Αφηρημένο

Η χρόνια φλεγμονή-προωθείται μετάσταση έχει θεωρηθεί ως ένα σημαντικό πρόκληση στη θεραπεία του καρκίνου. Προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη ΤΝΡα μπορεί να προκαλέσει την εισβολή καρκίνου και μετάσταση συνδέονται με επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν είναι απολύτως σαφής. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι ο TNFa επάγει ΕΜΤ σε ανθρώπινα κύτταρα HCT116 και έτσι να προάγει τον ορθοκολικό καρκίνο (CRC) προσβολή και μετάσταση. ΤΝΡα-επαγόμενη EMT χαρακτηρίστηκε από την απόκτηση μεσεγχυματικά ατρακτοειδόμορφα μορφολογία και την αύξηση της έκφρασης του Ν-καδερίνης και ινονεκτίνη με ταυτόχρονη μείωση του Ε-καδερίνης και Zona occludin-1 (ΖΟ-1). επεξεργασία TNFα αύξησε επίσης την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Snail, αλλά δεν Slug, ZEB1 και Twist. Η υπερέκφραση του σαλιγκαριού προκάλεσε μια μετάβαση από Ε-καδερίνης με την έκφραση Ν-καντερίνης στα κύτταρα HCT116, η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό του EMT. Αντιστρόφως, knockdown του σαλιγκαριού εξασθενημένου σημαντικά ΤΝΡα επαγόμενη EMT σε κύτταρα HCT116, υποδηλώνοντας ότι σαλιγκάρι διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επαγόμενη από τον ΤΝΡα EMT. Είναι ενδιαφέρον, η έκθεση σε TNFα γρήγορα αυξημένη έκφραση Σαλιγκάρι πρωτεΐνης και Σαλιγκάρι πυρηνικού εντοπισμού, αλλά δεν mRNA επίπεδο προς τα πάνω ρύθμιση. Τέλος, αποδείξαμε ότι ο TNFa είναι αυξημένα σταθερότητα Σαλιγκάρι ενεργοποιώντας μονοπάτι ΑΚΤ και ακολούθως καταστολή δραστικότητα της GSK-3β και μειώνοντας τη σύνδεση των σαλιγκάρι με GSK-3β. Νοκ ντάουν της GSK-3β επαληθευτεί περαιτέρω εύρημα μας. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΑΚΤ /GSK-3β-διαμεσολαβούμενη σταθεροποίηση του σαλιγκαριού απαιτείται για ΤΝΡα επαγόμενη EMT σε κύτταρα CRC. Η μελέτη μας παρέχει μια καλύτερη κατανόηση της φλεγμονής που προκαλείται CRC μετάσταση

Παράθεση:. Wang Η, Wang H-S, Zhou Β-Η, Li C-L, Zhang F, Wang Χ-F, et al. (2013) μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) επάγεται από τον TNF-α Απαιτεί ΑΚΤ /GSK-3β-Mediated Σταθεροποίηση σαλιγκάρι στον Καρκίνο του παχέος. PLoS ONE 8 (2): e56664. doi: 10.1371 /journal.pone.0056664

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 14η Ιανουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Προγράμματος, Νο 2011CB935800), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 30873032 και Νο 81071712). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η χρόνια φλεγμονή έχει προσδιοριστεί να συνδέεται στενά με την ογκογένεση [1], [2]. Αύξηση αποδείξεις έχουν αποδείξει ότι η φλεγμονώδης μικροπεριβάλλον του όγκου παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκων [3]. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου σε μεγάλο βαθμό ενορχηστρωμένη από φλεγμονώδη κύτταρα, τα οποία διευκολύνουν την εξωκυτταρική αποικοδόμηση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, αγγειογένεση, και την αναδιαμόρφωση του ιστού, την προώθηση των κυττάρων του όγκου έτσι την κινητικότητα [4]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα οι ίδιοι μπορούν να εκκρίνουν κυτοκίνες προφλεγμονώδεις οποία συμβάλλουν άμεσα στην κακοήθη εξέλιξη [5]. Οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του όγκου και των φλεγμονωδών κυττάρων που προκαλείται από φλεγμονώδεις κυτοκίνες είναι μια σημαντική πτυχή της μικροπεριβάλλον του όγκου [6]. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκου α (TNFa), ένας προφλεγμονώδης κυτοκίνη που παράγεται κυρίως από μακροφάγα, είναι ένα βασικό μόριο που ρυθμίζει τις φλεγμονώδεις διεργασίες σε προαγωγή όγκων. Τοποθέτηση αποδείξεις πρότεινε ότι ο TNFa προκαλεί πολλές κρίσιμες διαδικασίες της εξέλιξης του όγκου, συμπεριλαμβανομένων των ογκογονίδιο ενεργοποίησης, βλάβης του DNA, και μετάσταση όγκου [7].

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), ένα ουσιαστικό μετατροπή φαινοτυπικά κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, ο ιστός αναδιαμόρφωση, και την επούλωση τραυμάτων, παίζει ζωτικό ρόλο στην εισβολή και μετάσταση όγκων [8] – [10]. EMT είναι μια αναστρέψιμη διαδικασία που συμβαίνει συχνά στο μεταναστευτικό μέτωπο πολλών μεταστατικών καρκίνων [11]. EMT μπορεί να προκληθεί από διάφορα σήματα που λαμβάνονται από μικροπεριβάλλον του όγκου, όπως ΤΟΡβ, EGF, Wnts και Notch [12]. Κατά τη διάρκεια των διαδικασιών της ΕΜΤ, επιθηλιακά κύτταρα απώλεια ενδοκυτταρικής προσκόλλησης, αποκτούν τα χαρακτηριστικά που μοιάζουν με ινοβλάστες και να αυξήσει μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητες [13]. Ένα από τα πιο καλά καθορισμένα χαρακτηριστικά της ΕΜΤ είναι η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης [8]. Μια ομάδα παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των σαλιγκαριών, Slug, ZEB1, Twist, έχουν ενοχοποιηθεί στον έλεγχο της ΕΜΤ [14]. Σαλιγκάρι, ένας παράγοντας μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου εντοπίστηκε για πρώτη φορά στη Drosophila, έχει αποδειχθεί ως ένα βασικό ρυθμιστή EMT [15]. Μελέτες έδειξαν ότι Σαλιγκάρι καταστέλλει τη μεταγραφή Ε-καδερίνης με σύνδεση προς την θέση E-box στον προαγωγό του Ε-καδερίνης [16] – [18]. Οι ρόλοι των σαλιγκαριών στη ρύθμιση EMT έχουν αναφερθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου, όπως καρκίνωμα του μαστού, καρκίνωμα των ωοθηκών, κλπ [14], [18], [19]. Αποσιώπηση του σαλιγκαριού με σταθερή παρεμβολή RNA επάγει την πλήρη μεσεγχυματικών σε επιθηλιακό μετάβαση (ΚΟΑ) σε κύτταρα MDCK-σαλιγκάρι, η οποία συνδέεται με την αναστολή της εισβολής [20]. Επιπλέον, η υψηλή έκφραση του σαλιγκαριού συσχετίζεται επίσης με το βαθμό του όγκου, υποτροπής, κομβικό μετάσταση και η κακή έκβαση σε ασθενείς [21] – [25]. Αρκετές φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως ΤΟΡβ, υποξία και IL-6 μπορεί να ρυθμίζουν προς τα πάνω σαλιγκάρι και κατά συνέπεια θα προκαλέσουν EMT [3]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία του μικροπεριβάλλοντος στη ρύθμιση των σαλιγκαριών και στην έναρξη της EMT.

Το καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια μεγάλη παγκόσμια ανησυχία για την υγεία. Οι περισσότεροι θάνατοι από CRC οφείλονται σε μεταστάσεις που είναι ανθεκτικά σε συμβατικές θεραπείες. EMT είναι ένα θέμα εξαιρετικά επίκαιρο να CRC μετάσταση [26]. Ωστόσο, ο ρόλος του TNFα σε ΕΜΤ του CRC είναι σπάνια ερευνηθεί και ο υποκείμενος μοριακός μηχανισμός παραμένει ασαφής. Εδώ δείξαμε ότι ο TNFa που προκαλείται με τη σταθεροποίηση ΕΜΤ Σαλιγκάρι σε HCT116 και τα κύτταρα Caco-2. Δείξαμε επίσης ότι TNFα σταθεροποιεί σαλιγκάρι με την ενεργοποίηση της οδού ΑΚΤ και αναστέλλοντας έτσι GSK-3β δραστηριότητα και μειώνοντας τη σύνδεση της GSK-3β και σαλιγκάρι.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

ΝΡ-κΒ αναστολέα BAY11-7082, PD98059 αναστολέα ΕΚΚ, αναστολέα p38 ΜΑΡΚ SB-203580, αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002, αναστολέα GSK-3β λίθιο (LiCl) και ο αναστολέας πρωτεασώματος MG132 ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St Louis, ΜΟ) . Πρωτογενή αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης, Zona occludin-1 (ΖΟ-1), σαλιγκάρι, ZEB1, ρ-GSK-3β (Ser9), GSK-3β, ρ-Akt (Ser473), Akt, και β-κατενίνη ελήφθησαν από Cell Signaling Technology (MA, USA). Πρωτογενής αντίσωμα έναντι ιστόνης H2A.X ελήφθη από Bioworld (Bioworld Technology, Minneapolis, ΜΝ, USA). Πρωτεΐνη Α /G Sepharose και πρωτεύοντα αντισώματα έναντι Ν-cadherin, ουβικιτίνη, β-ακτίνη, α-τουμπουλίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Πρωτογενές αντίσωμα σε φιμπρονεκτίνη ελήφθη από Boster Βιολογική Μηχανική. Η υπεροξειδάση χράνου (HRP) δευτερογενές αντίσωμα, Alexa Fluor 488/594 συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα, ϋΑΡΙ και Lipofectamine 2000 αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη TNFα αγοράστηκε από την PeproTech. PrimeScript® RT Κιτ αντιδραστηρίων και SYBR® Προμίγματα Ex Taq ™ ήταν προϊόντα της TaKaRa. E.Z.N.A® HP Total RNA Kit αγοράστηκε από την Omega Bio-Tek (Doraville, USA). Smart πισίνα siRNA κατά της ανθρώπινης σαλιγκάρι και GSK-3β ήταν από RIBOBIO.

Πολιτισμός τηλέφωνα

Η HCT116 και Caco-2 κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος ελήφθησαν από το Type Culture Collection της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). κύτταρα HCT116 διατηρήθηκαν σε McCoy’5a μέσο καλλιέργειας (Gibco BRL) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και τα κύτταρα Caco-2 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο καλλιέργειας (Gibco BRL) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό υπό υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C σε θερμοκοιτίδα.

Transwell τη μετανάστευση και την εισβολή Δοκιμασία

μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν σε θαλάμους Boyden. Τα φίλτρα πολυανθρακικού (μέγεθος πόρων 8 μm, Corning) προ-επικαλυμμένες με Matrigel Matrix (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία εισβολής, και μη επικαλυμμένα φίλτρα χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία μετανάστευσης. Κύτταρα (1 χ 10

5) σε 300 μΙ μέσου (που περιέχει 0,1% FBS) με ή χωρίς 20 ng /ml ΤΝΡα σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο. Στη συνέχεια, 600 ml μέσου με 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο και υπηρέτησε ως χημειοτακτικό παράγοντα. Μετά από 24 ώρες επώασης, για τη μετανάστευση, τα κύτταρα μετανάστευσαν και προσκολλάται πάνω στο κατώτερο θάλαμο μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο όρθια (5 πεδία ανά θάλαμο). Για εισβολή, τα κύτταρα στον άνω θάλαμο μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, το Matrigel είχε μηχανικά απομακρύνεται από το φίλτρο με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα προσκολλημένο στο κάτω πλευρά του φίλτρου χρώστηκαν με αιματοξυλίνη και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο όρθια (5 πεδία ανά θάλαμο). Κάθε δοκιμασία μετανάστευσης και εισβολή επαναλήφθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Gene Υπερ-έκφραση και παρεμβολή RNA

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων (2 χ 10

5 κυττάρων /φρεάτιο) και αφέθηκαν σε καλλιέργεια μέχρι την επόμενη ημέρα. Αυτά στη συνέχεια επιμολύνονται με το πλασμίδιο φορέα 2 μg ή 100 pmol siRNA ολιγομερές αναμειγνύεται με αντιδραστήριο λιποφεκταμίνης 2000 σε μειωμένη ορό μέσο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μέσο αλλάχθηκε σε πλήρες μέσο καλλιέργειας 6 ώρες αργότερα, και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε CO

2 επωαστήρα για ακόμη 24 έως 48 ώρες πριν από τη συγκομιδή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Σύνολο mRNA των κυττάρων εκχυλίζεται μετά τη θεραπεία για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Πρώτου κλώνου cDNA σύνθεση παρήχθη από 500 ng ολικού RNA. Ποσοτικοποίηση των στόχων και γονιδίων αναφοράς (GAPDH) διεξήχθη εις τριπλούν σε LightCycler® 480 II (Roche, Applied Science). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση έχουν ως εξής: Ε-καδερίνης εμπρός 5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 ‘και αντίστροφος 5′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′? Ν-cadherin, μπροστά 5’-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3 ‘και αντίστροφη 5′-GGAGCCACTGCCTTCATAGTCAA-3′? Σαλιγκάρι, μπροστά 5’-GACCACTATGCCGCGCTCTT-3 ‘και αντίστροφη 5′-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3′? ZEB1, μπροστά 5’-TACAGAACCCAACTTGAACGTCACA-3 ‘και αντίστροφη 5′-GATTACACCCAGACTGCGTCACA-3′? Twist, μπροστά 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3 ‘και αντίστροφη 5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′? Slug, μπροστά 5’-TTCGGACCCACACATTACCT-3 ‘και αντίστροφη 5′-GCAGTGAGGGCAAGAAAAAG-3′? GAPDH, μπροστά 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘και αντίστροφη 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’. Μετά κανονικοποιήθηκαν σε γονίδιο GAPDH, τα επίπεδα έκφρασης για κάθε γονίδιο στόχο υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (CT). Οι τιμές ΔCt υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον τύπο ΔCt = ct (γονίδιο που μας ενδιαφέρει) -ct (GAPDH) στην ανάλυση συσχέτισης, και το 2-ΔΔct υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο ΔΔct = ΔCt (ομάδα ελέγχου) -Δct (πειραματική ομάδα) για τον προσδιορισμό της σχετικής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Ανάλυση Western Blotting

Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και στη συνέχεια λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ-40, 0.5% Na-δεοξυχολικό, 5 μg /ml απροτινίνης, 5 μg /ml λευπεπτίνη και 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση και μετουσιώνεται με βρασμό σε ρυθμιστικό Laemmli. Ίσες ποσότητες δειγμάτων πρωτεΐνης φορτώθηκαν ανά φρεάτιο και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου, και έπειτα μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες PVDF. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (1:1,000 αραίωση) στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (1:5,000 αραίωση) για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Ειδικά ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Western Blotting Plus Χημειοφωταύγειας (Life Science).

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί αντικειμενοφόρων θαλάμου, χωρίς ορό για 12 ώρες, στη συνέχεια εκτίθενται σε ΤΝΡα για την υποδεικνυόμενη χρόνος. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,3% Triton Χ-100 για 10 λεπτά. Μετά από αποκλεισμό με ορό κατσίκας επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, ινωδονεκτίνη, ΖΟ-1 ή Σαλιγκάρι (1:100 αραίωση) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 ή Alexa Fluor 594-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (1:1,000 αραίωση) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (10 μg /ml) για 10 λεπτά. Τα δείγματα εξετάστηκαν με συνεστιακή λέιζερ σάρωσης μικροσκοπία (Zeiss) για να αναλυθεί έκφραση Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, ινωδονεκτίνη, ΖΟ-1 και πυρηνικής μετατόπισης του σαλιγκαριού.

Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα πλένεται τρεις φορές με παγωμένο PBS και συλλέχθηκαν σε 4 ° C σε ανοσοκαταβύθιση ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 50 mM HEPES, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40, 2 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM NaF, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 1 mM 4- (2-αμινοαιθυλο) βενζολοσουλφονυλο φθορίδιο, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη και 1 μg /ml απροτινίνη. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-Σαλιγκάρι ή αντι-GSK-3β αντίσωμα, και τα ανοσοσύμπλοκα δεσμεύεται στις πρωτεΐνες του A /G Sepharose. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western με αντι-ουβικιτίνης, αντι-σαλιγκάρι ή αντι-GSK-3β αντίσωμα.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD του τρία ανεξάρτητα πειράματα εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με t-test δύο ουρών unpaired Student μεταξύ οποιωνδήποτε δύο ομάδες. Η μονόδρομη ANOVA ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η διαφορά των μέσων μεταξύ των ομάδων. Αυτές οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Ένα P-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

TNFα Προωθεί τη Μετανάστευση και την εισβολή των HCT116 κύτταρα

καρκινικών κυττάρων με έναν επιθετικό φαινότυπο αποκτήσουν μεταναστευτικών και επεμβατική. ικανότητες. Αυτό θα προωθήσει τη διάδοση των όγκων κυττάρων σε απομακρυσμένα όργανα [8]. Οι ικανότητες μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων HCT116 που επηρεάζονται από ΤΝΡα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Transwell προσδιορισμούς μετανάστευσης και εισβολή. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α και C, η θεραπεία TNFα οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, ο αριθμός των μετανάστευσαν και μεταστατικών κυττάρων αυξήθηκε από περίπου 4 φορές (μετανάστευση) και 20 φορές (εισβολή) μετά από κατεργασία με ΤΝΡα (Σχ. 1 Β και D).

(Α) κύτταρα HCT116 ήσαν επιτρέπεται να μεταναστεύσουν Transwell θαλάμους για 24 ώρες με την παρουσία ή απουσία του TNFa (20 ng /ml). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και φωτογραφήθηκαν. Μεγέθυνσης, 100 ×. (Β) Ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Μετά την επεξεργασία με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 48 ώρες, HCT116 κύτταρα που είχε εξαπλωθεί μέσω του matrixgel και μέσα στο υπό-πλευρά του φίλτρου σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν, και φωτογραφήθηκαν. Μεγέθυνσης, 200 ×. (Δ) Ο αριθμός των μεταστατικών κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

TNFα Προκαλεί EMT σε HCT116 κύτταρα

Οι αυξημένες ικανότητες μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων θυμίζουν τα γεγονότα στο EMT, κατά την οποία, η επιθηλιακά ιθύνοντες E-cadhein και ΖΩ-1 είναι κάτω-ρυθμίζονται, ενώ οι δείκτες μεσεγχυματικά Ν-cadherin και ινονεκτίνης είναι up-ρύθμιση [27]. Η ΕΜΤ των κυττάρων HCT116 παρατηρήθηκε μετά από διέγερση με 20 ng /ml ΤΝΡα επί 4 ημέρες. Κύτταρα οδήγησε σε μια σημαντική αλλαγή στη μορφολογία, από τη μορφολογία καλντερίμια με μεσεγχυματικά ατρακτοειδόμορφα και ατρακτοειδή χαρακτηριστικά (Εικ. 2Α). Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι αυτή η μορφολογική αλλαγή συνδέθηκε με τη ρύθμιση προς τα κάτω της επιθηλιακής χαρακτηριστικών Ε-καδερίνης, ΖΟ-1 έκφραση και η προς τα πάνω ρύθμιση των χαρακτηριστικών μεσεγχυματικών ινονεκτίνη και έκφραση Ν-καδερίνης (Εικ. 2Α). Ομοίως, κηλίδωση Western ανάλυση επιβεβαίωσε περαιτέρω την αυξανόμενη έκφραση της φιβρονεκτίνης και Ν-καδερίνης, και τη φθίνουσα έκφραση Ε-καδερίνης και ΖΟ-1 σε επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. 2Β). Επιπλέον, η ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι η θεραπεία TNFα κάτω-ρυθμιζόμενες Ε-καδερίνης και πάνω ρυθμισμένα Ν-καδερίνης σε επίπεδα mRNA (Εικ. 2C). Συλλογικά, οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι τα κύτταρα HCT116 είχε υποβληθεί σε ΕΜΤ αφού αντιμετωπίζονται από TNFa.

(Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 4 ημέρες. Οι κυτταρικές μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με EMT εμφανίζεται στην εικόνα αντίθεσης φάσης. Η έκφραση του Ε-καδερίνης, ΖΟ-1, φιμπρονεκτίνη, Ν-cadherin αναλύθηκαν με χρώση ανοσοφθορισμού. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με χρώση ϋΑΡΙ. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm. (Β) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 4 ημέρες, και η έκφραση Ε-καδερίνης, ΖΟ-1, φιμπρονεκτίνη, Ν-cadherin, σαλιγκάρι, ZEB1, Twist, Slug αναλύθηκαν με western λέκιασμα. β-ακτίνη servers ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 4 ημέρες. Τα επίπεδα mRNA του Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, σαλιγκάρι, ZEB1, Twist, Slug αναλύθηκαν με qRT-PCR. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

σαλιγκάρι είναι ζωτικής σημασίας για TNFα μεσολάβηση EMT

Από μεταγραφικοί παράγοντες σαλιγκάρι, ZEB1, Twist και Slug παίζουν ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση EMT [14] , μπορούμε τότε διερευνήσαμε εάν εκφράσεις τους ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα HCT116 μετά από αγωγή με TNFa. Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, TNFa αύξησε σημαντικά το επίπεδο της πρωτεΐνης σαλιγκάρι, αλλά όχι επίπεδο mRNA (Σχ. 2Β και C). Ωστόσο, η θεραπεία TNFα μεταβληθεί ούτε mRNA ούτε επίπεδα πρωτεΐνης του ZEB1, Twist, Slug (Σχ. 2Β και C).

υπερεκφράζεται Σαλιγκάρι να διερευνήσει περαιτέρω τους ρόλους του στην επαγόμενη από τον ΤΝΡα ΕΜΤ των κυττάρων HCT116. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-σαλιγκάρι και φορέα αναφοράς pcDNA-3,1, αντίστοιχα. Έκφραση των σαλιγκαριών και EMT δείκτες εντοπίστηκαν με ανοσοφθορισμό και κηλίδωση western. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η αυξημένη έκφραση που προκαλείται Σαλιγκάρι ΕΜΤ-όπως μορφολογικές αλλαγές και προκάλεσε ένα διακόπτη από Ε-καδερίνης με την έκφραση Ν-καντερίνης στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 3Α και Β). Τα ευρήματα έδειξαν ότι έκτοπη έκφραση σαλιγκάρι μπορεί να προκαλέσει EMT στα κύτταρα HCT116. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, εκτιμήσαμε ότι Σαλιγκάρι πάνω ρύθμιση μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για TNFα-επαγόμενη EMT στα κύτταρα HCT116.

(Α) ροϋΝΑ-σαλιγκάρι (Σαλιγκάρι) ή φορέα ελέγχου pcDNA-3.1 (Vector) εκφράστηκαν σε κύτταρα HCT116 για 48 ώρες. Οι κυτταρικές μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με EMT εμφανίζεται στην εικόνα αντίθεσης φάσης. Η έκφραση του Ε-καδερίνης και Ν-καντερίνης αναλύθηκαν με χρώση ανοσοφθορισμού. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με χρώση ϋΑΡΙ. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm. (Β) Η έκφραση της Ε-καδερίνης, Ν-cadherin και Σαλιγκάρι από κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με ροϋΝΑ-Σαλιγκάρι ή φορέα ελέγχου εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. β-ακτίνη servers ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με Σαλιγκάρι ειδικές si-RNA (SI-σαλιγκάρι) ή αρνητικό μάρτυρα si-RNA (SI-NC) διεγέρθηκαν με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 48 ώρες, και οι μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. κύτταρα (D) HCT116 επιμολυσμένα με SI-Σαλιγκάρι ή SI-NC διεγέρθηκαν με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 4 ημέρες, και η έκφραση Ε-καδερίνης και Σαλιγκάρι ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. β-ακτίνη servers ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Εμείς περαιτέρω εκτελούνται νοκ ντάουν αναλύσεις για να βεβαιωθείτε ότι σαλιγκάρι αποτελεί βασικό ρυθμιστή σε TNFα-επαγόμενη EMT. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με μη στόχευση ελέγχου si-RNA ή si-Σαλιγκάρι για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΝΡα για διαφορετικό χρόνο. Μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Οι εκφράσεις του σαλιγκαριού και Ε-καδερίνης ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, οι ατρακτοειδόμορφα μορφολογικές αλλαγές δεν παρατηρήθηκαν κατά την προσθήκη ΤΝΡα σε σι-Σαλιγκάρι επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3C). Αποσιώπηση του σαλιγκαριού εξασθενημένου επίσης ΤΝΡα επαγόμενη μειορύθμιση της Ε-καδερίνης, η οποία δεν παρατηρήθηκε σε έλεγχο si-RNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3D). Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι σαλιγκάρι είναι απαραίτητη για TNFα-επαγόμενη EMT στα κύτταρα HCT116.

TNFα Ρυθμίζει Σταθεροποίησης και υποκυτταρικός εντοπισμός της Σαλιγκάρι

Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι ο TNFα αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης σαλιγκάρι, αλλά δεν επίπεδο mRNA (Σχ. 2Β και C). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι πάνω ρύθμιση του σαλιγκαριού με ΤΝΡα που συμβαίνουν στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Για να επαληθευθούν περαιτέρω αυτή την άποψη, HCT116 και τα κύτταρα Caco-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡα για 0-8 h, και σαλιγκάρι πρωτεΐνης και mRNA ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western και qRT-PCR, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης του σαλιγκαριού ενισχύθηκε μετά από 1 ώρα από ΤΝΡα διέγερση και αυξημένο χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4Α). Ωστόσο, το επίπεδο του mRNA του σαλιγκαριού δεν είχαν σημαντική αλλαγή μετά από θεραπεία ΤΝΡα (Σχ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η προς τα πάνω ρύθμιση του σαλιγκαριού με ΤΝΡα μπορεί να οφείλεται σε σταθεροποίηση πρωτεΐνης.

(Α-Β) HCT116 και Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNFa (20 ng /ml) για τους χρόνους που αναφέρονται, και η πρωτεΐνη (Α) και του mRNA (Β) τα επίπεδα του σαλιγκαριού εξετάστηκαν με κηλίδωση Western και qRT-PCR αντίστοιχα? (Γ) Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 6 ώρες. Μετά τη σταθεροποίηση, η κυτταρική τοποθεσία του Σαλιγκάρι (πράσινο) εξετάστηκε με χρώση ανοσοφθορισμού και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Ράβδοι κλίμακας: 20 μm

Η

Από παράγοντες μεταγραφής μπορεί να τεθεί σε ισχύ μόνο όταν μεταφέρουν στον πυρήνα [28], θα καθορίζεται επίσης τη δραστηριότητα πυρηνική μετατόπιση των σαλιγκαριών με ανοσοφθορισμό.. Η πυρηνική εντόπιση του σαλιγκαριού αξιολογήθηκε σε κύτταρα HCT116 διεγερμένα με ή χωρίς ΤΝΡα για 8 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, TNFα αύξησε σημαντικά την πυρηνική μετατόπιση του σαλιγκαριού.

TNFα Παρεμβαίνει σαλιγκάρι Σταθεροποίηση μέσω ενεργοποίησης της ΑΚΤ και αναστολή της GSK-3β

Για την διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν TNFα μεσολάβηση σαλιγκάρι σταθεροποίηση, χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς του ΝΡ-κΒ (BAY11-7082), ΡΙ3Κ /ΑΚΤ (LY294002), ΜΑΡΚ (PD98059), ρ38 (SB-203580), αφού TNFα μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση αυτών των οδών. HCT116 και Caco-2 κύτταρα προκατεργάστηκαν με αναστολείς για 1 ώρα πριν TNFα διέγερση, και στη συνέχεια, η έκφραση του σαλιγκαριού προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Βρήκαμε ότι ο αναστολέας ΡΙ3Κ /ΑΚΤ (LY294002), αλλά όχι τα άλλα, εντελώς αποκλεισμένη ΤΝΡα σταθεροποιημένη Σαλιγκάρι (Εικ. 5Α), υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K /AKT είναι υπεύθυνη για ΤΝΡα με τη μεσολάβηση Σαλιγκάρι σταθεροποίησης.

μονοπάτι. (Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με SB-203580 (20 μΜ), ΡΟ98059 (20 μΜ), BAY11-7082 (10 μΜ), LY294002 (20 μΜ) για 1 h αντίστοιχα ακολουθείται από διέγερση με TNFa (20 ng /ml) για 6 ώρες. Η έκφραση των σαλιγκάρι εξετάστηκε από κηλίδωση western. κύτταρα Caco-2 προκατεργάστηκαν με SB-203580 (20 μΜ), BAY11-7082 (10 μΜ), LY294002 (20 μΜ) για 1 h αντίστοιχα ακολουθείται από διέγερση με TNFa (20 ng /ml) για 6 ώρες. Η έκφραση των σαλιγκάρι εξετάστηκε από κηλίδωση western. (Β) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς LY294002 (20 μΜ) για 1 ώρα, που ακολουθείται από διέγερση με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 6 ώρες. Η έκφραση του σαλιγκάρι και η ενεργοποίηση των ΑΚΤ και GSK-3β εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. (Γ) HCT116 και τα κύτταρα Caco-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με TNFa (20 ng /ml) για τους χρόνους που υποδεικνύονται. Η έκφραση του pGSK-3β και GSK-3β εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. (D) Έλεγχος και GSK-3β si-RNA εκφράστηκαν σε κύτταρα HCT116 επί 42 ώρες και ακολουθεί αγωγή με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για επιπλέον 6 ώρες. Η έκφραση των σαλιγκαριών και GSK-3β εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. (Ε) Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με TNFa (20 ng /ml) ή LiCI (40 mM) για 6 ώρες. Η έκφραση του σαλιγκαριού, pGSK-3β, GSK-3β, και β-κατενίνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Στ) μετά κατεργασία HCT116 κυττάρων με ή χωρίς TNFa (20 ng /ml) για 6 ώρες, σαλιγκάρι και β-κατενίνης που βρίσκεται στην μεμβράνη και την πυρηνική απομονώθηκαν αντίστοιχα και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

Snail είναι ένα ρυθμίζεται κυρίως από GSK-3β, μια κινάση που βρίσκεται κατάντη της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [24], [29], [30]. Η GSK-3β διατηρεί μια ενεργή κατάσταση στην αποφωσφορυλιωμένη μορφή. Για να προσδιοριστεί αν η σταθεροποίηση του σαλιγκαριού με ΤΝΡα διαμεσολαβείται από ρύθμιση της δραστικότητας της GSK-3β, εμείς κατεργασμένα κύτταρα HCT116 με LY294002 πριν TNFα θεραπεία, και στη συνέχεια, η έκφραση του ρ-ΑΚΤ, ρ-GSK-3β, και σαλιγκάρι προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα του p-ΑΚΤ, ρ-GSK-3β, και σαλιγκάρι αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία ΤΝΡα σε 6 ώρες, ενώ οι επιδράσεις αυτές αναστρέφονταν μετά την αγωγή με LY294002 μόνο ή σε συνδυασμό με ΤΝΡα (Σχ. 5Β). Εμείς επόμενη μετρήσει τις χρονικές πορείες για GSK-3β φωσφορυλίωση και διαπίστωσε ότι η έκφραση του ρ-GSK-3β αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από ΤΝΡα διέγερση σε HCT116 και τα κύτταρα Caco-2 (Σχ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σταθεροποίηση των σαλιγκάρι με ΤΝΡα οφείλεται στην αναστολή της δραστηριότητας GSK-3β. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα ευρήματά μας, έχουμε γκρέμισε την έκφραση της GSK-3β στα κύτταρα HCT116 χρησιμοποιώντας ειδικά GSK-3β si-RNA (Εικ. 5D). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, ρύθμιση προς τα κάτω της GSK-3β σημαντικά αυξημένα τα επίπεδα της έκφρασης Σαλιγκάρι (Σχ. 5D). Ωστόσο, TNFa μεσολαβούμενη Σαλιγκάρι σταθεροποίηση δεν ανυψώθηκε περαιτέρω μετά knockdown της GSK-3β (Σχ. 5D). Παρομοίως, όταν κατεργάζεται HCT116 κυττάρων με LiCl, έναν ισχυρό αναστολέα της GSK-3β, σύμφωνα με την θεραπεία TNFa, τις εκφράσεις του σαλιγκαριού, ρ-GSK-3β, και β-κατενίνη (μια πρωτεΐνη ρυθμίζεται από GSK-3β) αυξήθηκαν ( Σχ. 5Ε). Ωστόσο, η προς τα πάνω ρύθμιση της β-κατενίνης δεν ήταν τόσο προφανής όσο σαλιγκάρι. Θα μπορούσε να οφείλεται σε ενδοκυτταρικό εντοπίσεις μεταξύ β-κατενίνης και σαλιγκάρι είναι διαφορετικά. Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση, απομονώσαμε σαλιγκάρι και β-κατενίνης από μεμβράνη και την πυρηνική κυττάρων HCT116 σε επεξεργασία με ή χωρίς TNFa. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι διαφορετικά να σαλιγκάρι, β-κατενίνης υπάρχει στην πλασματική μεμβράνη, και TNFa αυξάνει την πυρηνική μετατόπιση του σαλιγκαριού και β-κατενίνης, αλλά δεν επηρεάζει μεμβράνη β-κατενίνης (Εικ. 5F). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο TNFa πάνω ρυθμισμένα σαλιγκάρι σε κύτταρα HCT116 με την ενεργοποίηση σηματοδότησης ΑΚΤ που οδηγούν στην φωσφορυλίωση της GSK-3β και στη συνέχεια σταθεροποίηση των σαλιγκαριών.

TNFα Καταστέλλει Ubiquitylation του σαλιγκαριού με αναστολή της σύνδεσης του σαλιγκαριού και GSK-3β

Επειδή η σταθερότητα της πρωτεΐνης του σαλιγκαριού ρυθμίζεται μέσω διεργασιών υποβάθμισης του πρωτεασώματος ουβικιτίνης μεσολάβηση, έχουμε σκεφτεί αν η σταθεροποίηση των σαλιγκαριών από TNFα διαμεσολαβείται από την καταστολή των σαλιγκαριών ubiquitylation. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡα ή τον αναστολέα πρωτεασώματος MG132 για 6 ώρες, και στη συνέχεια Σαλιγκάρι ανοσοκατακρημνίστηκε από ίση ποσότητα των προϊόντων λύσης. Η κατάσταση ουβικιτινίωση σαλιγκάρι ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντι-ubiquitin αντισωμάτων. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε σύγκριση με MG132, TNFa κατέστειλε δραματικά την ubiquitylation του σαλιγκαριού, παρόλο που η συνολική σταθεροποιημένη πρωτεΐνες Σαλιγκάρι ήταν παράλληλες (Σχ. 6Α). Δεδομένου ότι η GSK-3β είναι η κύρια κινάση που φωσφορυλιώνει σαλιγκάρι και στη συνέχεια επάγει την πρωτεΐνη υποβάθμιση της Σαλιγκάρι [24], έχουμε την επόμενη εξέτασαν τη σχέση των σαλιγκαριών και GSK-3β. κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡα ή MG132 για 6 ώρες, και στη συνέχεια Σαλιγκάρι ανοσοκατακρημνίστηκε από ίση ποσότητα των προϊόντων της λύσης, και η σχετική GSK-3β μετρήθηκε με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, η ένωση των σαλιγκάρι με GSK-3β είχε μειωθεί σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TNFα, σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με MG-132. Ομοίως, όταν η GSK-3β ανοσοκαταβυθίστηκε από κύτταρα HCT116, των συνδεδεμένων σαλιγκάρι ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα κατεργασμένα με ΤΝΡα, σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με MG-132 (Εικ. 6Β). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά έδειξαν ότι ο TNFa ανέστειλε την σύνδεση των σαλιγκάρι με GSK-3β και στη συνέχεια καταστέλλεται ubiquitylation του σαλιγκαριού.

(Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με TNFa (20 ng /ml) ή MG132 (10 μΜ ) για 6 ώρες. Μετά Σαλιγκάρι ανοσοκατακρημνίστηκε από ίση ποσότητα των προϊόντων λύσης (δύο κάτω πλαίσια), η ουβικιτινίωση σαλιγκάρι εξετάστηκε με κηλίδωση Western. (Β) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με TNFa (20 ng /ml) ή MG132 (10 μΜ) για 6 ώρες. Σαλιγκάρι ή GSK-3β ανοσοκαταβυθίστηκαν αντίστοιχα από ίση ποσότητα λύματα και των συνδεδεμένων GSK-3β ή σαλιγκάρι ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

Συζήτηση

Μια σημαντική πρόκληση κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου είναι μετάσταση που προκαλείται από χρόνια φλεγμονή. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν απεικονίζεται πλήρως. Αρκετές φλεγμονώδεις μεσολαβητές, όπως ΤΟΡβ και IL-6, έχει αποδειχθεί ότι συνεισφέρουν στην εισβολή και τη μετάσταση των καρκίνων [3]. TNFα είναι μια σημαντική προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη η οποία έχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής, απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση [31]. Αν και ο TNFa έχει θεωρηθεί ως αντικαρκινικός παράγοντας, επί του παρόντος αναγνωρίζεται ότι χρονίως αυξημένα TNFα σε ιστούς μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή και μετάσταση [32]. Υπάρχουν κάποιες αναφορές ότι η έκφραση του ΤΝΡα είναι αυξημένη στον ορό των ασθενών CRC [33]. έκφραση ΤΝΡα σχετίζεται επίσης με την εξέλιξη του όγκου του παχέος αδενοκαρκινώματα [34]. Επιπλέον, η έκφραση High TNFα συνδέεται στενά με υποτροπή του όγκου σε ασθενείς με CRC θετική μεταστάσεων λεμφαδένα [34]. ΤΝΡα μπορεί να είναι χρήσιμο ως κατασκευαστής για την πρώιμη διάγνωση του CRC. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε ένα σημαντικό άξονα σηματοδότησης που ελέγχει φλεγμονωδών κυτοκινών και επάγει EMT. Παρά τον σημαντικό ρόλο του ΝΡ-κΒ σε φλεγμονώδεις διαδικασίες, αποδείξαμε ότι η ΑΚΤ /GSK-3β-διαμεσολαβούμενη σταθεροποίηση του σαλιγκαριού απαιτείται για ΤΝΡα επαγόμενη EMT σε κύτταρα CRC. Με βάση τα ευρήματά μας, προτείναμε ένα μοντέλο στο οποίο TNFα up-ρυθμίζει σαλιγκάρι μέσω ενεργοποίησης της σηματοδότησης ΑΚΤ και ως εκ τούτου αναστέλλει τη δραστικότητα της GSK-3β. TNFα αναστέλλει επίσης τη σύνδεση των σαλιγκαριών και GSK-3β. Και τότε TNFα σταθεροποιηθεί μεταφορά Σαλιγκάρι στον πυρήνα, μειώνει ιθύνοντες επιθηλιακά E-cadherin και ΖΩ-1 εκφράσεις, αυξάνει ιθύνοντες μεσεγχυματικά Ν-cadherin και φιμπρονεκτίνη εκφράσεις, τελικά προκαλεί EMT και προωθεί τη μετάσταση των όγκων.

EMT έχει θεωρηθεί ως το πρώτο βήμα της εισβολής όγκου και μετάσταση. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα προφίλ έκφρασης του EMT συσχετίζεται με τους βαθμούς του όγκου και τη μετάσταση του καρκίνου του μαστού [35], [36].