ενεργοποίηση του πρωτεασώματος. Επιπλέον, η διαμόρφωση αυτών των σχετικών γεγονότων κυρίως ενορχηστρωμένη από το άγχος ανταποκρίνεται παράγοντες μεταγραφής, όπως συνήθως τονίζεται από NF-E2 που σχετίζονται με παράγοντα 2 (NRF2) και του παράγοντα θερμικού σοκ 1 (HSF1). Διάφορες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η συντονισμένη ρύθμιση αυτών των παραγόντων μεταγραφής και έτσι κατάντη γονίδιά τους που εμπλέκονται στη μετατροπή οξειδωτική σηματοδότησης σε κατάντη στρες αποκρίνονται γεγονότα που ρυθμίζουν προ-αποπτωτικών και αποπτωτικών δραστηριότητες στις χρονικές και χωρικές επίπεδα, που χαρακτηρίζουν το οξειδωτικό στρες που προκαλείται προγραμματισμένος το θάνατο και όχι την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η μελέτη παρέχει έναν οδικό χάρτη για την κατανόηση οξειδωτικό στρες απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να αναπτυχθούν περαιτέρω σε πιο εξελιγμένα θεραπευτικά πρωτόκολλα, καθώς εμπλέκονται με συνεργική επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων χρησιμοποιώντας αναστολείς πρωτεασώματος με φενρετινίδη

Παράθεση:. Wang Κ, Fang η, Xiao D, Zhu Χ, Ο Μ, Παν Χ, et al. (2009) Μετατροπή Redox Σηματοδοσίας σε αποπτωτικά Δραστηριότητες από άγχος-Responsive Ρυθμιστικών HSF1 και NRF2 σε φενρετινίδη Επεξεργασμένα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 4 (10): e7538. doi: 10.1371 /journal.pone.0007538

Επιμέλεια: Maurizio Γ Capogrossi, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Ιταλία

Ελήφθη: May 31, 2009? Αποδεκτές: 30 Σεπ του 2009? Δημοσιεύθηκε: 21 του Οκτωβρίου 2009

Copyright: © 2009 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από τη γνώση Πρόγραμμα Καινοτομίας της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (KSCX2-YW-R-19, KSCX1-YW-22-01), Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας Επιχορηγήσεις (2006CB910405, 2006CB910700, 2007AA02Z335 και 2009CB825607), εθνικό Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα Επιχορηγήσεων (30730033, 30670436 και 30600260), Σαγκάη Μεταδιδακτορικός Επιστημονικό Πρόγραμμα (09R21414900). LTR είναι μέρος του δικτύου TB-VIR (κοινοτικές επιδοτήσεις της Ευρωπαϊκής του 7ου ΠΠ, 200973). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη θεραπειών του καρκίνου μπορούν να επωφεληθούν από τη συσσωρευμένη γνώση στη βιολογία του καρκίνου, ιδίως σε σχέση με χαρακτηριστικά του καρκίνου, όπως η αυτάρκεια σε σήματα ανάπτυξης, της φοροδιαφυγής του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και μετάσταση [1]. Πρόσφατα πειραματικά και κλινικά δεδομένα παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι η μείωση /οξείδωση (redox) οδούς σηματοδότησης μπορεί να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην καρκινογένεση και κακοήθη πρόοδο [2]. Σε γενικές γραμμές, τα κακοήθη κύτταρα είναι εγγενώς κάτω από προ-οξειδωτικό μικροπεριβάλλον, με αυξημένα επίπεδα σταθερής κατάστασης των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [3], που εκπροσωπεί άλλο πολλά υποσχόμενο συστατικό των βιολογικών διαφορών μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα. Πρόσφατα, νέες στρατηγικές θεραπευτικής παρέμβασης που παράγουν μία κατάσταση επιλεκτικής οξειδωτικού στρες σε καρκινικά κύτταρα έχουν αποκτήσει σημασία [4].

ρύθμιση Redox έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός μηχανισμός της κακοήθους κυτταρικής επιβίωσης. Μετατόπιση της ισορροπίας κυτταρική οξειδωτική μέσω φαρμακολογική χειραγώγηση υπέρ της αύξησης ενδοκυτταρικών ROS μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτικό στρες και επακόλουθη επαγωγή της απόπτωσης εντός καρκινικών κυττάρων. Η εμπλοκή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα επάγεται από παράγοντες ROS ροών πιθανώς συνοδεύεται από την ενεργοποίηση του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) του στρες. Η απόπτωση μπορεί να αρχίσει από υποδοχείς θανάτου διεγείροντας την εξωγενή οδό, ή με διαταραχή της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης που περιλαμβάνουν ενδογενή οδό και ER στρες μεσολάβηση μονοπάτι μιτοχονδρίων που σχετίζονται. Αυτά έναρξη προ-αποπτωτικά σήματα συγκλίνουν τελικά στο κεντρικό εκτελεστή της απόπτωσης από τη διακοπή του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού (ΜΜΡ) σε μιτοχόνδρια, καθώς και την ενεργοποίηση των καταρρακτών κασπάσης. Φθάνοντας το επίπεδο σε βαθμό που υπερβαίνει το όριο υποφερτή οξειδοαναγωγής, ROS μπορεί να λειτουργήσει ως ειδικών σημάτων διέγερσης ER στρες απόπτωση ειδικά σε καρκινικά κύτταρα. Σε απόκριση σε διάφορα ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων οξειδωτικού στρες [5], [6], ER εξελίχθηκε απόκριση ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη (UPR) ρύθμιση αρκετούς παράγοντες μεταγραφής (π.χ., ATF6, XBP1 και CHOP) σε μια προσπάθεια να προσαρμοστεί για την επιβίωση ή άλλως υφίστανται απόπτωση που αντιμετωπίζει παρατεταμένη UPR. Ωστόσο, υπάρχει περιορισμένη γνώση σχετικά με τους μηχανισμούς που διέπουν τη μετατροπή από την οξειδωτική σηματοδότησης σε μεταγενέστερους εκδηλώσεις του στρες που οδηγεί τα κύτταρα στο θάνατο. Με τη διαθεσιμότητα των κατάλληλων θεραπευτικών ROS δημιουργίας παράγοντες, συστηματική χαρακτηρισμός της γονιδιακής έκφρασης και της υποκείμενης μεταγραφικής ρύθμισης θα είναι το κλειδί για τη διαλεύκανση της εν λόγω μετατροπής.

Με την ανάπτυξη των ROS που παράγουν παράγοντες όπως τριοξείδιο του αρσενικού (ΑΤΟ) για τη θεραπεία της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (APL) [7], η δυνατότητα εκμετάλλευσης επιλεκτικής οξειδωτικό στρες ως θεραπεία επαγωγής απόπτωσης του καρκίνου είναι η αναδυόμενη ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική επιλογή. Πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει ότι η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του ΑΤΟ διαμεσολαβείται από ROS ενδοκυτταρική παραγωγή και την επακόλουθη απόπτωση [8]. Παρά το γεγονός ότι παράγοντες ROS επάγουν σαν ΑΤΟ έχουν δείξει μεγάλες δυνατότητες στην αγωγή κακοηθών κυττάρων, οι παρενέργειες παραμένουν να αξιολογηθούν πλήρως [9]. Υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για το σχεδιασμό των πλέον λογική οξειδοαναγωγικά δραστικά στρατηγικές με ελάχιστη

in vivo

παρενέργειες. Σε αυτή την άποψη, Ν- (4-υδροξυφαινυλ) ρετιναμίδη (φενρετινίδη), ένα συνθετικό ρετινοειδές με αρκετές μακροχρόνιες κλινικές δοκιμές, αξίζει περαιτέρω έρευνα [10]. Σε αντίθεση με αυτά τα φυσικά ρετινοειδή, όπως

all-trans

ρετινοϊκό οξύ (ATRA), φενρετινίδη ασκεί διαφορετικές βιολογικές επιδράσεις, κατά προτίμηση εμπλέκει το αποπτωτικό μονοπάτι σε πολλά καρκινικά κύτταρα που στοχεύουν ROS διατηρώντας ελάχιστη

in vivo

κυτταροτοξικότητα της με τα κανονικά κύτταρα [11], [12]. Μηχανισμοί φενρετινίδης απόπτωση έχουν εντατικά μελετηθεί [13] – [15]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι αυτός ο παράγοντας ROS-παραγωγής μπορεί να διαταράξει την κυτταρική ομοιόσταση και ρυθμίζουν τα διάφορα γονίδια που σχετίζονται με το άγχος, εμπλέκοντας ότι η συμμετοχή του στρες ROS-εξαρτώμενη ER μπορεί να καταστήσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να φενρετινίδη επαγόμενη απόπτωση [16]. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους το σχηματισμό ROS οδηγεί σε ER στρες και της απόπτωσης των κυττάρων του καρκίνου δεν είναι καθόλου σαφής. Λεπτομερής διαλεύκανση αυτών των μηχανιστικών δεσμών μπορεί να επιτρέψει διορατικότητα οξειδωτικό στρες απόπτωση που διαμεσολαβείται σε καρκινικά κύτταρα και τη βελτιστοποίηση των θεραπειών που στοχεύουν ειδική για τον καρκίνο.

εικάζουν ότι τα καρκινικά κύτταρα με προδιάθεση της σηματοδότησης οξειδοαναγωγής είναι πιο πιθανό ευαίσθητα σε οξειδωτική ερεθίσματα από πράκτορες ROS-παραγωγής, όπως φενρετινίδη, που υποβάλλονται σε οξειδωτικό στρες απόπτωση. Να αποκαλύψει ακριβώς ρυθμιστικών μηχανισμών που διέπουν τη μετατροπή από την οξειδωτική σηματοδότησης σε μεταγενέστερους εκδηλώσεις του στρες που ασκείται στο ER και τελικά αποτελέσματα θάνατο παρά πλεονεκτήματα επιβίωσης, χρησιμοποιήσαμε ενοποιητική μεθόδους προηγμένης εξόρυξης δεδομένων με την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών στο προφίλ μεταγραφικό αλλαγές σε φενρετινίδη ευαίσθητη κυτταρική γραμμή , και βρήκε πολλές χρονικές-χωρικές σχέσεις μεταξύ άγχους-απόκρισης γεγονότα. Επιπλέον, το άγχος που ανταποκρίνεται παράγοντες μεταγραφής, όπως τονίζεται από NF-E2 που σχετίζονται με παράγοντα 2 (NRF2) και του παράγοντα θερμικού σοκ 1 (HSF1), παίζουν εξέχοντα ρόλο στη διαμόρφωση αυτών των σχετικών εκδηλώσεων. Επικυρώσεις μέσω immunofluorescene και χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση αναλύσεις και σχετίζονται με το άγχος συγκρίσεις μεταγραφικό παρείχε περαιτέρω αποδείξεις ότι αυτά τα stress-απόκρισης ρυθμιστικές αρχές και ως εκ τούτου τα γονίδια στόχους τους για τη μετατροπή της οξειδωτικής σηματοδότησης σε κατάντη δραστηριότητες του στρες, συμπεριλαμβανομένων απάντηση οξειδοαναγωγής, ER στρες /UPR και την ενεργοποίηση του πρωτεασώματος, που αντιπροσωπεύουν τυπικό γεγονότα του οξειδωτικού στρες που προκαλείται απόπτωση σε κακοήθη κύτταρα φενρετινίδη φάρμακο.

Αποτελέσματα

φενρετινίδη επάγει ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS και έτσι την απόπτωση σε μια ποικιλία κακοηθειών συμπεριλαμβανομένης λευχαιμίας [10]. Αναλύσαμε τα αντιπολλαπλασιαστικά και αποπτωτικά αποτελέσματα του φενρετινίδης επί λευχαιμίας που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές ΝΒ4, U937, και HL60, και διαπιστώθηκε ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε αναστολή της ανάπτυξης και της απόπτωσης σε απόκριση 1-2 μΜ φενρετινίδης, και ότι ευαισθησίες τους φάνηκε να είναι συσχετίζονται με τα επίπεδα των ROS (Συμπληρωματική Εικόνα S1). Με βάση την σχετικά υψηλή ευαισθησία στο φάρμακο που προκαλείται από την παραγωγή και την απόπτωση ROS, ΝΒ4 επιλέχθηκε ως κυτταρική σειρά πρωτότυπο για την κυτταρική και μοριακή αξιολογήσεις πριν από την λεπτομερή ανάλυση μεταγραφικό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η κυτταρική ανάπτυξη ΝΒ4 ανεστάλη με φενρετινίδη κατεργασία με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η αγωγή με μια χαμηλή δόση (1 μΜ) του φενρετινίδης φάνηκε να είναι επαρκής για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα ΝΒ4 εντός 72 ωρών, όπως δείχνεται από δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και δοκιμασίες αννεξίνη V (Σχήματα 1Β και 1Γ). Εξετάσαμε περαιτέρω ενδοκυτταρική ROS αλλάζει κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής πορείας. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι ROS αλλαγές ήταν πιο περίπλοκη από ό, τι είχε προηγουμένως αναγνωριστεί, εμφανίζοντας στην αριστερή λοξή καμπύλη σε σχήμα καμπάνας (Εικόνα 1D). Όπως ήταν αναμενόμενο, ROS συσσωρευμένη απότομα, φθάνοντας σε τετραπλάσια αύξηση σε σύγκριση με τα βασικά επίπεδα μέσα σε 6 ώρες από την αγωγή, ενώ απροσδόκητα μειώθηκε σταδιακά στη συνέχεια σε επίπεδα που αντιστοιχούν χονδρικά με το διπλάσιο των βασικών επιπέδων των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν την εμπλοκή της σηματοδότησης οξειδοαναγωγής σε ΝΒ4 κύτταρα κατά την αγωγή φενρετινίδη. Φενρετινίδη διέγερση προκαλεί ταχεία συσσώρευση ενδοκυτταρικού ROS, η οποία μπορεί με τη σειρά ενεργοποιούν κυτταρικούς μηχανισμούς για τη μείωση των επιπέδων ROS. Επίσης, τα μέτρια επίπεδα ενδοκυτταρικής ROS πιθανώς απαιτούνται για φενρετινίδη επαγόμενη απόπτωση.

(Α) Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ μετά διάφορες δόσεις φενρετινίδης για 48 ώρες. (Β) απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό Δ

Ψm με τη θεραπεία φενρετινίδη 1 μΜ, όπως προσδιορίζεται μέσω της ροδαμίνης 123 και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση, και που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (Γ) Η απόπτωση μετά τη θεραπεία φενρετινίδη 1 μΜ αξιολογήθηκε με αννεξίνη V αντισώματος-ειδικά και διπλή χρώση ΡΙ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. (D) Δυναμική μεταβολές των ROS, όπως αξιολογείται σε κύτταρα χρωματίστηκαν με DCFH-DA και ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Οι μέσες τιμές ± SD χαράσσεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Στιβαρή μεταγραφικό προφίλ των φενρετινίδης απόπτωση

υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών Time-series, η επιλογή γονιδίων, και τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών μεταγραφικό.

για να αναλυθούν οι λεπτομερείς μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω φενρετινίδη απόπτωση, εκτελέσαμε μεταγραφικό προφίλ σε δείγματα φενρετινίδης επεξεργασμένα κύτταρα ΝΒ4 που συλλέχθηκαν σε 19 χρονικά σημεία και τα δείγματα χωρίς θεραπεία κυττάρων σε 4 χρονικά σημεία. Μετά από υβριδισμό μικροσυστοιχιών και απόκτηση δεδομένων, τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης για πρώτη φορά υποβάλλεται σε μια διαδικασία επιλογής γονίδιο τοπολογία-διατήρηση μέσω της αυτο-οργάνωση χάρτη (SOM) ολοκληρωμένα ενικό αποσύνθεση αξία (SVD). Ακολουθώντας τη διαδικασία που βασίζεται σε ψευδείς ρυθμό ανακάλυψης (FDR) στατιστική συμπερασματολογία, επιλέχθηκαν συνολικά 3.345 γονιδίων που ρυθμίζονται με το χαρακτηριστικό μοτίβα (βλέπε Μέθοδοι) και αναλύονται περαιτέρω ανά συνιστώσα παρουσίαση αεροπλάνο (CPP) ολοκληρωμένα SOM [17] – [19]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, κάθε παρουσίαση απεικονίζει μία χρονική στιγμή ειδικό μεταγραφικό χάρτη, επιτρέπουν άμεσες συγκρίσεις των μεταβολών μεταγραφικό εντός /μεταξύ της σειράς ελέγχου και σειράς φενρετινίδη επεξεργασία. Συγκρίνοντας τη σειρά του ελέγχου και της θεραπείας, οι παρατηρούμενες αλλαγές μεταγραφικό πριν από τη θεραπεία των 6 ωρών (που ονομάζεται το αρχικό στάδιο) είναι κυρίως λόγω της διάρκειας του πολιτισμού, πράγμα που σημαίνει ότι τα αποτελέσματα στα πρώτα στάδια προκαλείται από φενρετινίδη είναι κυρίως βιοχημικές, με περιορισμένες επιπτώσεις στην μεταγραφική ρύθμιση. Ωστόσο, εξέχουσα αλλαγές μεταγραφικό γίνει εμφανής μετά από 8 ώρες θεραπείας, όπως τονίζεται από γονίδια που αντιστοιχίζονται σε νευρώνες στις γωνίες κάτω δεξιά (επίσης ονομάζεται Ομάδα 6 στο δεξιό τμήμα του Σχήματος 2Α). Αυτά τα γονίδια είναι σε περίοπτη θέση πάνω ρυθμισμένα μετά το αρχικό στάδιο, που αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό χαρακτηριστικό μεταγραφικό κατά τη διάρκεια φενρετινίδη απόπτωση. Δεδομένου ότι η συσσώρευση των ROS είναι ένα σημαντικό αποτέλεσμα της αγωγής φενρετινίδης, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι η διαφοροποίηση αυτών των γονιδίων είναι αποτέλεσμα της συσσώρευσης ROS.

(Α) Απεικόνιση των αλλαγών μεταγραφικό η CPP-SOM. Κάθε παρουσίαση απεικονίζει ένα χρονικό σημείο συγκεκριμένες χάρτη μεταγραφικό, στην οποία όλα τα up-ρύθμιση (που αντιπροσωπεύεται από τους νευρώνες με κόκκινο χρώμα), κάτω-ρυθμίζονται (που αντιπροσωπεύεται από τους νευρώνες σε μπλε) και μέτρια ρύθμιση (που αντιπροσωπεύεται από τους νευρώνες σε κίτρινο και πράσινο) γονίδια καλά οριοθετημένες. μπαρ χρώμα συμβολίζει τις τιμές έκφρασης (αναλογία με βάση 2 log), με λαμπρότερο για να υποδηλώσει την υψηλότερη τιμή. Οι παρουσιάσεις σε σειρά ελέγχου που υποδεικνύεται από λευκή γραμμή κάτω, ενώ εκείνοι στην φενρετινίδη επεξεργασμένο σειρά είναι χωρισμένο σε τρία στάδια: στις αρχές, τους ενδιάμεσους και αργά, όπως φαίνεται από γκρι-βαθμολογούνται μπαρ κάτω. Όλες οι παρουσιάσεις που συνδέονται με θέσεις, δηλαδή, η ίδια θέση αντιπροσωπεύει την ίδια νευρώνα του οποίου ο δείκτης εμφανίζεται στη διευρυμένη ιδεόγραμμα πλέγμα στο δεξί πλαίσιο. Οι έξι αναγνωρίσιμες περιοχές που λαμβάνονται μέσω ιεραρχικής ομαδοποίησης με βάση τις ομοιότητες μοτίβο χρωματιστό κωδικοποιημένο όπως υποδεικνύεται. Γονίδια στην ομάδα 6 είναι πιο περίοπτη θέση πάνω ρυθμισμένα κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, που αντιπροσωπεύει ένα οξειδωτικό στρες-απόκρισης φάσματος μεταγραφικό υπογραφή. (Β) Εικονογράφηση πρότυπα έκφρασης των γονιδίων σε αντιπροσωπευτικές νευρώνες της ομάδας 6 μέσω γραφήματα γραμμής χρωματική κωδικοποίηση και ιστογράμματα, όπως αποδεικνύεται από τους νευρώνες 46, 47, 40 και 49. αντίστοιχα PWM τους και /ή να πάτε εμπλουτισμοί έχουν επίσης δηλώσει. (Γ) Σημαντικές λειτουργικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες απόπτωση που διαμεσολαβείται, όπως οπτικοποιείται με ιεραρχική ομαδοποίηση των αντιπροσωπευτικών γονιδίων.

Η

μεταγραφής και λειτουργικά χαρακτηριστικά του συμπλέγματος γονιδίων χαρακτηριστικά τονίζοντας οξειδωτικό στρες απόπτωση που διαμεσολαβείται.

ισχυρή προσέγγιση μεταγραφικό μας επιτρέπει την ομαδοποίηση των γονιδίων με πολύ παρόμοιες πρότυπα έκφρασης για τα ίδια ή κοντινά γειτονικά νευρώνες, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 2Β. Αυτό μπορεί να διευκολύνει πολλές πτυχές της σε βάθος εξόρυξης των βιολογικών πληροφοριών σχετικά με την φενρετινίδη απόπτωση. θέση δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής (TFBS) εμπλουτισμός αναλύσεις μετά την εκθετική κατανομή με βάση πολλαπλές δοκιμές υπόθεση για να συμπεράνουμε κοινή μεταγραφική χαρακτηριστικά του συμπλέγματος γονιδίων (βλέπε Μέθοδοι) Πραγματοποιήσαμε. Όπως απεικονίζεται από την αντιπροσωπευτική νευρώνες της ομάδας 6 (Σχήμα 2Β), η μεταγραφή παράγοντες NRF2, HSF1, ATF6 και ELK1 είναι σημαντικά υπερεκπροσωπούνται αντίστοιχα σε νευρώνα 40, 46, 47 και 49. NRF2 είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αντιοξειδωτική υπό οξειδωτικού στρες [20], [21], HSF1 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής υπεύθυνος για την έκφραση γονιδίων θερμικού σοκ [22], ATF6 αποτελεί βασικό μεταγραφικός ενεργοποιητής του ξεδιπλωμένη απόκρισης πρωτεΐνης (UPR) [23], και ELK1 εμπλέκεται σε μεταγραφή επιβίωσης γονιδίων [24]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα γονίδια στην ομάδα 6 ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από παράγοντες μεταγραφής στρες-απόκρισης, τονίζοντας τις επιπτώσεις της ανάντη οξειδωτικού σηματοδότησης στην κατάντη αποτελέσματα.

Για την αντιμετώπιση των περαιτέρω λειτουργική σημασία του συμπλέγματος γονιδίων, χρησιμοποιήσαμε Gene Ontology ( GO) για ανάλυση λειτουργικών εμπλουτισμό. Λειτουργικά χαρακτηριστικά με στατιστική σημαντικότητα αποκαλύφθηκαν, που απεικονίζει μια σχετικά ολοκληρωμένη εικόνα του οξειδωτικού στρες απόπτωση. Ανάμεσα σε αυτά τα χαρακτηριστικά ήταν τα γονίδια που εμπλέκονται στη μεταγραφική ρύθμιση, ριβόσωμα μηχανήματα, οξειδωτικό στρες, ER στρες UPR, ουβικιτίνης-πρωτεασώματος σύστημα /και απόπτωση (Σχήμα 2C). Οι αλλαγές των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής φαίνεται να είναι λογικό για την εισδοχή των κακοήθων κυττάρων σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, όπως φαίνεται από πάνω ρυθμισμένα

DDIT3

/

CHOP

,

CEBPB

,

CEBPG

,

NFE2L1

και

PHF1

, και κάτω-ρυθμίζονται

MYC

και

IKZF1

. Μειωμένη ριβόσωμα δραστηριότητα μπορεί να αντιπροσωπεύει μια άμεση απάντηση στην συνολική μετάφραση της πρωτεΐνης του στρες-κατασταλεί. Ρύθμιση των γονιδίων οξειδοαναγωγής που σχετίζονται μπορεί να ευθύνεται για τη μείωση ROS κατά τη διάρκεια της μετέπειτα στάδια της φενρετινίδης απόπτωση. Up-ρύθμιση ενός μεγάλου αριθμού ER άγχους και UPR ρυθμιζόμενα γονίδια παρατηρήθηκε κατά το χρονικό διάστημα από 6 έως 24 ώρες μετά τη θεραπεία (ονομάζεται το ενδιάμεσο στάδιο), εμπλέκοντας την εμφάνιση ER άγχους και UPR δραστηριότητες που σχετίζονται με την άμυνα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρατηρήσαμε ενεργοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται στο σύστημα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. Τα περισσότερα από τα γονίδια που κωδικοποιούν για τη συσκευή πρωτεασώματος επήχθησαν μετά το αρχικό στάδιο, η προώθηση της αποδόμησης του υπερφορτωμένο ξεδιπλωμένη /misfolded πρωτεΐνες που προκύπτουν από ER στρες /UPR. Up-ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις ρυθμιστικές /συμμετέχοντες αποπτωτικών καταρράκτες (π.χ.,

CASP7

,

BCLAF1

,

DEDD2

,

DAP3

,

STK17A

,

LAPTM5

και

MAGEH1

) και προς τα κάτω ρύθμιση των αρνητικών ρυθμιστών της απόπτωσης, όπως

BCL2

και

MPO

ήταν εμφανής κατά τη διάρκεια της ενδιάμεσα και όψιμα στάδια.

Πρόσθετα μοριακής και κυτταρικής αποδείξεις για το οξειδωτικό στρες απόπτωση σε κύτταρα λευχαιμίας φενρετινίδη επεξεργασμένα

Η διαδοχική συμμετοχή του ER στρες /UPR και τα μιτοχόνδρια των συναφών δραστηριοτήτων αποπτωτικών.

για να επικυρώσετε χαρακτηριστικά αποκαλύφθηκε με ανάλυση μεταγραφικό και να καθοριστούν επιπλέον συνιστώσες του οξειδωτικού στρες απόπτωση, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω μια σειρά κυτταρικών και μοριακών δοκιμασιών. Όπως φαίνεται στο αριστερό πλαίσιο της Εικόνας 3Α, οι αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης του στρες ER /UPR GRP78 δείκτη /HSPA5 και το άγχος που επάγεται προ-αποπτωτικών παράγοντα μεταγραφής CHOP /GADD153 συσχετίσθηκαν με τα επίπεδα του mRNA (Σχήμα 2C). Αυτά τα γονίδια και οι πρωτεΐνες ήταν ειδικά up-ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του ενδιάμεσου σταδίου, παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις ότι ER στρες /UPR συνέβησαν κατά τη διάρκεια αυτού του χρονικού πλαισίου. Επιπλέον, η προ-αποπτωτική μορφή CASP4, ένα ER στρες-ειδικά κασπάσης [25], μειώθηκε δραματικά κατά το τελευταίο στάδιο, που εμπλέκουν τη συμμετοχή σε φενρετινίδη επαγόμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο δεξιό τμήμα του Σχήματος 3Α, μιτοχόνδρια συνδέονται αποπτωτικών καταρρακτών κασπάσης ενεργοποιήθηκαν κατά το τελευταίο στάδιο. Προ-αποπτωτική CASP9 μειώθηκε, ενώ CASP3 αυξήθηκε σε δραστική μορφή της πριν από τη προχωρημένο στάδιο. Επιπλέον, διασπασμένη PARP παρατηρήθηκε μετά την ενεργοποίηση της κασπάσης καταρράκτη. Εν ολίγοις, οι βιοχημικά δεδομένα πρωτεΐνη υποστηρίζουν επίσης την άποψη ότι ER στρες /UPR εμφανίζεται στο ενδιάμεσο στάδιο, ενώ τα μιτοχόνδρια-εμπλέκονται απόπτωση εμφανίζεται κυρίως κατά το τελευταίο στάδιο.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των ER στρες /UPR σχετίζονται δείκτες και αποπτωτικά κασπάσες κατά την κατεργασία φενρετινίδη 1 μΜ σε ΝΒ4 κύτταρα. (Β) Κατάργηση της φενρετινίδης απόπτωση που επάγεται από τη βιταμίνη C. (C) Συνεργική επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης με αναστολέα πρωτεασώματος MG132 και φενρετινίδη. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με αννεξίνη V αντισώματος-ειδικά και διπλή χρώση ΡΙ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των τριών ανεξάρτητων αξιολογήσεων ± SD.

Η

Synergistic επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης από φενρετινίδη και αναστολέας πρωτεασώματος.

Στα κύτταρα φενρετινίδη-θεραπεία, ROS σηματοδότησης μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό ερέθισμα στο αρχικό στάδιο του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Να υποβάλει περαιτέρω αποδείξεις για ROS σηματοδότησης στην απόπτωση, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση ανταγωνιστή χρησιμοποιώντας τη βιταμίνη C ως αντιοξειδωτικό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η θεραπεία βιταμίνης C καταργηθεί εντελώς φενρετινίδη επαγόμενη απόπτωση σε ΝΒ4 κύτταρα. Γονίδια που κωδικοποιούν τα συστατικά του πρωτεοσώματος ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα κατά τα ενδιάμεσα και τελικά στάδια. Έτσι, υποθέσαμε ότι η δραστηριότητα πρωτεασώματος μπορεί να λειτουργήσει ως μηχανισμός άμυνας σε συνδυασμό με το UPR για εκτυλίχθηκε /misfolded υποβάθμιση πρωτεΐνη για να μειωθεί η επιβάρυνση ER στρες [26]. Κατά συνέπεια, η ενεργοποίηση του πρωτεασώματος μπορεί να ανταγωνίζεται τη προ-αποπτωτικών /αποπτωτικό καταρράκτη. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε τον αναστολέα πρωτεασώματος MG132 να εμποδίσει τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος κατά την διάρκεια φενρετινίδη επαγόμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, ένα υπο-κυτταροτοξική συγκέντρωση (0,2 μΜ) του MG132 μαζί με μια χαμηλή δόση του φενρετινίδης (0,5 μΜ) προκάλεσε σημαντική κυτταρική απόπτωση εντός 48 ωρών, επιδεικνύοντας συνεργική παρά ανταγωνιστικές επιδράσεις των δύο ενώσεων.

Μετατρέποντας το οξειδωτικό σηματοδότησης σε κατάντη αποτελέσματα μέσω μεταγραφικών παραγόντων στρες-απόκρισης, όπως τονίζεται από NRF2 και HSF1

Ο συντονισμός μεταξύ των χρονικών-χωρικές μεταβολές της NRF2 και HSF1, και τα πρότυπα έκφρασης των πιθανών γονιδίων στόχων τους.

ισχυρή μεταγραφικό προφίλ προσέγγισή μας διευκόλυνε τη σε βάθος εξόρυξης των βιολογικών πληροφοριών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες, απόπτωση, συμπεριλαμβανομένης της πρόβλεψης της ανάντη μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη γονιδιακή ρύθμιση. Μετεγγραφικών ρυθμιστών προβλεφθεί, το άγχος αποκρίνεται παράγοντες μεταγραφής NRF2 και HSF1 παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την κατανόηση του πώς οξειδωτική σηματοδότηση μεταφράζεται σε κατάντη επιδράσεις. Ως εκ τούτου, διερεύνησε περαιτέρω τη χρονική αφθονία και ο χωρικός εντοπισμός αυτών των δύο παραγόντων μεταγραφής άγχος ανταποκρίνεται κατά την απόπτωση. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 4Α, τα επίπεδα της πρωτεΐνης τόσο NRF2 και HSF1 ήταν σημαντικά αυξημένα σε πυρηνικά εκχυλίσματα εντός 6 ωρών από την έκθεση σε φενρετινίδης, και χρονική αφθονία τους διαφοροποιήθηκε στη συνέχεια. επαγωγή NRF2 επεκτάθηκε πέραν των 24 ωρών, ενώ τερματίστηκε η επαγωγή HSF1 σε αυτό το χρονικό σημείο. Ομοίως, μικροσκοπία ανοσοφθορισμού αναλύσεις αποκάλυψαν αξιοσημείωτη συσσώρευση των δύο παραγόντων σε πυρήνες κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με φενρετινίδη για 6 ώρες, σε σύγκριση με μια διάχυτη κατανομή NRF2 και HSF1 σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4Β). Επίσης, η πυρηνική συγκέντρωση των NRF2 διατηρήθηκε πέραν της περιόδου θεραπείας 24 ώρες, ενώ καταγγέλθηκε ότι από HSF1. Λαμβάνοντας υπόψη τα σχετικώς χαμηλά επίπεδα ROS σε αγωγή 24 ωρών (Σχήμα 1 D), η αδρανοποίηση του HSF1 είναι πιθανόν να οφείλεται σε μείωση μικροπεριβάλλον [22]. Επιπλέον, τα διαχρονικά-χωρικές μεταβολές της NRF2 και HSF1 συσχετίζονται καλά με τις ρυθμιστικές πρότυπα των πιθανών γονιδίων στόχων τους (Σχήμα 4C). Up-ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων NRF2 πιθανό στόχο επεκτάθηκε σε προχωρημένο στάδιο, ενώ γονιδιακή έκφραση HSF1 πιθανών στόχων ομόφωνα καταγγελθεί από το τέλος του ενδιάμεσου σταδίου.

(Α) ανάλυση Western blot των NRF2 και HSF1 από πυρηνικά εκχυλίσματα των κυττάρων ΝΒ4 ανεπεξέργαστων ή επεξεργασία με 1 μΜ φενρετινίδης στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. «*» Υποδεικνύει την ζώνη μη-ειδική σύνδεση. (Β) Η πυρηνική μετατόπιση της NRF2 και HSF1 μετά από θεραπεία φενρετινίδη 1 μΜ σε κύτταρα ΝΒ4, όπως οπτικοποιείται με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (ράβδοι κλίμακας, 5 μm). (Γ) Απεικόνιση των προτύπων έκφρασης γονιδίων δυνητικά στοχεύονται από NRF2 και HSF1, που απεικονίζεται στο αριστερό και δεξιό πάνελ, αντιστοίχως. (D) ChIP σε συνδυασμό με αναλύσεις PCR για να επικυρώσετε τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ παραγόντων μεταγραφής (δηλαδή, NRF2 και HSF1) και τα γονίδια στόχους τους. Σύνολο: συνολικών εισροών? IgG: αντίδραση τσιπ με το αντίσωμα IgG ως μάρτυρας? DNAJB6

#:.. Εκκινητές που σχεδιάστηκαν από μη TFBS περιοχή του γονιδίου

DNAJB6

Η

Φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ NRF2 και HSF1, και τα γονίδια στόχους τους κατά την ενεργοποίηση

για να διερευνήσουν κατά πόσον NRF2 και HSF1 είναι φυσικά συνδεδεμένο με τους στόχους τους, πραγματοποιήσαμε ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (chip) θα δοκιμασίες χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι NRF2 ή HSF1. Με βάση τις προβλεπόμενες TFBS των αντιπροσωπευτικών γονιδίων που απαριθμούνται στο Σχήμα 4C, ειδικοί εκκινητές PCR σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας προϊόντα τσιπς είτε NRF2 ή HSF1 ως πρότυπα DNA. Όπως φαίνεται στο αριστερό πίνακα του σχήματος 4D, τα γονίδια με την προβλεπόμενη TFBS της NRF2 (δηλαδή,

FTL

,

NQO1

,

TXNRD1

,

GCLM

και

GCLC

) είναι θετικές για τα προϊόντα NRF2 ChIP, ενώ άσχετα γονίδια (δηλαδή,

LRRC

,

AFIM

και

PAX7

) είναι αρνητική σε τα ίδια προϊόντα. Παρά το γεγονός ότι η δέσμευση παρατηρήθηκε βασικό επίπεδο NRF2 σε ακατέργαστα προϊόντα τσιπς, τα περισσότερα από τα προβλεπόμενα γονιδίων αποκάλυψε σημαντικά ισχυρότερα σήματα σε επεξεργασμένα δείγματα. Παρομοίως, δοκιμασίες ChIP-PCR HSF1 αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα (Εικόνα 4D, δεξιό πλαίσιο). Αξίζει να σημειωθεί ότι, εκκινητές σχεδιάζονται από την περιοχή TFBS αποκάλυψε κύριες λωρίδες στα προϊόντα ChIP HSF1, ενώ εκείνες από τις μη TFBS περιοχές των ίδιων γονιδίων αποκάλυψε απουσιάζει σήματα (π.χ.,

DNAJB6 εναντίον DNAJB6

#

). Συνολικά, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι NRF2 και HSF1 ενεργοποιούνται μετά τη συσσώρευση των ROS από το τέλος του πρώιμου σταδίου, μετατρέποντας το οξειδωτικό σηματοδότησης σε κατάντη επιπτώσεις από την απευθείας ενεργεί για γονίδια στόχους τους. ενεργοποίηση NRF2 εκτείνεται σε προχωρημένο στάδιο, ενώ η δραστηριότητα HSF1 τερματίζεται με το τέλος του ενδιάμεσου σταδίου.

Λειτουργική σημασία της ενεργοποίησης NRF2 και HSF1 στο οξειδωτικό στρες απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα.

Πιθανοί στόχοι της NRF2 κυρίως εκπροσωπείται από γονίδια που κωδικοποιούν αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες ή ένζυμα (Σχήμα 4C) για την άμβλυνση των ενδοκυτταρική δραστηριότητες οξειδοαναγωγής, όπως

FTL

,

NQO

,

TXNRD

,

GCLM

και

GCL

. Η ενεργοποίηση του NRF2 κατά τον σχηματισμό του οξειδωτικού σηματοδότησης στο πρώιμο στάδιο ενισχύει την έκφραση του αντιοξειδωτικού γονιδίων, η οποία μπορεί κατά συνέπεια να οδηγήσει σε σταδιακή μείωση ROS στο ενδιάμεσο στάδιο, και μέτρια επίπεδα ROS σε προχωρημένο στάδιο (Εικόνα 1D). Οι πιθανοί στόχοι της HSF1 εκπροσωπούνται σε μεγάλο βαθμό από τα γονίδια που κωδικοποιούν UPR που σχετίζονται με συνοδούς (Σχήμα 4C) όπως

HSPA8

,

HSPH1

,

HSPA1A

,

HSPA9B

,

DNAJA1

,

DNAJB1

,

DNAJB6

και

SERIPINH1

. HSF1 ενεργοποίηση και γονιδίων-στόχων τους φαίνεται να είναι παροδική, παρέχοντας πρόσθετη απόδειξη ότι UPR που παρατηρείται στα κύτταρα φενρετινίδη επεξεργασμένα συμβαίνει κατά τη διάρκεια του ενδιάμεσου σταδίου. Παροδική διαμόρφωση του UPR είναι πιθανώς σημαντικό για το οξειδωτικό στρες απόπτωση που διαμεσολαβείται σε καρκινικά κύτταρα, με βάση το γεγονός ότι πολλά από αυτά τα UPR σχετίζονται συνοδοί είναι λειτουργικά ανασταλτικές να προ-αποπτωτικών /αποπτωτικών καταρρακτών [27]. Ως εκ τούτου, τερματισμός, παρά τη διατήρηση της UPR πριν από το τελικό στάδιο, όπου συμβαίνουν τα περισσότερα αποπτωτικών δραστηριότητες είναι μάλλον απαραίτητη για την αποτελεσματική εξέλιξη της απόπτωσης. Εκτός από την chaperone γονίδια, αρκετές προ-αποπτωτικών /αποπτωτικών γονιδίων ρυθμίζονται επίσης από HSF1, συμπεριλαμβανομένων των

DEDD

[28] και

BAG3

[29]. Από το επάνω-ρύθμιση αυτών των γονιδίων είναι επίσης τερματίζεται στο τέλος του ενδιάμεσου σταδίου, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι εμπλέκονται σε ανάντη δραστηριότητες προ-αποπτωτικών /αποπτωτικών καταρράκτες.

Σημαντική επίπτωση της NRF2 και HSF1 για το στρες που ανταποκρίνεται υπογραφές μεταγραφικό σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες απόπτωση

φενρετινίδη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα εμφανίζεται ως απάντηση σε οξειδωτικό στρες, και είναι ενορχηστρωμένα από τους παράγοντες μεταγραφής άγχος ανταποκρίνεται, όπως τονίστηκε από την διαμόρφωση του ένας μεγάλος αριθμός στρες αποκρίνονται γονιδίων. Συνήθως, αυτά τα στρες-γονιδίων που αποκρίνονται αντιπροσωπεύονται από εκείνους συγκεντρωμένα σε ομάδα 6 (Σχήμα 2Α). Κατά συνέπεια, υπέθεσαν ότι τα γονίδια στην ομάδα 6 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα χαρακτηριστικό φάσμα υπογραφή των καρκινικών κυττάρων που υποβάλλονται σε οξειδωτικό στρες με τη μεσολάβηση προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και όχι η επιβίωση μετά από ερέθισμα άγχους. Για την επικύρωση αυτή την υπόθεση, και να αξιολογήσουν τις πιθανές επιπτώσεις της NRF2 και HSF1 για την υποτιθέμενη φάσμα υπογραφή, έχουμε συγκριτικά επικαλύπτονται γονίδια στην ομάδα 6 με διάφορα σύνολα δεδομένων έκφρασης που σχετίζονται με διάφορες αντιδράσεις στρες υπό μη αποπτωτικές συνθήκες [30] και στο παρελθόν μας δημοσιευμένα στοιχεία σχετικά με έκφραση ΑΤΟ /RA επαγόμενη διαφοροποίηση /απόπτωση κυττάρων ΝΒ4 [18]. Μέσω ιεραρχική συσταδοποίηση που ακολουθείται από ενσωμάτωση των γονιδιωματικών πληροφοριών TFBS, στρες αποκρίνονται χαρακτηριστικά μεταγραφικό υπό αποπτωτική ή μη αποπτωτικές συνθήκες (Εικόνα 5). Με τη σύγκριση αυτών των χαρακτηριστικών σε όλες τις συνθήκες, το φάσμα υπογραφή μπορεί να χωριστεί περαιτέρω σε τέσσερις κατηγορίες (Ι-IV). Διαφοροποίηση των γονιδίων στην κατηγορία Ι αποδίδεται σε μεγάλο βαθμό στην ενεργοποίηση HSF1, όπως φαίνεται και από εξέχοντα ρύθμιση προς τα πάνω κάτω από θερμικό σοκ. ενεργοποίηση HSF1 υπό μη αποπτωτικές συνθήκες θερμικού σοκ φαίνεται να συνεχιστούν και όχι παροδική. Διαμόρφωση των γονιδίων της κατηγορίας II φαίνεται να είναι πιο σύνθετη, ίσως επειδή είναι ενορχηστρωμένη από πολλαπλούς παράγοντες μεταγραφής άγχος ανταποκρίνεται όπως CHOP και XBP1, όπως εμπλέκονται με την παρατηρούμενη πολύπλευρη σύνθεση TFBS. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι αυτή η κατηγορία γονίδιο εμπλέκεται επίσης στο στρες ER /UPR που συμβαίνουν στο ενδιάμεσο στάδιο του οξειδωτικού στρες απόπτωση, με βάση τα πρότυπα της έκφρασης καθώς και τη λειτουργική σχολιασμούς. Γονίδια στην κατηγορία III είναι εκείνες που εμπλέκονται άμεσα στη σηματοδότηση οξειδοαναγωγής κατά τη διάρκεια των ενδιάμεσων και όψιμα στάδια, όπως τονίζεται από σημαντικό εμπλουτισμό των NRF2 και συν-παράγοντα του MAF. Η ενεργοποίηση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις υπομονάδες της συσκευής πρωτεασώματος είναι ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά σε αυτή τη μελέτη. Αυτά τα γονίδια συγκεντρωμένα αποκλειστικά στην κατηγορία IV. ανάλυση TFBS εμπλέκει ότι τα γονίδια σε αυτή την κατηγορία διαμορφώνονται από ELK1.

δεδομένα έκφραση του άγχους που σχετίζονται με συναρμολογήθηκαν και εμφανίζεται μέσω της ιεραρχικής ομαδοποίησης. TFBS πληροφορίες για κάθε παράγοντα μεταγραφής είναι ενσωματωμένο στο αριστερό μέρος της οθόνης, με υποτιθέμενο επιτυχίες σημειώνονται με κόκκινο χρώμα. Διάφορες συνθήκες που υποδεικνύονται στην κορυφή της οθόνης. Τρεις απαντήσεις άγχος ήταν όλοι που προκαλείται κάτω από το όριο όπου συνέβη σημαντική θνησιμότητα. θερμικού σοκ προκλήθηκε σε HeLa, ινοβλάστες και Κ562 κύτταρα? Ενδοπλασμικό δίκτυο στρες προκλήθηκε σε κύτταρα HeLa με την τουνικαμυκίνη αναστολέα γλυκοζυλίωσης ή θειόλη παράγοντα αναγωγής DTT, και σε ινοβλάστες με DTT? Το οξειδωτικό στρες προκλήθηκε σε κύτταρα HeLa με H

2O

2 ή με μεναδιόνη, και σε ινοβλάστες με μεναδιόνη.