Αφηρημένο

Η σισπλατίνη (

cis

διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος, CDDP) είναι ένα πολύ γνωστό χημειοθεραπευτικό παράγοντα για η θεραπεία αρκετών καρκίνων. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός υποκείμενη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων που επάγεται από την CDDP παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι μηχανιστικά CDDP επάγει GM3-μεσολαβούμενη απόπτωση κυττάρων HCT116 με αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και την αύξηση του κατακερματισμού του DNA και τα σήματα απόπτωση μιτοχόνδρια-εξαρτώμενη. CDDP απόπτωση που επάγεται εντός των κυττάρων μέσω της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), ρυθμίζεται η ROS μεσολάβηση έκφραση Bax, Bcl-2, και ρ53, και επαγόμενη από την αποικοδόμηση του πολύ (ΑΟΡ-ριβοσυλ) πολυμεράσης (PARP). Ελέγξαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης των διαφορετικών γαγγλιοσιδίων σε κύτταρα HCT116 με την παρουσία ή απουσία του CDDP. Είναι ενδιαφέρον ότι, μεταξύ των γαγγλιοσιδών, CDDP αύξησε την έκφραση της συνθάσης μόνο GM3 και το προϊόν της GM3. Μείωση του επιπέδου συνθάσης GM3 μέσω έκτοπη έκφραση της GM3 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) διασωθεί κύτταρα HCT116 από CDDP επαγόμενη απόπτωση. Αυτό αποδείχθηκε από την αναστολή των αποπτωτικών σημάτων με τη μείωση της παραγωγής ROS μέσω της ρύθμισης της δραστηριότητας 12-λιποξυγενάσης. Επιπλέον, η αποπτωτική ευαισθησία σε CDDP είχε αξιοσημείωτα αυξημένη σε GM3 κύτταρα HCT116 συνθάσης επιμολυσμένα σε σύγκριση με εκείνη των ελέγχων. Επιπλέον, GM3 συνθάσης-επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με CDDP επέδειξαν αυξημένη συσσώρευση ενδοκυτταρικού ROS. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το CDDP επαγόμενη οξειδωτική απόπτωση κυττάρων HCT116 διαμεσολαβείται από GM3

Παράθεση:. Chung Τ-W, Choi H-J, Kim S-J, Kwak C-H, Song Κ-Η, Jin U-H, et al. (2014) Η γαγγλιοσίδης GM3 συνδέεται με την επαγόμενη από cisplatin απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (5): e92786. doi: 10.1371 /journal.pone.0092786

Επιμέλεια: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιούλη, 2013? Αποδεκτές: 25, Φεβρουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2014

Copyright: © 2014 Chung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα μελέτη έχει υποστηριχθεί από το Πρόγραμμα βασική επιστημονική έρευνα, μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (MEST) της Κορέας (NRF-2013R1A1A2005387) και Εξατομικευμένη όγκου επιχορήγηση Engineering Research Center (2008- 0062611). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cisplatin (

cis

διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος, CDDP) είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία πολλών στερεών όγκων. CDDP δεσμεύεται με DNA για να δημιουργήσει ενώσεις προσθήκης DNA [1]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι CDDP ρυθμίζει τη δραστηριότητα ορισμένων διαύλων ιόντων, πρωτεΐνες μεταφοράς και διάφορα ένζυμα μεμβράνης πλάσματος [2], [3], και επάγει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας του καρκίνου [4]. Κατά συνέπεια, CDDP ρυθμίζει την επιδιόρθωση του DNA, η αναστολή της μεταγραφής, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [5]. Έχει αναφερθεί ότι οι εξωκυτταρικές κινάσες σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ), τα c-Jun Ν-τερματικές κινάσες (JNKs) /στρες-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (SAPK) και το ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) ενεργοποιούνται σε CDDP επαγόμενη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [6], [7]. Επιπλέον, CDDP προκαλεί Fas /FasL απόπτωση σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα [8] και μιτοχονδριακή βλάβη ρυθμίζοντας τα επίπεδα έκφρασης της οικογένειας Bcl-2, τα οποία έχουν είτε προ- ή αντι-αποπτωτικών λειτουργίες. Επηρεάζοντας CDDP κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα, ρ53-διαμεσολαβούμενη τρανσενεργοποίηση του προ-αποπτωτικών Bax, μειωμένη Bcl-2 έκφρασης και διάσπαση της προσφοράς οδηγεί σε μείωση στο μιτοχονδριακό δυναμικό και αυξάνει κασπάσης με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης PARP μέσω της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια [9] – [12]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι αυτά τα αποπτωτικά φαινόμενα οφείλονται στην μεταβολή της σύνθεσής της μεμβράνης [13]. Μεταξύ των συνιστωσών της μεμβράνης, έχει αναφερθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης των γαγγλιοζιτών μεταβληθεί σε καρκινικά κύτταρα αγωγή με φάρμακο [14].

Συστάδες γλυκοσφιγγολιπίδια που περιέχουν σιαλικό οξύ (ΓΣΛ) είναι πανταχού παρόντες στην μικροπεριοχή μεμβράνη σε όλα τα κύτταρα θηλαστικών και εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και την μεταγωγή σήματος [15]. Πολλές μελέτες έχουν αναφέρει ότι συγκεκριμένα γαγγλιοσίδια όπως GM3, GD3, και GD1b επάγουν απόπτωση σε διάφορους τύπους κυττάρων [16], [17]. θεραπεία GM3 σε ανώριμα νευρογλοιακά πολλαπλασιαζόμενα και νευρωνικών κυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επαγωγή της απόπτωσης [18], [19]. Επιπλέον, GM3 εμπλέκεται σε κυτταρικό θάνατο μέσω της συσσώρευσης των ROS και εισροής ιόντων ενδοκυτταρικού ασβεστίου στα νευρωνικά κύτταρα [20], [21]. Σε ποντικού καρκινικά κύτταρα κύστης, GM3 υπερέκφραση προκαλεί απόπτωση και μειώνει κακοήθους δυναμικού [22]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η λειτουργική σημασία της γαγγλιοσίδη GM3 σε CDDP-θεραπεία καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή HCT116 καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? JBI, Daegu, Κορέα) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C υπό 5% CO

2. Σισπλατίνη αγοράστηκε από Dong-A Φαρμακευτική CO., LTD (Σεούλ, Κορέα).

Ν

ακετυλο

L-κυστεΐνη (NAC) ελήφθη από την Molecular Probes ™ (Invitogen, CA). Βαϊκαλεΐνη ήταν από την Sigma-Aldrich. Αντισώματα ελήφθησαν ως εξής: Αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβοσυλ) πολυμεράση (PARP), BCL-2, Βαχ, και ρ53 ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-αφυδρογονάση 3-phosphode-υδρογενάση (GAPDH) αγοράστηκε από την Chemicon (Temecula, LA). Αντι-GM3 (M2590) αγοράστηκε από Biotest Laboratories (Ιαπωνία).

Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA από κάθε κυτταρική απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ ( Invitrogen). Ένα μικρογραμμάριο RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή με ολίγο dT εκκινητές με χρήση RT-AccuPower προμίγμα (Bioneer Co., Daejon, Κορέα), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το cDNA ενισχύθηκε με PCR με τους ακόλουθους εκκινητές χρησιμοποιώντας EF-Taq πολυμεράσης (SolGent, Σεούλ, Κορέα): GM3 συνθάσης (413 bp), 5′-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3′ (αντινοηματικό )? GD3 συνθάσης (460 bp), 5’-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3 ‘(νοηματικό) και 5′-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3′ (antisense) ΟαΙΝΑο-T (GM2 /GD2 συνθάση) (230 bp), 5’-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3 ‘( αίσθηση) και 5’-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3 ‘(antisense)? β-ακτίνης (247 bp), 5’-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3’ (antisense). Η χρήση ίσων ποσοτήτων mRNA στην δοκιμασία RT-PCR επιβεβαιώθηκε με ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του β-ακτίνης. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος σε 1.5% βρωμιούχο αιθίδιο που περιέχει αγαρόζη με 0.5 × τρις-οξικό EDTA ρυθμιστικό (ΤΑΕ).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ πολλαπλασιασμού II (ΧΤΤ? Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Εν συντομία, τα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 96 φρεατίων σε πυκνότητα 103 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μι ϋΜΕΜ /10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώασης, το μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με 100 μL φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις CDDP. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO2 για 12 ώρες. Στο τέλος της επώασης, 50 μL του διαλύματος δοκιμής ΧΤΤ παρασκευάστηκε με ανάμιξη 5 ml αντιδραστηρίου ΧΤΤ-επισήμανση και 100 μL του αντιδραστηρίου ηλεκτρονίων σύζευξης, το οποίο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 4 ώρες επώασης στους 37 ° C και κάτω από συνθήκες 5% CO2, μετρήθηκε η απορρόφηση χρησιμοποιώντας αναγνώστη ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) σε δοκιμαστικό μήκος κύματος 490 nm.

κυτταρομετρίας ροής εκτίμηση του ενδοκυττάρια οξειδοαναγωγική κατάσταση

παραγωγής

ROS αξιολογήθηκε με χρώση των κυττάρων με dichlorodihydrofluorescein διοξική (H

2DCFDA? Molecular Probes, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, επωάζονται σε 10 μΜ H

2DCFDA αραιωμένο σε ϋΜΕΜ για 20 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν με PBS, και επεξεργασία με θρυψίνη. Διαχωρισμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε PBS, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Western ανάλυση κηλίδος

Cells ομογενοποιήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8,0), 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 100 μg /mL φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), 1 μg /mL απροτινίνη, και 1% Triton Χ- 100. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA). Τριάντα μικρογραμμάρια ολικού κυτταρόλυμα κλασματώθηκε κατά μέγεθος με δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου-(SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας το σύστημα Hoefer ηλεκτρομεταφορά (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Για την ανίχνευση των πρωτεϊνών στόχων, επωάσαμε τις μεμβράνες με τα αντίστοιχα αντισώματα. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συνδεόμενου με υπεροξειδάση αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού αντισώματα δευτερογενούς χρένο (Santa Cruz), και σύστημα χημειοφωταύγειας ECL (Amersham Biosciences).

Υπερ-έκφραση της γαγγλιοσίδης GM3 συνθάσης και των προϊόντων της σε κύτταρα HCT116

Για την κατασκευή του πλασμιδίου έκφρασης συνθάσης GM3, ένα θραύσμα DNA 1.1 kb, συμπεριλαμβανομένης της ανθρώπινης συνθάσης κωδικοποιητική περιοχή GM3 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδια εκκινητή 5′-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3 ‘(νοηματικό), 5’-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3 ‘(αντινοηματικό) και cDNA ανθρώπινου εμβρυϊκού εγκεφάλου ως πρότυπο. Η αίσθηση και αντίθετης φοράς εκκινητών περιέχει

Hind

III και

Eco

RI θέσεις περιορισμού (υπογραμμισμένη), αντιστοίχως. Το θραύσμα καθαρίστηκε από πηκτή αγαρόζης 1% χρησιμοποιώντας τον Οδηγό SV Gel και σύστημα καθαρισμού PCR (Promega) και πέψη με το κατάλληλο ένζυμο περιορισμού, και προσδέθηκε με την χρησιμοποίηση Τ4 λιγκάσης (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) σε μια pcDNA3 φορέα, για να δημιουργήσει pcDNA-GM3. Για τον προσδιορισμό του κατασκευάσματος με γονίδιο συνθάσης GM3, χαρτογράφηση περιορισμού και αλληλούχιση του DNA διεξήχθησαν. κύτταρα HCT116 επιστρώθηκαν πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύσσονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1 μα pcDNA και pcDNA-GM3 πλασμιδίου με τη μέθοδο WelFect-EX ™ PLUS (JBI). Μετά την επώαση, τα επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε παρουσία 500 μg /mL G418 (Life Technologies, Inc.). Μετά από 21 ημέρες σε επιλεκτικό μέσο, ​​ατομική G418-ανθεκτικές αποικίες απομονώθηκαν. Τρεις θετικοί κλώνοι που εκφράζουν GM3 συνθάσης σε υψηλά επίπεδα, όπως προσδιορίζεται με RT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

δοκιμασία Λουσιφεράσης

Reporter πλασμίδια, pGL3-1600 παρασκευάστηκαν με εισαγωγή του

Sac

I /

Bgl II

θραύσματα από το καθένα από τα πλασμίδια που παράγονται προηγουμένως [23] στις αντίστοιχες θέσεις του φορέα λουσιφεράσης-προαγωγέα λιγότερο pGL3-Basic (Promega). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων σε πυκνότητα 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύσσονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 0.5 pmol του GM3 συνθάσης προαγωγό-λουσιφεράσης κατασκευάσματα αναφοράς και 0.5 μg πλασμιδίου β-γαλακτοσιδάσης με τη μέθοδο WelFect-EX ™ PLUS (JBI). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 10% FBS και επωάστηκαν με CDDP για 12 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης και η δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης και ένζυμο β-γαλακτοσιδάση (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με την δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης στο προϊόν λύσης κυττάρου και υπολογίσθηκε η μέση τιμή βασίζεται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου σπάρθηκαν σε υπο-συρρέουσες πυκνότητα στις 12 διαμέτρου mm- στείρες καλυπτρίδες σε πλάκες καλλιέργειας ιστών έξι φρεατίων. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 3.7% φορμαλδεΰδη /PBS και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά σε 0.5% Tween-20 /PBS για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μη ειδικές θέσεις μετά φράχθηκαν με PBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανακίνηση. Στη συνέχεια, ένα διάλυμα GM3 (M2590), GD3 ή GM2-ειδικά αντισώματα είχαν πλημμυρίσει πάνω από τα κύτταρα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω με FITC συζευγμένο αντι-ποντικού IgM για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθήθηκε από πλύση με PBS, και τελικά τοποθετούνται σε αντιδραστήριο αντι-ξεθωριάσματος (Molecular Probes) που περιέχει 4 ‘, 6-iamidino- 2-φαινυλινδόλη (DAPI). Τα πλακίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Nikon φθορισμού μικροσκοπία (Nikon, Ιαπωνία). Η προ-απορροφήθηκε δευτερεύον αντίσωμα μόνο συμπεριλήφθηκε επίσης ως αρνητικός μάρτυρας για το πείραμα.

DNA κατακερματισμό δοκιμασία

Τα καλλιεργημένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM Tris -ΗΟΙ (ρΗ 7.4), 10 mM EDTA, 0,5% Triton Χ-100), και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 4 ° C για 10 λεπτά, και τα υπερκείμενα επωάστηκαν με 200 μg /mL RNase Α στους 37 ° C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν με 200 μg /mL πρωτεάσης Κ στους 50 ° C για 30 λεπτά. Μετά την καταβύθιση με ισοπροπανόλη, το DNA επαναιωρήθηκε σε ένα διάλυμα Tris-EDTA. Τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου και υπεριώδη ακτινοβολία.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των αποπτωτικών κυττάρων

Για να ταυτοποιηθούν αποπτωτικά κύτταρα, pcDNA- ή ροϋΝΑ-GM3 -transfectaed κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDDP για 24 ώρες. Τα δείγματα πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με 1 μg /mL του FITC-αννεξίνης V (BD Pharmingen, San Diego, CA) για 10 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACS Calibur (Becton-Dickinson )

ανάλυση HPTLC των γαγγλιοσιδίων

γαγγλιοσίδες από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου σε επεξεργασία με ή χωρίς CDDP (1,5 × 10

7 κύτταρα) εκχυλίστηκαν με χλωροφόρμιο:. μεθανόλη: νερό (2: 1:0.4, ν /ν /ν), και κλασματοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με HPTLC χρησιμοποιώντας Silica Gel 60 πλάκες (Merck). Οι πλάκες αναπτύχθηκαν με χλωροφόρμιο: μεθανόλη: 0.2% υδατικό CaCl

2 (55:45:10, ν /ν /ν). Τα γαγγλιοσίδια έγιναν ορατές με ψεκασμό της πλάκας με το αντιδραστήριο ρεσορκινόλης υδροχλωρική.

Προετοιμασία και διαμόλυνση των μικρών RNAs παρεμβολών (siRNAs)

Ένα siRNA duplex σχεδιασμένα να στοχεύουν την αλληλουχία κωδικοποίησης του mRNA συνθάσης ανθρώπινης GM3 και φυτό χλωροφύλλη α mRNA πρωτεΐνης /b πρόσδεσης ως αρνητικός έλεγχος συντέθηκαν με Bioneer Corporation. Οι αλληλουχίες στόχοι για GM3 siRNAs συνθάσης είναι 5′-GUAUGUAACGAUGUUGUAU-3 ‘, 5′-CAUCAAAGAGACUGCCUUU-3′, και 5’-CAGGUAUAGCGUGGACUUA-3 ‘. HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου επιμολύνθηκαν με GM3 siRNAs συνθάσης και αρνητικός έλεγχος αντίστοιχα siRNA, με τη χρήση WelFect-EX ™ PLUS (JBI), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα σύμπλοκα επιμόλυνσης αφαιρείται και αντικαθίσταται με μέσο καλλιέργειας. Μετά την επώαση με CDDP σε μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Αποτελέσματα

CDDP επάγει την απόπτωση μέσω της συσσώρευσης των ROS

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα του CDDP να επάγει απόπτωση σε κύτταρα HCT116, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CDDP για 24 ώρες και DNA που απομονώθηκε από CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, CDDP που προκαλείται από τον κατακερματισμό του DNA. Εξετάσαμε επίσης την επίδραση της CDDP στα σήματα απόπτωση μιτοχόνδρια-εξαρτώμενη και την έκφραση του p53 κατά τη διάρκεια της CDDP απόπτωση. Κατεργασία HCT116 κυττάρων με CDDP είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση του ρ53 και έκφραση Bax, καθώς και η μείωση της έκφρασης Bcl-2. Επιπλέον, η θεραπεία CDDP είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη διάσπαση της PARP, υποδεικνύοντας ενεργοποίηση της κασπάσης με την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c μέσω της μείωσης του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Σχ. 1Β). Δεδομένου ότι η παραγωγή των ROS έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην προκαλούμενη από CDDP κυτοτοξικότητα [24], αξιολογήθηκε η επίδραση της θεραπείας CDDP σε ενδοκυτταρική οξειδοαναγωγική κατάσταση των κυττάρων HCT116. Συγκρίναμε την παραγωγή των ROS στις CDDP-κατεργασμένων κυττάρων με αυτό στο CDDP-μη-κατεργασμένα κύτταρα με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με τη χρήση H

2DCFDA. Όπως φαίνεται στο Σχ. παραγωγή 1C, ROS αυξήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα CDDP- σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα CDDP-. Ωστόσο, η ταυτόχρονη θεραπεία με NAC, έναν αναστολέα ROS, μαζί με CDDP μείωσε την συσσώρευση ενδοκυτταρικού ROS (Εικ. 1 C). Συσχετίζεται με την ανασταλτική ικανότητα να επάγει ROS, NAC ήταν επίσης σε θέση να αναστείλει σημαντικά σήματα κυτταρικού θανάτου με την παρουσία του CDDP, όπως αποδεικνύεται από κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1D, CDDP επήγαγε την έκφραση των αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και ρ53 καθώς και επαγόμενη διάσπαση PARP και τη μειωμένη έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2. Αυτές οι επιδράσεις της CDDP σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είχαν μπλοκαριστεί από NAC. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η παραγωγή των ROS από CDDP απαιτείται για την απόπτωση των κυττάρων HCT116.

(Α) Μετά τη θεραπεία του CDDP στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 h, γενωμικό DNA απομονώθηκε και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 2% πηκτή αγαρόζης. Το DNA χρωματίσθηκε με βρωμιούχο αιθίδιο και κατέστησαν ορατά υπό υπεριώδες φως. (Β) Η συνολική πρωτεΐνη από κύτταρα HCT116 απομονώθηκε και ανάλυση ανοσοκηλίδωσης διεξήχθη με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Γ) Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς 30 μg /ml CDDP μετά την προ-αγωγή με 10 ηΜ NAC, ακολουθούμενη από την αντικατάσταση του μέσου καλλιέργειας με προσφάτως παρασκευασθέν μέσο που περιέχει 10 μΜ DCFH-DA. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, μετρήθηκε η ένταση φθορισμού με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το πλάσια αύξηση από την αντίστοιχη τους ελέγχους τους (κύτταρα που δεν αντιμετωπίζονται με CDDP), που θεωρείται ως 1. Τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων μετρήσεων.

*** P & lt? 0,001 έναντι του CDDP επεξεργασμένο έλεγχο. (D) Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς CDDP (30 μg /mL) μετά από προκατεργασία του NAC (10 ηΜ). Η πρωτεΐνη απομονώνεται από τα κύτταρα και αναλύονται με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας υποδεικνυόμενα αντισώματα. GAPDH συμπεριλήφθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η

CDDP αυξάνει γαγγλιοσίδιο GM3 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η απόπτωση των κυττάρων που προκαλείται από τη μεταβολή της σύνθεσης της μεμβράνης [13], [14] Εμείς εξέτασε εάν CDDP σε κύτταρα HCT116 ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων συνθάσης GM2 και GD3 και τα γαγγλιοσίδια του GM2 και GD3, αλλά δεν υπήρχαν αλλαγές τόσο στις παραμέτρους της έκφρασης γονιδίων (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και η παραγωγή γαγγλιοζίτη (Εικ . 2D). CDDP αύξησε την έκφραση του GM3 συνθάσης μόνο στις CDDP που προκαλείται από κύτταρα HCT116 (Εικ. 2Α). Εκτός από αυτό, διερευνήσαμε επίσης αν CDDP προκαλεί την έκφραση GM3 συνθάσης που χρησιμοποιούν άλλα καρκινικά κύτταρα κόλου όπως DLD-1, LoVo, και WiDr. αγωγή CDDP είχε σαν αποτέλεσμα την ενισχυμένη έκφραση του GM3 συνθάσης σε άλλους καρκίνου του παχέος εντέρου ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ερευνήσαμε περαιτέρω το εάν η έκφραση του GM3 συνθάσης στην παρούσα μοντέλο του ανθρώπινου κόλου HCT116 κυττάρων του καρκίνου προκαλείται από τη χρήση άλλων χημειοθεραπευτικών παραγόντων (5-φθοριοουρακίλη και δοξορουβικίνη) τα οποία είναι πολύ γνωστό ότι επάγει την απόπτωση των διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, καθώς και καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Η έκφραση του GM3 συνθάσης δεν προκλήθηκε από τις δύο αντικαρκινικών παραγόντων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, τα επίπεδα mRNA του GM3 συνθάσης αυξήθηκαν σε κύτταρα HCT116 που επάγεται από την CDDP, όπως αποδεικνύεται από RT-PCR. Επιπλέον, ερευνήσαμε αν η δραστηριότητα προαγωγέα του γονιδίου συνθάσης GM3 διεγείρεται σε CDDP που προκαλείται από κύτταρα HCT116. Πρόσφατα, έχουν αναφέρει την CREB διαμεσολαβείται μεταγραφική ρύθμιση του ανθρώπινου γονιδίου συνθάσης GM3 [23]. Έτσι, για να προσδιοριστεί δραστικότητα προαγωγού γονιδίου συνθάσης GM3 από CDDP, GM3 γονίδιο συνθάσης προαγωγό (pGL3-1600), CREB μετάλλαξη GM3 συνθάσης προαγωγό (pGL3-1600 CREB Mu) και pGL3-βασικό πλασμίδια διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HCT116 με, ή χωρίς CDDP , αντίστοιχα, που ακολουθείται από μέτρηση δραστικότητας λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανταποκριτή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, η μεταγραφική δραστικότητα των pGL3-1600 σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με CDDP ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου και στα pGL3-Basic-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 με ή χωρίς θεραπεία CDDP. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μεταγραφική δραστικότητα από το μεταλλαγμένο CREB σημαντικά μειώθηκε κατά περίπου δύο φορές σε σύγκριση με pGL3-1600 προαγωγό σε CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, η αύξηση της παραγωγής γαγγλιοσίδιο GM3 παρατηρήθηκε σε HCT1116 κυττάρων που επάγεται από την CDDP, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία ανοσοφθορισμού. δραστικότητα ανοσοφθορισμού GM3 σε CDDP-επεξεργασμένα κύτταρα έγινε ιδιαίτερα ανιχνεύσιμη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ ότι στα μη επεξεργασμένα κύτταρα δεν ανιχνεύθηκε, με τη χρήση M2590 ως ένα μονοκλωνικό αντίσωμα GM3-ειδικά και δευτερεύον αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. Επιπλέον, ερευνήσαμε γαγγλιοσιδικά πρότυπα στα κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με και χωρίς CDDP χρησιμοποιώντας ανάλυση HPTLC. Είναι ενδιαφέρον, μεταξύ των γαγγλιοσιδίων, γαγγλιοσίδη GM3 ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα HCT116 αγωγή με CDDP σε σύγκριση με την κανένας έλεγχος CDDP (Σχ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι τόσο η έκφραση της συνθάσης GM3 και γαγγλιοσίδιο GM3 παραγωγή είναι αυξημένη σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με CDDP.

(Α) ολικό RNA από κύτταρα HCT116 απομονώθηκε μετά από αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις θεραπεία CDDP για 12 mRNA h και GM3 συνθάσης ανιχνεύθηκε με RT-PCR. (Β) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν παροδικά με GM3 γονίδιο συνθάσης προαγωγό (pGL3-1600) και CREB μετάλλαξη GM3 προαγωγού συνθάσης (pGL3-1600 CREB Mu), και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς CDDP για 12 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε από κυτταρολύματα όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι μέσοι ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων με μέτρηση τριπλούν.

*** P & lt? 0,001 έναντι του CDDP επεξεργασμένο έλεγχο. (Γ) Κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με ενδεικνυόμενη συγκέντρωση της θεραπείας CDDP για 12 ώρες. Ανοσοαντιδραστικότητα κατά γαγγλιοσίδιο GM3 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) κατσίκας αντι-ποντικού IgM χωρίς ή με το αντίσωμα M2590. (Δ) Οι γαγγλιοζίτες απομονώνεται από τα κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με CDDP (0, 10, και 30 μg /mL) αναλύθηκαν με HPTLC.

Η

κάτω ρύθμιση των γαγγλιοσίδης GM3 από siRNA που στοχεύει GM3 συνθάσης προστατεύει κυτταρική απόπτωση από CDDP

προηγούμενα δεδομένα μας έδειξαν ότι CDDP που προκαλείται αποπτωτικά γεγονότα σήματος μέσω της παραγωγής ROS, και αυξημένη έκφραση του γαγγλιοσιδίου GM3 συνθάσης και των προϊόντων της GM3. Έτσι, για να καθοριστεί αν η αυξημένη GM3 γαγγλιοσιδίου σε CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα συσχετίστηκε με CDDP απόπτωση που διαμεσολαβείται, σχεδιάσαμε τρία siRNAs που κατευθύνονται ειδικά έναντι GM3 συνθάσης (siGM3). Νο 2 και 3, αλλά δεν Νο 1 τρεις siGM3 σαφώς κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση της GM3 συνθάσης σε CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση RT-PCR (Σχ. 3Α). Επιπλέον, siGM3 2 και 3, αλλά όχι 1 (Εικ. 3Β) αποκαθίσταται πρότυπα έκφρασης των Bax, Bcl-2 και ρ53 σε CDDP-επεξεργασμένα κύτταρα με αυτές CDDP-μη επαγόμενα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξητική ρύθμιση του GM3 απαιτείται για απόπτωση επάγεται από την CDDP κύτταρα HCT116.

κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με τρία siRNA που στοχεύει GM3 και αρνητικού ελέγχου siRNA. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 12 (30 μg /mL). Ολικό RNA και πρωτεϊνών λύματα από τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Α) Τα επίπεδα του mRNA συνθάσης GM3 σε ολικό RNA ελήφθη από κάθε κύτταρο ανιχνεύθηκε με RT-PCR. (Β) Η συνολική πρωτεΐνη παρασκευάστηκε από τα κύτταρα και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Η ενίσχυση της γαγγλιοσίδης GM3 σε CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα ρυθμίζει 12-λιποξυγενάσης (12-LOX) ενεργοποίηση για την παραγωγή ROS

θάνατο των νευρικών κυττάρων που προκαλείται από γλουταμικό έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ROS μέσω ενεργοποίησης 12-LOX, και επαγόμενη εντοπισμός του 12-LOX στην μεμβράνη, η οποία σχετίζεται με την ενεργοποίηση του 12-LOX [25]. συναδέλφων μας έχουν αναφέρει ότι το 12-LOX προσλαμβάνεται για γλυκοσφιγγολιπιδίων εμπλουτισμένο μικροπεδία (GEM) σε ένα γαγγλιοσιδίου GM3-εξαρτώμενο τρόπο κατά τη διάρκεια της οξειδωτικής τοξικότητα γλουταμινικού [21]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι CDDP επάγεται σήματα απόπτωση μιτοχόνδρια εξαρτώμενη μέσω γαγγλιοσίδης GM3 μεσολάβηση παραγωγή ROS στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 3 και το Σχ. 4Α). Έτσι, ερευνήσαμε αν ένας ειδικός αναστολέας της 12-LOX, βαϊκαλεΐνη αναστέλλει δραστικότητα 12-LOX για την παραγωγή ROS σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν γαγγλιοσίδη GM3 που επάγεται από την CDDP. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, CDDP που προκαλείται από την έκφραση της συνθάσης GM3 και της παραγωγής ROS. Ωστόσο, βαϊκαλεΐνη κατέστειλε CDDP-διεγερμένη παραγωγή ROS, αν και η έκφραση της συνθάσης GM3 που επάγεται από την CDDP δεν ρυθμίζονται από βαϊκαλεΐνη. Επιπλέον, ο σαρωτής NAC ROS, ανέστειλε την παραγωγή ROS, αλλά όχι GM3 συνθάσης σε CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι επάγεται από την CDDP γαγγλιοσίδη έκφραση GM3 μπορεί να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα 12-LOX για την παραγωγή ROS μέσω πρόσληψης 12-LOX να GEM.

(Α) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει GM3 και αρνητικού ελέγχου siRNA. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 12 ώρες με την παρουσία ή απουσία του CDDP (30 μg /mL). Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με προσφάτως παρασκευασθέν μέσο που περιέχει 10 μΜ DCFH-DA. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, μετρήθηκε η ένταση φθορισμού με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων μετρήσεων.

** P & lt? 0,01 και

*** P & lt? 0,001 έναντι του CDDP επεξεργασμένο έλεγχο. ns: καμία σημασία. Για RT-PCR, το συνολικό RNA και πρωτεΐνης υλικά λύσεως από τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα επίπεδα του mRNA συνθάσης GM3 σε ολικό RNA που λαμβάνεται από κάθε κυτταρική ανιχνεύθηκαν με RT-PCR. (Β) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς 30 μg /ml CDDP μετά την προ-επεξεργασία των 10 ηΜ NAC ή 1 μΜ βαϊκαλεΐνη, και στη συνέχεια, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με προσφάτως παρασκευασθέν μέσο που περιέχει 10 μΜ DCFH-DA. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, μετρήθηκε η ένταση φθορισμού με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων μετρήσεων.

*** P & lt? 0,001 έναντι του CDDP επεξεργασμένο έλεγχο. Για RT-PCR, το συνολικό RNA και πρωτεΐνης υλικά λύσεως από τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα επίπεδα του mRNA συνθάσης GM3 σε ολικό RNA που λαμβάνεται από κάθε κυτταρική ανιχνεύθηκαν με RT-PCR.

Η

CDDP-επαγόμενη απόπτωση ενισχύεται σε HCT116 κύτταρα που υπερεκφράζουν GM3 συνθάσης

Για να εξεταστεί η ευαισθησία του CDDP απόπτωσης που διαμεσολαβείται μεταξύ κυττάρων HCT116 και κυττάρων HCT116 υπερεκφράζουν GM3 συνθάσης, δημιουργήσαμε σταθερές επιμολύνσεις που εκφράζουν GM3. Ο φορέας έκφρασης pcDNA3-GM3 που φέρει το ανθρώπινο GM3 cDNA συνθάσης (HCT116 /GM3) και pcDNA3 άδειο φορέα (ψευδο) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HCT116. Μετά την επιλογή των ανθεκτικών στο G418 αποικιών, επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση του GM3 mRNA συνθάσης και γαγγλιοσίδιο GM3 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε HCT116 κύτταρα /GM3 σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από RT-PCR και δοκιμασία ανοσοφθορισμού (Εικ. 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενζυμικά ενεργή συνθετάση GM3 συντίθεται σε κύτταρα HCT116 /GM3. Υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (10% FBS), ο ρυθμός αύξησης των HCT116 /κυττάρων GM3 δεν ήταν διαφορετική σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, και οι αλλαγές στα αποπτωτικά σήματα δεν παρατηρήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση κηλίδας Western (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, όταν αυτά τα προϊόντα επιμόλυνσης υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDDP με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, μεγαλύτεροι αριθμοί των κυττάρων διαχωριστεί από την πλάκα σε HCT116 /GM3 σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα κατεργασμένα με 30 μg /mL CDDP. Πράγματι, κύτταρα HCT116 /GM3 δείχθηκαν να είναι περισσότερο ευαίσθητα σε CDDP από mock κύτταρα σε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία ΧΤΤ (Εικ. 5Β). Επιπλέον, η αύξηση της βλάβης του DNA μετά από έκθεση CDDP παρατηρήθηκε σε HCT116 /GM3 κυττάρων σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας δοκιμασία κατάτμησης DNA (Σχ. 5C). Από αννεξίνη V χρωματίζει το γυρνάει έξω φωσφατιδυλοσερίνη στην εξωτερική πλευρά της μεμβράνης του πλάσματος, κτυπώντας έξω από το φωσφατιδυλοσερίνης από την εσωτερική πλευρά προς την εξωτερική πλευρά της μεμβράνης του πλάσματος είναι γνωστό ότι είναι ένα από τα χαρακτηριστικά των αποπτωτικών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, όπως φαίνεται στο Σχ. 5D, αννεξίνη V-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής ήταν επίσης σημαντικά αυξημένη σε CDDP επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα /GM3 σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα. Για τη διερεύνηση της μοριακός μηχανισμός βασίζεται η δράση ευαισθητοποίησης των GM3 σε CDDP επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, η κασπάση-μεσολάβηση PARP αποδόμηση από αναγωγή του μιτοχονδριακού δυναμικού εξετάστηκε μετά τη θεραπεία CDDP σε διάφορες συγκεντρώσεις (Εικ. 5Ε). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξαν ότι σε HCT116 κύτταρα /GM3 το επίπεδο διάσπασης του PARP ήταν αυξημένη σε σύγκριση με mock κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι GM3 ευαισθητοποιεί HCT116 κυττάρων σε CDDP απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ROS παίζει ένα κεντρικό ρόλο στην διεγειρόμενη από CDDP κύτταρα HCT116, που οδηγεί σε κυτταρική απόπτωση. Συγκρίναμε την παραγωγή ROS σε HCT116 κύτταρα /GM3 με εκείνη στο mock κύτταρα με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με τη χρήση H

2DCFDA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5F, ο CDDP επαγόμενη παραγωγή ROS ενισχύθηκε σε HCT116 /GM3 κυττάρων σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα, αλλά όχι σε NAC-προεπεξεργασία κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση των επιπέδων GM3 απαιτείται για την παραγωγή ROS σε CDDP επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HCT116. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η παραγωγή ROS εξαρτάται από τα επίπεδα GM3 σε CDDP που προκαλείται από κύτταρα HCT116.

(Α) RT-PCR και δοκιμασία ανοσοφθορισμού επιβεβαίωσε την έκφραση του GM3 συνθάσης και το προϊόν της GM3 σε ένα σταθερό μορφομετατροπέα του pcDNA- GM3 σε κύτταρα HCT116. Ως μάρτυρας, τον φορέα μόνο (ροϋΝΑ) επιμολυσμένα HCT116 δεν εξέφραζε GM3. Mock, τον φορέα (pcDNA3) HCT116 επιμολυσμένα κύτταρα /GM3, pcDNA3-GM3-επιμολυσμένα κύτταρα. βιωσιμότητας (Β) των κυττάρων εκτιμήθηκε 24 ώρες μετά την αγωγή CDDP στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΧΤΤ σε HCT116 /GM3 κυττάρων σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Γ) Μετά την επεξεργασία του CDDP στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 h, γενωμικό DNA αναλύθηκε σε μια γέλη αγαρόζης 2%. (D) πληθυσμούς αποπτωτικός κυτταρικός μετρήθηκαν με ανάλυση FACS Calibur απασχολούν Annexin V-χρώση όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα βέλη δείχνουν αποπτωτικών πληθυσμούς σε εικονικές και HCT116 /GM3 κύτταρα, αντίστοιχα. (Ε) HCT116 /GM3 ή ψευδο κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπέδειξε τις συγκεντρώσεις CDDP για 12 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων και το υπερκείμενο μέσα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Στ) Το αποτέλεσμα της θεραπείας CDDP μετρήθηκε σχετικά με την κατανομή του φθορισμού της οξείδωσης DCFH σε HCT116 /GM3 ή εικονικές κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ.