Abstract

microRNA-449Α εκφράζεται σε χαμηλό επίπεδο σε διάφορους όγκους και καρκινικές κυτταρικές σειρές, και προκαλεί G1 διακοπή, απόπτωση και γήρανση. Να προσδιορίσει τη λειτουργία των miR-449Α σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), συζητήσαμε την πιθανή σημασία του miR-449Α με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και την πρόγνωση σε NSCLC. Ερευνήσαμε επίσης τον αντίκτυπο του miR-449Α για τη μετανάστευση και την εισβολή στα κύτταρα NSCLC. Η έκφραση του miR-449Α σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας RT-qPCR.

In vitro

, να αποκτήσουν-του-λειτουργία, πειράματα απώλειας λειτουργίας, και προσδιορισμοί φθορισμού εκτελέστηκαν για τον προσδιορισμό του πιθανού στόχου των miR-449Α και τη λειτουργία των miR-449Α στα κύτταρα NSCLC. MiR-449Α ήταν κατιούσα ρύθμιση και στις δύο NSCLC ιστούς και κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, ένα χαμηλό επίπεδο έκφρασης του miR-449Α φαίνεται να συσχετίζονται με λεμφαδένα μετάσταση και φτωχή επιβίωση.

In vitro

, miR-449 ρυθμιζόμενη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα NSCLC ως πιθανός καταστολέας όγκου, τουλάχιστον εν μέρει από τη στόχευση c-Met. Περαιτέρω, αμοιβαία έκφραση του miR-449Α και c-Met δείχθηκε σε δείγματα ιστού NSCLC. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι το miR-449Α μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη NSCLC, και προτείνει έναν κρίσιμο ρόλο για miR-449Α σε NSCLC

Παράθεση:. Luo W, Huang Β, Li Ζ, Li Η Sun L, Ζανγκ Q, et al. (2013) microRNA-449Α ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή από Στόχευση c-Met. PLoS ONE 8 (5): e64759. doi: 10.1371 /journal.pone.0064759

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Δεκεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 17 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 29, 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Νο 30972967) επιδοτήσεις, Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης (Αρ 20092104110018), Πρόγραμμα για Λιαονίνγκ εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο, Liaoning επαρχιακή Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (Νο 20102122) και Shenyang Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα (F10-149-9-41). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μία κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs, περίπου 20 έως 25 νουκλεοτιδίων, τα οποία ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά. Με τη δέσμευση σε μια συμπληρωματική αλληλουχία που βρίσκεται κυρίως στην 3′-UTR του mRNAs στόχου, miRNAs είτε αποικοδομούν αυτά τα mRNAs ή αναστέλλουν αυτούς από το να μεταφράζονται σε πρωτεΐνες. Σχεδόν το 50% του ανθρώπινου miRNAs βρίσκονται σε εύθραυστη χώρους και περιοχές του γονιδιώματος που εμπλέκονται σε καρκίνους [1]. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs συσχετίζεται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και λειτουργία τόσο ως ογκογονίδια και κατασταλτικά του όγκου [2], [3], [4].

απορρύθμιση έκφρασης microRNA σε ανθρώπινους καρκίνους έχουν δείξει ότι η miRNA δυσρύθμιση σχετίζεται με πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα [5], [6], [7], [8], [9]. Υψηλή έκφραση του miR-155 και χαμηλή έκφραση του ας-7, miR-126 αναφέρονται να προβλέψουμε φτωχή πρόγνωση του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [6], [7], [10]. Raponi και συνεργάτες περιέγραψαν διακριτές εκφράσεις miRNA στον πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του πνεύμονα [11]. Βασισμένο σε miRNA απορρύθμιση έκφρασης, miRNAs θα μπορούσε να παρέχει μία νέα μέθοδο για τη διάγνωση του καρκίνου.

MiR-449 εκφράζεται σε χαμηλό επίπεδο σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές και στερεών όγκων συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του προστάτη [12], γαστρικών καρκίνων [13 ], καρκίνους της ουροδόχου κύστης [14] και τον καρκίνο του πνεύμονα [15]. Οι βιολογικές στόχοι του miR-449 έχουν μερικώς ταυτοποιηθεί, και miR-449 προκαλεί G1 διακοπή, απόπτωση, και γήρανση με ρύθμιση των βασικών παραγόντων σε κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση όπως αποακετυλάσης ιστόνης 1 (HDAC1) [12], CDK6 [16] [17], [18], cdc25A [16], [18], η κυκλίνη D1 (CCND1) [19], και SIRT1 [17]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο του miR-449Α σε εξέλιξη NSCLC. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-449Α ήταν προς τα κάτω σε ιστούς NSCLC και συνδέονται με κλινικοπαθολογική χαρακτήρες και την πρόγνωση. Ερευνήσαμε την επίδραση των miR-449Α στην κυτταρική μετανάστευση NSCLC και την εισβολή και τη ρύθμιση του γονιδίου-στόχου c-Met. Αμοιβαία έκφραση του miR-449Α και c-Met παρατηρήθηκε σε δείγματα ιστών NSCLC και τους πιθανούς ρόλους του miR-449Α και c-Met σε εξέλιξη NSCLC συζητούνται.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα

Φρέσκα δείγματα από καρκίνο του πνεύμονα και το αντίστοιχο κανονικό γειτονικό ιστό (NAT, & gt? 5 εκατοστών από τον καρκινικό ιστό) ελήφθησαν από ασθενείς στο First Affiliated Νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου και Liaoning Αντικαρκινικό Νοσοκομείο μεταξύ Ιανουαρίου 2008 και Νοέμβρης 2009 με ενημερωμένη συγκατάθεση. (Επιτροπή δεοντολογίας αναθεώρηση του νοσοκομείου έδωσε έγκριση). Κανένας από τους 84 ασθενείς στη μελέτη έλαβε καμία χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία πριν την επέμβαση. Δέκα δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα ελήφθησαν από συναινούντες ασθενείς κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης για καλοήθη νόσο των πνευμόνων. Για miR-449 ποσοτική ανάλυση, επιλέχθηκαν ιστών σε παραφίνη ενσωματωμένο φορμόλη-σταθερό (FFPETs) από τις περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα τυχαία από τους ασθενείς σε Λιαονίνγκ Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Γενάρης 2004 – Δεκέμβριος 2005 με ενημερωμένη συγκατάθεση και έγκριση. Κλινικοπαθολογικοί πληροφορίες ήταν διαθέσιμες και δύο παθολόγους ανεξάρτητα καθορίζεται διαγνώσεις και ιστολογική βαθμό με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας. Κλινικοπαθολογικοί πληροφορίες και τα δεδομένα παρακολούθησης συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του τοπικού συμβουλίου θεσμική αναθεώρηση στο First Affiliated Νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου και Liaoning Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και όλους κλινικές έρευνες έχουν διεξαχθεί.

πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR) του miR-449Α

Το συνολικό RNA εξήχθη από φρέσκα ιστοί και κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, ΝΥ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA από FFPETs διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα miRNA Απομόνωση Kit Am1975 RecoverAllTM (Ambion, Austin, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. MicroRNA ποσοτικοποίηση από εκχυλίζεται RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems, Foster City, USA). RT εκκινητή και TaqMan ανιχνευτής του miR-449Α (Applied Biosystems, Foster City, USA) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση PCR σε έναν ΑΒΙ 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. RNU6B, ως ένας εσωτερικός έλεγχος, εκτελέστηκε με τον ίδιο τρόπο όπως παραπάνω. Κάθε ανάλυση RT-qPCR διεξήχθη σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, χρησιμοποιώντας τρία ανεξάρτητα δείγματα. Η σχετική ποσότητα του miR-449Α σε ιστούς και κυτταρικές σειρές NSCLC συγκρίθηκαν με τη μέση έκφραση του 10 φυσιολογικά δείγματα, χρησιμοποιώντας την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCT [20], [21].

Κυττάρων Πολιτισμός και Μορφομετατροπή

Το ανθρώπινο καρκίνου του πνεύμονα Α549 κυτταρικής γραμμής και κυτταρικές γραμμές Η1299 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Άλλες κυτταρικές σειρές NSCLC BE1 και LH7 κύτταρα από την προηγούμενη δημοσιευμένη εργασία της ομάδας μας [8]. Α549 αναπτύχθηκαν σε Dulbecco που τροποποιημένα Eagle Medium (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, USA). ΒΕ-1, LH-7 και Η1299 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, USA). Σε κάθε περίπτωση, το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, USA), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 U /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2.

Μια μιμούνται αρνητικό έλεγχο, ένα μιμητικό miR-449Α, ένας αρνητικός έλεγχος αναστολέα και ενός αναστολέα miR-449Α, ήταν από RiboBio (Guangzhou, Κίνα). Α549 και Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Επιμόλυνσης HiPerFect (Qiagen, Hilden, γερμανικά). Εν συντομία, σύμπλοκα που περιέχουν τα μιμητικά ή αναστολέων παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το μίγμα προστέθηκε στα κύτταρα σε μια τελική συγκέντρωση 100 ηΜ. Οι τέσσερις ομάδες ήταν: κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μιμητικό αρνητικό μάρτυρα, επιμολύνθηκαν με ένα μιμητικό miR-449Α, επιμολυσμένα με έλεγχος αναστολέα, επιμολυσμένα με έναν αναστολέα miR-449Α. Επιπλέον, ένα μικρό RNA c-Met παρεμβολής (siRNA) και ένα αρνητικό έλεγχο σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν με GenePharma (Σαγκάη, Κίνα) και επιμολύνθηκε σε κύτταρα Α549. Οι ακολουθίες του c-Met siRNA ήταν 5′-GUC AUA GGA AGA GGG CAU UTT-3 ‘(αίσθηση), και 5′-AAU GCC CUC UUC CUA UGA CTT-3’ (αντιπληροφοριακό).

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

Transwell θαλάμους (Corning, ΝΥ, USA) με μέγεθος πόρων 8 μm χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 60% συρροή και επιμολυσμένα με το miRNA ή siRNA. Μετά από 24 ώρες, για δοκιμασία μετανάστευσης, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 5 × 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού και τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο. Ως χημειοελκτικό, ο κατώτερος θάλαμος περιείχε 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 16 ώρες, και μη μεταναστεύοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Μετανάστευσαν κύτταρα πλένονται δύο φορές με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη, βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. Βαμμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο (200 χ μεγέθυνση), και ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μετρήθηκε σε πέντε τυχαία πεδία. Για τις δοκιμασίες εισβολή, ο άνω θάλαμος προεπικαλυμμένα με Matrigel αναμιγνύεται με μέσο ελεύθερο ορού (αραιωμένο σε 1:03, BD Biosciences, San Jose, ΗΠΑ). Μετά τη στερεοποίηση του μείγματος, 5 × 10

4 κύτταρα σε μέσο χωρίς ορό τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο. Ο κάτω θάλαμος περιείχε 10% FBS ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 18 ώρες, και μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με βαμβάκι. Επεμβατική κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν. Βαμμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο (200 χ μεγέθυνση), και ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν μετρήθηκε σε πέντε τυχαία πεδία. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

RT-qPCR Ανάλυση miR-449Α γονιδίου στόχου

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα, και cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με κιτ αντιδραστηρίου PrimerScript RT ( Takara, Dalian, Κίνα). Το προκύπτον cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας c-Met εκκινητές με SYBR πρόμιγμα Εχ Taq II (Takara, Dalian, Κίνα) με τις παραμέτρους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5s, 60 ° C για 30 s . Εκκινητές για c-Met ήταν F: 5′-GGCTGGTGGCACTTTACTTA-3 ‘και R: 5′-CTTGTCTCTCGGTTGGCTA-3′, και εκκινητές για ενδογενή β-ακτίνη ήταν F: 5’-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ‘, R: 5’-ACATGCCGGAGCCGTTGT -3 ‘. Ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη στο τέλος των κύκλων για να εξασφαλιστεί η ειδικότητα προϊόντος. Η σχετική ποσότητα του c-Met, κανονικοποιημένη σε β-ακτίνη, που υπολογίζεται με βάση την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCT.

Ανάλυση Western Blot

Δείγματα ιστών από 0,2 g αλέστηκαν να σκόνη σε υγρό άζωτο. σκόνη ιστών και κυττάρων εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% SDS, 2 mg /ml απροτινίνη και 1 mM PMSF) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μία ίση ποσότητα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 10% γέλες SDS-PAGE. Anti-c-Met (21220, Signalway αντισωμάτων, Maryland, USA), αντι-ΜΜΡ2 (SC-13595, Σάντα Κρουζ, CA, USA), αντι-ΜΜΡ9 (SC-13520, Σάντα Κρουζ, CA, USA), αντι- β-ακτίνης (sc-1616, Santa Cruz, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν ακολούθησαν τις οδηγίες του κατασκευαστή. λογισμικό J εικόνας (National Institutes of Health, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της έντασης των ζωνών πρωτεΐνης.

φθορισμού Reporter Δοκιμασία

Για να εκτελέσετε τη δοκιμασία φθορισμού ρεπόρτερ, οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν την 3’UTR του γονιδίου c-Met από ανθρώπινο cDNA (NM_000245):. πρόσθιο εκκινητή 5′-GATCCTGCTAGTACTATGTCAAAGCAACAGTCCACACTTTGTCCAATGGTTTTTTCACTGCCTGAG -3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-AATTCTCAGGCAGTGAAAAAACCATTGGACAAAGTGTGGACTGTTGCTTTGACATAGTACTAGCAG-3’

το πλασμίδιο που περιέχει c-Met 3’UTR σε μια φθορίζουσα δημοσιογράφο κατασκευάστηκε (Sauer Biotechnology Inc, Κίνα). Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 48 φρεατίων, καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, στη συνέχεια, συνεπιμολύνθηκαν με μιμητικό ελέγχου, miR-449Α μιμούνται, έλεγχος αναστολέα, αναστολέα miR-449Α που ακολουθείται από την /EGFP-c-Met 3’UTR φορέα αναφοράς pcDNA3 μετά από 24 ώρες. Η ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) δραστηριότητα ομαλοποιήθηκε με κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) δραστηριότητα. Μετά από 72 ώρες οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν, και ο φθορισμός Φασματοφωτόμετρο F-4500 (Hitachi, Japan) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ένταση φθορισμού. Δοκιμασίες διεξήχθησαν εις διπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

SPSS13.0 στατιστικό πακέτο λογισμικού (SPSS, Chicago, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Για RT-qPCR, το επίπεδο έκφρασης του miR-449Α στον καρκίνο του πνεύμονα και αντιστοιχισμένο ΝΑΤ ήταν log2 μεταμορφωθεί. Όλες οι τιμές αναφέρθηκαν ως μέσος όρος με τυπική απόκλιση (SD). Μια ζευγαρωμένα δείγματα T-test χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τις διαφορές στην έκφραση του miR-449Α μεταξύ καρκίνου του πνεύμονα και συμφωνημένα ΝΑΤ. Ένα τεστ chi-square είχε χρησιμοποιηθεί για να αναλύσει τη σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-449Α και κλινικοπαθολογική χαρακτήρες. Το Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα δεδομένα κατάταξης των ιστολογικών βαθμού και παθολογικών στάδιο. Spearman προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-449Α και παθολογικές στάδιο, και την κατάσταση των λεμφαδένων. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για τις καμπύλες επιβίωσης, και μια δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Cox παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την επίδραση της covariables. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων κυτταρικής αναλύθηκαν από ανεξάρτητα δείγματα T-test και μονόδρομη ANOVA.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

1.. MiR-449Α ήταν προς τα κάτω σε NSCLC Ιστοί και των συνδεδεμένων με μετάσταση λεμφαδένα

Διαπιστώσαμε έκφραση του miR-449Α με RT-qPCR σε 84 φρέσκα δείγματα NSCLC ιστού με συζευγμένες συσκευές NAT. Σε σύγκριση με το ΝΑΤ, το επίπεδο έκφρασης του miR-449Α (77/84) ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς NSCLC (paired t-test,

P =

0.004,

t

= -2,997, Εικόνα 1Α). Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-449Α ανιχνεύεται με RT-qPCR σε ιστούς NSCLC, επίσης φαίνεται στο boxplot (Εικόνα 1Β). RNU6B χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο.

Α. Αξιόπιστες ιστόγραμμα δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση του miR-449Α σε ιστούς NSCLC. RT-qPCR αποτέλεσμα miR-449Α σε 84 φρέσκα ιστούς NSCLC και σε συνδυασμό ΝΑΤ. Τριπλούν πειράματα ολοκληρώθηκαν για κάθε δείγμα, η σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCT. Σε σύγκριση με το ΝΑΤ, miR-449Α σημαντικά προς τα κάτω σε δείγματα NSCLC (paired t-test,

P =

0.004,

t

= -2.997). Β Boxplot δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση του miR-449Α σε ιστούς NSCLC. Γ συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του miR-449Α και παθολογικές στάδιο, λεμφικό κατάσταση του κόμβου του 84 φρέσκα ζεύγη δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. καμπύλη D. Kaplan-Meier για ολική επιβίωση 5 ετών (14,29%) των 70 FFPET δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. E. Σε 70 FFPET δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, καμπύλη Kaplan-Meier για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα έχουν χαρακτηρισθεί ως υψηλού ή χαμηλή έκφραση του miR-449Α, χαμηλό επίπεδο έκφρασης του miR-449Α συσχετίστηκε σημαντικά με δοκιμή κακή επιβίωση (log-rank ασθενή,

P

& lt?. 0.001)

Η

για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων της έκφρασης miR-449Α για την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου, οι ασθενείς με NSCLC χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, χαμηλή και υψηλή έκφραση, σύμφωνα με το μέσο επίπεδο έκφρασης του miR-449Α σε καρκινικούς ιστούς (τιμή log2, μέση τιμή = 1,47). Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης miR-449Α και κλινικοπαθολογική μεταβλητές του καρκίνου του πνεύμονα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Σημαντικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ της έκφρασης miR-449Α και παθολογικών στάδιο (

P

= 0,012) (Mann-Whitney U test). Σε 17 περιπτώσεις, που εμφανίζονται με παθολογική σταδίου ΙΙΙ, 13 (76,47%) περιπτώσεις είχαν χαμηλή έκφραση του miR-449Α, ενώ το χαμηλό ποσοστό έκφρασης ήταν 16/32 (50,00%) των παθολογικών stageII και 13/35 (37,14%) των παθολογικών στάδιο Ι (Σχήμα 1 C). Αλλαγές στην έκφραση miR-449Α ήταν επίσης σημαντικά σχετίζεται με μετάσταση στους λεμφαδένες. Σε 40 περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα με μετάσταση στους λεμφαδένες, 25 (62,5%) είχαν χαμηλή έκφραση του miR-449Α. Αντίθετα, σε 44 περιπτώσεις, χωρίς μετάσταση στους λεμφαδένες, μόνο 17 περιπτώσεις (38,64%) είχαν χαμηλή έκφραση του miR-449Α (

P

= 0,029, chi-square test? Σχήμα 1C). Καμία συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης του miR-449Α και το φύλο, την ηλικία, τον τύπο ιστολογία ή ιστολογικές βαθμού.

Η

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-449Α και παθολογικές στάδιο, μετάσταση στους λεμφαδένες, η συσχέτιση Spearman δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-449Α και παθολογικών στάδιο (r = -0,276,

P

= 0,011), και των λεμφαδένων μετάσταση στους λεμφαδένες (r = -0,238,

P

= 0,029 ).

2. Συσχέτιση μεταξύ miR-449Α Έκφραση και την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα Ασθενείς

MiR-449Α έκφραση ανιχνεύθηκε σε FFPETs των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα 70 με δεδομένα παρακολούθησης (Πίνακας S1). Η συνολική καμπύλη επιβίωσης στο σχήμα 1D παρουσιάζει ένα συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 14,29% για 70 περιπτώσεις. Σύμφωνα με την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, οι ασθενείς με NSCLC με χαμηλή έκφραση του miR-449Α είχαν σημαντικά χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με υψηλή έκφραση του miR-449Α (δοκιμασία log-rank,

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1Ε). Εκτός από την έκφραση του miR-449Α, άλλα κλινικοπαθολογική παράγοντες, όπως η ιστολογική Βαθμός (δοκιμασία log-rank,

P

= 0.004), παθολογική στάδιο (δοκιμασία log-rank, P & lt? 0.001) και των λεμφαδένων μετάσταση στους λεμφαδένες (log -rank δοκιμή,

P

& lt? 0.001) επίσης συνδέεται με την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, σύμφωνα με την ανάλυση επιβίωσης. Μονοπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων διεξήχθη για να βρείτε το πιο έντονα προγνωστικός παράγοντας για την κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-449Α (

P

& lt? 0.001, αναλογία κινδύνου [HR] = 0,345), ιστολογικές Βαθμός (

P

= 0,002, HR = 1.725), παθολογική στάδιο (

P

& lt? 0.001, HR = 3.254), και λεμφαδένα μετάσταση (

P

& lt? 0.001, HR = 6.535) ήταν προγνωστικοί παράγοντες για την κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας 2) .

η

η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση ανάλογη παλινδρόμησης κινδύνου έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-449Α (

P

= 0,041, HR = 0,558, 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI]: 0.319- 0,976) ήταν ένας σημαντικός προγνωστικός παράγοντας ευνοϊκή ανεξάρτητα από άλλους παράγοντες κλινικοπαθολογική, για παράδειγμα, παθολογικές στάδιο (

P

= 0,002, HR = 2,162, 95% CI: 1,338 – 3,491), την κατάσταση των λεμφαδένων (

P

= 0,001, HR = 3,104, 95% CI:. 1,615 έως 5,966? Πίνακας 2)

3. MiR-449Α ήταν προς τα κάτω σε NSCLC Γραμμές κυττάρων και επηρεάζουν τη μετανάστευση και την εισβολή

in vitro

Η

Εξετάσαμε την έκφραση του miR-449Α σε κυτταρικές σειρές 4 NSCLC: Α549, BE-1, LH- 7, Η1299 χρησιμοποιώντας RT-qPCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, σε σύγκριση με τη μέση έκφραση του 10 δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα, και τα 4 κυτταρικές σειρές έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του miR-449Α. Επιπλέον, η έκφραση της miR-449Α βρέθηκε να είναι σημαντικά μειωμένη στην ιδιαίτερα επεμβατική NSCLC κυτταρική γραμμή BE1 σε σύγκριση με το λιγότερο επεμβατικές LH7 κυτταρική γραμμή.

Η σχετική ποσότητα του miR-449Α σε κυτταρικές γραμμές 4 NSCLC συγκρίθηκαν με το μέσο επίπεδο έκφρασης των 10 δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα με βάση την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCT.

η

έκφραση miR-449Α και στις δύο ιστούς και κυτταρικές σειρές NSCLC πρότεινε ότι το miR-449Α συνδέθηκε με μετάσταση. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε τις πιθανές επιπτώσεις του miR-449Α για τη μετανάστευση και την εισβολή στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. Σύμφωνα με την έκφραση του miR-449Α σε κυτταρικές γραμμές NSCLC, επιλέξαμε Α549 και κύτταρα Η1299 γραμμές, οι οποίες είχαν σχετικά μέτρια έκφραση του miR-449Α, για επικοινωνούντα δοκιμασίες. Για να προσδιοριστεί η επίδραση του miR-449Α για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή, Α549 και κύτταρα Η1299 επιμολύνθηκαν με μιμητικό ελέγχου, miR-449Α μιμούνται, έλεγχος αναστολέα και αναστολέα miR-449Α. Για να εξασφαλιστεί επιδράσεις επιμόλυνση, RT-qPCR διεξήχθη για να προσδιορίσει έκφραση της miR-449Α μετά από 24 ώρες (Εικόνα S1). Η σχετική έκφραση του miR-449Α σε Α549 και Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μιμητικό ήταν σημαντικά αυξημένη.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, σε σύγκριση με τους ελέγχους, οι μεταναστευτικές δυνατότητες των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον μιμητικό miR-449Α μειώθηκαν κατά περίπου 42,9% για τα κύτταρα Α549 και 36,4% για Η1299 κύτταρα. Αντίθετα, τα κύτταρα στην ομάδα αναστολέα miR-449Α είχαν υψηλότερη ικανότητα μετανάστευσης από τους ελέγχους, τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν αυξήθηκαν κατά 62,5% για Α549 και 48,5% για Η1299 κύτταρα (Σχήμα 3). δοκιμασίες Matrigel εισβολής διεξήχθησαν επίσης, και εξωγενώς αύξηση της έκφρασης miR-449 μείωσε τον αριθμό των μεταστατικών κυττάρων σημαντικά κατά 44,8% για Α549 και 38,2% για Η1299 κύτταρα (Σχήμα 3). Ο αριθμός των μεταστατικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά κατά 58,1% για Α549 και 46,9% για Η1299 κύτταρα όταν επιμολυσμένα με αναστολέα miR-449Α (Σχήμα 3)

Α & amp?. Β. MiR-449Α ρυθμίζεται κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή. Α549 κύτταρα /Η1299 επιμολύνθηκαν με Mimic ελέγχου, miR-449Α Mimic, Inhibitor Ελέγχου και ο αναστολέας miR-449Α, στη συνέχεια υποβάλλονται σε δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή, όπως περιγράφεται στο τμήμα 2. Μετανάστευση /μεταστατικών κυττάρων απεικονίστηκαν για αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες μετά από χρώση με αιματοξυλίνη. Αρχική μεγέθυνση, × 200. C & amp? Δ. Μέσος όρος μετεγκατεστημένα /επεμβατική αριθμό κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται στο γράφημα ράβδων, μέση τιμή ± SD. * P & lt?. 0.01

Η

4. Mir-449Α Στοχευμένες c-Met

Για τον προσδιορισμό πιθανών γονιδίων στόχων του miR-449Α στα κύτταρα NSCLC, χρησιμοποιήσαμε τρεις αλγορίθμους για την ανάλυση πιθανών στόχων του miR-449Α: TargetScan 5.2 (Ιούνιος 2011), Μιράντα (Αύγουστος 2010 ), και Diana-μΤ (Ιούλιος 2011). Στη δυναμικό κατάλογο στόχων, c-Met που έχει δύο προβλεπόμενες θέσεις με miR-449Α πρόσδεσης εμπλέκεται ως ένας μεσολαβητής κλειδί της κυτταρικής μετανάστευσης, εισβολή, και μετάσταση στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου σε μια ποικιλία όγκων, συμπεριλαμβανομένων NSCLC (Εικόνα S2). Εξετάσαμε αν c-Met ρυθμιζόταν από miR-449Α σε δείγματα ιστών NSCLC και

in vitro

. Για να προσδιοριστεί η κλινική σημασία του miR-449Α και c-Met, επιλέξαμε 27 ζεύγη από τα φρέσκα δείγματα NSCLC ιστού 84 με ζεύγη ΝΑΤ σύμφωνα με το επίπεδο σημαίνει η έκφραση των miR-449Α σε 84 καρκινικά δείγματα ιστών, συμπεριλαμβανομένων 13 miR-449Α χαμηλής εκφραστές και 14 miR-449Α υψηλής εκφραστές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 Α & amp? Β, στυπώματα Western διεξήχθησαν για να εξεταστεί το επίπεδο έκφρασης του c-Met σε αυτά τα δείγματα 27 ζεύγος, c-Met έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς NSCLC σε σύγκριση με NATs (paired t-test,

P

& lt? 0.001,

t

= 6.352), ενώ miR-449Α ήταν κάτω-ρυθμίζονται με τον ίδιο πίνακα των ιστών NSCLC όπως ανιχνεύεται στην Αποτέλεσμα 1 (Σχήμα 4C). Επιπλέον, οι όγκοι με χαμηλό επίπεδο έκφρασης του miR-449Α αποκάλυψαν υψηλές συγκεντρώσεις c-Met, ενώ οι όγκοι με υψηλό επίπεδο έκφρασης του miR-449Α εκτελείται χαμηλές συγκεντρώσεις του c-Met (

P

= 0.037, Εικόνα 4D) . ανέφερε τα αποτελέσματα αυτά ότι μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-449Α και την έκφραση του c-Met σε δείγματα ιστών

& amp?. Β. Η έκφραση του c-Met ανιχνεύεται με Western Blot σε 27 ζεύγη φρέσκων δειγμάτων NSCLC. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Η ένταση των ζωνών πρωτεΐνης μετρήθηκαν, ο άξονας-γ του boxplot βασίστηκε σε OD. Αξίες της Western Blot. Γ Σχετική έκφραση του miR-449Α στο ίδιο πάνελ των 27 ζεύγη δειγμάτων NSCLC. Δ Η έκφραση του c-Met φάνηκε ομαδοποιούνται από το μέσο επίπεδο έκφρασης του miR-449Α σε 84 καρκινικά δείγματα ιστών. Η έκφραση του c-Met σε miR-449Α χαμηλό εκφραστές ήταν υψηλότερη από ό, τι miR-449Α υψηλής εκφραστές. Η ένταση των ζωνών πρωτεΐνης μετρήθηκαν, ο άξονας-γ του boxplot βασίστηκε σε OD. Οι τιμές των Western Blot (

P

= 0.037).

Η

Για να προσδιορίσετε αν το miR-449Α στοχευμένες c-Met

in vitro

, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα Α549 και Η1299 κυττάρων με miR-449Α μιμούνται ή αναστολέα και ανιχνεύεται το επίπεδο του c-Met mRNA χρησιμοποιώντας RT-qPCR στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η υπερέκφραση του miR-449Α μειώθηκε σημαντικά mRNA του c-Met σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ενώ η αναστολή της miR-449Α ως αποτέλεσμα την αύξηση της c-Met mRNA (Σχήμα 5Α). Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε για να ελεγχθεί η πρωτεΐνη έκφραση του c-Met. Τα αποτελέσματα έδειξαν υπερέκφραση του miR-449Α οδήγησε σε δραματική μείωση των c-Met πρωτεΐνη, ενώ η μείωση του miR-449Α αξιοσημείωτα αυξημένη c-Met πρωτεΐνη (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-449Α ρυθμίζεται η έκφραση του c-Met, τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης.

Α. Η επίδραση του miR-449Α επί c Met-mRNA σε κύτταρα NSCLC. Α549 κύτταρα /Η1299 επιμολύνθηκαν με ένα Ελέγχου Mimic, ένα miR-449Α Mimic, έλεγχος αναστολέα και ενός αναστολέα miR-449Α, στη συνέχεια, το RNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε RT-qPCR. Η σχετική ποσότητα του c-Met, ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη, συγκρίθηκαν με Mock ομάδα με βάση την εξίσωση RQ = 2

-ΔΔCT. * P & lt? 0,01. B. Η επίδραση του miR-449Α επί c-Met πρωτεΐνη στα κύτταρα NSCLC. Α549 κύτταρα /Η1299 επιμολύνθηκαν με ένα μιμητικό Ελέγχου, ένα μιμητικό miR-449Α, έναν αναστολέα ελέγχου και ενός αναστολέα miR-449Α. Μετά από 48 ώρες, κυτταρική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση Western Blot της c-Met. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. θέσεις σύνδεσης C. MiR-449Α στην 3’UTR του c-Met εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς φθορισμού ανταποκριτή. Με φορέα που περιέχει c-Met 3′-UTR, κύτταρα Α549 επιμολύνονται με ένα μιμητικό Ελέγχου, ένα miR-449Α μιμούνται, έλεγχος αναστολέα και ενός αναστολέα miR-449Α, τότε πρωτεΐνη εκχυλίστηκε και η ένταση του φθορισμού προσδιορίστηκε. * P & lt?. 0.05

Η

Για να προσδιορίσετε αν το c-Met ήταν άμεσο στόχο του miR-449Α, φθορισμού δοκιμασίες δημοσιογράφος πραγματοποιήθηκαν. Το 3′-UTR του c-Met με δύο προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης για miR-449Α κλωνοποιήθηκε σε ένα φθορίζον φορέα αναφοράς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, προς τα πάνω ρύθμιση του miR-449Α μείωσε την ένταση φθορισμού EGFP σε κύτταρα επιμολυσμένα με ένα φορέα που περιέχει c-Met 3′-UTR σύγκριση με τους μάρτυρες, ενώ στην ομάδα αναστολέα miR-449Α η ένταση του φθορισμού EGFP αυξήθηκε σημαντικά . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-449Α δεσμεύεται με c-Met 3’UTR περιοχή άμεσα.

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν miR-449Α ρυθμίζεται μετανάστευση και την εισβολή μέσω της στόχευσης c-Met, c-Met siRNA χρησιμοποιήθηκε για να φιμώσουν γ -Met έκφρασης. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση των αποτελεσμάτων (Σχήμα 6Α). Με κατάντη αλλαγές ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 (Σχήμα 6Β), συν-διαμόλυνση του αναστολέα miR-449Α και c-Met siRNA κατήργησε τις επιδράσεις των miR-449Α για τη μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 6C & amp? D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι miR-449Α μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης, εισβολή, και μετάσταση όγκου μέσω στόχευσης του ογκογονιδίου c-Met.

A. C-Met siRNA ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν στη σιωπή έκφραση c-Met, και επαληθεύτηκε η επίδραση. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με έναν αρνητικό μάρτυρα και c-Met siRNA, κυτταρική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση Western Blot της c-Met. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. B. Η συν-επιμόλυνση ενός αναστολέα miR-449Α και ένα c-Met siRNA διεξήχθη σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο, αναστολέα miR-449Α και ενός αναστολέα miR-449Α συν ένα c-Met siRNA, πρωτεΐνη από τα κύτταρα αυτά εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση Western Blot της c-Met. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. C. Τα αποτελέσματα του miR-449Α για τη μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα Α549 καταργήθηκαν μετά από συν-διαμόλυνση. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα στοιχείο ελέγχου, αναστολέα miR-449Α και ενός αναστολέα miR-449Α συν ένα c-Met siRNA, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή, όπως περιγράφεται στο τμήμα 2. Μετανάστευση /μεταστατικών κυττάρων απεικονίστηκαν για αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες μετά χρώση με αιματοξυλίνη. Αρχική μεγέθυνση, × 200. Δ Μέση μετανάστευσαν /επεμβατική αριθμό κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται στο γράφημα ράβδων, μέση τιμή ± SD. * P & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Βρήκαμε ότι το miR-449Α σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς NSCLC και κυτταρικές σειρές, σύμφωνα με την έκθεση ότι το miR-449 μειώθηκε σε αρκετές ανθρώπινη όγκους και καρκινικές κυτταρικές γραμμές [16]. Επιπλέον, Liang και συνεργάτες βρήκαν ότι miR-449 ανιχνεύτηκε σε ανθρώπινο πνεύμονα, όρχεις, και σάλπιγγες, αλλά όχι άλλους φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς [22], [23]. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση miR-449 παρατηρήθηκε σε γαστρικό καρκίνο. Η έκφραση του miR-449 ήταν χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα σε 8 από 10 γαστρικού καρκινικούς ιστούς, αν και δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της μείωσης στην έκφραση miR-449 και κλινικά χαρακτηριστικά του γαστρικού καρκίνου στα 10 ζεύγη των ιστών [13]. Πρόσφατα, Jeon και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι το miR-449Α /b έχει μειωμένη έκφραση σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα, με την HDAC1 γονίδιο στόχο υπερεκφράζεται σε επίπεδο mRNA [15]. Ωστόσο, τα δεδομένα από ένα μεγάλο δείγμα που για την κατάσταση έκφρασης του miR-449 και συνάφειά του με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά είναι ασαφείς. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε 154 δείγματα NSCLC (συμπεριλαμβανομένων 84 φρέσκα δείγματα και 70 FFPET δείγματα) για την ανίχνευση της πιθανής σχέσης μεταξύ της κατάστασης έκφρασης του miR-449Α και διάφορες κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά, καθώς και την επιβίωση των ασθενών με NSCLC. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα RT-qPCR σε 84 περιπτώσεις νέων ιστών NSCLC και σε συνδυασμό ΝΑΤ, miR-449Α σημαντικά προς τα κάτω σε NSCLCs σε σύγκριση με συζευγμένες συσκευές NAT. Διεξήχθη στατιστική ανάλυση, και ένα χαμηλό επίπεδο miR-449Α φαίνεται να συσχετίζονται με προχωρημένο παθολογικό στάδιο, και μετάσταση λεμφαδένα. Για τις γνώσεις μας, η ανάλυση μας έδειξε για πρώτη φορά ότι miR-449Α συνδέθηκε με μετάσταση στους λεμφαδένες. Επιπλέον, τα δεδομένα από 70 FFPETs έδειξε ότι οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με χαμηλή έκφραση του miR-449Α είχε κακή πρόγνωση. ανάλυση παλινδρόμησης Η πολυπαραγοντική Cox έδειξε ότι το χαμηλό επίπεδο έκφρασης του miR-449Α συσχετίστηκε ανεξάρτητα με χειρότερη πρόγνωση καθώς και προηγμένες παθολογική στάδιο και λεμφαδένων μεταστάσεων. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-449Α μπορεί να είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό παράγοντα πρόβλεψης ανεξάρτητα από άλλους παράγοντες κλινικοπαθολογική.

Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί για την αλλοιωμένη έκφραση του miR-449 σε όγκους παραμένουν άγνωστα. Η οικογένεια miR-34 που έχει την ίδια ακολουθία σπόρου με miR-449 είναι ογκο-κατασταλτικά και μεθυλιωμένα στον καρκίνο του πνεύμονα [24], [25], [26]. Επιπλέον, η έκφραση του miR-449 αδρανοποιείται με ιστόνης H3lys27 (H3K27mes) και αναστραφεί με επιγενετικές φάρμακα για τροποποιήσεις των ιστονών [16]. Στο σύνολό τους, παρεκκλίνουσα επιγενετικές γεγονότα μπορεί να είναι σημαντική για τους μηχανισμούς πίσω από miR-449 απορρύθμισης. MiR-449Α βρίσκεται στο πρώτο ιντρόνιο του CDC20B στο χρωμόσωμα 5q11 το οποίο είναι συχνά ένα σημείο της ανωμαλίας στον καρκίνο του πνεύμονα [27], [28].