Αφηρημένο

Ιστορικό

Η οικογένεια microRNA-200 συμμετέχει στη διατήρηση ενός επιθηλιακού φαινοτύπου και απώλεια της έκφρασης του μπορεί να οδηγήσει σε επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ). Επιπλέον, η απώλεια της έκφρασης των μελών της οικογένειας miR-200 συνδέεται με έναν επιθετικό φαινότυπο καρκίνου. Κανονισμός της οικογένειας έκφραση του miR-200 σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα δεν είναι πλήρως κατανοητός.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Επιγενετική μηχανισμούς συμμετέχουν στον έλεγχο του miR-200c και miR-141 έκφρασης φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Ένα νησί CpG κοντά στην προβλεπόμενη Mir-200C /mir-141 θέση έναρξης της μεταγραφής δείχνει μια εντυπωσιακή συσχέτιση μεταξύ miR-200c και miR-141 έκφρασης και ΟΝΑ μεθυλίωσης και σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με τεχνολογία MassARRAY. Το νησί CpG είναι μη μεθυλιωμένες στην ανθρώπινη miR-200 /miR-141 επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν και θετικά καρκινικά κύτταρα miR-200c /miR-141. Το νησί CpG είναι σε μεγάλο βαθμό μεθυλιωμένο στην ανθρώπινη miR-200c /miR-141 αρνητικών ινοβλάστες και τα αρνητικά καρκινικά κύτταρα miR-200c /miR-141. κύτταρα ποντικού δείχνουν μια παρόμοια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και την έκφραση του miR-200c. Εμπλουτισμός ανεκτική τροποποιήσεις των ιστονών, Η3 ακετυλίωση και H3K4 trimethylation, παρατηρείται σε κανονικό miR-200c /επιθηλιακά κύτταρα miR-141-θετικά, όπως προσδιορίζεται με ανοσοκαταβύθιση χρωματίνη συζευγμένο με πραγματικού χρόνου PCR. Σε αντίθεση, κατασταλτική σήματα H3K9 διμεθυλίωση υπάρχουν σε φυσιολογικά miR-200c /miR-141-αρνητικών ινοβλάστες και miR-200c /miR-141 αρνητικά καρκινικά κύτταρα και τα ανεκτική τροποποιήσεις των ιστονών είναι απούσα. Η επιγενετική τροποποιητής φάρμακο, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη, επανενεργοποιεί miR-200c έκφραση /miR-141 δείχνει ότι επιγενετικών μηχανισμών παίζουν λειτουργικό ρόλο στον έλεγχο της μεταγραφής τους.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αναφέρουμε ότι μεθυλίωσης του DNA παίζει ένα ρόλο στην κανονική τύπου ειδική έκφραση κυττάρου του miR-200c και miR-141 και ο ρόλος αυτός εμφανίζεται εξελικτικά συντηρημένη, αφού παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ποντικό. Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA του νησιού CpG miR-200c /141 συνδέεται στενά με ακατάλληλες αποσιώπηση τους σε καρκινικά κύτταρα. Από το σύμπλεγμα miR-200c διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην EMT, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν σημαντικό ρόλο για τη μεθυλίωση του DNA στον έλεγχο των φαινοτυπική μετατροπές σε φυσιολογικά κύτταρα

Παράθεση:. Vrba L, Jensen TJ, Garbe JC, Heimark RL, Cress AE, Dickinson S, et al. (2010) Ο ρόλος των μεθυλίωσης του DNA στον κανονισμό του miR-200c και miR-141 έκφρασης σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 5 (1): e8697. doi: 10.1371 /journal.pone.0008697

Επιμέλεια: Κατερίνα Μ Suter, Victor Chang Καρδιακές Research Institute, Αυστραλία

Ελήφθη: 13 Οκτ, 2009? Αποδεκτές: 21 Δεκεμβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιανουαρίου του 2010

Copyright: © 2010 Vrba et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Επιχορηγήσεις R01CA65662 να BWF υποστήριξε αυτό το έργο. Κέντρο Επιχορηγήσεις P30ES06694 και P30CA023074, και το κέντρο διεπιστημονικής βιοτεχνολογίας BIO5 στο UA υποστήριξαν την Genomics Shared Υπηρεσία. J.C.G. και M.R.S. υποστηρίχθηκαν από ΝΙΗ U54 CA112970, DOD BCRP BC060444, και το Γραφείο Έρευνας Ενέργειας, Γραφείο Υγείας και Βιολογικών Ερευνών, Υπουργείο Ενέργειας των ΗΠΑ στο πλαίσιο της συμβάσεως Νο DE-AC03-76SF00098. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

miRNAs είναι μονόκλωνα, 20-24 nt καιρό RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. miRNAs στοχεύουν συχνά 3 ‘UTRs του mRNA, και δεδομένου ότι miRNA μοτίβα στόχος δεν απαιτούν πλήρη ομολογία, μπορεί να υπάρχουν εκατοντάδες στόχους mRNA για κάθε miRNA. Οι τρέχουσες εκτιμήσεις είναι ότι υπάρχουν σχεδόν 900 μοναδικές miRNAs κωδικοποιούνται στο ανθρώπινο γονιδίωμα, και αυτοί τον έλεγχο miRNAs, εν μέρει, η έκφραση περισσότερο από το ένα τρίτο των ανθρώπινων γονιδίων [1]. Ένας αριθμός miRNA απορρυθμισμένης στον ανθρώπινο καρκίνο έχουν δείξει να έχουν ογκογόνο ή κατασταλτική του όγκου δραστικότητα [2], [3], [4]. Αυτά περιλαμβάνουν τα είδη miRNA που παρουσιάζουν κυτταρικού τύπου ειδική πρότυπα έκφρασης, μερικά από τα οποία είναι σημαντικά για τη διατήρηση της ταυτότητας των κυττάρων [5], [6]. Αυτοί οι τύποι των miRNA είναι πρωταρχικοί στόχοι για επιγενετική έλεγχο, και οι πρώτες μελέτες υποστήριξης του ελέγχου των miRNAs η δυνατότητα αυτή [7], [8].

miR-200c και miR-141 είναι μέλη της οικογένειας miR-200 και είναι σημαντικοί ρυθμιστές του επιθηλιακού να μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [5], [9], [10], [11]. Εκτός από το ρόλο του miR-200c και miR-141 στην φαινοτυπική μετατροπή των φυσιολογικών κυττάρων, απορύθμιση του φυσιολογικού πρότυπα έκφρασης miR-200c συμβαίνει σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων και συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου [2], [6] [12], [13], [14], [15]. Ο μηχανισμός που ευθύνεται για τον έλεγχο της έκφρασης miR-200c και σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα δεν είναι πλήρως κατανοητός. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η επιγενετική κατάσταση είναι στενά συνδεδεμένη με ειδικό κανονικό τύπο κυττάρων έκφραση του miR-200c και miR-141, και αυτή η επιγενετική κατάσταση απορρυθμισμένη σε κύτταρα καρκινώματος, όπου η απώλεια του miR200c /141 έκφραση συνδέεται με παρεκκλίνουσα DNA μεθυλίωση και ιστόνης τροποποιήσεις. Τέλος, βρήκαμε ότι ο κανονισμός miR-200c με μεθυλίωση του DNA είναι εξελικτικά συντηρημένη ανάμεσα στους ανθρώπους και ποντίκια. Από το miR-200c διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην EMT, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μεθυλίωση του DNA παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της φαινοτυπική μετατροπή των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Το miR -200 οικογένεια αποτελείται από πέντε miRNAs που κωδικοποιούνται μέσα σε δύο ομάδες. Κάθε συστάδα κωδικοποιεί ένα πολυσιστρονικό γονίδιο. Ένα σύμπλεγμα βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1 και κωδικοποιεί miR-200b, miR-200a και miR-429, ενώ το άλλο σύμπλεγμα βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 12, και κωδικοποιεί miR-200c και miR-141. δεδομένα αλληλούχισης μικρή βιβλιοθήκη RNA μας (Σχήμα 1Α) δείχνουν ότι η οικογένεια miR-200 εκφράζεται έντονα σε καλλιεργημένα κανονικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMEC) που προέρχονται από τρία διαφορετικά άτομα, ενώ τα ισογονιδιακές ανθρώπινα μαστικά κύτταρα ινοβλάστης (FB) στερούνται miR-200 οικογένεια έκφρασης (Σχήμα 1Α). Είναι προφανές από τα μικρά στοιχεία προσδιορισμού αλληλουχίας βιβλιοθήκης RNA (Σχήμα 1Α) ότι οι πλέον εντόνως εκφρασμένα μέλη της οικογένειας miR-200 σε HMEC είναι miR-200c και miR-141. Εμείς ενισχύεται η έκφραση του miR-200c και miR-141 στην ίδια σειρά κανονικών μαστικών δειγμάτων με πραγματικού χρόνου PCR, και στη συνέχεια επεκτάθηκε αυτά τα αποτελέσματα στα ζεύγη των επιθηλιακών κυττάρων και των ινοβλαστών από προστάτη και του δέρματος, καθώς και (Σχήμα 1Β? Σχήμα S1). Σε όλες τις περιπτώσεις, miR-200c και miR-141 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα, αλλά δεν εκφράστηκαν σε ινοβλάστες.

A. έκφραση οικογένεια miR-200 σύμφωνα με μαζική παράλληλο αλληλούχιση μικρών βιβλιοθηκών RNA από ένα σύνολο τριών ισογονικών ζεύγη ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMEC) και ινοβλαστών (FB). Η έκφραση του συμπλέγματος mir-200b-200A-429 που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1, και η έκφραση του συμπλέγματος mir-200c-141 που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 12 απεικονίζονται. Με το μέσο όρο των 63.829 μετρήσεις έξω από 3.926.984 ανά βιβλιοθήκη σε HMEC, miR-200c σχηματίζει 1,625% του συνόλου των μικρών RNAs σε αυτά τα κύτταρα. Β πραγματικό χρόνο αξιολόγηση PCR της έκφρασης miR-200c σε κανονικούς τύπους κυττάρων. Το αριστερό πάνελ δείχνει την έκφραση του miR-200c στα ίδια δείγματα όπως πίνακα A. Ο δεξιός πίνακας δείχνει την έκφραση του miR-200c σε επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη (PREC), ινοβλάστες στρωματικά προστάτη (PSF), τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του δέρματος (Kcytes) και ινοβλάστες δέρματος (Ε.Π.Ο.). Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε σχέση με αφήσει-7α, το οποίο εκφράζεται σε ισοδύναμα επίπεδα μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων, σύμφωνα με τις μικρές δεδομένα αλληλούχισης RNA. Real Time PCR ανάλυση της έκφρασης miR-141 σε αυτά τα δείγματα παρέχεται στο Σχήμα S1.

Η

Η φουρκέτα Mir-200c κωδικοποιητική αλληλουχία και περίπου 300 bp ανοδικά της γονιδιωματικής αλληλουχίας είναι πλούσια σε CpG. Σύμφωνα με τους υπολογισμούς μας χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα CpG Cluster [16] η περιοχή αυτή είναι μια εξαιρετικά στατιστικά σημαντική σύμπλεγμα CpG (Σχήμα 2Α). Αυτό το σύμπλεγμα CpG (μήκους 334 bp, GC% 68.56, O /E αναλογία 0,58, 21CpGs, τιμή p 8,44 × 10

-11) έχει τα χαρακτηριστικά κοντά σε έναν ορισμό νησί CpG με βάση το μέγεθος, το περιεχόμενο GC και CpG δινουκλεοτίδιο συχνότητα [17], καθώς και τη θέση του σε σχέση με την μεταγραφική μονάδα [18]. Επιπλέον, η περιοχή αυτή θεωρείται νησί CpG βασίζεται σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη πιθανολογική ορισμός [19]. Αναλύσαμε την περιοχή αυτή ως πιθανός στόχος των επιγενετικών ελέγχου.

Α. Ένα διάγραμμα της γονιδιωματικής περιοχής της HSA-mir-200c. Η επάνω γραμμή δείχνει τις συγκεκριμένες θραύσματα αναλύθηκαν από MassARRAY. Τα κόκκινα θραύσματα που ονομάζεται με CpG θέσεις δείχνουν τα θραύσματα από τα οποία ελήφθησαν τα δεδομένα της μεθυλίωσης του DNA. Αυτά τα δεδομένα παρουσιάζονται πλαίσιο Β Κάτω από αυτό είναι η περιοχή αναλύθηκε με MassARRAY σε σχέση με την γενωμική θέση (σε μπλε χρώμα), ακολουθούμενο από την περιοχή του πραγματικού χρόνου PCR amplicon για ανάλυση ανοσοκαταβύθισης χρωματίνη (μάρκας), και το νησί CpG προσδιορίζονται από το CpGcluster πρόγραμμα. Οι περιοχές που κωδικοποιούν το mir-200c και mir-141 φουρκέτες και την υποτιθέμενη έναρξης της μεταγραφής (TSS) περιοχή συναχθεί από την ανθρώπινη EST κομμάτι του προγράμματος περιήγησης γονιδιώματος UCSC εμφανίζεται, και κάθε κύκλος σε αυτό το κομμάτι αντιπροσωπεύει τη θέση ενός δινουκλεοτιδίου CpG. Ο κυβερνήτης στο κάτω μέρος δείχνει τη θέση στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 12 σύμφωνα με την ανθρώπινη hg18 συναρμολόγηση γονιδιώματος. B. Περίληψη των επιπέδων 5-μεθυλκυτοσίνη λαμβάνεται με MassARRAY ανάλυση της HSA-mir-200c νησί CpG σε δείγματα που χαρακτηρίζεται από το σχήμα 1Β. Ο γ-άξονας δείχνει το ποσοστό της μεθυλίωσης κυτοσίνης εντός των μεμονωμένων μονάδων CpG σημειώνονται επί άξοναχ. Οι μονάδες CpG μέσα στο αμπλικόνιο MassARRAY αριθμούνται κατά την αντίστροφη κατεύθυνση, με CpG 2 που βρίσκεται μέσα αλληλουχία που κωδικοποιεί το miR-200c.

Η

Η επιγενετική κατάσταση του miR-200c /141 νησιού CpG δείχνει σαφή και εκτεταμένες ειδικές διαφορές τύπου κυττάρου μεταξύ της κανονικής miR-200c /141-θετικά και miR-200c /141-αρνητικά κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία MassARRAY να αναλύσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του συμπλέγματος mir-200c νησί CpG (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι περιοχές CpG είναι μη μεθυλιωμένες σε τρία ξεχωριστά στελέχη miR-200c /miR-141-θετικά HMEC. Αντίθετα, όλες οι τοποθεσίες CpG είναι εξαιρετικά μεθυλιωμένη στην ισογονιδιακά miR-200c /στελέχη miR-141-αρνητική ινοβλαστών. Η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης miRNA και μεθυλίωσης του DNA επεκτείνεται και σε άλλες miR-200c /miR-141-θετικών /αρνητικών ζευγών των φυσιολογικών κυττάρων, όπως κύτταρα προστάτη επιθηλιακά κερατινοκύτταρα και δέρμα, και μεσεγχυματικών ομολόγους κυτταρικό τύπο τους, του προστάτη και ινοβλάστες δέρματος. Έτσι, το σύμπλεγμα miR-200c νησί CpG είναι μη μεθυλιωμένες στην κανονική miR-200c /επιθηλιακά κύτταρα miR-141-θετικά, ενώ πυκνά μεθυλιώνονται στα ζεύγη κανονική miR-200c /miR-141-αρνητικό ινοβλάστες (Σχήμα 1Β, Σχήμα 2Β, Εικόνα S2).

miR-200c και miR-141 έκφρασης χάνεται σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων [5], [11], [20], [21], και επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν αυτή η απώλεια της έκφρασης συνδέθηκε με επιγενετικές αλλαγές στο νησί CpG miR-200c /miR-141. Αναλύσαμε 11 κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, και σε κάθε περίπτωση, miR-200c και miR-141 έκφρασης ήταν στενά συνδεδεμένη με την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του νησιού CpG (Σχήμα 3Α? Σχήμα S3). Επτά από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού δοκιμαστεί ρητή miR-200c και miR-141 και το καθένα έχει ένα μη-μεθυλιωμένο νησί mir-200c CpG. Οι άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού τέσσερις δοκιμαστεί δεν εκφράζουν miR-200c και miR-141 και εμφανίζουν πυκνά μετουσιωμένο νησί mir-200c CpG. Μια παρόμοια εικόνα προκύπτει σε σχέση με κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Δείχνουμε δύο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και PC3 Β1), όπου η απώλεια του miR-200c και miR-141 έκφραση συνδέεται με παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA του mir-200C /141 CpG νησίδα (Σχήμα 3Β? Σχήμα S3), και δύο προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές (LNCaP και DU145) που διατηρούν miR-200c /miR-141 έκφρασης και ένα μη-μεθυλιωμένο mir-200c /141 νησιού CpG. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από την κανονική miR-200c /miR-141-θετικά επιθηλιακά κύτταρα μπορεί να αναπαράγουν το είδος-ειδικό πρότυπο μεθυλίωσης του DNA των κυττάρων του /141 νησιού CpG miR-200c δει σε κανονική miR-200c /miR-141 -αρνητικοί κύτταρα, και ότι η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA του νησιού CpG miR200c /141 σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με μεταγραφική σίγηση του σε κύτταρα καρκινώματος.

A. έκφραση του miR-200c και mir-200c CpG νησί μεθυλίωσης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έντεκα μαστού. Β έκφραση του miR-200c και mir-200c CpG νησί μεθυλίωσης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τέσσερις. Το πινάκιο κορυφής κάθε σχήμα δείχνει την έκφραση του miR-200c σε δείγματα καρκίνου του όπως ανιχνεύεται με PCR πραγματικού χρόνου, ομαλοποιήθηκε να αφήσει-7α. Το κάτω μέρος του πίνακα δείχνει το επίπεδο μεθυλίωσης του mir-200c CpG νησιωτική περιοχή στα ίδια δείγματα καρκίνου. Το επίπεδο της μεθυλίωσης των μεμονωμένων μονάδων CpG εντός του amplicon MassARRAY εμφανίζεται ως θερμικός χάρτης με το χαμηλότερο μεθυλίωση σε κίτρινο και το υψηλότερο μεθυλίωση με μπλε χρώμα. Ο άξονας y σηματοδοτεί τις ξεχωριστές μονάδες CpG.

Η

Για να αποδειχθεί η λειτουργική σημασία της επιγενετικών κατάσταση του miR-200C /νησί Mir-141 CpG σε καρκινικά κύτταρα, εκθέσαμε τα καρκινικά κύτταρα με τη επιγενετικών τροποποιητής και το DNA αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-ADC). Το miR-200c /miR-141-αρνητικού καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές ΜϋΑ-ΜΒ-231 και ΒΤ549 και καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ 5-ADC για 96 ώρες και miR-200c /141 έκφραση αξιολογήθηκε με πραγματικό time PCR. Το Σχήμα 4 δείχνει 5-ADC επανενεργοποιηθεί έκφραση miR-200c και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Το επίπεδο του miR-200c αυξήθηκε 4,3-φορές σε MDA-MB-231 (p-value = 0,0004), 6,4-φορές σε ΒΤ549 (p-value = 0,0107) και 4,2-φορές σε κύτταρα PC3 (p-value = 0,0072) . Μια παρόμοια επανενεργοποίηση της έκφρασης miR-141 (ρ-τιμή & lt? 0,01) παρατηρήθηκε επίσης σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου μετά από 5-ADC θεραπεία (Σχήμα S4). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι επιγενετικών μηχανισμών συμμετέχουν στην ακατάλληλη καταστολή του miR-200c /miR-141 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης για 96 ώρες. Το επίπεδο έκφρασης του miR-200c μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Εμφανίζεται η μέση 4 ανεξάρτητων δειγμάτων, οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα της μέτρησης. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με μη κατεργασμένους μάρτυρες (100%). Εικόνα S4 δείχνει το 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης μεσολάβηση επανενεργοποίηση του miR-141 στα ίδια δείγματα.

Η

Η ιστόνης κατάσταση τροποποίηση του συμπλέγματος mir-200c νησί CpG δείχνει επίσης κυττάρων τύπου συγκεκριμένες διαφορές που συνδέονται στενά με την κατάσταση έκφρασης του miR-200c /141 σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Το Σχήμα 5 δείχνει τα αποτελέσματα της ανοσοκαταβυθίσεις χρωματίνης συνδέεται με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση που χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση της κατάσταση τροποποίηση ιστόνης του νησιού CpG miR-200c /141 σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Το νησί CpG του mir-200c /141 στα τρία διαφορετικά στελέχη του miR-200c /miR-141-θετική HMEC υπάρχει σε μεταγραφικά αρμόδιες κρατικές? εμπλουτίζεται για τα μεταγραφικά ανεκτική τροποποιήσεις των ιστονών Η3 ακετυλίωση (H3Ac) και λυσίνη 4 trimethylation (H3TriMeK4), ενώ η μεταγραφικά κατασταλτικά σήμα της ιστόνης της ιστόνης H3 λυσίνη 9 διμεθυλίωση (H3DiMeK9) είναι λιγότερο εκπροσωπούμενο (Σχήμα 5). Αντίθετα, στην ισογονικούς miR-200c /miR-141-αρνητικών μαστικού ινοβλάστες ανεκτική τροποποιήσεις των ιστονών είναι απούσα, και η κατασταλτική H3 λυσίνη 9 σήμα διμεθυλίωση είναι παρούσα (Σχήμα 5). Ομοίως, οι καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές που είχαν χάσει miR-200c /141 έκφρασης χάσει ιστονών Η3 ακετυλίωση και Κ4 trimethylation και απέκτησε μια κατασταλτική κατάσταση των ιστονών, εμπλουτισμένο για το σήμα διμεθυλίωση H3 λυσίνη 9 (Σχήμα 5). Αριθ εμπλουτισμό trimethylation ιστόνης Η3 λυσίνης 27 ανιχνεύθηκε στο miR-200C /141 CpG νησίδα στα δείγματα που αναλύθηκαν (Σχήμα S5). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις του miR-200c /141 έκφρασης, μεθυλίωση του DNA, και τα κράτη τροποποίηση των ιστονών σε μια ποικιλία φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών τύπων αποδεικνύουν τη στενή σχέση μεταξύ της έκφρασης του mir-200c /141 και την επιγενετική κατάσταση των συνδεδεμένες νησί CpG τους.

Ανεκτική σήματα των ιστονών που αντιπροσωπεύεται από την ακετυλίωση της ιστόνης Η3 (H3Ac) και trimethylation της λυσίνης 4 της ιστόνης Η3 (H3TriMeK4), καθώς και η κατασταλτική σήμα της ιστόνης διμεθυλίωση της λυσίνης 9 της ιστόνης Η3 (H3diMeK9 ) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοκαθίζηση χρωματίνης συζευγμένο με πραγματικού χρόνου PCR της περιοχής που περιγράφεται στο Σχήμα 2Α. Τα δείγματα HMEC εμφανίζεται με πράσινο χρώμα, οι ισογονιδιακές δείγματα FB σε κόκκινο χρώμα, καθώς και δύο miR-200-αρνητικό καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές είναι σε μπλε χρώμα. Η y-άξονας δείχνει φορές εμπλουτισμό του κάθε σήματος ιστόνης πάνω DNA είσοδο στο εσωτερικό του νησιού mir-200c CpG.

Η

Τέλος, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν η επιγενετική ρύθμιση της έκφρασης miR-200c σε φυσιολογικά κύτταρα είναι συντηρημένες εξελικτικά, σκεπτικό ότι η μεθυλίωση του DNA που συνδέονται με τον έλεγχο της έκφρασης miR-200c σε όλα τα είδη θηλαστικών θα παράσχει περαιτέρω πειραματική υποστήριξη για την επιγενετική έλεγχο των συγκεκριμένων κυττάρων τύπου έκφραση του miR-200c. Ολόκληρη η γενωμική σύμπλεγμα που περιέχει mir-200c και mir-141 είναι καλά συντηρημένη μεταξύ του ανθρώπου και του ποντικού γονιδιώματος. Παρόμοια με τον /141 γονιδιωματική περιοχή της ανθρώπινης mir-200c, το ποντίκι mir-200c /141 γονιδιωματική περιοχή περιέχει επίσης ένα νησί CpG (Σχήμα 6Α? Μήκους 325 bp, GC% 66.77, O /E αναλογία 0,58, 19 CpGs, p-value 1,06 × 10

-10). Για να αξιολογηθεί ένα πιθανό ρόλο για το DNA μεθυλίωση στον έλεγχο του miR-200c /141 σε ποντικούς, CpG μεθυλίωση και έκφραση miRNA αναλύθηκαν σε επιθηλιακά κύτταρα ποντικού (επιδερμίδα του SKH-1 κυτταρικές γραμμές ποντικού και κερατινοκυττάρων 308 και 6R90) και ινοβλάστες ποντικού ( κυτταρικές σειρές ΝΙΗ 3Τ3, ΝΙΗ 3Τ6, και NR6). Ένα αμπλικόνιο MassARRAY σχεδιάστηκε για να αναλύσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του ομόλογου ποντικού Mir-200C /141 περιοχή με εκείνη που αναλύθηκαν σε άνθρωπο (Σχήμα 6Α). Εντυπωσιακά παρόμοια αποτελέσματα για miR-200c βρέθηκαν ανάμεσα στα ανθρώπινα κύτταρα και κύτταρα ποντικού. Ποντίκι κερατινοκύτταρα εκφράζουν σημαντικά επίπεδα miR-200c, ενώ οι ινοβλάστες ποντικού δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα του miR-200c (Εικόνα 6Β). ανάλυση μεθυλίωσης του DNA με MassARRAY αποκάλυψε ότι τα miR-200c-θετικά κερατινοκυττάρων παρουσίασαν ελάχιστη μεθυλίωσης του DNA στο ΜΙΚ-200C νησί CpG, ενώ τα miR-200c-αρνητικών ινοβλάστες ποντικού έδειξαν εκτεταμένη μεθυλίωση του DNA όλων των CpG θέσεων στην περιοχή (Σχήμα 6Β) . Η σημαντική διατήρηση σε ακολουθία DNA, τα πρότυπα των κυτταρικό τύπο μεθυλίωσης του DNA, και τα πρότυπα έκφρασης των συναφών miR-200c μεταξύ των γονιδιωμάτων ανθρώπου και ποντικού, τα οποία διαχωρίζονται κατά 75 εκατομμύρια χρόνια εξέλιξης [22], παρέχει την απόδειξη ότι επιγενετικών μηχανισμοί παίζουν ένα λειτουργικό ρόλο στον έλεγχο της έκφρασης miR-200c.

α. Διάγραμμα της γονιδιωματικής διάστημα ποντίκι MMU-mir-200c. Η επάνω γραμμή δείχνει την περιοχή που αναλύθηκαν από MassARRAY. Οι περιοχές που κωδικοποιούν τις φουρκέτες της mir-200c και mir-141 και την έναρξη υποθετικές μεταγραφής (TSS) συνάγεται από την EST κομμάτι του ποντικιού εμφανίζεται στο πρόγραμμα περιήγησης στο γονιδίωμα UCSC φαίνεται, και κάθε κύκλος σε αυτό το κομμάτι αντιπροσωπεύει τη θέση του δινουκλεοτιδίου CpG. Παρόμοιο με το ανθρώπινο HSA-mir-200c, το ποντίκι MMU-mir-200c περιέχει ένα νησί CpG, που προσδιορίζονται από το πρόγραμμα CpG Cluster. Ο κυβερνήτης στο κάτω μέρος εμφανίζει την τοποθεσία του ποντικιού χρωμοσώματος 6 σύμφωνα με την γονιδιώματος mm9 συναρμολόγηση. Τα γονίδια που κωδικοποιούνται από την (-) κλώνο. κύτταρα Β Mouse δείχνουν ένα παρόμοιο ειδικό σχέδιο τύπου κυττάρου σε έκφραση miR-200c στα ανθρώπινα κύτταρα και αυτή η έκφραση συνδέεται με την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του νησιού CpG. Το αριστερό πάνελ δείχνει την έκφραση του miR-200c σε επιθηλιακά κύτταρα ποντικού (308, 6R90, SKH-1 επιδερμίδα) και ινοβλαστών ποντικού κυτταρικές γραμμές (ΝΙΗ 3Τ3, NR6, ΝΙΗ 3Τ6) όπως ανιχνεύεται με PCR πραγματικού χρόνου. Ο δεξιός πίνακας δείχνει το επίπεδο μεθυλίωσης του mir-200c CpG νησιωτική περιοχή στα ίδια δείγματα του ποντικιού. Το επίπεδο της μεθυλίωσης των μεμονωμένων μονάδων CpG εντός του amplicon MassARRAY εμφανίζεται ως θερμικός χάρτης με το χαμηλότερο μεθυλίωση σε κίτρινο και το υψηλότερο μεθυλίωση με μπλε χρώμα. Ο άξονας x σηματοδοτεί τις επιμέρους μονάδες CpG. Οι μονάδες CpG μέσα MassARRAY αμπλικόνιο αριθμούνται κατά την αντίστροφη κατεύθυνση, με CpG 1 που βρίσκεται εντός της κωδικοποίησης miR-200c ακολουθία.

Η

Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας παρέχουν πολλαπλές γραμμές ενδείξεις ότι οι επιγενετικές μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ρύθμιση του miR-200c 141 έκφρασης /και σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Πρώτον, υπάρχει μία συνεπής αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και μεθυλίωσης του DNA μελών, υπό κανονικές τύπους ανθρώπου και ποντικού κύτταρο, όπως επίσης και ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και του προστάτη. Δεύτερον, υπάρχουν διαφορετικοί κωδικοί των ιστονών μεταξύ miR-200c /141 εκφράζοντας και μη κύτταρα που εκφράζουν που αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια την έκφραση και μεθυλίωσης του DNA κράτη. Τρίτον, η επιγενετική τροποποιητής 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης ανακουφίζει την καταστολή του miR-200c /miR-141 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τέταρτον, η σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και της έκφρασης μελών συμβαίνει μεταξύ των ειδών θηλαστικών, δεδομένου ότι παρατηρείται σε ανθρώπου και ποντικού. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι το miR-200c /141 είναι μια εξελικτικά συντηρημένη επιγενετικώς ασταθές σύμπλεγμα των miRNAs.

Δυσλειτουργία του miR-200c και miR-141 εμφανίζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου [5], [11], [ ,,,0],20], [21], [23], [24], [25], [26], και αυτό απορρύθμισης συνεπάγεται μια συμβιβαστική λύση της επιγενετικής κατάσταση του νησιού CpG σχετίζεται με miR-200c και miR141. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα κύτταρα καρκινώματος μπορεί να καλέσει

de novo

οδούς μεθυλίωσης του DNA που εμπλέκονται στην επιγενετική έλεγχο της κανονικής τύπου ειδικά γονίδια των κυττάρων, όπως εκείνες που διέπουν την επιγενετική κατάσταση του miR-200c /miR-141 . Μια παρόμοια εμφανή συν-επιλογή του τύπου κυττάρου οδών ειδική μεθυλίωσης του DNA από τα καρκινικά κύτταρα θεωρείται επίσης σε γονίδια που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, όπως

maspin

και

14-3-3 σίγμα

[27] , [28]. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οδών υπεύθυνη για τη σύσταση ή τη διατήρηση του φυσιολογικού τύπου συγκεκριμένες καταστάσεις μεθυλίωσης του DNA των κυττάρων μπορεί να διακοπεί κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης.

Από το miR-200c και miR141 διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην EMT και ως εκ τούτου η ταυτότητα των κυττάρων, διατάραξη των μηχανισμών που διέπουν τον κυτταρικό τύπο μοτίβα μεθυλίωσης συγκεκριμένων DNA κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης θα μπορούσε πιθανόν επηρεάζουν την έκφραση του miR-200c και miR141 και να παρέχουν φαινοτυπική πλαστικότητα στα καρκινικά κύτταρα. Υποστήριξη αυτής της δυνατότητας προέρχεται από τους φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Και οι τέσσερις από τις καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές που έχασε miR-200c και miR-141 έκφρασης έχουν παρεκκλίνοντα μεθυλιωμένα Mir-200C /141 CpG νησίδας, και κάθε ένα από αυτές τις κυτταρικές σειρές εμφανίζει ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά [11], [29]. Αντιθέτως, οι εν λόγω κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού τα οποία εκφράζουν miR-200c και miR-141 και να έχουν ένα μη-μεθυλιωμένο CpG νησίδα εμφανίσει ένα επιθηλιακό φαινότυπο [11], [29]. Μια παρόμοια εικόνα προκύπτει στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Τα PC3 κύτταρα που έχουν χάσει miR-200c και την έκφραση του miR-141, εμφανίζει μια έκτροπα μετουσιωμένο νησί CpG και φαινοτύπου μεσεγχυματικών, ενώ LnCaP και Du145 διατηρούν miR-200c και miR-141 έκφρασης και ένα επιθηλιακό φαινότυπο [11], [30] . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεθυλίωση του DNA μπορεί να ελέγχει τις φαινοτυπικές μεταβολές που παρατηρούνται σε καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

πεπερασμένων διάρκεια ζωής προ-στάση HMEC από δείγματα 184 (παρτίδα D), 48R (παρτίδα Τ), και 240 L (παρτίδα Β), προήλθαν από μείωση mammoplasty ιστό των γυναικών ηλικίας 21, 16 και 19 αντίστοιχα. Τα κύτταρα ξεκίνησαν ως organoids σε πρωτογενή καλλιέργεια σε μέσο Μ85 που περιείχε ορό συμπληρωμένο με ωκυτοκίνη (Bachem) στα 0.1 ηΜ, και διατηρήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με M87A οξυτοκίνη και τοξίνη χολέρας σε 0,5 ng /ml [31]. Οι ινοβλάστες από δείγματα 184, 48, και 240 L ελήφθησαν από την ίδια mammoplasty μείωση ιστού και αναπτύχθηκαν σε DMEM /F12 με 10% FBS και 10 μg /ml ινσουλίνη [31] και περαιτέρω πολλαπλασιάζονται σε ϋΜΕΜ /Ρ12 με 10% FBS. Προστάτη επιθηλιακά κύτταρα ελήφθησαν από την Clonetics (San Diego, CA), και εμβρυϊκού δέρματος κερατινοκύτταρα από την Cell Applications (San Diego, CA) και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες των προμηθευτών. Ινοβλάστες ανθρώπινης ακροποσθίας (ΟΔΠΣ) διατηρήθηκαν και καλλιεργήθηκαν από την Αριζόνα Κέντρο Cancer Cell Culture Shared Υπηρεσία. Ανθρώπινα ινοβλάστες στρωματικών προστάτη (PSF) ήταν καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές γραμμές ΒΤ549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-157, ΜϋΑ-ΜΒ-231, ΜϋΑ-ΜΒ-453, ΜϋΑ-ΜΒ-468, UACC893, UACC1179, UACC2087, και UACC3199 καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] , [34]. Προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC3, PC3 Β1, LNCaP, και DU145 [35], [36], [37] διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου συμπληρωμένο με 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Mouse κερατινοκυττάρων κυτταρικές γραμμές 308 και 6R90 καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται [38], οι κυτταρικές σειρές ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ 3Τ3, ΝΙΗ 3Τ6 και NR6 [39], [40], [41] διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. δείγματα επιδερμίδα SKH-1 ποντικού απομακρύνθηκαν από το υγρό άζωτο θραύση παγώσει ραχιαίο δέρμα με απόξεση σε ξηρό πάγο.

miRNA προετοιμασία της βιβλιοθήκης, αλληλούχιση και ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ. Το μικρό κλάσμα RNA καθαρίστηκε σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου-ουρίας 15%. Ένα preadenylated προσαρμογέας συνδέθηκε στο 3 ‘άκρο του μικρού RNA που ακολουθείται από καθαρισμό του προϊόντος απολίνωσης σε ένα πήκτωμα ΡΑΑ-ουρία 15%. Μια ειδική 5 προσαρμογέας ‘Illumina συνδέθηκε και το προϊόν καθαρίστηκε σε μία γέλη ΡΑΑ-ουρία 10%. Μικρό RNA με προσδεμένο προσαρμογείς μεταγράφηκε αντίστροφα σε DNA με τη χρήση ενός εκκινητή RT με Illumina συγκεκριμένη επέκταση. cDNA μετά ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας Illumina ειδικούς εκκινητές και το προϊόν PCR καθαρίστηκε σε μία γέλη αγαρόζης 3%. Μικρές βιβλιοθήκες RNA υποβλήθηκαν για την αλληλούχιση Illumina να NCGR (Santa Fe, NM). Διαβάζει από Illumina GAII χαρτογραφήθηκαν στο hg18 ανθρώπινο γονιδίωμα συναρμολόγηση χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Novoalign (www.novocraft.com). Έξοδος από Novoalign αναλύθηκε περαιτέρω στον τομέα της Ε (https://www.r-project.org). Οι μετρήσεις των ατομικών miRNAs ομαλοποιήθηκαν για το μέσο μέγεθος της βιβλιοθήκης (3.926.984 μετρήσεις).

απομόνωση νουκλεϊκών οξέων

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ είτε (Invitrogen) ή το κιτ RNeasy Mini (Qiagen) και ποσοτικοποιείται με μετρήσεις απορρόφησης στα 260 nm. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το DNeasy αίματος και ιστού Kit (Qiagen) και ποσοτικοποιείται φασματοφωτομετρικά.

σε πραγματικό χρόνο ανίχνευση PCR του miRNA

σε πραγματικό χρόνο ανίχνευση PCR του microRNAs διεξήχθη κατ ‘αρχήν όπως περιγράφεται [42]. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan Reverse Transcription Αντιδραστήρια (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Real-time PCR διεξήχθη σε έναν ΑΒΙ Prism 7500 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας Perfecta SYBR Green SuperMix, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) με ένα C μετουσίωση 95 ° για 3 λεπτά ακολουθούμενα από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 45 δευτερόλεπτα. Οι διαφορές στην έκφραση προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο που περιγράφεται στο Ct ΑΒΙ εγχειρίδιο χρήσης σε σχέση με την αφήσουμε-7α. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

CpG πρόβλεψη νησί

CpG νησιά είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα CpGcluster [16]. Αυτό το πρόγραμμα χρησιμοποιεί μια στατιστική προσέγγιση για να ψάξετε περιοχές με σημαντικό εμπλουτισμό των δινουκλεοτιδίων CpG παρά τις παραμέτρους μέσα σε ένα συρόμενο παράθυρο. Θέτουμε το κατώτατο όριο σε 50 (μέση απόσταση) και περικοπή τιμή-p σε 10

-8.

ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από MassARRAY

ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από MassARRAY εκτελέστηκε όπως περιγράφεται [ ,,,0],43]. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

θεραπεία

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Sigma, St Louis, ΜΟ , USA) για 96 ώρες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [44].

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση

χρωματίνης immoprecipitation (μάρκας) ανάλυση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [33], [45], [46] με αντισώματα έναντι ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 (# 06-599, Millipore), τριμεθυλιωμένη ιστόνης Η3 Κ4 (# 05-745, Upstate), απομεθυλιώνεται ιστόνης Η3 K9 (CS200587, Millipore), και τριμεθυλιωμένη ιστόνης Η3 Κ27 (# 07-449, Millipore ). Ίσες ποσότητες (1 ng) του chip και εισόδου DNA χρησιμοποιήθηκαν για πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για χρήση με την καθολική Probe Βιβλιοθήκη Set Ανθρώπου (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ, USA). Real-time PCR διεξήχθη σε έναν ΑΒΙ Prism 7500 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιώντας Perfecta qPCR SuperMix, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) με μία μετουσίωση στους 95 ° C για 3 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 45 δευτερόλεπτα. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

πραγματικό χρόνο αξιολόγηση PCR του miR-141 έκφρασης σε κανονικούς τύπους κυττάρων. Το αριστερό πάνελ δείχνει την έκφραση του miR-141 σε τρία ισογονικών ζεύγη των μαστικών επιθηλιακών κυττάρων (HMEC) και του μαστικού ινοβλάστες (FB). Ο δεξιός πίνακας δείχνει την έκφραση του miR-141 σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (PREC), ινοβλάστες στρωματικά προστάτη (PSF), τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του δέρματος (Kcytes) και ινοβλάστες δέρματος (Ε.Π.Ο.). Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε σχέση με το αφήνω-7α, η οποία εκφράζεται σε σταθερά επίπεδα μεταξύ των διαφόρων δειγμάτων, σύμφωνα με τις μικρές δεδομένα αλληλουχίας RNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s001

(0,13 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

μεθυλίωσης του DNA του mir-200c νησί CpG συσχετίζεται αντίστροφα με την έκφραση του miR-200c σε φυσιολογικά ανθρώπινα δείγματα. Αυτό το σχήμα συνοψίζει δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 1Β και 2Β. Το άνω πάνελ δείχνει την έκφραση του miR-200c εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Το κάτω μέρος του πίνακα δείχνει το επίπεδο της μεθυλίωσης του mir-200c CpG νησιωτική περιοχή στα ίδια ανθρώπινα δείγματα. Το επίπεδο της μεθυλίωσης των μεμονωμένων μονάδων CpG εντός του amplicon MassARRAY εμφανίζεται ως θερμικός χάρτης με το χαμηλότερο μεθυλίωση σε κίτρινο και το υψηλότερο μεθυλίωση με μπλε χρώμα. Ο άξονας y σηματοδοτεί τις επιμέρους μονάδες CpG

doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s002

(0,19 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

πραγματικό χρόνο αξιολόγηση PCR της έκφρασης miR-141 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού και του προστάτη. Το αριστερό πάνελ δείχνει την έκφραση του miR-141 σε έντεκα κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του μαστού. Ο δεξιός πίνακας δείχνει την έκφραση του miR-141 σε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη στον άνθρωπο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s003

(0,14 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S4. έκφραση

miR-141 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου επανενεργοποιείται με επεξεργασία 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ 5-ADC για 96 ώρες. Το επίπεδο έκφρασης του miR-141 μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Εμφανίζεται η μέση τιμή 4 μετρήσεων, οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα της μέτρησης. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν να μη κατεργασμένους ελέγχους (100%)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s004

(0,06 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

ιστόνης Η3 Κ27 κατάσταση trimethylation του mir-200c νησί CpG.