Αφηρημένο

Προστατευόμενες και ειδική παράδοση των νουκλεϊκών οξέων σε κακοήθη κύτταρα παραμένει ιδιαίτερα επιθυμητή προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου. Εδώ παραθέτουμε στοιχεία σχετικά με τα φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά, μηχανισμός δράσης, και πιλοτική θεραπευτική αποτελεσματικότητα ενός tenfibgen (TBG) -shell τεχνολογία nanocapsule για όγκου-κατευθυνόμενη παράδοση του μονόκλωνου DNA /RNA χιμαιρικό ολιγομερή που στοχεύουν CK2αα να ξενομοσχεύματος όγκων σε ποντίκια . Η υπο-50 nm μεγέθους TBG nanocapsule (S50-TBG) είναι μια ελαφρώς αρνητικά φορτισμένη, ομοιόμορφη σωματιδίων 15 – 20 μέγεθος nm, που παρέχει προστασία στο φορτίο νουκλεϊκών οξέων. Το DNA /RNA χιμαιρικό ολιγομερές (RNAi-CK2) λειτουργίες για να μειώσετε τα επίπεδα έκφρασης CK2αα »μέσω τόσο siRNA και μηχανισμούς αντίθετης φοράς. Συστημική απελευθέρωση S50-TBG-RNAi-CK2 στοχεύει συγκεκριμένα κακοήθη κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου στα οστά, και σε χαμηλές δόσεις μειώνει το μέγεθος και τα σήματα που σχετίζονται με CK2 σε ορθοτοπική πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη. Συμπερασματικά, η τεχνολογία nanoencapsulation S50-TBG μαζί με το χιμαιρικό ολιγομερές στόχευση προσφορά CK2αα «σημαντική υπόσχεση για τη συστημική θεραπεία της κακοήθειας του προστάτη

Παράθεση:. Trembley JH, Unger GM, Korman VL, Αμπεντίν MJ, Nacusi LP, Vogel RI, et al. (2014) Tenfibgen ρίζας Nanoencapsulation Εκδίδει Bi-Λειτουργική Anti-CK2 RNAi Ολιγομερές σε βασικούς χώρους για καρκίνο του προστάτη Στόχευση Χρησιμοποιώντας ανθρώπινου ξενομοσχεύματος όγκων σε ποντίκια. PLoS ONE 9 (10): e109970. doi: 10.1371 /journal.pone.0109970

Επιμέλεια: Gnanasekar Munirathinam, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 του Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 2 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτωβρίου, 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και υποστήριξη αρχείων πληροφοριών του

Χρηματοδότηση:. Έρευνα επανεξέτασης Αξίας ταμεία (1IO1B001731) που χορηγείται από το Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων www.va.gov (ΚΑ). Επιχορήγηση για έρευνα CA150182 απονεμήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών www.nih.gov (ΚΑ). Ερευνητικές επιχορηγήσεις CA158730 και DK067436-05 απονεμήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου και το Εθνικό Ινστιτούτο Διαβήτη, Digestive Diseases and Kidney Diseases, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών www.nih.gov (BTK). Έρευνα χορηγεί HHS-N261-2008-00027 /N42CM-2008-00027C, CA99366, και CA119556 απονεμήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών www.nih.gov (GMU). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Αποποίηση ευθυνών: Οι απόψεις που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αυτές των συγγραφέων και δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα τη θέση ή την πολιτική του Τμήματος των Ηνωμένων Πολιτειών Υποθέσεων Βετεράνων ή την κυβέρνηση των Ηνωμένων Πολιτειών

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. GMU έχει ιδιοκτησιακό συμφέρον ( συμπεριλαμβανομένων των διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας) σε GeneSegues, Inc. Δεν πιθανές συγκρούσεις συμφερόντων αποκαλύφθηκαν από τους άλλους συγγραφείς. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

σε όλο το φάσμα της κακοήθους νόσου, αποτελεσματική θεραπεία για προχωρημένο και /ή μεταστατικό καρκίνο ερείπια ένα κρίσιμο γκολ στο προσπάθειες για τη μείωση της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με. θεραπεία του καρκίνου βασίζονται σε νουκλεϊκά οξέα εξακολουθεί να κατέχει σημαντική υπόσχεση για ειδική γονιδιακή, αποτελεσματικό, και χαμηλής τοξικότητας αγωγή νόσο η οποία έχει το πρόσθετο δυναμικό για την υπέρβαση θεραπευτικών αντίστασης που παρατηρείται συχνά σε επιθετική ασθένεια. Τόσο αντίθετης φοράς και θεραπευτικής siRNA που βασίζεται έχουν τεθεί σε κλινικές δοκιμές με πολύ μέτρια επιτυχία [1] – [4]. Ζωτικής σημασίας για την συστηματική χρήση των βραχέα γραμμικά νουκλεϊκά οξέα όπως κάποια θεραπευτική μονάδα περιλαμβάνει ότι στρέφονται ειδικά σε καρκινικά κύτταρα σε ένα προστατευόμενο τρόπο, αποτελεσματικά σταυρό κυτταρικές μεμβράνες και εμπλέκεται με το μηχανισμό του κυττάρου. Πολυάριθμες προσεγγίσεις που ενσωματώνουν αυτές τις έννοιες έχουν επιδείξει χρησιμότητα σε μοντέλα ποντικών, συμπεριλαμβανομένων, π.χ., PSMA στοχευμένες χίμαιρες απταμερούς-siRNA, Her2 στοχευμένες μονής αλυσίδας κατακερματισμένες αντίσωμα-πρωταμίνης πρωτεΐνη σύντηξης μεσολάβηση παράδοσης siRNA, και υποδοχέα τρανσφερίνης στοχευμένη κυκλοδεξτρίνης με βάση τη μεσολάβηση πολυμερές παράδοσης siRNA [1], [5], [6]. Η προσέγγισή μας για να παραδώσει αποτελεσματικά θεραπευτικά νουκλεϊκού οξέος σε όγκους χρησιμοποιεί ένα nanocapsule υπο-50 nm μέγεθος που περιλαμβάνει το tenfibgen συνδέτη (TBG), το καρβοξυ-τερματικό πεδίο ινωδογόνου σφαίρα της τενασκίνης-C. TBG σχηματίζει το κέλυφος συνδετήρα πρωτεΐνης του nanocapsule και επιτρέπει τη μεσολάβηση υποδοχέα στόχευση σε καρκινικά κύτταρα μέσω τενασκίνη υποδοχείς, οι οποίοι είναι αυξημένα σε αυτά τα κύτταρα [7] – [12]. Οι TBG νανοκάψουλες λαμβάνονται ειδικά από τα κύτταρα του όγκου και μικροαγγεία που προέρχονται από όγκους, αλλά όχι από φυσιολογικά κύτταρα ή σκαφών [13] – [15].

CK2 (πρώην κινάσης καζεΐνης II ή CKII) είναι μια πανταχού παρούσα πρωτεΐνη Ser /Thr κινάσης με μια ετεροτετραμερείς δομή που αποτελείται από δύο καταλυτικές υπομονάδες (42 α kDa και /ή 38 kDa α ‘) και δύο ρυθμιστικών υπομονάδων (28 kDa β) σε α

2β

2, αα’β

2 ή α ‘

2β

2 διαμορφώσεις. CK2 φωσφορυλιώνει ένας μεγάλος αριθμός υποστρωμάτων με διάφορες λειτουργίες που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, είναι ουσιαστικά δραστική, και είναι απαραίτητη για την επιβίωση [16] – [22]. Επιπλέον, CK2 έχει βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε όλους τους καρκίνους που εξετάστηκαν, όπου μία από τις λειτουργίες του είναι να καταστείλει την απόπτωση [18], [23] – [29]. Έχουμε αναπτύξει προηγουμένως την αποτελεσματικότητα της 20-mer αλληλουχία νουκλεϊκών οξέων μας για τη στόχευση τόσο CK2α και CK2α ». Έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή την αλληλουχία ως ένα ολιγονουκλεοτίδιο αντίθετης φοράς που παραδίδονται συστηματικά σε ποντίκια που φέρουν ορθοτοπική όγκους PCa, ως φορτίο siRNA για S50-TBG νανοκάψουλες παραδίδονται σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (PCA), και ως ένα μονόκλωνο RNAi-CK2 φορτίου για S50-TBG νανοκάψουλες παραδίδονται συστημικά σε ποντίκια που φέρουν κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) ξενομοσχεύματα [15], [30] – [32]. Εδώ έχουμε επεκτείνει τη χρησιμότητα του μηχανισμού και τη θεραπεία τόσο της nanocapsule S50-TBG και το ολιγομερές RNAi-CK2 χρησιμοποιώντας μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη που ξεκίνησε σε ποντίκια σε θεραπευτικώς σχετικές ιστοσελίδες. Παρουσιάζουμε δεδομένα που χαρακτηρίζουν την nanocapsule S50-TBG και συστηματική χορήγηση της ως απόδειξη της έννοιας για την ικανότητα να στοχεύουν σημαντικό

in vivo

PCa θέσεις ανάπτυξης του όγκου, καθώς και την αποτελεσματικότητα της χρήσης μεσολάβηση RNAi προς τα κάτω ρύθμιση των CK2 ως μια θεραπευτική προσέγγιση.

Αποτελέσματα

Tenfibgen σχεδιασμό nanocapsule και τη σταθερότητα

Για να επιτύχει το στόχο της μείωσης της έκφρασης CK2 μας ειδικά σε κακοήθη κύτταρα του προστάτη, ένα μονόκλωνο DNA /RNA χιμαιρικό μόριο (RNAi-CK2) στοχεύουν μεταγραφές υπομονάδα του CK2αα »συμπυκνώνεται και έγκλειστα μέσα σε ένα κέλυφος πρωτεΐνης που αποτελείται από TBG. TBG νανοκάψουλες είναι συνήθως 15-20 nm σε μέγεθος, και εισάγετε τα καρκινικά κύτταρα μέσω των υποδοχέων τενασκινικό χρησιμοποιώντας την λιπιδική σχεδία μεσολάβηση caveolar οδού [13], [15]. Τα χαρακτηριστικά και τη μορφολογία του TBG-RNAi-CK2 νανοκάψουλες, καθώς και η δομή και αλληλουχία του RNAi-CK2 συνοψίζονται στον Πίνακα 1 και στο Σχήμα 1a, b. ανάλυση Σταθερότητα των γυμνών RNAi-CK2 χιμαιρικό ολιγομερές και νανοκάψουλες S50-TBG-RNAi-CK2 (Εικ. 1c) αποδεικνύει ότι μετά πέψη πρωτεϊνάσης Κ γυμνών ολιγομερούς RNAi-CK2 (αριστερός πίνακας) ή S50-TBG-RNAi-CK2 νανοκάψουλες (δεξιά panel), το φορτίο ολιγομερές παραμένει άθικτο. Επιπλέον, η θεραπεία των νανοκαψουλών με DNase πριν από την πέψη πρωτεϊνάσης Κ δείχνει ότι το φορτίο νουκλεϊκών οξέων προστατεύεται πλήρως από τη διαδικασία ενθυλάκωσης (Εικ. 1c, δεξιά πλευρά).

(α) Cartoon απεικόνιση του σχεδιασμού nanocapsule. (Β) ηλεκτρονική μικρογραφία μετάδοσης της S50-TBG-RNAi-CK2 νανοκάψουλες για

in vivo

μελέτες. Μεγέθυνση 230.000 φορές. Κλίμακα bar 100 nm. (Γ) Αριστερό πλαίσιο: Γυμνή RNAi-CK2 ολιγομερές υποβλήθηκε σε πέψη με πρωτεϊνάση Κ για 24 έως 96 ώρες. INP, αχώνευτος ολιγομερών εισόδου. Δεξιό πλαίσιο: γυμνός και S50-TBG έγκλειστα RNAi-CK2 ολιγομερή υποβλήθηκαν σε πέψη με DNase που ακολουθείται από την πρωτεϊνάση Κ όπως αναφέρεται παραπάνω πίνακα. Οι διαδρομές 1 & amp? 2, γυμνό RNAi-CK2? 3 & amp? 4, γυμνό RNAi-CK2 με νανοκάψουλες TBG-ζάχαρη που περιλαμβάνονται στην πέψη? 5-7,

in vitro

χρήση διατύπωση S50-TBG-RNAi-CK2? 8-10,

in vivo

χρήση διατύπωση S50-TBG-RNAi-CK2

Η

Οι πιθανοί μηχανισμοί δράσης για την /RNA χιμαιρικό ολιγομερές RNAi-CK2 DNA

Το μονόκλωνο DNA /RNA ολιγομερή φορτίου RNAi-CK2 θα μπορούσε να λειτουργήσει για να μειώσετε την έκφραση CK2 μέσω antisense- και /ή siRNA που βασίζονται σε μηχανισμούς. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, πρέπει πρώτα διερευνήθηκε αν RNAi-CK2 σχεδιασμό ολιγομερές μας που αποτελείται από 14 υπολείμματα πρότυπο φωσφοδιεστέρα DNA στο 5 ‘άκρο, 6 2’

O

μεθυλ κατάλοιπα RNA στο άκρο 3 ‘, και ένα τερματικό πρόπυλο συνδετήρα (επισημαίνονται RNAi-CK2-6R στο Σχ. 2α) θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως κίνητρο για δράση RNase Η1. Για σύγκριση, έχουμε περιλάβει την ίδια αλληλουχία που αποτελείται εξ ολοκλήρου από φωσφοροθειοϊκού (PS) τροποποιημένα υπολείμματα DNA (AS-CK2-PS), καθώς και ένα σχέδιο ολιγομερές με 8 πρότυπο υπολείμματα DNA στο 5 ‘άκρο, 12 2’

O

μεθυλο υπολείμματα RNA στο 3 ‘άκρο, και ένα τερματικό συνδετήρα πρόπυλο (RNAi-CK2-12R). Τα δεδομένα στο Σχήμα 2a δείχνουν ότι το ολιγομερές RNAi-CK2 με 14 υπολείμματα DNA (RNAi-CK2-6R) χρησιμεύει σαν ένα αποτελεσματικό ερέθισμα για δραστικότητα ριβονουκλεάσης Η1. Σε όλο το υπόλοιπο του χειρογράφου, RNAi-CK2-6R αναφέρεται ως RNAi-CK2 και είναι το θεραπευτικό φάρμακο ενθυλακωμένο στις νανοκάψουλες TBG.

(α) δοκιμή RNase Η1 υποστρώματος διαφορετικών μορφών σύνθεσης DNA /RNA της RNAi-CK2 ολιγομερή. 5 ‘άκρο-σημασμένο (*) ανιχνευτής RNA ανοπτήθηκε με RNAi-CK2-6R, RNAi-CK2-12R ή AS-CK2-PS συμπληρωματικά ολιγομερή, στη συνέχεια επωάστηκαν για διάφορες χρονικές περιόδους με RNase Η1. Τα γράμματα στην αριστερή πλευρά του πήγματος και ένθετο αντιπροσωπεύουν τις σκάλες αλληλουχία για τον τελικό σημασμένο υπόστρωμα RNA 5 ‘. Οι διαστασιολόγηση σκάλες υποδεικνύονται ως AL (αλκαλική λύση), C (μείον RNase Τ1), και Τ1 (RNase διάσπαση Τ1). RNase Η1 φορές πέψης είναι 0, 30, 60 και 120 s (διαδρομές 1-4, αντίστοιχα). Η ταυτότητα του ολιγομερούς δοκιμής υποδεικνύεται πάνω από τις διαδρομές. Το ένθετο δείχνει μια ελαφρύτερη έκθεση των προϊόντων αντίδρασης RNAi-CK2-12R RNase H1. Τα ολιγομερή συμπληρώνονται με τον σημασμένο ανιχνευτή RNA δείχνεται με βέλη δείχνουν σημαντικές θέσεις διάσπασης. Για τις σειρές ολιγομερών RNAi-CK2-6R και RNAi-CK2-12R, πεζά δηλώνει 2 ‘

O

μεθυλο υπολείμματα RNA και κεφαλαία γράμματα είναι συμβατικά φωσφοδιεστέρα συνδέονται υπολείμματα DNA. Το AS-CK2-PS είναι ένα φωσφοροθειικά συνδεδεμένα ολιγομερές DNA. (Β) Ανίχνευση των προϊόντων διάσπασης ago2 /RISC που παράγεται από RNAi-CK2 επιμόλυνση σε κύτταρα PC3-LN4. 5 ‘RACE RNA λιγάση μεσολάβηση έγινε για την CK2α και CK2α »μεταγραφές όπως περιγράφεται στο online μεθόδους. Οι διαδρομές 1 & amp? 5, siControl επιμολυσμένα κύτταρα? 2 & amp? 6, siCK2 επιμολυσμένα κύτταρα? 3 & amp? 7, RNAi-CK2 επιμολυσμένα κύτταρα? 4 & amp? 8, υπάρχουν έλεγχοι cDNA νερό? Μ, δείκτες μεγέθους DNA. Οι προβλεπόμενες προϊόντα RACE (CK2α, 242 bp? CK2α ‘, 236 bp) υποδεικνύονται στα αριστερά, και είναι το γονίδιο ειδικοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν υποδεικνύονται πάνω από τις διαδρομές. (Γ) Χαρτογράφηση της θέσης διάσπασης RACE ελήφθη με αλληλούχιση των προϊόντων που ελήφθη στο (β). Η αλληλουχία mRNA δείχνεται με πεζά, ο επιμολυσμένα ολιγομερές απεικονίζεται κάτω από το mRNA, και οι θέσεις διάσπασης υποδεικνύεται με ένα βέλος.

Η

Για να εξεταστεί η συμμετοχή των μηχανισμών siRNA που βασίζεται, RNA καθαρισμένο από TBG-RNAi -CK2 επιμολυσμένα PC3-LN4 [33] κύτταρα αναπτύσσονται επί τενασκίνης-C /ινωδονεκτίνης (TnFn) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη λιγάση μεσολάβηση τεχνική RACE 5 ‘RNA να χαρτογραφήσουν οποιεσδήποτε πιθανές θέσεις διάσπασης που προκύπτουν από ago2 /με RISC επεξεργασία του DNA /ΚΝΑ χιμαιρικός ολιγομερούς. Καθαρισμένα RNA από κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA να CK2 (ίδιο στόχο αλληλουχία ως RNAi-CK2) ή ένα μη-στόχευσης ακολουθία ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν ως περαιτέρω ελέγχους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2b, τα προϊόντα διάσπασης του CK2α και μεταγραφές α ‘ανιχνεύθηκαν σε δύο RNAi-CK2 και siCK2 επιμολυσμένων κυττάρων. Χαρτογράφηση των θέσεων διάσπασης με αλληλούχιση των προϊόντων RACE επιβεβαίωσε τη θέση διάσπασης στις δύο μεταγραφές στην προβλεπόμενη 10

ου νουκλεοτιδίου από το 5 ‘άκρο του ολιγομερούς [34] (Σχ. 2c). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η RNAi-CK2 μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω CK2α και CK2α »μεταγραφές από RNase H και ago2 μηχανισμούς.

Επιπτώσεις της TBG-RNAi-CK2 σε κακοήθεις και καλοήθεις καλλιεργημένα κύτταρα

έχουμε παρατηρήσει επανειλημμένα ότι S50-TBG νανοκάψουλες να παραδώσει το φορτίο τους στην περιπυρηνική περιοχή που προηγείται της πυρηνικής εισόδου, ανεξάρτητα από τον τύπο των καρκινικών κυττάρων. Για τα είδη που δεν νουκλεϊκών οξέων, όπως είναι οι παράγοντες αντίθεσης, το φορτίο είναι συνήθως εξάγεται από τους πυρήνες να κυτταρόπλασμα, όπου συσσωρεύεται σε κυτταροπλασματικά οργανίδια και στη συνέχεια εξάγονται. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό της διακίνησης και την απελευθέρωση του φορτίου του S50-TBG νανοκάψουλες, τα κακοήθη κύτταρα PC3-LN4 καλλιεργήθηκαν επί TnFn επικαλυμμένα 3-διαστάσεων ικριωμάτων νανοΐνες (TnFn-3D) για να διευκολύνει το σχηματισμό των λιπιδικών σχεδιών αναγκαίες για μελέτες nanocapsule S50-TBG [15] . Σχήμα 3α απεικονίζει μεταφορά στον πυρήνα, απελευθέρωση του φορτίου, και την εξαγωγή του FeO-δεξτράνης επί μία περίοδο από 24 ώρες χρόνο μετά την αγωγή των κυττάρων με νανοκάψουλες S50-TBG-FeO-δεξτράνης. Σε μια παρόμοια μελέτη, μία σύγκριση του S50-TBG-FeO-δεξτράνης πρόσληψη 8 ώρες μετά την προσθήκη των νανοκαψουλών σε κύτταρα διεξήχθη σε PC3-LN4 και καλοήθη υπερπλασία του προστάτη κύτταρα (ΒΡΗ-1). Τα αποτελέσματα δείχνουν μανιώδεις πρόσληψη των νανοκαψουλών TBG-FeO από κακοήθη αλλά δεν είναι καλοήθη κύτταρα (Σχ. 3β).

(α) Η πρόσληψη πάνω από 24 ώρες της S50-TBG νανοκάψουλες με FeO-δεξτράνη φορτίου σε PC3-LN4 κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε TnFn-3D. Τα κύτταρα βάφτηκαν με DAB-ενισχυμένη κυανό της Πρωσίας για το σίδηρο και αντίθετα με Fast Red. μπαρ κλίμακα 100 μm. (Β) Κακόηθες κυττάρου-ειδική πρόσληψη S50-TBG νανοκάψουλες. πρόσληψη S50-TBG-FeO-δεξτράνη προσδιορίστηκε με χρώση σιδήρου σε 8 ώρες σε PC3-LN4 και ΒΡΗ-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε TnFn- ή λαμινίνη επικαλυμμένα ικριώματα νανοΐνες, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακα 100 μm. (Γ) επιδράσεις κυτταρικός πολλαπλασιασμός του S50-TBG-RNAi-CK2 θεραπεία σε καλοήθη και κακοήθη κύτταρα του προστάτη. PC3-LN4 και C4-2 καλλιεργούνται σε TnFn-3D και ΒΡΗ-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε λαμινίνη-3D σε πλάκες 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με S50-TBG-RNAi-CK2 ή ελέγχουν νανοκάψουλες TBG περιέχουν RNAi-RFP-6R στόχευση ερυθρός φθορισμός πρωτεΐνη όπως υποδεικνύεται.

3Η-θυμιδίνης προστέθηκε μετά από 48 ώρες, και τα κύτταρα αναλύθηκαν σε 72 ώρες μετά την προσθήκη-nanocapsule. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε σχέση με τη θεραπεία με νανοκάψουλες S50-TBG-σακχάρου. Οι nanocapsule φορτίου και κυτταρικών σειρών S50-TBG χρησιμοποιείται αναφέρεται κάτω από τις μπάρες. Μέσα ± SE παρουσιάζονται (η = 3 για όλα). * P & lt? 0.005 σε σχέση με το S50-TBG-ζάχαρη και -RFP? # P & lt? 0,01 σε σχέση με την TBG-ζάχαρη? $ P = 0,006 σε σχέση με την TBG-RFP. θεραπείας (δ) S50-TBG-RNAi-CK2 μειωμένα επίπεδα έκφρασης σταθερής κατάστασης του mRNA CK2α και CK2α »στα κύτταρα PC3-LN4. mRNA που απομονώθηκε από κύτταρα PC3-LN4 καλλιεργούνται σε TnFn 24 και 48 ώρες μετά την S50-TBG-RNAi-CK2 ή-ζάχαρη αγωγή όπως υποδεικνύεται αναλύθηκε με αντίστροφης μεταγραφάσης σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR για έκφραση CK2α και CK2α ». HPRT μεταγραφής χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα επίπεδα έκφρασης. Μέσα, SE και p-τιμές που παρουσιάζονται (24 ώρες CK2α n = 5, CK2α ‘n = 6? 48 ώρες CK2α n = 2, CK2α’ n = 2).

Η

Εμείς εξέτασε τις επιδράσεις του S50-TBG-RNAi-CK2 επί του πολλαπλασιασμού των καλλιεργημένων κυττάρων του προστάτη με τη χρήση των άκρως ογκογονικών γραμμές PC3-LN4 και C4-2 κυττάρων σε σύγκριση με ΒΡΗ-1. Θεραπεία των PC3-LN4 και C4-2 κύτταρα καλλιεργούνται σε TnFn-3D με S50-TBG-RNAi-CK2 για 3 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετράται από [

3Η] -θυμιδίνης, ενώ TBG-RNAi -CK2 θεραπεία της ΒΡΗ-1 κύτταρα αναπτύσσονται σε μία μήτρα λαμινίνης δεν μείωσαν τον πολλαπλασιασμό τους (Σχ. 3c). Χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης PCR πραγματικού χρόνου, CK2α και τα επίπεδα mRNA CK2α ‘βρέθηκαν μειώθηκαν σημαντικά σε TnFn καλλιεργημένα κύτταρα PC3-LN4 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή με S50-TBG-RNAi-CK2 (Εικ. 3δ), και η μείωση ήταν ισοδύναμη με αυτή που παρατηρείται μετά από αγωγή με TBG-siCK2 [31].

Βιοκατανομή TBG νανοκαψουλών

για να αποδειχθεί ότι S50-TBG νανοκάψουλες δεσμεύουν κακοήθη και μη φυσιολογικά κύτταρα των ιστών, και ότι δεν συσσωρεύονται μη ειδικώς στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα, κατεψυγμένα τμήματα των PC3-LN4 όγκου ορθοτοπική ξενομόσχευμα, καθώς και μη-καρκινική ήπατος φέρει ποντικού, νεφρό και σπλήνα υποβλήθηκαν σε nanocapsule αναλύσεις δέσμευσης. Σε αυτές τις δοκιμασίες, τομές ιστών επωάστηκαν με νανοκάψουλες S50-TBG-RNAi-CK2 περιέχουν συριακού χάμστερ IgG περιλαμβάνονται στο κέλυφος πρωτείνης. Μετά τα βήματα έκπλυσης, τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για έμμεσο ανοσοανίχνευση του χάμστερ IgG. Τα δεδομένα στο σχήμα 4α και το Σχήμα S1 αποδεικνύουν τη σύνδεση του S50-TBG-RNAi-CK2 νανοκάψουλες στον ιστό του όγκου, αλλά όχι σε ήπαρ, τους νεφρούς ή τον σπλήνα. Περαιτέρω απόδειξη της εξειδίκευσης nanocapsule ιστού που επάγεται με συνδέτη παρουσιάζεται στην Εικόνα 4b και το σχήμα S2 στην οποία ασιαλοοροσοβλεννοειδές (ASOR) νανοκάψουλες με συριακού χάμστερ IgG περιλαμβάνονται στο κέλυφος χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει προσδιορισμούς δέσμευσης nanocapsule. ASOR είναι το πρόσδεμα για τον υποδοχέα που εκφράζεται ασιαλογλυκοπρωτέΐνης σε ηπατοκύτταρα και τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η nanocapsule ASOR δεσμεύεται ειδικά στο συκώτι και όχι ιστό του όγκου.

(α) Δέσμευση S50-TBG-RNAi-CK2 να όγκου αλλά δεν ήπαρ, σπλήνα και νεφρά. Τομές ιστού υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοφθορισμού για συριακού χάμστερ IgG μετά από επώαση με S50-TBG-RNAi-CK2. μπαρ κλίμακα 100 μm. (Β) Η σύνδεση του ASOR-DyDOTA στο συκώτι, αλλά όχι του όγκου, σπλήνα και νεφρά. Οι ιστοί υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοφθορισμού για συριακού χάμστερ IgG μετά από επώαση με ASOR-DyDOTA. μπαρ κλίμακα 100 μm. (Γ) Ανάλυση του οστού κνήμης για την παρουσία του όγκου και προσλήψεως του TBG-DyDOTA nanocapsule 24 ώρες έπειτα από ί.ρ. ένεση. Άνω πάνελ, όγκος που περιέχουν κνήμη: Η &? Ε λεκές, Β = οστών, GP = πλάκα ανάπτυξης, M-S = μυελό κόλπων, Τ = όγκος? ανίχνευση ανοσοφθορισμού της Συρίας χάμστερ IgG (πράσινο)? άμεση ανίχνευση των Dy (κόκκινο)? τη συγχώνευση του πράσινου και του κόκκινου. πάνελ κέντρο, όγκου που περιέχει κνήμη: ανίχνευση ανοσοφθορισμού ελέγχου ισοτύπου για Ck8 (πράσινο)? ανίχνευση ανοσοφθορισμού της Ck8 (πράσινο)? άμεση ανίχνευση των Dy (κόκκινο)? τη συγχώνευση του πράσινου και του κόκκινου. Κάτω πάνελ, μακέτα ένεση κνήμη: ανίχνευση ανοσοφθορισμού ελέγχου ισοτύπου για Ck8 (πράσινο)? ανίχνευση ανοσοφθορισμού της Ck8 (πράσινο)? άμεση ανίχνευση των Dy (κόκκινο)? τη συγχώνευση του πράσινου και του κόκκινου. DNA επίχρωση εμφανίζεται με μπλε χρώμα. Ράβδοι κλίμακας 100 μm. (Δ) Ανάλυση ήπαρ, σπλήνα και το αίμα για φλεγμονώδη απόκριση. Ανοσο-ικανά ποντίκια ενέθηκαν ενδοφλεβίως με 10 mg /kg του S50-TBG-RNAi-CK2 ή S50-TBG-ζάχαρη ή με ίσο όγκο οχήματος και οι ιστοί συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες. Ήπαρ, σπλήνα και θύμος μάζα παρουσιάζονται σε σχέση με το βάρος σώματος ποντικού (αριστερός άξονας). Η ιντερφερόνη-γ μετρήθηκε στον ορό του αίματος (δεξιός άξονας).

Η

Για να παράσχει επικύρωση για S50-TBG nanocapsule παλιννόστησης σε κακοήθη κύτταρα μέσα σε ποντίκια, ξεκινήσαμε ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη στα οστά με απευθείας έγχυση της PC3- LN4 κύτταρα στην κνήμη. Το ετερόπλευρο κνήμης σε κάθε ποντικού εγχύθηκαν ψεύτικα. Μόλις η ανάπτυξη του όγκου ήταν εμφανής, τα ποντίκια ενέθηκαν με νανοκάψουλες S50-TBG περιέχουν δυσπρόσιο-DOTA-δεξτράνης ως φορτίο (S50-TBG-DyDOTA) και συλλέγεται μετά από 24 ώρες για επεξεργασία. παρουσία όγκων στα οστά επιβεβαιώθηκε με Η &? E λεκέ. Ο εντοπισμός της S50-TBG-DyDOTA νανοκάψουλες σε καρκινικά κύτταρα επαληθεύθηκε με άμεση απεικόνιση των Dy, ένα φθορίζον στοιχείο λανθανιδών, και την έμμεση ανίχνευση της Συρίας χάμστερ IgG. Αντισώματα προς Ck8 χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επιθηλιακών κυττάρων του όγκου. Τα δεδομένα στο Σχήμα 4c απεικονίζουν την παρουσία του σήματος Dy, που αντιπροσωπεύει το φορτίο νανοκάψουλας, σε καρκινικά κύτταρα τα οποία ειδικώς συνεντοπίζεται με είτε συριακού χάμστερ IgG περιλαμβάνονται στο κέλυφος nanocapsule (Σχ. 4c, άνω σειρά) ή με Ck8 που αντιπροσωπεύουν το ανθρώπινο προστάτη καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4c, κέντρο σειρά). Minimal σήματα Dy και Ck8 ανιχνεύθηκαν σε οστό ψευδο-εγχυθεί μη-όγκου από τους ίδιους ποντικούς (Σχ. 4c, κάτω σειρά), η οποία μπορεί να οφείλεται σε μετανάστευση των κυττάρων από τον όγκο ξενομοσχεύματος στην αντίπλευρη κνήμες.

S50-TBG nanocapsule-παραδοθεί νουκλεϊκά οξέα να μην προκληθεί πρώιμη φλεγμονώδη αντίδραση

Επειδή η ιντερφερόνη ή στις αρχές του φλεγμονώδη αντίδραση είναι ένα σοβαρό θέμα για τη διοίκηση των αιωρημάτων σωματιδίων που περιέχουν νουκλεϊκά οξέα, μετρήθηκε η συγκέντρωση της ιντερφερόνης-γ στον ορό και οι αναλογίες βάρους ιστού για σπλήνα, το ήπαρ, και θύμο σε μία ομάδα από μη-όγκου που φέρει, ανοσοϊκανά ετερόμικτα ποντίκια. Αυτές οι ιστοί θεωρούνται πρωτογενείς θέσεις αποστράγγιση για ενδοφλέβια σκευάσματα [35]. Τα αποτελέσματα έδειξαν κανένα αξιοσημείωτες διαφορές στη σπλήνα, το ήπαρ, ή θύμου βάρη για τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με τις νανοκάψουλες S50-TBG περιέχουν RNAi-CK2 ή τρεαλόζη σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος (Σχ. 4d). Βρήκαμε επίσης καμία ένδειξη ανύψωσης ιντερφερόνης-γ, η οποία τυπικά παρατηρείται σε μεσολάβηση σωματιδίων νωρίς φλεγμονώδεις αποκρίσεις (Εικ. 4d) [36].

απόδειξη της έννοιας για θεραπευτική αποτελεσματικότητα και RNAi μηχανισμού S50 -TBG-RNAi-CK2

in vivo

Η

Πιλοτικά πειράματα οξείας δόσης-απόκρισης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας S50-TBG-RNAi-CK2 για τη θεραπεία PC3-LN4 όγκους ορθοτοπική προστάτη σε γυμνούς ποντικούς. Μετά από 10 έως 14 ημέρες, ορθοτοπικά ξεκίνησε όγκοι ήταν ψηλαφητοί, και οι ποντικοί χωρίστηκαν σε ομάδες θεραπείας. Τα ποντίκια έλαβαν δύο ε.π. ενέσεις είτε S50-TBG-RNAi-CK2 (4 ποντίκια ανά ομάδα) ή όχημα (5 ποντίκια), δίνεται σε διάστημα 24 h. Δεκατρείς ημέρες μετά την πρώτη θεραπεία, ο ιστός του όγκου συλλέχθηκε για ανάλυση. Και τα δύο επίπεδα δόσης 33 και 330 ng /kg οδήγησε σε μεγαλύτερη από 50% μικρότερη μάζα όγκου σε σύγκριση με το έκδοχο (ρ = 0,011 και ρ = 0,029, αντίστοιχα? Εικ. 5α). Περαιτέρω, οι αγωγές είχαν ως αποτέλεσμα μειωμένο όγκο του μεγαλύτερου συλλογής ρετρό-περιτοναϊκή λεμφαδένα όγκου ανά ποντικό σε σύγκριση με όχημα καθώς και μειωμένη μέση διάρκεια όλων των συλλεγόμενων οπισθοπεριτοναϊκή όγκους λεμφαδένα για τα επίπεδα δόσεων 33 και 330 ng /kg (2,0 ± 0,7 και 1.5 ± 0.3, αντίστοιχα) σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (3,6 ± 0,7). Τέλος, υπήρχε μία σημαντική διαφορά στην παρουσία ή απουσία απομακρυσμένες μεταστάσεις κατά τη σύγκριση S50-TBG-RNAi-CK2 σε ποντίκια που έλαβαν φορέα (ρ = 0.046? Εικ. 5β). Η ορθοτοπική θέση των πρωτοπαθών όγκων αποκλείεται ακριβή μέτρηση της αρχικής όγκων του όγκου, έτσι την αδυναμία να προσδιοριστεί με ακρίβεια ξεκινώντας μεγέθη του όγκου μπορεί να εξηγήσει γιατί η παρατηρούμενη πρωτογενή ανταπόκριση του όγκου έως 33 ng /kg ήταν μεγαλύτερη από εκείνη σε 330 ng /kg.

(α) οι όγκοι μάζα Πρωτοβάθμιας όγκου και των λεμφαδένων όγκου φαίνονται παρακάτω θεραπείες S50-TBG-RNAi-CK2 σε 33 και 330 ng /kg σε σύγκριση με το όχημα. Μέσα ± SE παρουσιάζονται (TBG-RNAi-CK2 η = 4? Οχήματος, n = 5). * P & lt? 0,05. (Β) Ποσοστό των ποντικών με μακρινό μεταστατικούς όγκους ακόλουθες επεξεργασίες S50-TBG-RNAi-CK2 σε 33 και 330 ng /kg σε σύγκριση με το όχημα. Σύγκριση χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher p = 0,046. (Γ) ανάλυση ανοσοκηλίδας για την αντιμετώπιση CK2α και CK2α »σε πρωτογενείς όγκους. Τα άνω πάνελ αντιπροσωπεύουν το 10 μα κυτταρολύματος πυρηνικής μήτρας με κανονικοποίηση προς λαμίνη Β1. Οι κατώτεροι πίνακες αντιπροσωπεύουν 20 μα κυτταρολύματος λύματος με κανονικοποίηση προς γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH). (Δ) ανάλυση της έκφρασης πρωτεϊνών και ανταπόκριση σηματοδότησης σε αντιπροσωπευτικές όγκοι λεμφαδένων. Λεμφαδένων όγκου κατεψυγμένες τομές αναλύθηκαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό συν-χρώση για ΑΚΤ-1 φωσφο-S129 (πράσινο) και NF-κΒ ρ65 (κόκκινο). DNA επίχρωση εμφανίζεται (μπλε). μπαρ κλίμακα 100 προϊόντα μm διάσπασης (ε) CK2α RISC είναι παρούσα σε S50-TBG-RNAi-CK2 όγκους θεραπεία. Ολικό RNA απομονώθηκε από ιστό όγκου και χρησιμοποιήθηκε για 5′-απολίνωση μεσολάβηση RACE για να καθοριστεί εάν συνέβη RISC που προκαλείται διάσπαση της μεταγραφής CK2α. Οι διαδρομές 1 & amp? 2, ημέρα-10 όγκους πλευρό αγωγή με όχημα? Λωρίδα 3, μέρα-5 S50-TBG-RNAi-CK2 αντιμετωπίζονται πλευρό του όγκου? Λωρίδα 4, ημέρα-6 S50-TBG-RNAi-CK2 αντιμετωπίζονται πλευρό του όγκου? Λωρίδα 5, ημέρα-10 S50-TBG-RNAi-CK2 αντιμετωπίζονται πλευρό του όγκου? Λωρίδα 6, ημέρα-10 S50-TBG-siCK2 αντιμετωπίζονται πλευρό του όγκου? Λωρίδα 7, ημέρα-6 S50-TBG-RNAi-CK2 αντιμετωπίζονται ορθοτοπική όγκου? Λωρίδα 8, κανένας έλεγχος cDNA νερό? Μ, δείκτες μεγέθους DNA. Το προβλεπόμενο προϊόν RACE 242 bp υποδεικνύεται στα αριστερά, το μέγεθος bp των προτύπων DNA που φαίνεται στα δεξιά και θεραπεία που χορηγείται υποδεικνύεται πάνω από τις διαδρομές.

Η

Για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης στόχο CK2, ποσοτική πραγματικού -Time ανάστροφης μεταγραφάσης ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκε σε RNA όγκου. Τα δεδομένα κατέδειξαν CK2α mRNA επίπεδα σταθερής κατάστασης μειώθηκαν κατά 11 έως 14% και CK2α »από 3 έως 6% σε σχέση με τους ελέγχους οχημάτων. Η περιορισμένη μείωση των επιπέδων mRNA CK2 είναι πιθανό να οφείλεται στο χρόνο της συλλογής δείγματος, δηλαδή 11 ημέρες μετά τη δεύτερη θεραπεία. Όγκου ιστός λύονται και κλασματοποιήθηκε σε πυρηνικό μήτρας και κυτταρόπλασμα για αναλύσεις ανοσοαποτύπωσης. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα για τους όγκους από κάθε ομάδα φαίνεται στο Σχήμα 5γ. Η πυκνότητα των ζωνών στις CK2α και CK2α «πρωτεΐνες υπολογίστηκαν για όλους τους όγκους και στο κλάσμα της πυρηνικής μήτρας μέσα επίπεδα πρωτεΐνης CK2α 1,06 ± 0,19 για 33 ng /kg και 0,68 ± 0,06 για 330 ng /kg, και η μέση CK2α« πρωτεΐνες επίπεδα 0,83 ± 0,17 και 0,43 ± 0,03 για 33 και 330 ng /kg, αντίστοιχα, παρατηρήθηκαν σχέση με τους μάρτυρες (Εικ. 5c, άνω πάνελ). Στο υψηλότερο επίπεδο δόσης, τόσο CK2α και CK2α »επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης παρομοίως μειώθηκε (CK2α 0,51 ± 0,12? CK2α ‘0,39 ± 0,11). Στο κυτοσολικό διαμέρισμα, καθώς και (Εικ. 5c, κατώτερο πάνελ)

όγκοι λεμφαδένων αναλύθηκαν με έμμεσο ανοσοανίχνευση για CK2 σχετίζονται απόκριση σηματοδότησης στην ΑΚΤ και μονοπάτια NF-κΒ. Πολύ μειωμένη φωσφορυλίωση του ΑΚΤ-1 S129 [37] τοποθεσία CK2-ειδική παρατηρήθηκε μετά από αγωγή είτε με 33 ng /kg ή 330 ng /kg S50-TBG-RNA-CK2 (Σχ. 5d, άνω πάνελ). Ομοίως, μια δραματική απώλεια του ΝΡ-κΒ ρ65 συνολική πρωτεΐνη ανιχνεύτηκε επίσης, ιδιαίτερα σε 330 ng /kg TBG-RNAi-CK2 (Εικ. 5d, κέντρο πάνελ).

RNA από S50-TBG-RNAi- CK2 αγωγή όγκων τις ημέρες 5, 6 και 10 από έναν ανεξάρτητο πείραμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την τροποποιημένη τεχνική 5 ‘RACE για να χαρτογραφήσει πιθανές θέσεις διάσπασης. RNA από S50-TBG-siCK2 αντιμετωπίζονται όγκου καθώς και από όγκους ελέγχου συμπεριλήφθηκαν ως συγκριτές. Ημέρα 5 και 6 όγκοι αντιπροσωπεύουν 2 θεραπείες S50-TBG-RNAi-CK2 δίδεται τις ημέρες 1 και 4. Ημέρα 10 όγκους αντιπροσωπεύουν 3 θεραπείες είτε S50-TBG-RNAi-CK2 ή -siCK2 τις ημέρες 1, 4 και 7. Η στοιχεία δείχνουν ότι τα προϊόντα της διάσπασης CK2α RISC ανιχνεύονται κατά τις ημέρες 6 και 10 (Σχ. 5e). Σε αντίθεση με τα καλλιεργημένα κύτταρα, προϊόν διάσπασης του CK2α «δεν ανιχνεύθηκε. προϊόντα RACE αλληλουχήθηκαν για τις δύο όγκους αγωγή S50-TBG-RNAi-CK2 και -siCK2, και η θέση διάσπασης που ανιχνεύθηκε ήταν η ίδια όπως φαίνεται στο Σχ. 2γ. Μειωμένη έκφραση mRNA CK2α από 10 έως 20% στους ημέρα 6 και την ημέρα-10 όγκους επαληθεύτηκε.

Συζήτηση

Έχουμε ήδη προτείνει την υπόσχεση και την προσαρμοστικότητα αυτού του όγκου-σκηνοθεσία νουκλεϊκών οξέων με βάση θεραπεία στόχευσης CK2 τόσο καρκίνο του προστάτη και στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο [14], [15], [30], [38], [39]. Εδώ έχουμε παράσχει στοιχεία σχετικά με την προστασία του φορτίου ολιγομερών από TBG nanoencapsulation, δεσμευτική κακοήθων κυττάρων ή πρόσληψη TBG νανοκαψουλών σε καλλιεργημένα κύτταρα και σε σχετικές ιστοσελίδες του καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια, δυνατό και παρατηρείται μηχανισμούς δράσης για ένα μονόκλωνο DNA /RNA χιμαιρικό RNAi ολιγομερή, και τα δεδομένα θεραπείας ξενομοσχεύματος πιλότος του ποντικιού απόδειξη της έννοιας.

στην πιλοτική μελέτη θεραπείας, παρατηρήθηκε αποτελεσματικότητα χρησιμοποιώντας S50-TBG-RNAi-CK2 σε

in vivo

προστάτη μοντέλο σε σχετικά χαμηλή δοσολογία των 330 ng /kg, που αντιπροσωπεύουν μόλις δύο θεραπείες. Σε αυτό το επίπεδο δόσης, επιπτώσεις στην πρωτογενή βάρος του όγκου και το σχηματισμό μεταστατικών όγκων και του όγκου ήταν εμφανής και σύμφωνη με μειωμένη έκφραση CK2 και σηματοδότηση. Αποτελέσματα 2 δόσεων μας συγκρίνονται ευνοϊκά με μια άλλη έκθεση χαμηλών δόσεων

in vivo

γονιδιακή σίγηση στο οποίο μη στοχοθετημένη βάση λιπίδιο παράδοσης siRNA μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου μετά από μία μόνο δόση των 3 μg /kg [40] . Σε σύγκριση με άλλα συστήματα παροχής siRNA όγκου με στόχευση, μελέτη οξείας θεραπείας μας επιτυγχάνεται μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου και το βάρος του όγκου σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα δόσης [5], [6]. Χρησιμοποιήσαμε ένα στοιχείο ελέγχου του οχήματος σε αυτή τη συγκεκριμένη μελέτη για την απόδειξη της ιδέας που TBG-RNAi-CK2 θα μπορούσε να παράγει μια κατάλληλη θεραπευτική ανταπόκριση στο ξενομόσχευμα προστάτη καρκινικούς όγκους. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια ξεχωριστή μελέτη που σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει ένα ολιγομερές έγκλειστα σε TBG που θα μπορούσε να χρησιμεύσει ένα στοιχείο ελέγχου για την έγκλειστα θεραπευτική RNAi. Η μελέτη αυτή διεξήχθη χρησιμοποιώντας όγκους πλευρά να διευκολυνθεί η άμεση μέτρηση του όγκου του όγκου. Σύγκριση των RNAi ολιγομερών σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός κατάλληλου ελέγχου PCa, και τα συγκριτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο οι έλεγχοι RNAi και του οχήματος έδωσε ανάλογα αποτελέσματα (δηλαδή, μεταβολές όγκου του όγκου επικαλύπτονται πλήρως). Έτσι, τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 5γ προσκομίσει την απόδειξη της ιδέας που TBG-RNAi-CK2 είναι ικανό να επάγει καρκινικών κυττάρων θάνατο

in vivo

που αποδίδεται στο στόχο CK2. Περαιτέρω, τα κύτταρα PC3-LN4 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες είναι ένα μοντέλο για ΡΤΕΝ-null, υποδοχέα ανδρογόνου (AR) μη-εκφράζουν, και ανδρογόνο-ανεξάρτητων μεταστατικό PCa. Ενώ η σηματοδότηση AR θεωρείται σημαντική για την επιβίωση των κυττάρων του προστάτη, ανεξάρτητα από ανθεκτικό ευνουχισμού φαινότυπο [41], [42], τα PC3-LN4 ξενομοσχεύματος όγκους που χρησιμοποιούνται για αυτές τις μελέτες που σερβίρεται για να παρέχει απόδειξη της έννοιας των δεδομένων.

Χρήση του μονόκλωνου ολιγομερή για δραστικότητα RNAi σε καλλιεργημένα κύτταρα και σε ποντίκια έχει τεκμηριωθεί προηγουμένως [43], [44]. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η υποκατάσταση των υπολειμμάτων DNA σε 5 ‘άκρο του κλώνου οδηγού (δηλαδή, σπόρος θέσεις περιοχή 2-8) παράγει ένα μόριο RNAi με δραστικότητα γονιδιακή σίγηση και ελάχιστη επιπτώσεις εκτός-? ενώ RNA υπολείμματα στο 3 ‘άκρο του κλώνου οδηγό είναι απαραίτητη [45]. Χρήση DNA /RNA μας χιμαιρικό μονόκλωνο ολιγομερές RNAi-CK2 συνδυάζει την αποδοτικότητα της παράδοσης μόνο τον οδηγό κλώνου με τη δυνατότητα μείωσης των επιδράσεων εκτός στόχου λόγω της απουσίας του ενός κλώνου επιβάτη. Εμείς αποδεικνύεται από

in vitro

πειράματα που και οι δύο antisense- και siRNA αποσιώπηση μηχανισμοί που προκαλείται από RNAi-CK2? περαιτέρω, μετά τη χρήση του S50-TBG-RNAi-CK2 για τη θεραπεία όγκων ξενομοσχεύματος, δείξαμε ότι RISC διασπάται CK2α mRNA ανακτήθηκε 2 έως 3 ημέρες μετά την αγωγή. Δεν εντοπίσαμε «προϊόν διάσπασης σε όγκους αντιμετωπίζονται, αν και CK2α« CK2α επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν. Αυτό υποδηλώνει ότι τα ολιγομερή RNAi-CK2 που περιέχουν 1 αναντιστοιχία με την ανθρώπινη CK2α »mRNA και 2 αναντιστοιχίες σε στρωματικών κυττάρων ποντικού CK2α» mRNA μπορεί κυρίως να επάγουν RNase Η- και όχι RISC μεσολάβηση διάσπαση αυτής της μεταγραφής

in vivo

. Αυτή η έννοια υποστηρίζεται από την σημαντικά μειωμένη αφθονία του προϊόντος διάσπασης του CK2α ‘παρατηρήθηκε είτε με siRNA-CK2 ή RNAi-CK2 στις μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας. Εναλλακτικά, RNAi-CK2 μπορεί να εμποδίζει τη μετάφραση των μεταγραφών CK2α ή CK2α »σε πρωτεΐνη.