Αφηρημένο

καρκίνο του στόματος είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες Ταϊβάν. Ινδιρουβίνη-3′-μονοξίμη (I3M), ενός ισχυρού αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη, έχει θεραπευτικά αποτελέσματα σε άλλα καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, θα πραγματοποιηθεί

in vitro

δοκιμασίες για να ελεγχθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, μετανάστευση κυττάρων και εισβολή σε αυτόν τον τύπο καρκίνου. Επιπλέον, με τη χρήση από του στόματος ογκογόνα ζωικό μοντέλο, εξετάσαμε γονιδίου-στόχου και η έκφραση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνο qPCR, ανοσοαποτύπωση και ανοσοϊστοχημική χρώση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι I3M έχει μια αντι-πολλαπλασιαστική δράση και στα δύο του στόματος καρκινικές κυτταρικές σειρές Cal-27 και HSC-3 και ότι η επεξεργασία του Cal-27 και HSC 3-κυττάρων με I3M αποτελέσματα στην απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του κυτοχρώματος

γ

. Επιπλέον, I3M διακόπτει τον κυτταρικό κύκλο Cal-27 κυττάρων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο συλλαμβάνοντας κυττάρων στην G2 /M φάση. Βρήκαμε επίσης ότι I3M καταστέλλει τη μετανάστευση και εισβολή σε Cal-27 κύτταρα με αναστολή της έκφρασης κινάσης εστιακής προσκόλλησης, αναστολέας πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης, και μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας 9. Επιπλέον, προσδιορίσαμε survivin ως πρωτεΐνη-στόχο σε I3M επεξεργασμένα στόματος καρκινικά κύτταρα . Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού του στόματος του καρκίνου, αποδεικνύουμε ότι η τοπική εφαρμογή μιας κόλλας που αποτελείται από γέλη I3M και πολυ (βινυλική αλκοόλη) (I3M /PVA) έχει δοσοεξαρτώμενη αντι-ογκογόνα αποτελέσματα. Μετά την κατεργασία, η έκφραση της πρωτεΐνης survivin και το mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, τα επίπεδα στο πλάσμα survivin μειώθηκαν επίσης στα ποντίκια I3M φάρμακο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η τοπική εφαρμογή του I3M, ενός φαρμάκου που συντίθεται από ινδιρουβίνη, το οποίο βρίσκεται σε Qing-Dai – έχει θεραπευτικό δυναμικό για τη θεραπεία του καρκίνου του στόματος

Citation: Lo WY, Chang NW (2013) Μια ινδιρουβίνη παράγωγο. , ινδιρουβίνη-3′-μονοξίμη Καταστέλλει τον καρκίνο του στόματος Ογκογένεση μέσα από την ρύθμιση προς τα κάτω της Σουρβιβίνης. PLoS ONE 8 (8): e70198. doi: 10.1371 /journal.pone.0070198

Επιμέλεια: Α Ρ Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 του Μαΐου 2013? Αποδεκτές: 16, Ιουν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 του Αύγ 2013

Copyright: © 2013 Lo, Chang. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC96-2320-B-039-024, NSC 97-2320-B-039-016-my3), Το Τμήμα Ταϊβάν Υγείας, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου Cancer Hospital Research Center of Excellence ( DOH102-TD-C-111-005) και την Κίνα Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (DMR-96-043) για την υποστήριξη του έργου αυτού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στοματική ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OSCC) αντιπροσωπεύει περίπου το 90% της από του στόματος κακοηθειών. Περίπου 274.000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο, και παρά τις βελτιωμένες διαγνωστικές και θεραπευτικές μεθόδους, οι ασθενείς έχουν μόνο ένα ποσοστό επιβίωσης 50% πάνω από 5 χρόνια [1]. Το κάπνισμα, betel-quid μάσημα, χρήση αλκοόλ και καπνού χωρίς καύση προϊόντων αποτελούν τους σημαντικότερους παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο του στόματος. Τρέχουσα επιλογές θεραπείας για τον καρκίνο του στόματος περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία και, παρόλο που το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για τον καρκίνο του στόματος παραμένει ένα από τα χαμηλότερα μεταξύ των κοινών κακοήθη νεοπλάσματα [2]. καρκίνο του στόματος είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στην Ταϊβάν και η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών από την Ταϊβάν από το 2006 [3]. Επομένως, η ταυτοποίηση νέων παραγόντων και νέους στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου του στόματος απαιτούνται για τη βελτίωση της κλινικής διαχείρισης της ασθένειας αυτής.

Danggui Long Hui Wan είναι μια ένωση από την παραδοσιακή κινεζική ιατρική που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της χρόνιας μυελοκυτταρική λευχαιμία [4], και το δραστικό συστατικό εμφανίζεται να είναι Qing Dai (

Indigo Naturalis

), το οποίο περιέχει υψηλά επίπεδα χρωστικής indigo. Επιπλέον, το αντι-λευχαιμικής δράσης του συστατικού αυτού έχει αποδοθεί στην κόκκινου χρώματος λουλακί ισομερές ινδιρουβίνη. Ινδιρουβίνη και τα παράγωγά του αναστέλλουν ισχυρά την ανάπτυξη διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, κυρίως μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου (κατά G2 /M ή G1 φάση) ακολουθούμενη από απόπτωση [5], [6]. Έχει προσδιοριστεί ότι ινδιρουβίνη παράγωγα είναι ισχυροί αναστολείς της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσες (CDKs), την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β [7], c-Src κινάση και STAT3 σηματοδότησης [8], [9]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ινδιρουβίνη ίδια έχει χαμηλή διαλυτότητα, ένα χαμηλό ποσοστό απορρόφησης, και σημαντικές γαστρεντερικής τοξικότητας, συνθετικά ινδιρουβίνη-3′-μονοξίμη (I3M) έχει καλύτερες φαρμακολογικές ιδιότητες και μειωμένη τοξικότητα. Επιπλέον, σε σύγκριση με ινδιρουβίνη, I3M αναστέλλει πολλές κινάσες επιπλέον πρωτεΐνη, καθώς και σηματοδότηση STAT3, και έχει αποδειχθεί ότι έχουν αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα [10] – [12]. Πρόσφατα, ινδιρουβίνη-3′-οξίμης έχουν επίσης αναφερθεί επάγει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και ενεργοποιεί την αναστολή της ανάπτυξης και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος [13]. Ως εκ τούτου, I3M θεωρείται ένας από τους πιο ισχυρούς παράγωγα ινδιρουβίνη για τη θεραπεία του καρκίνου.

Survivin είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας της επιβίωσης των κυττάρων, και λειτουργεί τόσο με τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και την αναστολή της απόπτωσης [14]. Ως μέλος του αναστολέα της απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένεια πρωτεϊνών, survivin αρχικά χαρακτηρίστηκε ως αναστολέας φυσική κασπάσης, παρέχοντας μια κυτταροπροστατευτική βήμα προς τα κάτω του υποδοχέα θανάτου και της μιτοχονδριακής απόπτωσης [15]. Ωστόσο, είναι πλέον γνωστό ότι φυλοσύνδετη αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης (ΧΙΑΡ) είναι η μόνη αληθής αναστολέας φυσιολογικές κασπασών 3, 7, και 9 [16]. Παρά την έλλειψη δομικών μοτίβων που μεσολαβούν δέσμευσης κασπάσης, survivin μπορεί να αναστέλλουν δραστική κασπάση 9, μέσω της συνεργασίας με την πρωτεΐνη Χ-αλληλεπιδρώντας ιό της ηπατίτιδας Β [17]. Επιπλέον, η σύνδεση της survivin με ΧΙΑΡ οδηγεί σε μια συνεργική αναστολή της κασπάσης 9 ενεργοποίησης [18]. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η survivin υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και συνδέεται με κακή γενική πρόγνωση [19]. Πιο συγκεκριμένα, η survivin έκφραση συσχετίζεται με κακή πρόγνωση και χημειοαντίσταση στον καρκίνο του στόματος [20] – [22]. Επιπλέον, η αναστολή της survivin σε διαφορετικές καρκίνους κεφαλής και λαιμού αυξάνει σημαντικά τις αντι-ογκογόνο δραστηριότητες αρκετών κυτταροτοξικών και στοχευμένες θεραπείες [23].

Αξιοποιώντας τις προηγούμενες μελέτες, έχουμε ως στόχο να μελετήσει το ρόλο του survivin σε σχέση με την θεραπείας I3M στον καρκίνο του στόματος. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι I3M έχει πολλαπλές αντι-ογκογόνο δραστηριότητες και ότι μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή, ενώ την ίδια στιγμή την προώθηση της απόπτωσης, σε από του στόματος καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ανοσοκηλίδωση και ανάλυση σε πραγματικό χρόνο qPCR, βρήκαμε ότι survivin έκφρασης μειωτικά στην κυτταρική σειρά καρκίνου Cal-27 μετά την αγωγή I3M, προσδιορίζοντας survivin ως δυνητικός μεσολαβητής των αντι-ογκογόνο δραστηριότητες του I3M. Τέλος, διαπιστώσαμε ότι I3M αναστέλλει την έκφραση survivin και εμφανίζει αντι-ογκογόνο δράση σε προφορική μοντέλο ογκογένεση του ποντικιού. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι I3M καταστέλλει τον καρκίνο του στόματος ογκογένεση με μεσολάβηση της δραστηριότητας της survivin.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για την πειραματική ποντίκια αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου (έγκριση IACUC όχι. CMU-99-26-N). Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες (ένορκη βεβαίωση έγκρισης του πρωτοκόλλου ζώων Χρήσης, Νο 98-33-N) που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου (Taichung, Ταϊβάν).

Αντιδραστήρια και κυτταρική καλλιέργεια

ινδιρουβίνη, I3M, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), θειαζολύλιο μπλε βρωμιούχο τετραζόλιο (ΜΤΤ), μπλε τρυπάνης, triton Χ-100, και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη αγοράσθηκαν από τη Sigma Chemical ( St. Louis, MO, USA).

το ανθρώπινο καρκίνο του στόματος κυτταρική σειρά Cal-27 και η κυτταρική σειρά HSC-3 αγοράστηκαν από τη Συλλογή Bioresource και Ερευνητικό Κέντρο (BCRC), Βιομηχανίας Τροφίμων Έρευνας και του Ινστιτούτου Ανάπτυξης (FIRDI) (Hsinchu, Ταϊβάν). Τα κύτταρα τοποθετούνται σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Gibco) και DME /F-12 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 ng /mL στρεπτομυκίνη, και 1% γλουταμίνη στους 37 ° C [24 ], [25].

ΜΤΤ δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια ΜΤΤ δοκιμασία. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε μια συγκέντρωση 1000 κύτταρα /φρεάτιο. Έξι φρεάτια προσδιορίστηκαν για κάθε πειραματική θεραπεία. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 5, ή 10 μΜ ινδιρουβίνη ή I3M (διαλυμένο σε 0,1% DMSO) για 0, 24, ή 48 ώρες, 20 μL του αντιδραστηρίου ΜΤΤ (5 mg /mL? Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο , και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 ώρες. Η αντίδραση ήταν στοπ αφαιρώντας το αντιδραστήριο ΜΤΤ. DMSO (150 μL) προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν επίσης με απαρίθμηση των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο. Όλες οι μετρήσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Παρασκευή υποκυτταρικών κλασμάτων και ανοσοστύπωμα του κυτοχρώματος c

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 10 cm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μεταβλητό I3M δόση για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικού εκχυλίσματος (20 mM HEPES (ρΗ 7,5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, και 1 mM διθειοθρεϊτόλη) ότι περιέχουν 250 mM μίγμα αναστολέα σακχαρόζης και πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) και ομογενοποιείται. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν δύο φορές σε 1000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C για απομάκρυνση πυρήνων και μη σπασμένα κύτταρα. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα από τα 10.000 χ

g

γύρισμα αναφέρονται ως το «κυτοσολικό κλάσμα». Κυτοσολικό δειγμάτων πρωτεΐνης (30 g) διαχωρίστηκαν σε 12% γέλες SDS-PAGE και ανοσοσημασμένων με αντι-κυτοχρώματος

γ

(1:1000) και αντι-β-ακτίνης (1:1000) πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Η δεύτερη χρένο σημασμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα επωάστηκε με τα κηλίδες, που ακολουθείται από πλύσιμο. Χημειοφωταύγειας σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας υποστρώματα SuperSignal West Femto- χημειοφωταύγειας (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Το μιτοχονδριακό σφαιρίδια από την πρώτη 10000 ×

g

γύρισμα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό εκχύλισμα κυττάρων που περιέχουν 250 mM σακχαρόζης για την προστασία των μιτοχονδρίων κατά 20 κτυπήματα χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στις 750 χ

g

για 3 χ 10 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθούν οι ακαθαρσίες και οι πυρήνες. Το υπερκείμενο στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 15,000 χ

g

για 20 λεπτά? το σφαιρίδιο, το οποίο περιείχε «κλάσμα μιτοχονδρίων», λύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS? και 30 μg των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοστυπώματος όπως οι παραπάνω περιγραφές.

αννεξίνης V /PI χρώση

Cal-27 κύτταρα (10

5) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μια πλάκα 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με είτε DMSO ή 10 μΜ I3M για 24 ώρες. Το κιτ αννεξίνης V-FITC ανίχνευσης απόπτωσης (Strong Biotech Corporation, Ταϊβάν) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων. Εν συντομία, τα κύτταρα που συλλέχθηκαν πλύθηκαν με PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 200 χ

g

για 5 λεπτά. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε χρώση ρυθμιστικό και χρωματίστηκαν με ανεξίνη V-FITC και ΡΙ για 15 λεπτά στους 25 ° C σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα κυττάρων χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αυτά τα αντιδραστήρια θα μπορούσαν να διαιρεθούν σε τρεις πληθυσμοί: αποπτωτικά κύτταρα (σημειώνονται με πράσινο φθορισμό), τα νεκρά κύτταρα (που σημειώνονται με κόκκινο ή κίτρινο φθορισμό που προκύπτει από το συνδυασμό του κόκκινου και του πράσινου φθορισμού), και τα ζωντανά κύτταρα (δείχνει λίγο προς δεν φθορισμού). Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Tali ™ εικόνας Κυτταρόμετρο (Invitrogen). Η Tali ™ Εικόνα Cytometer συλλαμβάνει 20 εικόνες από ένα χρωματισμένο δείγμα, αναλύει αυτόματα τις εικόνες χρησιμοποιώντας ψηφιακή μέτρηση κυττάρων εικόνα με βάση και αλγόριθμοι φθορισμού ανίχνευσης, και εμφανίζει μια ακριβή ποσοτική ανάλυση των ζωντανών, νεκρών και αποπτωτικών κυτταρικών πληθυσμών. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Cal-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0, 2,5, 5, ή 10 μΜ I3M, και μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα με ψυχρή αιθανόλη 70% και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα Κύκλου ΡΙ που αποτελείται από 2 mg /100 mL PBS CAT ΡΙ, 1 × PBS, 10 mg /mL RNase Α, και 5% Triton Χ-100. Μετά την επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, ένα κυτταρόμετρο ροής FACScan χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει κύτταρα ενεργοποιημένων με φθορισμό. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν.

προσδιορισμός Μετανάστευση

Cal-27 κύτταρα (10

6 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια «τραυματίστηκαν» από το ξύσιμο ατομικά φρεάτια χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο DMEM (χωρίς FBS) είτε με είτε χωρίς ινδιρουβίνη και I3M (10 μΜ). Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (100 × μεγέθυνση). Η μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη μέτρηση του πλάτους των πληγών. Οι αποστάσεις μετανάστευση των κυττάρων που προέρχονται από τις διαφορές μεταξύ των πλατών των πληγών σε 0, 24, και 48 ώρες.

Transwell σύστημα καλλιέργειας για δοκιμασίες εισβολή

Οι επεμβατική ικανότητες του καρκίνου κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς I3M εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας την μεμβράνη σύστημα καλλιέργειας Transwell. Εν συντομία, χρησιμοποιήσαμε μεμβράνες Transwell (8-μm μέγεθος πόρων, διαμέτρου 6,5-mm? Corning Costar Corporation) επικαλυμμένα με Matrigel για τις δοκιμασίες. Κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν στα ανώτερα φρεάτια των προεπικαλυμμένες Transwells με I3M (0, 2,5, 5, ή 10 μΜ). Οι χαμηλότερες Transwells περιείχε το ίδιο μέσο. Μετά από 24 ή 48 ώρες επωάσεων, τα κύτταρα από τα ανώτερα φρεάτια και τα επικαλυμμένα με Matrigel μεμβράνες σκουπίστηκε με ένα Q-tip, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa 20% (Sigma). Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φωτός (200 × μεγέθυνση). Τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν

ανοσοαποτύπωσης

Μελέτες in vitro:.

Μετά από κάθε θεραπεία, τα κύτταρα απομονώθηκαν για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τα μεταναστευτικά και επεμβατικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων P21 (20 kDa) και Ρ53 (53 kDa) (Cell Signaling Technology), survivin (ανθρώπινο, 16 kDa), μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 9 (MMP-9, 92 kDa) (Thermo Scientific), κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ, 125 kDa ), υ-ΡΑ (34 kDa) και ρ-ρ38 (Santa Cruz Biotechnology). Τα δείγματα εκχυλίζονται από τα απομονωμένα κύτταρα (με ή χωρίς επεξεργασία I3M), διαχωρίστηκαν σε 12-15% γέλες SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Χημειοφωταύγειας σήματα ανιχνεύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω για το κυτόχρωμα

γ

. Τα σήματα συνελήφθησαν και ποσοτικά με τη χρήση του Bio Σύστημα Απεικόνισης ChemiGenius (Syngene)

Μελέτες in vivo:.

Δείγματα πλάσματος (40 μg πρωτεΐνης) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των επιπέδων της survivin που εκκρίνεται από το όγκων χρησιμοποιώντας ανοσοκηλιδώσεως και survivin (ποντίκι) μονοκλωνικό αντίσωμα όπως περιγράφεται παραπάνω. Χρησιμοποιήσαμε το SwellGel® Μπλε Αλβουμίνη Απομάκρυνση Kit (Pierce) για τον εμπλουτισμό των δειγμάτων πλάσματος.

βιο-φωσφορισμού αναλύσεις της aaspase-3.7 και -9

Ένα χρόνο-εξαρτώμενη μελέτη της κασπάσης-3 /7 και -9 δραστηριότητες διεξήχθη εις τριπλούν με χρήση κιτ δοκιμασίας κασπάσης-Glo 3/7 και 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) σε λευκό 96 φρεατίων μικροπλάκα. 10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σπάρθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ του I3M για 12, 24 και 48 ώρες. Στη συνέχεια, η δράση της κασπάσης διερευνήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 100 μL του αντιδραστηρίου κασπάσης-Glo και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Οι παρουσίες των ενεργών κασπασών από αποπτωτικά κύτταρα θα διασπάσει το συνθετικό τετραπεπτίδιο, επισημασμένα με aminoluciferin στο αντιδραστήριο. Η απελευθερωμένη aminoluciferin δρα ως υπόστρωμα για το ένζυμο λουσιφεράση, η οποία μετράται με τη χρήση Synergy ™ 2 multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Winooski, Vermont).

Παρασκευή ινδιρουβίνη-3′-οξίμης /πολυ (βινυλική αλκοόλη) (I3M /PVA) συγκολλητικό φάρμακο

PVA (10 g? Sigma) αιωρήθηκε σε θερμό απεσταγμένο νερό (100 mL, 90 ° C) και αναδεύεται μέχρι να διαλυθεί εντελώς. Αφού το πολυμερές εμφανίστηκε να διαλυθεί εντελώς, η θερμοκρασία και η ανάδευση διατηρήθηκε για άλλες 4 ώρες ώστε να εξασφαλισθεί ότι συσσωμάτωμα δεν ήταν πλέον παρών. Το διάλυμα ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, και I3M προστέθηκε για να ληφθεί 10 και 20 μΜ I3M /PVA μίγματα κόλλας φαρμάκου.

Ανάπτυξη της 4-νιτροκινολίνης 1-οξείδιο (4-NQO) που επάγεται από το στόμα ογκογόνο μοντέλο ποντικού

αξιολόγησε την αντι-ογκογόνο δράση του I3M χρησιμοποιώντας μια προφορική ογκογόνο μοντέλο σε έξι εβδομάδων αρσενικών ποντικών C57BL /6JNarl (σωματικό βάρος: 21,6 ± 1,2 g). Για να προκληθεί η βέλτιστη διαμόρφωση του στόματος κλώνοι ενός κυττάρου, μπορούμε included0.2 mg /mL 4-NQO και 0.5 mg /mL αρεκολίνη στο πόσιμο νερό των ζώων για 8 εβδομάδες, όπως μας προηγουμένως δημοσιευθεί [26]. Ποντίκια (n = 240) τυχαιοποιήθηκαν σε μία από τέσσερις ομάδες: τυφλή ομάδα (n = 60) έλαβε μόνο το πόσιμο νερό? ομάδα Carrier (n = 60), 10 μΜ I3M (n = 60) και 20 μΜ I3M (n = 60) ομάδες έλαβαν αμφότερα 4-NQO (200 μg /mL) και η αρεκολίνη (500 μg /mL) για να αναπτυχθεί η OSCC ζώο μοντέλα. Μετά την προηγούμενη μελέτη, το πόσιμο νερό τους άλλαξε κάθε εβδομάδα, και οι ποντικοί επιτρέπεται η πρόσβαση στο νερό ανά πάσα στιγμή κατά τη διάρκεια της θεραπείας αρεκολίνη /4-NQO, πριν από την έναρξη των θεραπειών I3M. Ακολουθώντας το πρωτόκολλο του όγκου επαγωγή, η οποία διήρκεσε για 8 εβδομάδες [24], οι γλωττίδες και στοματική περιοχές των ποντικών αλείφεται με PVA μόνο (ομάδα φορέα) είτε με είτε 10 ή 20 μΜ I3M /PVA κάθε 2 ημέρες για 20 εβδομάδες ( 0,1 mg /g σωματικού βάρους ποντικού), η οποία ξεκίνησε μετά week8 (Σχήμα S1, Εικόνα 1 και 2). Τοπικές θεραπείες κινήθηκαν σε οκτώ και ολοκληρώθηκαν εντός μιας ώρας. Τα ποντίκια που έλαβαν αγωγή είχαν απαγορευθεί από την πρόσβαση σε πόσιμο νερό και τρόφιμα μέχρι 12 π.μ. Όλα τα ποντίκια ζυγίστηκαν κάθε 4 εβδομάδες. Οι ποντικοί (η = 10) θυσιάστηκαν κάθε μήνα από κάθε ομάδα μετά την εβδομάδα 8? ακόλουθες CO

2 θεραπεία, ο μέσος όρος των 0,9-1,3 mL του καρδιακού αίματος συλλέχθηκαν από κάθε ποντικό, και τη γλώσσα τους αποκόπηκαν σύνολο (με όγκους), σταθερές, ενσωματωμένο, και τεμαχίστηκαν για χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης.

(Α) Τα ανασταλτικά αποτελέσματα του ινδιρουβίνη και I3M επί Cal-27 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HSC-3. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ή 48 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις ινδιρουβίνη ή I3M. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (επάνω) και μέτρηση των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο (κάτω). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τιμές S. D.? αστερίσκοι υποδηλώνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,05). (Β) Cal-27 κύτταρα (10

5) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ I3M για 24 ώρες, και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την αννεξίνη κιτ V-FITC ανίχνευσης απόπτωσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. τιμές (η = 3)? αστερίσκοι υποδηλώνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,05) μεταξύ της μεταχείρισης I3M και των ομάδων ελέγχου. (Γ) ανοσοστυπώματα εκχυλισμάτων πρωτεΐνης (30 μg) απομονώνεται από τα κυτοσολικά και τα μιτοχόνδρια κλάσματα Cal-27 κύτταρα κατεργασμένα με 0, 2,5, 5, ή 10 μΜ I3M για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά έξι ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

(Α) Cal-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με I3M (0, 2,5, 5, ή 10 μΜ) για 24 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα για κάθε δείγμα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται σε G0 /G1, S και G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου. (Γ) Τα ανοσοστυπώματα που δείχνει την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων σε I3M επεξεργασμένο Cal-27 κύτταρα. Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά από 24 ώρες αγωγή με I3M (0, 2,5, 5, ή 10 μΜ). Η έκφραση των ρ53 και ρ21 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση.

β-ακτίνης

χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε αυτή τη μελέτη. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

σε πραγματικό χρόνο αλύσου ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης (real time qPCR)

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας την RNeasy Mini Kit (QIAGEN) . Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το III First Strand Synthesis System SuperScript (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μηχανή LightCycler 480 και το SYBR Green Ι κύριο Kit (Roche Diagnostics) [27]. Οι αλληλουχίες εκκινητών που καταγράφονται στον Πίνακα S1.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Δείγματα ιστού μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (Merck) στους 4 ° C. Μετά από μία σύντομη πλύση με PBS, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε 30% σακχαρόζη σε 0,01 Μ PBS για κρυοπροστασία. Έχουμε προ-επωάζονται (2 ώρες, 25 ° C) 8-μm τμήματα με 10% ορό αλόγου και 0,3% Triton Χ-100 σε PBS για να αποτραπεί μη-ειδική σύνδεση. Οι τομές επωάστηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων πολυκλωνικών αντι-COX2 (1:200? Abcam), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-survivin (1:50, Novus Biologicals), και TUNEL (1:100? QIA33 Calbiochem, Merck) για 1 ώρα στους 37 ° C που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν (2 ώρες, 25 ° C) με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη (1:200? Vector), που ακολουθείται από επώαση με ένα σύμπλεγμα υπεροξειδάσης αβιδίνης-χράνου (ABC-Elite)

. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. αξίες. Του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τις διαφορές μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ομάδων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού SPSS 12.0.

P

-τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

I3M αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του στόματος και επάγει την απόπτωση

Indigo, ινδιρουβίνη, και I3M πρώτα δοκιμάστηκαν για δραστικότητα αναστολής της ανάπτυξης με τη χρήση των από του στόματος καρκινικές κυτταρικές σειρές Cal-27 και HSC-3, και η 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC 50

) τιμές για αυτές τις τρεις ουσίες προσδιορίστηκαν ακόλουθη φαρμακευτική αγωγή 24 ώρες (Πίνακας S2). I3M ήταν σαφώς πιο ενεργός σε σχέση με λουλακί ή ινδιρουβίνη στις δύο κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα διαφόρων συγκεντρώσεων ινδιρουβίνη και I3M επί HSC-3 και Cal-27 κύτταρα (Σχ. 1Α). Οι προσδιορισμοί ΜΤΤ έδειξαν ότι και οι δύο 5 και 10 μΜ ινδιρουβίνη δεν είχε προφανή αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί κυτταρικών γραμμών είτε μετά από 48 ώρες θεραπείας. Σε αντίθεση, 10 μΜ I3M προκάλεσε σημαντική αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί HSC-3 κύτταρα μετά από 48 ώρες, και οι δύο 5 και 10 μΜ I3M ασκείται αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί Cal-27 κύτταρα. Τα πρώιμα στάδια της απόπτωσης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας FITC-ανεξίνη V και αναλύονται με ένα Tali ™ εικόνας Κυτταρόμετρο. Σε Cal-27 κύτταρα, 38,5% των κυττάρων ήταν θετικά για αννεξίνη V μετά από 24 ώρες θεραπείας με I3M (10 μΜ) σε σύγκριση με μόνο 5% των κυττάρων στην ομάδα ελέγχου (Εικ. 1Β). Μετά τη θεραπεία I3M 24 ώρες, το δοσο-εξαρτώμενη αύξηση της ανοσοκηλιδώσεως ήταν εμφανής στα κυτοσολικά κλάσματα του κυτοχρώματος

γ

(Εικ. 1Β).

I3M επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε μεγάλο βαθμό κατά τη G2 /Μ φάση και αυξάνει την p53 και p21

έκφραση WAF1

για να προσδιορίσετε αν I3M προκαλεί Cal-27 κυττάρων σύλληψη κύκλου, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής για να αναλύσει τον τρόπο με αυξανόμενες συγκεντρώσεις I3M να επηρεάσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η θεραπεία με I3M πάνω από 24 ώρες αύξησε το ποσοστό των Cal-27 κυττάρων που παραμένουν σε G2 /M φάση σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκεκριμένα, το ποσοστό των κυττάρων G2 /M φάσης αυξήθηκε από 36,6% σε 53,9% σε απόκριση 10 μΜ I3M. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων G0 /G1 φάσης από 11,4% σε 21,4% (Σχ. 2Α). Είναι γνωστό ότι η ρ53 καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση πυροδότηση. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε ανοσοαποτύπωση για να προσδιοριστεί αν η θεραπεία I3M ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης της ρ53. Μετά την επεξεργασία 24 ωρών με διαφορετικές συγκεντρώσεις I3M, Cal-27 κύτταρα εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενες αυξήσεις στην έκφραση της ρ53, με ταυτόχρονη αυξήσεις στην ρ21

έκφρασης πρωτεΐνης WAF1, καθώς, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους I3M ασκεί αντι του -proliferative επιπτώσεις θα μπορούσε να διαμεσολαβείται από ρ53 (Εικ. 2Β).

I3M αναστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

Για να εξεταστεί αν I3M αναστέλλει Cal-27 κυττάρων εισβολής, πραγματοποιήσαμε μια πληγή δοκιμασία επούλωσης . Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, οι αποστάσεις μετανάστευση μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ I3M σύγκριση με τον έλεγχο και ινδιρουβίνη ομάδες. Στη συνέχεια, διεξάγεται μια Δοκιμασία Matrigel Transwell να προσδιοριστεί αν I3M επηρεάζει επίσης την κυτταρική διείσδυση. Βρήκαμε ότι η δόση των 10 μΜ I3M αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική διείσδυση, τόσο σε 24 και 48 ώρες. Παρατηρήσαμε επίσης παρόμοια αποτελέσματα σε χαμηλότερη δοσολογία I3M (5 μΜ) μετά από 48 ώρες της θεραπείας (Εικ. 3Β). Για τον εντοπισμό των συγκεκριμένων μορίων που επηρεάζονται από I3M, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ανοσοαποτύπωσης για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης αρκετών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετανάστευση. Τα επίπεδα των FAK, ΜΜΡ-9, και ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) μειώθηκαν σημαντικά μετά από θεραπεία I3M για 6 ώρες. Ωστόσο, I3M προκάλεσε μια επίμονη ενεργοποίηση φωσφόρου ρ38 (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του FAK, ΜΜΡ-9, και υΡΑ παίζουν ένα ρόλο στην αναστολή της εισβολής και της μετανάστευσης που παρατηρείται σε I3M επεξεργασμένο Cal-27 κύτταρα.

(Α) Η επώαση των κυττάρων εν τη απουσία ή παρουσία 10 μΜ ινδιρουβίνη ή I3M διεξήχθη για 0, 24, ή 48 ώρες. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (100 × μεγέθυνση). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το ποσοστό της αναστολής? αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.05) μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου. (Β) Κύτταρα (10

4) απλώθηκαν στον άνω θάλαμο με I3M (0, 2,5, 5, ή 10 μΜ) και αφέθηκαν να υποβληθούν σε μετανάστευση για 24 ή 48 ώρες. Ποσοτικοποίηση των κυττάρων στον κατώτερο θάλαμο διεξήχθη με μέτρηση των κυττάρων κάτω από 200 × μεγέθυνση. Το ποσοστό της αναστολής και της στήλης μέσες τιμές ελήφθησαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι αστερίσκοι δεικνύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0,05) μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου. (Γ) Τα ανοσοστυπώματα που δείχνει μεταβολές στα επίπεδα ρρ38, FAK, ΜΜΡ-9 και πρωτεΐνες υΡΑ συνδέονται με τη μετανάστευση και την εισβολή σε Cal-27 κύτταρα μετά από 10 μΜ θεραπεία I3M (n = 3).

Η

Ταυτοποίηση survivin ως στόχος της I3M

μια ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως καταδείξει τόσο χρόνου και δοσο-εξαρτώμενο προς τα κάτω ρύθμιση των survivin με I3M (Σχ. 4Α και 4Β). έκφραση Σουρβιβίνης μειώθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία με 10 μΜ I3M από 12 έως 48 ώρες. Σε πραγματικό χρόνο qPCR έδειξε επίσης προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων mRNA survivin σε I3M-επεξεργασμένα κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι I3M καταστέλλει έκφραση survivin στο μεταγραφικό επίπεδο (Σχ. 4C). Για να εξεταστεί η ρύθμιση προς τα κάτω της survivin με I3M έχει καμία επίδραση στην κασπάσης-3/7 και -9 δραστηριότητες. Μετρήσαμε την κασπάση-3/7 και -9 δραστηριότητες της αγωγής I3M 10 μΜ σε 12, 24 και 48 ώρες χρονικό σημείο. Το αποτέλεσμα δείχνει την πολύ σημαντική αύξηση της σε κασπάσης-3/7 και -9 δραστηριότητες ανιχνεύθηκαν μετά από 12 (94 φορές και 131 φορές), 24 (388 φορές και 282 φορές) και 48 ώρες (462 φορές και 314 φορές) της έκθεσης I3M . Έτσι, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι I3M καταστέλλει survivin σε Cal-27 κύτταρα όχι μόνο, επηρεάζει επίσης την εγγενή (μιτοχονδριακή-κασπάση-9) οδό.

(Α) μια επίδειξη του χρόνου που εξαρτώνται από survivin μειορύθμιση ακόλουθες 10- επεξεργασία μΜ I3M για διάφορες διάρκειες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τιμές S. D. (n = 3)? αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.05) μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου. (Β) Η δοσοεξαρτώμενη του προς τα κάτω ρύθμιση της survivin μετά από αγωγή I3M για 12 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τιμές S. D. (n = 3)? αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.05) μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου. (C) Cal-27 κύτταρα επωάστηκαν με I3M (10 μΜ) για 0, 6, 12, 24, ή 48 ώρες. Παρουσιάζονται οι σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης για κάθε δείγμα στην ομάδα θεραπείας (η = 6). Οι τολμηρές γραμμές δηλώνουν το μέσο σχετικό ποσοστό των επιμέρους ομάδων θεραπείας. T /C: κατεργασμένης ομάδα (6, 12, 24, ή 48 ώρες) /ομάδα ελέγχου (0 h). (Δ) μια επίδειξη του χρόνου που εξαρτώνται από κασπάσης-3/7 και -9 upregulations ακόλουθες 10 μΜ θεραπεία I3M για 12, 24, και 48 ώρες.

Η

I3M καταστέλλει 4-NQO /arecoline- που προκαλείται από τον καρκίνο του στόματος σε ποντίκια

καταναλώσεις νερού έχουν αναφερθεί σε εβδομαδιαία βάση σε κάθε ομάδα κατά τη διάρκεια της 28-εβδομάδων, η χρονική πορεία (4 εβδομάδες /χρονικό σημείο) φαίνεται στο Σχήμα S1. Οι καταναλώσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Ποντίκια που προσφέρονται νερό με 4-NQO (200 μg /mL) και η αρεκολίνη (500 μg /mL) κατανάλωσαν το λιγότερο ποσό του νερού πριν από την εβδομάδα 8 (φορέας, 10 μΜ, και ομάδες 20Μ) από την τυφλή ομάδα. Ωστόσο, η ελάχιστη ποσότητα νερού σε 20, 24 και 28 εβδομάδων είναι η ομάδα φορέα. Στις 8 εβδομάδες, το βάρος σώματος ήταν χαμηλότερη στην ομάδα ποντικών φορέα (Σχ. 5Α). Όταν 4-NQO και αρεκολίνη διοικήσεων διακόπηκαν και ποντικοί έλαβαν νερό βρύσης κατά την εβδομάδα 9, τόσο την πρόσληψη νερού και το σωματικό βάρος των ποντικών αυξήθηκε. Μέχρι την εβδομάδα 12, 16, 20 και 24, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο σωματικό βάρος μεταξύ των τεσσάρων ομάδων. Την εβδομάδα 28, το σωματικό βάρος ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα φορέα από ό, τι σε οποιαδήποτε άλλη ομάδα. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με φορέα μόνο εμφάνισαν μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση τόσο του αριθμού και του μεγέθους των όγκων γλώσσα τους. Εντυπωσιακά, τοπική θεραπεία που αποτελείται από 10 ή 20 μΜ I3M /PVA ζελέ αλειμμένο στις γλώσσες των ποντικών καταστέλλεται ογκογένεση, με υψηλότερες συγκεντρώσεις που δείχνει μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα (Εικ. 5Β).

(Α) Στα πειράματα ποντίκια, το σωματικό βάρος δεν έδειξαν τη σημαντική διαφορετική μεταξύ των τεσσάρων ομάδων μέχρι 8η εβδομάδα. Μετά τα πειράματα I3M, το σωματικό βάρος της ομάδας φορέα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι άλλων ομάδων κατά την 28η εβδομάδα (

σ

= 0,031, η = 10). (Β) τον καρκίνο του στόματος βλάβες προκλήθηκαν στις γλώσσες των ποντικών με 0.5 mg /mL αρεκολίνη και 0.2 mg /mL 4-NQO. Ο πίνακας δείχνει αριθμούς των όγκων και τα μεγέθη από τέσσερις ομάδες (10 ποντικοί /ομάδα /δειγματοληψίας).

Η

I3M μειώνει την έκφραση survivin και COX-2, ενώ η αύξηση του ποσοστού των TUNEL θετικών κυττάρων

in vivo

η

H & amp? χρώση Ε σε διαφορετικά χρονικά σημεία έδειξε ότι 4-NOQ /αρεκολίνη έκθεσης αυξημένο σχηματισμό SCC σε ποντίκια φορείς που έλαβαν. Σε αντίθεση, I3M μειωμένο σχηματισμό SCC μετά από 28 εβδομάδες σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξαν υψηλά επίπεδα τόσο COX-2 και survivin σε κλώνοι ενός κυττάρου σε ποντίκια φορείς κατεργασία στους 28 εβδομάδες. Αξιοσημείωτα, I3M προκάλεσε δοσοεξαρτώμενες μειώσεις σε survivin και έκφραση COX-2. Μια δοκιμασία TUNEL διεξήχθη για την εκτίμηση των επιπέδων της απόπτωσης που συμβαίνουν

in vivo

. [35].