Αφηρημένο

Βερβερίνη (BBR), ένα αλκαλοειδές παράγωγο ισοκινολίνης απομονωθεί από κινέζικα βότανα, έχει μια μακρά ιστορία της χρήσης για την αντιμετώπιση των πολλαπλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί δράσης του BBR σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους BBR αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC). Η θεραπεία με BBR προωθείται αλλαγή κυτταρικής μορφολογίας, ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου, πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών, και την επαγωγή απόπτωσης. Περαιτέρω μελέτη μοριακός μηχανισμός έδειξε ότι BBR στοχευμένη ταυτόχρονα πολλαπλές κυτταρικές οδούς σηματοδότησης για να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC. Η θεραπεία με BBR ανέστειλε AP-2α και η έκφραση του ΑΡ-2β και κατήργησε σύνδεσης αυτών επί υποκινητές hTERT, αναστέλλοντας έτσι έκφραση hTERT. Knockdown του ΑΡ-2α και 2β-AP με siRNA αυξηθεί σημαντικά το BBR μεσολάβηση της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης. BBR κατέστειλε επίσης την πυρηνική μετατόπιση του ρ50 /ρ65 πρωτεΐνες ΝΡ-κΒ και την σύνδεσή τους με την COX-2 προαγωγό, προκαλώντας την αναστολή της COX-2. BBR μειωτικά επίσης HIF-1α και VEGF έκφραση και ανέστειλε Akt και ERK φωσφορυλίωση. Knockdown του HIF-1α με siRNA αυξηθεί σημαντικά το BBR μεσολάβηση της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης. Επιπλέον, η θεραπεία BBR πυροδότησε την απελευθέρωση κυτοχρώματος-c από μιτοχονδριακή διάστημα μεταξύ της μεμβράνης σε κυτοσόλιο, προωθείται διάσπαση της κασπάσης και PARP, και επηρέαζε την έκφραση του ΒΑΧ και Bcl-2, ενεργοποιώντας έτσι αποπτωτική παθολογική οδό. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι BBR ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC με ταυτόχρονη στόχευση AP-2 /hTERT, ΝΡ-κΒ /COX-2, ο HIF-1α /VEGF, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, Raf /MEK /ERK και κυτόχρωμα-c /κασπάσης μονοπάτια σηματοδότησης. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες γνώσεις για την κατανόηση των αντικαρκινικών μηχανισμούς της BBR στη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Fu L, Chen W, Guo W, Wang J, Tian Υ, Shi D, et al. (2013) Βερβερίνη Στόχοι AP-2 /hTERT, ΝΡ-κΒ /COX-2, ο HIF-1α /VEGF και Cytochrome-C /Caspase Σηματοδότησης να καταστείλει Human Cancer κυτταρική ανάπτυξη. PLoS ONE 8 (7): e69240. doi: 10.1371 /journal.pone.0069240

Επιμέλεια: Gutian Xiao, του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ Ινστιτούτου για τον Καρκίνο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 του Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 6 του Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιουλίου 2013

Copyright: © 2013 Fu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα κονδύλια από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81071687, 81272195), το κράτος «863 Πρόγραμμα» της Κίνας (SS2012AA020403), το Ίδρυμα διδακτορικά προγράμματα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20110171110077), και το Χημείο του κράτους Κλειδί Ογκολογίας στη Νότια Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς κήρυξε την υπαγωγή (s) για να «Guangzhou Δίκλινο Bioproduct Inc» στην ανταγωνιστικές τμήμα Συμφέροντα της online φόρμα χειρόγραφο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα κατέχει την πρώτη θέση ανάμεσα σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων στον κόσμο [1]. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου μη μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC), μια σημαντική μορφή καρκίνου του πνεύμονα, έχει αυξηθεί με σημαντική θνησιμότητα και νοσηρότητα. Η θεραπεία, όπως χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία είναι οι κύριες στρατηγικές θεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα [2]. Τα τελευταία χρόνια, οι θεραπείες στοχεύουν επιλεκτικά κυτταρικής σηματοδότησης οδών, όπως EGFR, VEGF, KRAS, BRAF, ALK, HER2, ΜΕΤ, TITF-1, ρ53, LKB1 και πολλοί άλλοι, με την προϋπόθεση όχι μόνο μια καλύτερη κατανόηση των NSCLC καρκινογένεσης, αλλά επίσης χρησιμοποιούνται ως προγνωστικοί παράγοντες ή στόχους για την εξατομίκευση της θεραπείας [3]. Ωστόσο, η επιβίωση παραμένει φτωχή. Η πρόοδος στον πνεύμονα βιολογίας και της γενετικής του καρκίνου οδήγησε στην ανάπτυξη των φυτοχημικών μικρού-μορίου, ειδικά τα φυτοχημικά που εξάγεται από κινέζικα βότανα που έχουν επιπτώσεις επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, την αγγειογένεση και την απόπτωση [4]. Έτσι, η βελτιστοποίηση της χρήσης των συμβατικών και νέων θεραπευτικών φυτοχημικά μπορεί να βελτιώσει το αποτέλεσμα της θεραπείας για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Κινέζικα βότανα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως και επιτυχώς για αιώνες για τη θεραπεία διαφόρων ειδών ασθενειών [5]. Φυτοχημικά από κινέζικα βότανα έχουν δείξει υπόσχεση για την πρόληψη του καρκίνου με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα [6]. Βερβερίνη (BBR) είναι ένα παράγωγο αλκαλοειδούς ισοκινολίνης απομονώνεται από το ρίζωμα, τις ρίζες και το στέλεχος φλοιό ενός αριθμού των κινεζικών βοτάνων, τα

Berberis

είδη, όπως

Hydrastis

canadensis

(goldenseal),

Cortex phellodendri

(Huangbai) και

Rhizoma coptidis

(Huanglian) [7]. Βερβερίνη έχει μια μακρά ιστορία που χρησιμοποιείται ως θεραπευτικό μέσο για τη θεραπεία μιας ποικιλίας ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Έχει αναφερθεί ότι BBR εκθέτοντας πολλαπλές φαρμακολογικές δράσεις, συμπεριλαμβανομένης της αντι-φλεγμονώδη [8], αντι-υπερτασικά [9], τη μείωση της χοληστερόλης [10], αντι-διαρροϊκά [11,12], αντι-μικροβιακή [13,14 ] δραστηριότητες, και η αντικαρκινική δράση του BBR ήταν όλο και περισσότερο τονίζεται στις τελευταίες δεκαετίες [15,16]. BBR έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν επιδράσεις αντι-πολλαπλασιασμού έναντι καρκινικών κυττάρων διαφορετικών προελεύσεων, που περιλαμβάνει το γλοιοβλάστωμα [17], το μελάνωμα [18], καρκίνος του παχέος εντέρου [19], του καρκίνου του μαστού [20,21], του καρκίνου του προστάτη [22] και ούτω καθεξής . Σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα, έχει δειχθεί ότι BBR ενίσχυσε την CYTO-τοξικότητα της ακτινοβολίας σε αμφότερες

in vivo

και

in vitro

μοντέλα μέσω της επαγωγής autophagy [23], και BBR παρουσίασαν μια προστατευτική επίδραση επί προκαλούμενη από ακτινοβολία βλάβη πνεύμονα μέσω της ενδοκυτταρικής προσκόλλησης μοριακού-1 και μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα-βήτα-1 [24]. BBR επίσης ανέστειλε αποτελεσματικά την κινητικότητα και την εισβολή ικανότητα του καρκίνου του πνεύμονα Α549 κυτταρική σειρά σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο κάτω από μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις μειωμένου παραγωγές ουροκινάσης-ενεργοποιητή πλασμινογόνου και μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 [25]. Επιπλέον, BBR αναφέρθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη και να επάγει απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, και η χορήγηση του BBR από του στόματος καθετηριασμό ανέστειλε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς [26]. Αν και τα στοιχεία της αντικαρκινικής επιδράσεις του BBR επεκτείνεται, η αβεβαιότητα των μηχανισμών BBR σε NSCLC παραμένει.

ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT) έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα σημαντικό συστατικό της ανθρώπινης τελομεράσης, το οποίο συνθέτει τελομερές DNA, μακραίνει άκρα των χρωμοσωμάτων και διατηρεί χρωμοσωμική σταθερότητα, τελικά οδηγεί σε κυτταρικό αθανατοποίηση [27]. hTERT δεν εκφράζεται στα περισσότερα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα, αλλά είναι συνήθως υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [28]. Η αυξημένη έκφραση του hTERT είναι απαραίτητη για να μετασχηματίσει κανονικά ανθρώπινα κύτταρα σε καρκινικά κύτταρα. Μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου hTERT είναι ο κύριος μηχανισμός για τον καρκίνο-ειδική ενεργοποίηση των τελομεράσης, και μια σειρά από παράγοντες έχουν ταυτοποιηθεί σε άμεσα ή έμμεσα ρυθμίζουν τον προαγωγό hTERT [29]. Η ενεργοποίηση ενισχυτή-δέσμευσης πρωτεΐνης-2 (ΑΡ-2), έχει δειχθεί ότι μεταγραφικά ελέγχουν την έκφραση των hTERT. Η οικογένεια του μεταγραφικού παράγοντα AP-2 περιέχει μια σειρά από αναπτυξιακά ρυθμίζονται, το ρετινοϊκό οξύ επαγώγιμων γονιδίων που αποτελείται από τέσσερις παράγοντες που συνδέονται-AP2α, AP2β, AP2γ και AP2δ [30]. Με τη δέσμευση με τον υποκινητή hTERT, ΑΡ-2 παράγοντες ασκούν τις βιολογικές τους επιδράσεις μέσω ενεργοποίησης ενός αριθμού γονιδίων των όγκων που σχετίζονται και οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του hTERT, ΡΙ3Κ /Akt, και Raf /MEK /ERK [31].

Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) έχει αναγνωριστεί ως ένας από τους κύριους εκκινητές για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του συστήματος αγγειοποίησης [32]. Pigment επιθήλιο προερχόμενο παράγοντα (PEDF), ένας ισχυρός αναστολέας της αγγειογένεσης, καθώς και ένα παράγοντα νευρο-προστατευτικά, εξισορροπεί την επίδραση της VEGF [33]. VEGF και PEDF αμφότερα έχουν πολλαπλές βιολογικές δραστηριότητες και τις λειτουργίες και έχουν μια αντίστροφη σχέση με το άλλο ειδικά στον καρκίνο [34]. Η έκφραση του VEGF και PEDF ρυθμίζεται από ένα σώμα εξωτερικών παραγόντων, εκ των οποίων η υποξία είναι η καλύτερα χαρακτηρισμένη μεσολαβητής. Υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση. Η δραστικότητα του HIF-1α ρυθμίζεται αυξητικά από μια ποικιλία μη-υποξικής σήματα, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης από διάφορους ογκογόνους οδούς όπως Src, HER-2, Ha-Ras, και που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) σηματοδοτώντας [35]. Με τη δέσμευση προς την υποξία στοιχεία απόκρισης σε VEGF υποκινητή, HIF-1 οδηγεί στην μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου VEGF [36].

COX-2 είναι ένα επαγώγιμο ένζυμο που μετατρέπει το αραχιδονικό οξύ σε προσταγλανδίνες, και συνήθως υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων [37]. Η αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης COX-2 και την παραγωγή PGE2 sequencial έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει σημαντικά την καρκινογένεση και φλεγμονώδεις αντιδράσεις με προς τα πάνω ρύθμιση EGFR, ΡΙ3Κ, και ERK1 /2 σηματοδότηση [38]. Η έκφραση COX-2 μεταγραφικά ελέγχεται από την πρόσδεση του πολλαπλών διαενεργοποιητών και συνενεργοποιητές με τις αντίστοιχες θέσεις που βρίσκονται σε προαγωγό της. Μεταξύ των γνωστών διάφορα ρυθμιστικά στοιχεία διανέμουν στην περιοχή προαγωγού πυρήνα της COX-2 θέση έναρξης της μεταγραφής, θέση δέσμευσης ΝΡ-κΒ είναι ουσιώδης για τη δράση προαγωγού COX-2 [39,40].

Ο ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και Raf /MEK /ERK είναι δύο κλασσικά κυτταρικής σηματοδότησης οδών και παίζει ένα ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων, την επιβίωση της ανάπτυξης. Ανώμαλη ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και Raf /MEK σηματοδότηση /ERK μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλασιασμό αυξημένη ή ανεξέλεγκτη κυτταρική, αντίσταση στην απόπτωση και στη χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, και στόχευση θεραπείες σε όγκους. Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης HIF-1 θα μπορούσε να διευκολυνθεί με την PI3K /AKT και Raf /MEK σηματοδότησης /ERK. Καθώς τα ανάντη μόρια σηματοδότησης πρωτεΐνης HIF-1, ERK μπορεί επίσης να διαδραματίσει το ρόλο της στη διαμεσολάβηση της επίδρασης του BBR επί της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων [41].

Η επαγωγή απόπτωσης θεωρείται ως ένα από τα πιθανά μηχανισμοί αναστολής της ανάπτυξης του καρκίνου. Η ενεργοποίηση της κασπάσης παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην εκτέλεση της απόπτωσης. Τα ενεργοποιημένα κασπάσες διασπούν μια ποικιλία πρωτεϊνών στόχων, με τον τρόπο αυτό την απενεργοποίηση σημαντικών κυτταρικών διεργασιών και διασπά δομικά συστατικά του κυττάρου. Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος-c από το μιτοχονδριακό διάστημα μεταξύ μεμβράνης στο κυτοσόλιο είναι η προϋπόθεση της κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι απόπτωσης. Το κυτόχρωμα c δεσμεύεται με Apaf-1 σε απουσία dATP, και το σύμπλοκο δεσμεύει προ-κασπάση-9 για να σχηματίσει αποπτωσώματος, η οποία διασπά το προ-κασπάσης να κασπάσης 9, και με τη σειρά ενεργοποιεί το τελεστή κασπάσης-3 [42].

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις λεπτομέρειες υποκείμενων μηχανισμών της BBR στην αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης NSCLC στον NSCLC

in vitro

. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με τη διερεύνηση των πιθανών θεραπευτικών στρατηγικών και νέων στόχων για ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

BBR αλλάξει τη μορφολογία των κυττάρων και αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων

Πρέπει πρώτα αναλύεται η επίδραση της BBR στη μορφολογία των κυττάρων στα Α549 και κύτταρα Η1299. Η θεραπεία με BBR στα 100 μΜ BBR μειωθεί αποτελεσματικά κύτταρο-προς-κύτταρο επαφή και οδήγησε σε ένα κατώτερο εξάπλωση με λιγότερες σχηματισμό fi lopodia σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου DMSO (Σχήμα 1Α). Δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση της BBR για τη μετανάστευση των κυττάρων με τη χρήση ενός ποσοτικού προσδιορισμού επούλωση της πληγής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, το τμήμα του χώρου τραυματισμό μεταξύ των κυτταρικών στρωμάτων μετά κάνει μία γρατσουνιά καταλήφθηκε πλήρως από τα κύτταρα που μεταναστεύουν μετά από 48 ώρες στην ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, ο κενός χώρος των κυττάρων δεν καταλήφθηκε από τους μεταναστεύουν κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 20 μΜ BBR. Αυτά τα αποτελέσματα απέδειξαν τις δυνατότητες του BBR στην αλλαγή της μορφολογίας των κυττάρων και την αναστολή της μετανάστευσης κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

(Α) Οι αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία και την εξάπλωση σε Α549 και Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με 100 μΜ BBR για παρατηρήθηκαν 48 ώρες και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο εφοδιασμένο με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. μετανάστευση (Β) Cell αναλύθηκε με μία δοκιμασία επούλωση της πληγής. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρη συρροή. Οι κυτταρικές μονοστοιβάδες τραυματίστηκαν με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας, και πλύθηκαν με μέσο για να απομακρυνθεί αποσπασμένα κύτταρα από τις πλάκες. Τα κύτταρα αφέθηκαν είτε άνευ αγωγής ή υπέστησαν αγωγή με 20 μΜ BBR. Μετά από 48 ώρες, το χάσμα πληγή παρατηρήθηκε και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν.

Η

BBR κατέστειλε κυτταρικού πολλαπλασιασμού και σχηματισμό αποικιών

Βερβερίνη έχει δειχθεί ότι επάγουν την αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση των μη-μικροκυτταρικού ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω μονοπατιού σηματοδότησης ρ53 [43]. Εμείς επόμενη αναλύθηκαν ποσοτικά την επίδραση της BBR στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε Α549 καρκίνου του πνεύμονα και κυττάρων Η1299 με δοκιμασία ΜΤΤ. Η θεραπεία με BBR σε δόση 10 μΜ έως 200 μΜ ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το IC

50 τιμές του BBR για Α549 και Η1299 κύτταρα είναι 67.1 μΜ και 59,2 μΜ, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α). Δοκιμάσαμε επίσης τα αποτελέσματα της BBR επί των κυττάρων του όγκου κλωνογονικότητας σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 2Β). Η θεραπεία με το σχηματισμό αξιοσημείωτα ανέστειλε αποικίας BBR, με αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση τόσο σε αναλογία σχηματισμού αποικίας (Σχήμα 2C) και το μέγεθος των αποικιών (Σχήμα 2D).

(Α-Γ) Ανθρώπινη Α549 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Οι τιμές IC50 του BBR για Α549 και κύτταρα Η1299 υπολογίστηκαν (Α). Ο σχηματισμός αποικίας των κυττάρων του όγκου Α549 προκαλούμενη αναλύθηκε επίσης (Β), και ο ρυθμός σχηματισμού αποικιών (C) και το μέγεθος των αποικιών (D) υπολογίστηκαν. Κύτταρα κατεργασμένα με DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αναφερόμενο με την κυτταρική βιωσιμότητα καθορίστηκε σε 100%. Η βιωσιμότητα των κυττάρων τοις εκατό σε κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε σε σχέση με κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO ελέγχου του οχήματος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών δοκιμών. *, P & lt? 0.05, σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας και ομάδες ελέγχου DMSO.

Η

BBR ανέστειλε AP-2 /hTERT σηματοδότησης

hTERT έχει θεωρηθεί ως το σήμα κατατεθέν της καρκινογένεσης και η έκφραση της hTERT είναι ελέγχονται αυστηρά από μεταγραφικού παράγοντα AP-2. Για να καθοριστεί εάν BBR στοχεύει την σηματοδότηση AP-2 /hTERT, εμείς κατεργασμένα κύτταρα Α549 με BBR (20 μΜ ή 100 μΜ) και εξέτασαν την έκφραση του ΑΡ-2α, ΑΡ-2β και πρωτεΐνες hTERT και mRNAs με κηλίδα Western και RT-PCR , αντίστοιχα. Η θεραπεία με BBR οδήγησε σε αξιοσημείωτη αναστολή της έκφρασης του ΑΡ-2α, ΑΡ-2β και hTERT σε πρωτεΐνη (Σχήμα 3Α) και τα επίπεδα mRNA (Σχήμα 3Β).

(Α-Γ) Ανθρώπινη NSCLC κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, οι πρωτεΐνες hTERT ΑΡ-2 και (Α) και mRNA (Β) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western και RT-PCR, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για τη φόρτωση του δείγματος. Η σύνδεση του ΑΡ-2 έως ανιχνευτή hTERT προαγωγό (C) αναλύθηκε με δοκιμασία κυλιόμενο στρεπταβιδίνης-αγαρόζης. (D) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με ένα ΑΡ-2 siRNA ή ΑΡ-2 που εκφράζουν φορέα για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BBR (100 μΜ). Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, την έκφραση της πρωτεΐνης και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκαν με στύπωμα Western και δοκιμασία ΜΤΤ, αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων τοις εκατό σε κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο του οχήματος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *, P & lt? 0.05, σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες θεραπείας και ομάδες ελέγχου DMSO.

Η δοκιμασία pull-down

Από έκφρασης hTERT ελέγχεται αυστηρά από την ενεργότητα δέσμευσης του AP-2 οικογένειας με υποκινητή hTERT, είμαστε δίπλα εκτελούνται στρεπταβιδίνης-αγαρόζης να εξετάσει την επίδραση της BBR για τις δραστηριότητες πρόσδεσης AP-2α και 2β-AP σε προωθητή hTERT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, θεραπεία BBR κατήργησε αποτελεσματικά AP-2α και 2β-AP δέσμευση στην βιοτίνη σημασμένο ανιχνευτή DNA προαγωγέα hTERT (Σχήμα 3C).

Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος του ΑΡ-2 σηματοδότηση σε BBR- μεσολαβεί αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επιμολύναμε κύτταρα Α549 με AP-2α ή ΑΡ-2β siRNA (100 ηΜ) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τους BBR (100 μΜ) για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επιμόλυνση με AP-2α ή ΑΡ-2β siRNA αποτελεσματικά κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση του ΑΡ-2α ή πρωτεΐνη ΑΡ-2β και σημαντικά ανέστειλαν την κυτταρική βιωσιμότητα (Σχήμα 3D). Knockdown του ΑΡ-2α ή ΑΡ-2β με siRNA επίσης σημαντικά αύξησε την BBR μεσολάβηση αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση με την επιμόλυνση με το siRNA μάρτυρα (si-NC) (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η επίδραση της BBR επί της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω μονοπατιού σηματοδότησης AP-2 /hTERT σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα.

BBR ανέστειλαν ΝΡ-κΒ /COX-2 σηματοδότηση

Υψηλή έκφραση της COX-2 εμπλέκεται στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και την αγγειογένεση. Για τον προσδιορισμό των επιδράσεων του BBR επί COX-2 σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, έχουμε την επόμενη αναλύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης COX-2 σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με BBR με κηλίδα Western. Η θεραπεία με BBR στη δόση των 20 μΜ δεν ανέστειλε σημαντικά έκφραση COX-2 πρωτεΐνης, ενώ η δόση των 100 μΜ μειώθηκε αισθητά την έκφραση πρωτεΐνης COX-2 σε Α549 κύτταρα (Σχήμα 4Α).

(Α) Ανθρώπινα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, η πρωτεΐνη COX-2 αναλύθηκε με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για τη φόρτωση του δείγματος. (Β) κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με την COX-2 εκλεκτικός αναστολέας σελεκοξίμπη (CB, 20 μΜ) επί 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BBR (20 μΜ). Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων τοις εκατό σε κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο του οχήματος. (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, η σύνδεση ρ50 και ρ65 να διερευνητή προαγωγό COX-2 αναλύθηκε με μία δοκιμασία κυλιόμενο στρεπταβιδίνης-αγαρόζης. (D) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR (100 ηΜ). Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, η επίδραση της BBR επί ΝΡ-κΒ ρ65 και ρ50 μετατόπιση αναλύθηκε με δοκιμασία ανοσοφθορισμού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *, P & lt? 0.05, σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας και των ομάδων ελέγχου DMSO.

Η

Η έκφραση της COX-2 ρυθμίζεται αυστηρά από την ενεργότητα δέσμευσης του ρ50 /ρ65 του ΝΡ-κΒ σε δομή υποκινητή COX-2. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν η BBR-επαγόμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την έκφραση της COX-2 προκαλείται από την αναστολή της πρόσδεσης του ΝΡ-κΒ σε COX-2 προαγωγό σε κύτταρα Α549. δοκιμασία pull-down στρεπταβιδίνης-αγαρόζης έδειξε ότι BBR σε δόση 100 μΜ αξιοσημείωτα ανέστειλε ρ50 ΝΡ-κΒ και ρ65 δέσμευση σε ανιχνευτή προαγωγέα COX-2 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4Β). Αντίθετα, BBR σε δόση 20 και 100 μΜ δεν επηρέασε τα επίπεδα ρ50 και ρ65 πρωτεΐνης σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου (Σχήμα 4Α).

Η μετατόπιση του ΝΡ-κΒ ρ65 και ρ50 σε πυρήνες κυττάρων και παίζει κυτταρόπλασμα ένα βασικό ρόλο στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης COX-2. Εμείς επόμενη εκτελείται δοκιμασία ανοσοφθορισμού για να αξιολογηθεί η επίδραση της BBR επί ΝΡ-κΒ ρ65 και ρ50 μετατόπιση σε κύτταρα Α549. Συστατική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ ρ65 και ρ50 στις κυτταρικές πυρήνες ανιχνεύθηκε (Σχήμα 4C). Η θεραπεία με BBR (100 μΜ) προωθηθούν αποτελεσματικά μετατόπιση του ρ65 ΝΡ-κΒ και ρ50 από πυρήνες κυττάρων προς κυτταρόπλασμα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων με BBR μπορούσε επίσης να προκαλούνται από τη διαμόρφωση της /COX-2 μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα.

BBR ανέστειλε HIF-1α /VEGF, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ , Raf /MEK /ERK σηματοδότηση

Η /VEGF σηματοδότηση HIF-1α /PEDF συνδέεται στενά με την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και την αγγειογένεση. Στην συνέχεια προσδιορίσαμε την επίδραση του BBR στην έκφραση του HIF-1α, VEGF και PEDF σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα με RT-PCR και στυπώματος Western, αντιστοίχως. Θεραπεία της Α549 κυττάρων με BBR ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του HIF-1α και VEGF, αλλά όχι PEDF, σε πρωτεΐνη (Σχήμα 5Α) και τα επίπεδα mRNA (Σχήμα 5Β).

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR στο υποδεικνυόμενο δόσεις. Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, η έκφραση του HIF-1α, VEGF και PEDF σε πρωτεΐνη (A) ή τα επίπεδα mRNA (Β), καθώς και η συνολική και φωσφορυλιωμένο Akt και /2 πρωτεΐνες ΕΚΚ1 (D), προσδιορίστηκαν. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον HIF-1α-ειδικό siRNA (si-HIF) (C) ή το Akt-εκλεκτικός αναστολέας LY294002 (LY, 30 μΜ) ή η ERK-εκλεκτικός αναστολέας U0126 (U, 50 μΜ) (Ε) για 24 ώρες, αντιστοίχως, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BBR. Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων τοις εκατό σε κάθε ομάδα αγωγής υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο του οχήματος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *, P & lt? 0.05, σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας και των ομάδων ελέγχου DMSO.

Η

Για την επικύρωση των επιπτώσεων της BBR για σηματοδότηση HIF-1α /VEGF /PEDF, επιμολύναμε κύτταρα Α549 με HIF-1α siRNA (100 ηΜ) και στη συνέχεια να κατεργάζεται με BBR (100 μΜ) για 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, knockdown του HIF-1α με siRNA αύξησε σημαντικά την BBR μεσολάβηση αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με την επιμόλυνση με τον έλεγχο siRNA. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η επίδραση της BBR επί της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων είναι επίσης διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω HIF-1α /VEGF /PEDF μονοπάτι σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα σηματοδότησης.

Ο ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και Raf /MEK σηματοδότηση /ERK παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όγκων και της επιβίωσης. Για να προσδιοριστεί αν η BBR μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης είναι επίσης μέσα από την αδρανοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και οδού σηματοδότησης Raf /MEK /ERK, αναλύσαμε την επίδραση του BBR επί της φωσφορυλίωσης της Akt και ERK σε κύτταρα Α549 με στύπωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, η θεραπεία με BBR μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένου Akt και πρωτεΐνες ERK1 /2, ενώ τα επίπεδα ολικής Akt και πρωτεΐνη ERK1 /2 δεν άλλαξε.

BBR ενεργοποιημένη κασπάση-εξαρτώμενη αποπτωτικά μονοπάτι

Μπορούμε επίσης καθοριστεί εάν η ενίσχυση της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης που προκαλείται από BBR συνδέεται με την αύξηση της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η θεραπεία με BBR σε δόσεις των 20 μΜ και 100 μΜ επάγεται 26% και 50% αποπτωτικά κύτταρα σε Α549 και 28% και 60% αποπτωτικά κύτταρα σε Η1299 κύτταρα (Σχήμα 6Α). Για να επιβεβαιωθεί η επίδραση του BBR στην απόπτωση, έχουμε την επόμενη ανίχνευσε την έκφραση κάποιων προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, κασπάσης-3/7/9 PARP, ΒΑΧ και Bcl-2 σε κύτταρα Α549 με ανάλυση κηλίδας Western. BBR σημαντικά αυξημένα τα επίπεδα έκφρασης του διασπασμένη κασπάση-3/7/9 διασπασμένη PARP και πρωτεΐνες ΒΑΧ, αλλά μειώθηκε τα επίπεδα πρωτεΐνης Bcl-2, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6Β).

Α549 και κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με BBR (20 μΜ ή 100 μΜ). Στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η απόπτωση προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS (Α). Τα επίπεδα της διασπασμένη κασπάση 3, 7, 9, διασπασμένη PARP, πρωτεΐνες ΒΑΧ και Bcl-2 σε κύτταρα Α549 αναλύθηκαν με κηλίδα Western (Β). Η απελευθέρωση του Cyt-c σε κύτταρα Α549 αναλύθηκε με ανάλυση απεικόνισης ανοσοφθορισμού για την παρακολούθηση της απελευθερώσεως Cyt-c από τη μεταξύ των μιτοχονδριακών χώρος μέσα στο κυτοσόλιο (C). Η απόπτωση αντιπροσωπεύονται από σχετικά ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων έναντι ότι σε κύτταρα DMSO-θεραπεία. *, P & lt?. 0.05, σημαντικές διαφορές μεταξύ των BBR αγωγή ομάδες και τις ομάδες DMSO-αγωγή

Η

κυτοχρώματος-c (Cyto-γ) απελευθέρωση είναι ένα σημαντικό γεγονός στην κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι της απόπτωσης . Είμαστε δίπλα πραγματοποιήθηκε ανάλυση απεικόνισης ανοσοφθορισμού (IF) για την παρακολούθηση των αλλαγών στην υποκυτταρική εντόπιση του Cyto-γ σε κύτταρα Α549 για να καθοριστεί αν BBR θα μπορούσε να προκαλέσει την απελευθέρωση Cyto-c. Η θεραπεία με BBR (20 μΜ ή 100 μΜ) προκάλεσε σημαντικά την απελευθέρωση του Cyto-c από τη μεταξύ των μιτοχονδριακών χώρος στο κυτοσόλιο (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι BBR μπορούν να διευκολύνουν την προς τα κάτω Cyto-c εξαρτώμενο από τη συναρμολόγηση αποπτωσώματος και την ενεργοποίηση της κασπάσης στο κυτταρόπλασμα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την απόκριση των ανθρώπινων πνεύμονα καρκινικά κύτταρα Α549 και Η1299 σε BBR, ένα παράγωγο αλκαλοειδές ισοκινολίνης απομονωθεί από κινέζικα βότανα. Βρήκαμε ότι BBR ενισχυμένη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ αυτές οι επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν σε φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αντικαρκινική δράση του BBR προκαλείται μέσω της διαφοροποίησης του AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF /PEDF, ΝΡ-κΒ /COX-2, ΡΙ3Κ /Akt, Raf /MEK /ERK, κασπάσης /κυτοχρώματος C και ΒΑΧ /Bcl-2-εξαρτώμενη σηματοδότησης.

hTERT έχει θεωρηθεί ως το ορόσημο της καρκινογένεσης. Η σηματοδότηση /hTERT ΑΡ2 δείχθηκε ότι είναι σημαντική σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [44]. Η αναστολή της έκφρασης hTERT βρέθηκε να συμβάλλει στην πρόληψη της διάδοσης και την αγγειογένεση και να διεγείρουν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [45]. Στη μελέτη μας, αποδείξαμε ότι η επίδραση της BBR στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω της /σηματοδότηση AP-2 hTERT. Η θεραπεία με BBR κατέστειλε την έκφραση του ΑΡ-2α και ΑΡ-2b και μειωμένη πρωτεΐνη αφθονία τους σε πυρήνες κυττάρων, μειώνοντας έτσι την σύνδεση του ΑΡ-2α και ΑΡ-2b σε προωθητή hTERT και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της hTERT στο BBR- επεξεργασμένα κύτταρα.

Η αυξημένη αναλογία του VEGF /PEDF απαιτείται για την αγγειογένεση και την ανάπτυξη όγκων [46]. Η /μονοπάτι HIF-1α /VEGF PEDF υπάρχει ως ένα κρίσιμο βήμα στην αγγειογένεση καρκίνου του πνεύμονα και μετάσταση όγκου [47]. Η μελέτη μας έδειξε ότι η BBR ανέστειλε έκφραση του HIF-1α, έτσι ανέστειλε την αναλογία VEGF /PEDF σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Είναι πιθανό ότι BBR ανέστειλε τη συσσώρευση πρωτείνης HIF-1α σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, και στη συνέχεια, κατέστειλε την έκφραση των σχετικών γονιδίων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η HIF-1α συνεισφέρει σηματοδότησης, τουλάχιστον εν μέρει, στην BBR επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης.

COX2 παίζει βασικό ρόλο στα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης του πνεύμονα [48]. Εδώ, αποδείξαμε ότι BBR έπαιξε αντι-πολλαπλασιαστική ρόλο της εν μέρει μέσω αναστολής της έκφρασης COX-2. Βρήκαμε ότι BBR ανέστειλε την έκφραση της COX-2, όχι μόνο στο επίπεδο της πρωτεΐνης αλλά και σε επίπεδο mRNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσε να ασκήσει BBR αντικαρκινική δράση εν μέρει μέσω καταστολής της COX-2 σηματοδότηση. Βρήκαμε επίσης ότι η αναστολή της έκφρασης COX-2 με κατεργασία BBR μερικώς διαμεσολαβείται από διέγερση ΝΡ-κΒ μετατόπιση από την πυρηνική προς κυτοσόλιο και με αναστολή της δέσμευσης του ΝΡ-κΒ για την COX-2 προαγωγό.

Η ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και Raf /MEK σηματοδότηση /ERK διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων, την επιβίωση της ανάπτυξης. Η σχέση του Raf /MEK /ERK και PI3K /AKT με καρκίνο του πνεύμονα είναι ακόμα ένα έντονο ερευνητικό τομέα στις μέρες μας [49,50]. Η έρευνά μας απέδειξε το σημαντικό ρόλο της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και οδού σηματοδότησης Raf /MEK /ERK σε BBR μεσολάβηση της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. BBR μπορεί να λειτουργήσει μέσω αδρανοποίησης ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και μονοπάτι Raf /MEK /ERK σηματοδότηση, την αναστολή της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών Akt και ERK, και προς τα κάτω ρύθμιση HIF-1α σηματοδότησης να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Η απόπτωση παίζουν κρίσιμο ρόλο στην η απόκριση του καρκίνου σε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η επαγωγή της απόπτωσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με BBR επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση του κυτοχρώματος-c και οδούς απόπτωσης κασπάσης-εξαρτώμενη. Βρήκαμε ότι BBR επαγόμενη την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών κασπάσης και PARP, και προώθησε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος-c από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας δείχνουν την αντικαρκινική δράση του BBR σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σχετίζεται με την αυξημένη ενεργοποίηση του κυτοχρώματος-c και κασπάσης-εξαρτώμενη αποπτωτική παθολογική οδό.

Εν περιλήψει, αποδείξαμε ότι BBR εμφάνισαν αντι-πολλαπλασιαστική και pro -apoptotic δραστηριότητες σε κύτταρα NSCLC με ταυτόχρονες διαμόρφωση του AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF, ΝΡ-κΒ /COX-2, Raf /MEK /ERK, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και μονοπατιών σηματοδότησης κασπάσης /κυτοχρώματος-c. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν νέες ιδέες στην εξερεύνηση των νέων πιθανών θεραπευτικών στρατηγικών και νέων στόχων για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549 και Η1299 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε RPMI 1640 μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμικά απενεργοποιημένο βόειο, 100 μg /ml πενικιλλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Βερβερίνη (BBR), U0126, LY294002 και celecoxib αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ) και διαλύθηκε σε μια μικρή ποσότητα DMSO πριν από την προσθήκη στο πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Στρεπταβιδίνη-αγαρόζη αγοράσθηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Αντισώματα προς GAPDH, VEGF, PEDF, HIF-1α, ρ50, ρ65, COX-2 ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι AP-2α, ΑΡ-2β, hTERT, κυτόχρωμα-c, PARP, κασπάσης-3/7/9 ΒΑΧ, Bcl-2, Akt, ERK1 /2, phosphrylated Akt ή ERK1 /2 αγοράστηκαν από Cell Signaling ( Beverly, ΜΑ).

επούλωση της πληγής δοκιμασία

Ο προσδιορισμός επούλωση της πληγής έγινε για τον εντοπισμό της μετανάστευσης των κυττάρων. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρη συρροή σε πλάκες έξι φρεατίων και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε μέσο λιμοκτονίας. μονοστοιβάδες κυττάρων τραυματίστηκαν με ένα αποστειρωμένο 100 μι pipettetip, πλύθηκαν με μέσο λιμοκτονίας για την απομάκρυνση αποσπασμένα κύτταρα από τις πλάκες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες δόσεις του BBR σε πλήρες μέσο και διατηρούνται σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Μετά από 48 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με PBS, το διάκενο πληγή παρατηρήθηκε και τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ (Roche Διάγνωση, Indianapolis, ΙΝ). Εν συντομία, οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σπάρθηκαν σε 4 Χ 103 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για όλη την νύχτα, και στη συνέχεια τα κύτταρα αλλάχθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις BBR διαλύθηκε σε DMSO (τελική συγκέντρωση, 0,1%). Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες, η ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε. Η επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε ως η επί τοις εκατό βιωσιμότητας κυττάρου σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα, οι οποίες αποδίδεται αυθαίρετα 100% βιωσιμότητα. Η συγκέντρωση BBR που απαιτείται για να προκαλέσει 50% αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (IC50) προσδιορίστηκε με παρεμβολή από καμπύλες δόσης-απόκρισης.

Anchorage ανεξάρτητη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας

Α549 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων ήταν αντιμετωπίζονται με BBR. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επεξεργασία με θρυψίνη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα (8 χ 10

3 /ml) αναμίχθηκαν σε άγαρ 5α 1,0 ml 0,3% McCoy που περιέχει 10% FBS. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε 37 ° C, 5% CO

2 εκκολαπτήριο για 14 ημέρες. Το μέσο απορρίφθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν προσεκτικά με PBS δύο φορές.