Αφηρημένο

HRAS

είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο που εμπλέκονται στην ογκογένεση του ουροποιητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης . Στο

HRAS

υποστηρικτής εντοπίσαμε δύο G-πλούσια στοιχεία,

HRAS

-1 και

HRAS

-2, ότι φορές, αντίστοιχα, σε αντιπαράλληλες και μια παράλληλη τετραπλών (

qhras

-1,

qhras

-2). Όταν παρουσιάσαμε στην ακολουθία

HRAS

-1 ή

HRAS

-2 δύο σημειακές μεταλλάξεις που εμποδίζουν το σχηματισμό τετραπλών, μεταγραφή αυξήθηκαν κατά 5 φορές, αλλά όταν σταθεροποιηθεί των G-τετραπλά από φθαλοκυανίνες γουανιδίνιο, μεταγραφής μειώθηκε στο 20% του ελέγχου. Με ChIP βρήκαμε ότι η ακολουθία

HRAS

-1 δεσμεύεται μόνο από MAZ, ενώ

HRAS

-2 δεσμεύεται από MAZ και Sp1: δύο μεταγραφικών παραγόντων αναγνωρίζοντας κουτιά γουανίνη. Ανακαλύψαμε επίσης από τον EMSA ότι η ανασυνδυασμένη MAZ-GST συνδέεται με δύο

HRAS

τετραπλά, ενώ Sp1-GST συνδέεται μόνο με

qhras

-1. Η υπερ-έκφραση της MAZ και Sp1 ενεργοποιεί συνεργικά μεταγραφή

HRAS

, ενώ φίμωση κάθε γονιδίου από τα αποτελέσματα RNAi σε μια ισχυρή ρύθμιση προς τα κάτω της μεταγραφής. Όλα αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι οι

HRAS

G-τετραπλά συμπεριφέρονται ως καταστολείς της μεταγραφής. Τέλος, σχεδιάσαμε δολώματα ολιγονουκλεοτίδια που μιμείται το

HRAS

τετραπλά, που φέρει (R) -1-Ο- [4- (1-Pyrenylethynyl) φαινυλομεθυλο] γλυκερόλη και LNA τροποποιήσεις για να αυξηθεί η σταθερότητα τους και την αντοχή νουκλεάσης (G4- κράχτες). Οι G4-κράχτες καταπιεσμένη

HRAS

μεταγραφή και προκάλεσε μια ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δράση, με τη μεσολάβηση απόπτωση, σε Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα όπου

HRAS

μεταλλάσσεται

Παράθεση:. Membrino Α , Cogoi S, Pedersen EB, Xodo LE (2011) G4-DNA Σχηματισμός στο

HRAS

Ανάδοχος και Ορθολογική Σχεδιασμός δολωμάτων ολιγονουκλεοτίδια για θεραπεία Καρκίνου. PLoS ONE 6 (9): e24421. doi: 10.1371 /journal.pone.0024421

Επιμέλεια: Mark Isalan, Κέντρο Genomic κανονισμού, Ισπανία

Ελήφθη: 3 Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 9, Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 8, Σεπτεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Membrino et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. AIRC 2010 «Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία της manuscruipt

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η οικογένεια γονιδίων ras αποτελείται από τρία λειτουργικά πρωτο-ογκογονίδια (

HRAS

,

NRAS

και

KRAS

) που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες γουανίνης-δεσμευτική μοιράζονται υψηλή ομολογία (p21

RAS) [1]. Αυτές οι πρωτεΐνες, που βρίσκεται στην εσωτερική κυτταρική μεμβράνη μέσω ενός φαρνεζυλ ομάδας [2], είναι δραστικά όταν αυτά είναι δεσμευμένα για GTP, και ανενεργά όταν GTP υδρολύεται προς το ΑΕΠ [3]. Ras πρωτεΐνες ρυθμίζουν κυτταρικές αποκρίσεις σε πολλά εξωκυτταρικά ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων μιτογόνα και παράγοντες διαφοροποίησης [4]. Τα γονίδια ras που εκφράζονται σε ένα ιστό-ειδικό τρόπο:

HRAS

εκφράζεται έντονα στο δέρμα και τους σκελετικούς μυς,

KRAS

στο παχύ έντερο και θύμο και

NRAS

σε αρσενικά βλαστικά ιστό [1]. Οι ras γονίδια έχουν παρόμοιες δομές και αλληλουχίες με πέντε εξώνια, η πρώτη των οποίων είναι μη κωδικεύουσα και διατηρημένων θέσεων ματίσματος. Τα εσώνια, αντ ‘αυτού, να έχουν διαφορετικά μήκη και αλληλουχίες [1]. Τα ras πρωτο-ογκογονίδια σε ογκογονίδια μετατρέπονται από σημειακές μεταλλάξεις που μειώνουν την ικανότητα της κωδικοποιημένης πρωτεΐνης να υδρολύει GTP σε GDP, με αποτέλεσμα η ρ21

RAS παραμένει ιδιοσυστατικά ενεργό. Υπερενεργοποιημένη ras πρωτεΐνες διεγείρουν καταρράκτες φωσφορυλίωση συμπεριλαμβανομένου του /ΕΚΚ μονοπάτι Raf /MEK η οποία οδηγεί σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων [5], [6]. Οι μεταλλάξεις στα γονίδια ras βρίσκονται συχνά σε πολλούς ανθρώπινους όγκους [7], [8].

HRAS

μεταλλάξεις είναι λιγότερο συχνές, αλλά έχουν υψηλό επιπολασμό σε θηλώματα του δέρματος και όγκους της ουροδόχου κύστης [9]. Καθώς το 80% των όγκων της ουροδόχου κύστης λιμάνι

HRAS

μεταλλάξεις [10] και πάνω από το ήμισυ των όγκων της ουροδόχου κύστης υπερεκφράζουν

HRAS

[11], τόσο η μετάλλαξη και η υπερέκφραση είναι σημαντικοί παράγοντες στην ογκογένεση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [12]. Στην πραγματικότητα, έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι οι εκφράσεις χαμηλού επιπέδου μόνιμα ενεργών

HRAS

που προκαλείται από απλές ουροφόρων υπερπλασία, ενώ ο διπλασιασμός των ενεργοποιημένων

HRAS

ογκογονίδιο ενεργοποιείται ταχύτατα αναπτυσσόμενη και διεισδυτική όγκων σε όλη την ουροδόχο έκταση. Δεδομένου του καθοριστικού ρόλου των

HRAS

υπερέκφραση και μεταλλάξεις στο ογκογένεση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, μία ελκυστική θεραπευτική στρατηγική θα μπορούσε να είναι για την αναστολή της

HRAS

μεταγραφή με μόρια τα οποία είναι ικανά να μειώνουν την δραστηριότητα του γονιδίου υποστηρικτής. Για το σκοπό αυτό ζητήσαμε από τον τρόπο

HRAS

μεταγραφή ρυθμίζεται. Παρατηρήσαμε ότι ο υποκινητής του

HRAS

περιέχει πολλαπλά αντίγραφα του στοιχείου GGGCGGG ή το συμπλήρωμά της. Αυτό G-box έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τον παράγοντα μεταγραφής Sp1 [13], [14]. Ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (TSS) υπάρχουν διαδρομές των γουανίνες που εκτείνεται πάνω από τρεις περιοχές Sp1, οι οποίες είναι πιθανές θέσεις για το σχηματισμό G-τετραπλών. έτσι Υποθέσαμε ότι οι G-πλούσιος στοιχεία θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην ρύθμιση της μεταγραφής. G4-DNA είναι ασυνήθιστες δομές σταθεροποιούνται με επίπεδες συστοιχίες των τεσσάρων γουανίνες (G-quartet) που συνδέονται το ένα με το άλλο με δεσμούς υδρογόνου Hoogsteen [15]. Τα άκρα των τερματικών G-quartets συνδέονται με θηλιές που μπορεί να ποικίλλουν σε μήκος και τοπολογία, δημιουργώντας μία ποικιλία διαφορετικών διαμορφώσεων [16]. αναλύσεις γονιδιώματος σε επίπεδο αποκάλυψαν ότι τρέχει από γουανίνες είναι άφθονα στις περιοχές υποκινητή του γονιδίου που περιβάλλουν TSS [17] – [20]. Έχει τη θεωρία, επομένως, ότι G4-DNA μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της μεταγραφής [21] – [25]. Η μελέτη μας παρέχει αδιάσειστα στοιχεία που

HRAS

μεταγραφή ρυθμίζεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ Sp1, MAZ και G4-DNA, το οποίο δρα ως καταστολέας της μεταγραφής. Με βάση αυτή την ανακάλυψη έχουμε σχεδιάσει G-πλούσιος ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για

HRAS

που έχουν ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση στην ουρική καρκινικά κύτταρα που φέρουν ένα μεταλλαγμένο

HRAS

. Αν και η κυτταροτοξικότητα ορισμένων G-πλούσια σε Ο ολιγονουκλεοτίδια έχει αναφερθεί προηγουμένως, ο μηχανισμός δράσης τους δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή [26], [27]. Η μελέτη μας δείχνει ότι οι σχεδιασμένες ολιγονουκλεοτίδια τετραπλών σχηματισμού μπορεί να αποφασίζει με απομόνωσης MAZ και, συνεπώς, αλλοιώνοντας

HRAS

μεταγραφή. Για ισχυρό αντι-πολλαπλασιαστική επίδρασή τους στον καρκίνο Τ24 ουροδόχου κύστης κύτταρα, G4-κράχτες φαίνεται να είναι πολύ ελπιδοφόρα φάρμακα τελεστές για θεραπεία καρκίνο της ουροδόχου κύστεως.

Αποτελέσματα

Η

HRAS

υποστηρικτής είναι δομικά πολυμορφική

Ο υποκινητής του ανθρώπινου

HRAS

γονίδιο στερείται τυπικού κουτιά ΤΑΤΑ και CAAT, περιέχει υψηλή περιεκτικότητα σε G + C (80%) και πολλαπλά αντίγραφα του GGGCGGG (G-box) , αναγνωρίζεται από το Sp1 μεταγραφικού παράγοντα [13], [14]. Οι τρεις G-κουτιά που βρίσκεται πλησιέστερα προς τις θέσεις έναρξης RNA επικαλύπτονται ακολουθίες τετραπλών σχηματισμού, δηλαδή

HRAS

-1 (435 – 462, αριθμός πρόσβασης J00277) και

HRAS

-2 (506 – 530 , J00277) (Σχήμα 1). Σύμφωνα με μια πρόσφατη μελέτη, τετραπλών σχηματίζουν ακολουθίες που καλύπτουν στοιχεία δέσμευσης Sp1 υπάρχουν σε διάφορα γονίδια [28]. Έχουμε πάρει μια πρώτη ένδειξη ότι το

HRAS

προωθητής είναι δομικά πολυμορφικό, ενώ αλληλουχίας των φορέων έκφρασης ειδικά κατασκευασμένο για αυτή τη μελέτη. Όταν οι αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή προσδιορισμού αλληλουχίας εκτελέστηκαν με εκκινητές συμπληρωματικούς των G-πλούσιο κλώνου, Taq πολυμεράση απροσδόκητα συλληφθεί στα

HRAS

-2 ή

HRAS

-1 G-πλούσιος στοιχεία. Σε αντίθεση, με εναύσματα συμπληρωματικά με το C-πλούσια σκέλος δεν παρατηρήσαμε κανένα εμπόδιο. Αυτό πρότεινε ότι οι δύο

HRAS

-1 και

HRAS

-2 ακολουθίες που σχηματίζεται ασυνήθιστες δομές. Η υπόθεσή μας επιβεβαιώθηκε από δοκιμασίες πολυμεράσης-stop. Σχεδιάσαμε δύο πρότυπα γραμμικού άγριου τύπου που περιέχουν

HRAS

-1 ή

HRAS

-2 και ένα μεταλλαγμένο πρότυπο στο οποίο τέσσερις G → Τ μεταλλάξεις εισήχθησαν στο

HRAS

– 2 για την πρόληψη σχηματισμού τετραπλών. αντιδράσεις Primer-επέκτασης έδειξαν ότι πολυμεράσης Taq παρουσία καλίου συνελήφθη στο 3 ‘άκρο του

HRAS

-2 ή

HRAS

-1, λίγο πριν από την πρώτη εκτέλεση του guanines, στη διατήρηση με το σχηματισμό μιας δομής G-τετραπλών από κάθε G-πλούσιο στοιχείο (Σχήμα S1)

Δύο G-πλούσιος στοιχεία (

HRAS

-1 και

HRAS

. – 2) που βρίσκεται ανάντη της θέσης έναρξης της μεταγραφής μπορεί ενδεχομένως να πάει πάσο σε δομές G-τετραπλών. Οι τετραπλών σχηματίζουν G-πλούσια στοιχεία που περιέχει τις θέσεις δέσμευσης για την μεταγραφή παράγοντες MAZ και Sp1.

Η ακολουθίες

Ανάδοχος

HRAS

-1 και

HRAS

-2 σχηματίζουν σταθερές δομές G4-DNA in vitro

Μια εικόνα για τη G-τετραπλά που σχηματίζεται από το

HRAS

G-πλούσια στοιχεία που λήφθηκε με DMS-αποτύπωμα, κυκλικού διχρωϊσμού (CD) και συντονισμού φθορισμού μεταφορά ενέργειας (FRET) πειράματα. Το Σχήμα 2 δείχνει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με ακολουθία

HRAS

-1. Οι DMS-αποτυπώματα των 27-mer

HRAS

-1 σε νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 100 mM Li

+ ή Cs

+ (λωρίδες 1, 4, 5) δείχνουν ότι όλα τα guanines αντιδρούν με DMS . Αντ ‘αυτού, με την παρουσία 50, 100 ή 140 mM KCl (διαδρομές 2, 3, 9), οι γουανίνες του G-τρέχει προοδευτικά προστατεύονται Α-Δ, ενώ γουανίνες G8 και G14 στο παρεμβαλλόμενη «TTGC» και «CGCA «αλληλουχίες δεν είναι. Αυτό το πρότυπο διάσπασης υποδηλώνει ότι

HRAS

-1 διπλώνει σε ένα G-τετραπλών (

qhras

-1). Με την παρουσία 50 ηΜ TMPyP4,

HRAS

-1 δίνει ένα ισχυρό αποτύπωμα είτε σε χαμηλή (1 mM) ή υψηλή (100 mM) συγκέντρωση KCl (λωρίδες 7, 8) [29]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μεταλλαγμένη αλληλουχία

h1-mut

, που φέρουν

HRAS

-1 με τέσσερα G → Τ μεταλλάξεις που καταργούν την αναδίπλωση, δεν δίνει κανένα ίχνος. Να καθορίσει τον προσανατολισμό σκέλος του

qhras

-1 χρησιμοποιήσαμε CD (Σχήμα 2γ, δ). Το CD φάσμα της

qhras

-1 σε 100 mM KCl χαρακτηρίζεται από θετικές και αρνητικές ελλειπτικότητας σε 287 και 260 nm, αντίστοιχα, χαρακτηριστικό της αντιπαράλληλο διάπλαση [30]. Θέρμανση του δείγματος λάβαμε μια καμπύλη τήξης (287 nm ελλειπτικότητα

έναντι

θερμοκρασίας) που δεν ήταν απόλυτα επιτιθέμενες με την καμπύλη ψύξης, καθώς η πρώτη ήταν ελαφρώς διφασικό ενώ το δεύτερο ήταν μονοφασική. Μια πιο ευαίσθητη μέθοδος αναλύσεως ελήφθη με πειράματα FRET-τήξης με αλληλουχία

HRAS

-1 άκρο σημασμένο με FAM και TAMRA στο 5 ‘άκρο και 3, αντίστοιχα. Έχουμε λάβει μια καλά επιλυθεί καμπύλη διφασική τήξης με

T

Μ στους 53 και 67 ° C υποδεικνύοντας ότι

HRAS

-1 διπλώνει σε τουλάχιστον δύο τετραπλά (Σχήμα 2ε). Όταν η συγκέντρωση του

HRAS

-1 αυξήθηκε κατά μία τάξη μεγέθους από 200 ηΜ έως 2 μΜ, η

T

Μ δεν άλλαξε: μια συμπεριφορά χαρακτηριστική της ενδομοριακής δομής ( δεν φαίνεται). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το

HRAS

-1 υιοθετεί μια αντιπαράλληλη τετραπλών που θα μπορούσε να υποθέσει διαφορετικές τοπολογίες: το ένα με πλευρική βρόχους φαίνεται στο Σχήμα 2στ [16]. Παρόλο που γνωρίζουμε από τα στοιχεία αποτύπωμα και CD τα guanines που εμπλέκονται στο σχηματισμό των αντιπαράλληλες

qhras

-1, μια εικόνα για τη δομή αυτού του τετραπλών θα επιτευχθεί μόνο με NMR. Το Σχήμα 3 δείχνει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με ακολουθία

HRAS

-2. Οι DMS-αποτυπώματα των 24-mer

HRAS

-2 δείχνει ότι σε 10, 50, 100 και 140 mM KCl (λωρίδες 2-5), η G-τρέχει μια-D προστατεύονται από DMS, ενώ G10 , G12, G13, G21 και G22 αντιδρούν με DMS. Αυτό δείχνει ότι οι τριάδες γουανίνη που αποτελούν το τετραπλών θα πρέπει να είναι G3-G4-G5, G7-G8-G9, G14-G15-G16, G18-G19-G20. Το γεγονός ότι η G16 δείχνει κάποια αντιδραστικότητα με DMS δείχνουν ότι η pentaguanine G12-G16 τέντωμα μπορεί να συμμετάσχει στο τετραπλών είτε με G14-G15-G16 ή με G13-G14-G15. Το μεταλλαγμένο

h2-mut

ακολουθία και άγριου τύπου

HRAS

-2 σε 100 mM Li

+ ή Cs

+ δεν έδωσε κανένα αποτύπωμα (λωρίδες 6-8). Το αποτύπωμα παρουσία 50 ηΜ TMPyP4 είναι πολύ ισχυρή (διαδρομές 9, 10). Το CD φάσμα της

HRAS

-2 δείχνει μια ισχυρή ελλειπτικότητα στα 260 nm ενδεικτική μιας G-τετραπλών με παράλληλη διαμόρφωση (Σχήμα 3γ) [30]. Αυτή η δομή είναι τόσο σταθερή ώστε ο CD στους 85 ° C παρουσιάζει ακόμη ένα έντονο ελλειπτικότητα 260 nm. Η σταθερότητα σε διάφορες συγκεντρώσεις ΚΟΙ προσδιορίστηκε με ακολουθία

HRAS

-2 επισημαίνονται με FAM και TAMRA. Πραγματοποιήσαμε πειράματα FRET-τήξη σε 20, 40, 60, 100 και 140 mM KCl και ελήφθη

T

αξίες Μ 78 έως 82, 85, & gt? 90 και & gt? 92 ° C, αντίστοιχα (Εικόνα 3d). Σε αυτήν την περίπτωση, επίσης, η

T

Μ δεν άλλαξε όταν η συγκέντρωση αυξήθηκε κατά μία τάξη μεγέθους (από 200 ηΜ έως 2 μΜ) (δεν φαίνεται). Συνολικά, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι

HRAS

-2 σχηματίζει ένα παράλληλο G-τετραπλών (

qhras

-2) των οποίων η υποθετική δομή προκύπτει από DMS-αποτύπωμα και CD θα πρέπει να έχουν είτε 1/1/4 ή 1/2/3 βρόχους (Εικόνα 3e). Επιβάλλεται οριστικός προσδιορισμός της δομής θα είναι δυνατή μόνο στη βάση των δεδομένων NMR.

(α) Άγρια τύπου (

HRAS

-1) και μεταλλαγμένα (

h1-mut

) ακολουθίες αναλύθηκαν από DMS-αποτυπώματος. Πλήρης τετράγωνα υποδεικνύουν DMS-αντιδρώσα guanines, ανοιχτές πλατείες δείχνουν DMS-χημικά αδρανής guanines? (Β) DMS-πατημασιάς του

HRAS

-1 σε νερό (λωρίδα 1)?

HRAS

-1 σε 50 και 100 mM KCl (διαδρομές 2 και 3)?

HRAS

-1 σε 100 mM ΟδΟΙ ή LiCl (λωρίδες 4 και 5)?

h1-mut

σε 100 mM KCl (λωρίδα 6)?

HRAS

-1 σε 50 mM TMPyP4, 1 mM KCl (λωρίδα 7)?

HRAS

-1 σε 50 mM TMPyP4, 100 mM KCl (λωρίδα 8)?

HRAS

-1 στα 140 mM ΚΟΙ (γραμμή 9)?

h1-mut

σε 100 mM KCl (λωρίδα 10)? (Γ) φάσματα CD στους 25 και 90 ° C δείχνουν ότι

HRAS

-1 διπλώνει σε αντιπαράλληλες G-τετραπλών? (Δ) καμπύλες τήξης για τετραπλών

HRAS

-1 λαμβάνεται σχεδίαζε την ελλειπτικότητα 287-nm έναντι Τ Α

T

M περίπου 63 ° C ελήφθη με καμπύλες θέρμανσης και ψύξης ? (Ε) Οι καμπύλες FRET-τήξης των τετραπλών

HRAS

-1 επισημαίνονται με FAM και TAMRA δείχνουν ότι διπλώνει στα δύο G-τετραπλά με

T

Μ 53 και 67 ° C (.. Εκ των 475 nm, Em 520 nm)? (Στ) Οι πιθανές διαμορφώσεις για

HRAS

-1, με βάση το αποτύπωμα και τα δεδομένα του CD, είναι αντιπαράλληλες τετραπλά με πλάγια και πλάγια /διαγώνια βρόχους. Η τετραπλών με πλευρική βρόχους φαίνεται στο σχήμα.

Η

(α) άγριου τύπου και μεταλλαγμένα

HRAS

-2 ακολουθίες αναλύθηκαν από DMS-αποτυπώματος. Πλήρης τετράγωνα υποδεικνύουν DMS-αντιδρώσα guanines, ανοιχτές πλατείες δείχνουν DMS-χημικά αδρανής guanines? (Β) DMS-πατημασιάς του

HRAS

-2 σε νερό (λωρίδα 1)?

HRAS

-2 σε 1, 10, 50, 100 mM KCl (λωρίδες 2-5)?

HRAS

-2 σε 100 mM LiCl ή χλωριούχου καισίου (λωρίδες 6,7)?

h2-mut

σε 100 mM KCl (λωρίδα 8)?

HRAS

-2 σε 50 nM TMPyP4, 1 mM KCl (λωρίδα 9)?

HRAS

-2 σε 50 nM TMPyP4, 100 mM KCl (λωρίδα 10). Guanines G10, G12, G13 και G21, G22 διασπώνται ενώ τα άλλα guanines δεν είναι (εκτός G16 δείχνει μια χαμηλή αντιδραστικότητα). Μεταλλαγμένα

h2-mut

δεν δείχνουν καμία αποτύπωμα σε 100 mM ΚΟΙ? (Γ) CD φάσματα τετραπλών

HRAS

-2 σε διάφορες θερμοκρασίες μεταξύ 25 και 90 ° C υποδηλώνουν το σχηματισμό ενός αντιπαράλληλη G-τετραπλών? (Δ) FRET-τήξης τετραπλών

HRAS

-2 στα 20, 40, 60, 100 και 140 mM KCl εμφανίζει μόνο μία μετάβαση με Τ

Μ 78, 82, 85, & gt? 90, & gt? 92 ° C? (Ε) Πιθανή δομή G-τετραπλών για

HRAS

-2, μια παράλληλη διαμόρφωση με 1/1/4 ή 1/2/3 βρόχους, με βάση τα στοιχεία αποτύπωμα και CD.

Η

G4-DNA σε

HRAS

-1 και

HRAS

-2 upregulate έντονα

HRAS

μεταγραφή

Όπως ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 βρίσκονται αμέσως ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και της μορφής

in vitro

σταθερά G-τετραπλά, ρωτήσαμε τι συμβαίνει στο

HRAS

μεταγραφή όταν η ικανότητα σχηματισμού τετραπλών από αλληλουχίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 καταργείται. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το σημείο κατασκευάσαμε ένα πλασμίδιο, pHRAS-Luc, που φέρουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας οδηγείται από το

HRAS

υποκινητή. Από pHRAS-Luc λάβαμε με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση δύο μεταλλαγμένα πλασμίδια: pHRAS-Mut1 και pHRAS-mut2, όπου δύο γουανίνες στο δεύτερο και τρίτο G-τετράδες των υποθετικών τετραπλών αντικαταστάθηκαν με θυμίνη /κυτοσίνη ή θυμίνες (Σχήμα 4α) . Αυτές οι μεταλλάξεις κατήργησε την ικανότητα των ακολουθιών

HRAS

-1 και

HRAS

-2 να πάει πάσο σε ένα τετραπλών (Εικόνα S2). Η άγριου τύπου και μεταλλαγμένων πλασμίδια συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa με pRL-CMV, έναν φορέα που κωδικοποιεί για το

Renilla

λουσιφεράσης. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση μετρήσαμε πυγολαμπίδας και

Renilla

λουσιφεράσεις δραστηριότητα στα προϊόντα λύσης των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων κυττάρων. Τα αποτελέσματα που αναφέρονται στο Σχήμα 4β δείχνουν ότι δέσμευση του σχηματισμού τετραπλών προκαλεί μια δραματική αύξηση της έκφρασης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας, έως και 5 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο. Αυτό δείχνει σαφώς ότι οι G-τετραπλά που σχηματίζεται από ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 είναι δομικά στοιχεία του

HRAS

υποκινητή που συμπεριφέρονται ως καταστολείς, όπως παρατηρήθηκε για το

cmyc

γονίδιο [21]

(α) Δύο G4-DNA μεταλλάξεις αποσταθεροποιητικό στοιχείο στο

HRAS

-1 ή

HRAS

. – 2 στοιχείο έχουν εισαχθεί. Πλασμίδιο pHRAS-Mut1 περιέχει ένα μεταλλαγμένο

HRAS

-1 στοιχείο, ενώ το πλασμίδιο pHRAS-mut2 περιέχει ένα μεταλλαγμένο

HRAS

-2 στοιχείο? (Β) δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης δείχνουν ότι οι σημειακές μεταλλάξεις προκαλούν μέχρι και 5-πλάσια αύξηση σε

HRAS

δραστηριότητα υποκινητή (βλέπε Εικόνα 5 υπόμνημα).

Η

σταθεροποιητικό G4-DNA γουανιδινίου φθαλοκυανίνες καταστέλλουν

HRAS

μεταγραφή

Δεδομένου ότι τετραπλών DNA συμπεριφέρεται ως ένα στοιχείο καταστολέα για

HRAS

, εξετάσαμε την επίδραση στην μεταγραφή του G4-DNA σταθεροποιητική συνδέτες. Λόγω της εξειδίκευσής τους για G4-DNA, στα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε ως συνδέτες τροποποιημένα φθαλοκυανίνες: τετράκις- (διισοπροπυλ-γουανιδίνη) φθαλοκυανίνη (DIGP) και Ζη περιέχουσα της παράγωγο Ζη-DIGP (Σχήμα 5a) [31] – [33] . Τα κύτταρα HeLa πρώτα σε επεξεργασία με 1 ή 5 μΜ DIGP ή Ζη-DIGP για 24 ώρες και στη συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν με ένα μίγμα pHRAS-Luc και pRL-CMV. Μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 48 ώρες πριν από την πυγολαμπίδα και

Renilla

λουσιφεράσες δραστηριότητα μετρήθηκαν με ένα φωτόμετρο. Ως μάρτυρας (i) που κατεργάζεται τα κύτταρα με TMPyP2, μια πορφυρίνη που δεν δεσμεύεται με G4-DNA [34]? (Ii) που χρησιμοποιείται ως ρεπόρτερ διάνυσμα pHRAS-Mut1 ή pHRAS-mut2 φέρουν ένα μεταλλαγμένο G-στοιχείο σε θέση να σχηματίσουν μια δομή τετραπλών. Σχήμα 5b, c, d δείχνει ότι DIGP και Ζη-DIGP αναστέλλουν ισχυρά λουσιφεράσης από άγριου-τύπου pHRAS-Ιυο, ενώ TMPyP2 δεν το κάνει. Επιπλέον, οι φθαλοκυανίνες δεν αναστέλλουν λουσιφεράσης στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τον μεταλλαγμένο πλασμίδια pHRAS-Mut1 ή pHRAS-mut2, σύμφωνα με το γεγονός ότι οι G-τετραπλά δεν μπορεί να σχηματιστεί από αυτούς τους φορείς. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις ότι η τετραπλά

qhras

-1 και

qhras

-2 δρουν ως καταστολείς της μεταγραφής.

(α) Δομή του τετράκις- (διισοπροπυλ-γουανιδίνη) φθαλοκυανίνης (DIGP) που χρησιμοποιείται, με Ζη που περιέχει το ανάλογο της Ζη-DIGP, για πειράματα λουσιφεράση? (Β) Διπλή δοκιμασίες λουσιφεράσης δείχνουν ότι γουανιδίνιο φθαλοκυανίνες DIGP και Zn-DIGP, σταθεροποίηση

HRAS

-1 και

HRAS

-2 τετραπλά, καταστέλλουν

HRAS

δραστηριότητα του υποκινητή. Αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρείται με τα μεταλλαγμένα πλασμίδια pHRAS-Mut1 και pHRAS-Mut2 (έλεγχος) (πάνελ c και d). Σχετική λουσιφεράσης δίνεται από R

T /R

NT × 100, όπου R

T και R

NT είναι (λουσιφεράσης πυγολαμπίδας) /(

Renilla

λουσιφεράσης) σε Τ24 κύτταρα κατεργάζεται με φθαλοκυανίνες και μη επεξεργασμένα κύτταρα. Οι διαφορές από τον έλεγχο που υποστηρίζονται από Φοιτητών

t

τεστ, P & lt? 0,05 (αστερίσκο), P & lt?. 0.01 (δύο αστερίσκους)

Η

Μεταγραφή παράγοντες Sp1 και MAZ δεσμεύονται να παραβλεφθούν ακολουθίες που σχηματίζουν (QFs)

HRAS

-1 και

HRAS

-2

Καθώς τα δεδομένα της μεταγραφής μας δείχνουν ότι και οι δύο ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 είναι κρίσιμης σημασίας για τη μεταγραφή, ρωτήσαμε αν αναγνωρίζονται από τις πυρηνικές πρωτεΐνες. Μια απάντηση στο ερώτημα αυτό ελήφθη με αναλύσεις της κινητικότητας μετατόπισης με ένα πυρηνικό εκχύλισμα HeLa. Σχήμα 6α δείχνει ότι και τα δύο

HRAS

δίπολα μορφή με HeLa πυρηνικά εκχυλίσματα διακριτά συμπλέγματα DNA-πρωτεΐνης, δείχνοντας έτσι το ενδιαφέρον αυτών των αλληλουχιών για

HRAS

μεταγραφή. Ishii

et al.

Έδειξε ότι η ακολουθία

HRAS

-2, το οποίο περιέχει δύο αντίγραφα του GGGCGGG, δεσμεύεται από Sp1 [13], [14]. Ωστόσο, ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 πρέπει επίσης να αλληλεπιδράσει με τον παράγοντα myc σχετίζεται μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου (MAZ), τη θέση συνδέσεώς της είναι (G /C) GG (C /Α) GGG [35], [36]. Στην πραγματικότητα, έχει αναφερθεί ότι η MAZ και Sp1 συχνά ρυθμίζουν μεταγραφή με έναν συνεργατικό τρόπο [37], [38].

(α) EMSA που δείχνει το σχηματισμό συμπλοκών DNA-πρωτεΐνης μεταξύ διπόλων

HRAS

-1 και

HRAS

-2 και πυρηνικά εκχυλίσματα HeLa? Οι ποσότητες εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται (μg) αναφέρεται, ραδιοσημασμένο DNA ήταν περίπου 4 nM. Γράμματα Α, Β και Γ δείχνουν τα σύμπλοκα ϋΝΑ-πρωτεΐνης? (Β) ανάλυση ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης που δείχνουν την αλληλεπίδραση των MAZ και Sp1 με ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2. Η αλληλεπίδραση μεταξύ MAZ και SP1 με την

HRAS

αλληλουχιών αναλύθηκε με PCR ενίσχυση των 190 bp (

HRAS

-1) και 161 bp (

HRAS

-2) θραύσματα. Οι δύο ζώνες για πολύπλοκες MAZ:hras-1 έχουν ληφθεί με την παρουσία και απουσία Mg

2+ στο μίγμα (c) EMSA που δείχνει τη δέσμευση του MAZ-GST και GST-Sp1 να τετραπλά

qhras

-1 και

qhras

-2.

Η

για να αποδείξει ότι Sp1 και MAZ συνδέονται με ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 κάτω από το

in vivo

συνθήκες, πραγματοποιήσαμε ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (chip) θα πειράματα. Τα ζωντανά κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορμαλδεΰδη για να συνδέσει εγκάρσια τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης, χρωματίνη ήταν ψαλιδισμένα σε τεμάχια και έπειτα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-MAZ και αντισώματα αντι-Sp1 (ABS). Η αφθονία του

HRAS

αλληλουχίες υποκινητή στα ανοσοϊζήματα μετρήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2. Τα αποτελέσματα αναφέρονται στο Σχήμα 6β δείχνουν ότι: IgG Ab δεν ανοσοκατακρήμνισε συμπλέγματα DNA-πρωτεΐνης που περιέχει ακολουθία

HRAS

-1 ή

HRAS

-2 (αρνητικός μάρτυρας)? αντι-MAZ Ab έκανε ανοσοκατακρήμνισμα ένα συγκρότημα DNA-πρωτεΐνης που περιέχει

HRAS

-1 και

HRAS

-2? αντι-Sp1 Ab γκρέμισαν ένα συγκρότημα με

HRAS

-2. Με τη μέτρηση της έντασης των ζωνών, διαπιστώσαμε ότι το

HRAS

αλληλουχίες ήταν πιο άφθονα στα ανοσοκαθιζήματα με αντι-MAZ και αντι-Sp1 Abs σε σχέση με το προϊόν ανοσοκαταβύθισης IgG Ab. Εμείς έτσι στο συμπέρασμα ότι κάτω από το

in vivo

συνθήκες MAZ συνδέεται με αλληλουχίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2, ενώ Sp1 συνδέεται σε σειρά

HRAS

-2. Αυτό επιβεβαιώθηκε από τον EMSA με ανασυνδυασμένη MAZ και Sp1 (Σχήμα S3). Δεδομένου ότι οι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι MAZ συνδέεται με G4-DNA από το μυϊκό

KRAS

[24] και

c-myb

[39] υποκινητές, ερευνήσαμε αν συνδέεται επίσης με τον

HRAS

τετραπλά. Πραγματοποιήσαμε EMSA με ανασυνδυασμένη MAZ και Sp1, οι οποίες εκφράζονται σε

Ε. πρωτεΐνες σύντηξης coli

ως GST (Σχήμα S4). Το Σχήμα 6c δείχνει ότι σε ρΗ 7,4, 50 mM ΚΟΙ,

qhras

-1 και

qhras

-2 με αυξανόμενες ποσότητες μορφή MAZ-GST – με την παρουσία 100-πλάσιας περίσσειας μη ραδιολογικά σημειωμένο πολυ d (IC) – δυο καθυστερημένος ζώνες λόγω του σχηματισμού δύο συμπλεγμάτων ϋΝΑ-πρωτεΐνης, πιθανότατα με 1:01 και 1:02 στοιχειομετρία. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι σε 50 mM ΟδΟΙ, όπου η

HRAS

αλληλουχίες είναι αδόμητη (βλέπε DMS ανάλυση πατημασιάς), και τα δύο συγκροτήματα αποσταθεροποιούνται υποδεικνύοντας ότι η αλληλεπίδραση DNA-πρωτεΐνης διαμεσολαβείται από τη δομή τετραπλών. Σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα σε ρΗ 9 όπου MAZ τροποποιεί πιθανώς δική αναδίπλωση της, η αλληλεπίδραση DNA-πρωτεΐνης αναστέλλεται επίσης. Δοκιμάσαμε επίσης την δέσμευση του Sp1-GST στο

HRAS

τετραπλά και διαπίστωσε ότι Sp1-GST αλληλεπιδρά με την αντιπαράλληλη

qhras

-1 τετραπλών, αλλά σε ασθενέστερη τρόπο σε σύγκριση με MAZ.

MAZ και Sp1 συνεργικά ενεργοποίηση

HRAS

μεταγραφή

Για να αποδείξει ότι MAZ και Sp1 εμπλέκονται σε

HRAS

μεταγραφή, είμαστε συν-επιμολυσμένα πλασμίδιο pHRAS-Luc σε κύτταρα HeLa είτε με pMAZ (κωδικοποίηση για ΜΑΖ) ή pSp1 (κωδικοποίηση για SP1) ή με ένα μίγμα δύο πλασμιδίων (Σχήμα 7α). Όταν pMAZ ή pSp1 συνεπιμολύνθηκε με τον φορέα ρεπόρτερ, το επίπεδο της έκφρασης της λουσιφεράσης αυξήθηκε κατά 50% σε σύγκριση με τον έλεγχο. Όταν και οι δύο pMAZ και pSp1 συνεπιμολύνθηκαν με τον φορέα αναφοράς, η μεταγραφή αυξήθηκε σχεδόν 3 φορές πάνω από τον έλεγχο, που δείχνει ότι οι δύο πρωτεΐνες συνεργικά ενεργοποιηθεί

HRAS

υποκινητή. Η συνέργεια ήταν ισχυρότερη (7 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο), όταν pMAZ και pSp1 συνεπιμολύνθηκαν με το μεταλλαγμένο διάνυσμα pHRAS-Mut1 ή pHRAS-mut2, που φέρουν μεταλλαγμένα

HRAS

-1 ή

HRAS

– 2 σειρές οι οποίες δεν είναι σε θέση να σχηματίσουν δομές τετραπλών. Αυτό υποδηλώνει ότι η μεταγραφή ενεργοποιείται όταν ακολουθίες

HRAS

-1 και

HRAS

-2 είναι στην ξεδιπλωμένη duplex διάπλαση. Επιπλέον, ως απόδειξη ότι η μεταγραφή απαιτεί τόσο MAZ και Sp1, εμείς γκρέμισε με επικυρωμένες shRNA κάθε ένα από τα δύο παραγόντων μεταγραφής ξεχωριστά (Σχήμα S5). κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με shRNA ειδικό για MAZ ή Sp1 και των επιπέδων

HRAS

μεταγραφές μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, στις 48 και 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Είναι δυνατόν να φανεί ότι

HRAS

μεταγραφή μειώθηκε σε 30 και 20% του ελέγχου, 48 ώρες μετά τη θεραπεία με αντι MAZ και αντι Sp1 shRNA, αντίστοιχα (Σχήμα 7b). Στο σύνολό τους τα δεδομένα μας δείχνουν ότι

HRAS

μεταγραφή ενεργοποιείται συνεργικά με MAZ και Sp1.

(α) κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με pHRAS-Luc /pRL-CMV, pHRAS-Luc /pRL-CMV /pMAZ? pHRAS-Luc /pRL-CMV /pSp1? pHRAS-Luc /pRL-CMV /pMAZ /pSp1. Οι διπλοί προσδιορισμοί λουσιφεράσης διεξήχθησαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Σχετική φωταύγεια δίνεται από R

T /R

NT × 100, όπου R

NT είναι (λουσιφεράσης πυγολαμπίδας) /(

Renilla

λουσιφεράσης) σε κύτταρα Τ24 αντιμετωπίζονται μόνο με pHRAS-Luc και pRL-CMV, ενώ R

T είναι (λουσιφεράσης πυγολαμπίδας) /(

Renilla

λουσιφεράσης) σε κύτταρα Τ24 αντιμετωπίζονται με pHRAS-Luc + pMAZ ή /και pSp1 + pRL-CMV. Οι διαφορές από τον έλεγχο που υποστηρίζονται από Φοιτητών

t

τεστ, P & lt? 0,05 (αστερίσκο), P & lt? 0,01 (δύο αστερίσκους)? (Β) Επίπεδο

HRAS

μεταγραφή σε κύτταρα HeLa στα οποία MAZ ή Sp1 χτυπήθηκε κάτω από επικυρωμένη Τα siRNAs.

Η

MAZ αποσταθεροποιεί τις

HRAS

G-τετραπλά

Θεωρώντας ότι MAZ είναι απαραίτητη για

HRAS

μεταγραφή και αναγνωρίζει

qhras

-1 και

qhras

-2, ρωτήσαμε αν αυτά τα τετραπλά ξετυλίγεται από MAZ. Για να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό, πραγματοποιήσαμε πειράματα FRET-τήξης με ανασυνδυασμένο MAZ-GST. Τετράκλινο

qhras

-1 άκρο σημασμένο με FAM και TAMRA επωάστηκε σε 50 mM KCl, για 30 λεπτά με την παρουσία αυξανόμενων ποσοτήτων MAZ-GST ή πρωτεΐνη ελέγχου (BSA ή τρυψινογόνο). Οι καμπύλες τήξης (-dF /dT) έδειξε ότι

qhras

-1 και μόνο λιώνει με χαρακτηριστική διφασικό προφίλ της με

T

Μ στους 53 και 67 ° C καμπύλη (Σχήμα 8α 1 ). Αλλά όταν

qhras

-1 επωάστηκε με MAZ-GST στο (moles πρωτείνης) /(moles του DNA) αναλογία r = 2,5, 5, 10 (καμπύλες 4, 5 και 6), το προφίλ τήξης άλλαξε σημαντικά, καθώς το

T

M έπεσε στο ~46 ° C. Αυτό δείχνει ότι και οι δύο

qhras

-1 είναι τετραπλά αποσταθεροποιείται από MAZ-GST. Όπως ήταν αναμενόμενο, μη ειδική πρωτεΐνες όπως BSA ή τρυψινογόνου σε r = 10 δεν επηρέασε την τήξη του

qhras

-1 (καμπύλες 2,3). Λόγω της υψηλής σταθερότητάς της σε κάλιο (

T

Μ = 78 ° C σε 10 mM KCl),

qhras

-2 αναλύθηκε σε 100 mM NaCl, όπου ο

T

M ήταν 65 ° C. Επωάστηκαν με MAZ-GST στο r = 2,5, 5, 10, ο τετραπλών τήκεται στους 42 ° C, υποδεικνύοντας ότι επίσης

qhras

-2 αποσταθεροποιήθηκε με MAZ-GST, αλλά όχι από BSA ή τρυψινογόνο. Διαπιστώσαμε επίσης ότι η GST δεν είχε καμία επίδραση στην τήξη των

HRAS

τετραπλά (Σχήμα S6b). Ένα πρόσθετο έλεγχο που εκτελείται για να αποκλείσει ότι βακτηριακών πρωτεϊνών δεν συμβάλλουν στην παραβλεφθούν αποσταθεροποίηση ήταν να αναμειγνύεται Γλουταθειόνης Sepharose 4Β ρητίνη με ένα εκχύλισμα που λαμβάνεται από μη-μετασχηματισμένα βακτήρια BL21 DE3 pLysS. Μία ανάλυση SDS-PAGE του εκλούσματος με 10 mM ανηγμένη γλουταθειόνη έδειξε ότι δεν βακτηριακές πρωτεΐνες δεσμεύονται μη-ειδικά στη ρητίνη (Εικόνα S6a).

Πείραμα

FRET-τήξης που δείχνουν ότι σε 50 mM ΚΟΙ, MAZ-GST στο r = 2,5, 5 και 10 (r = [MAZ] /[G4-DNA]) (καμπύλες 4, 5 και 6) αποσταθεροποιεί παραβλεφθούν

qhras

-1 σε 50 mM ΚΟΙ, 50 μΜ Ζη-οξεικό [καμπύλη 1 (πίνακας α)] και παραβλεφθούν

qhras

-2 σε 100 mM NaCl, 50 μΜ Ζη-οξεικό [καμπύλη 1, (πάνελ b)]. BSA και TR (τρυψινογόνο) σε r = 10 δεν έχουν καμία επίδραση στο

qhras

-1 και

qhras

-2 τετραπλών) (καμπύλες 2 και 3, πάνελ Α και Β)? (Γ) Σχηματική αναπαράσταση του

HRAS

ρύθμιση της μεταγραφής που προτείνονται από την παρούσα μελέτη. Όταν τα κρίσιμα στοιχεία προαγωγού

HRAS

-1 και

HRAS

-2 είναι διπλωμένα, συμπεριφέρονται ως καταστολείς της μεταγραφής. Αυτό υποδηλώνεται από το γεγονός ότι τετραπλών-αποσταθεροποίησης σημειακές μεταλλάξεις σε

HRAS

-1 και

HRAS

-2 αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση της μεταγραφής, ενώ οι φθαλοκυανίνες τετραπλών σταθεροποιητική βρέθηκε να καταστέλλει μεταγραφή . MAZ, μέσω της ικανότητάς της να αναγνωρίσει τις δομές τετραπλών, θα πρέπει να προσληφθεί στην κρίσιμη περιοχή του υποκινητή. Η αλληλεπίδραση MAZ-DNA αποσταθεροποιεί τις G-τετραπλά, η κρίσιμη

HRAS

-1 και

HRAS

-2 στοιχεία αναλάβει μια διαμόρφωση διπλής όψης που ευνοεί τη δέσμευση του Sp1 και άλλων πρωτεϊνών των μηχανημάτων μεταγραφής . Αυτά τα γεγονότα έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της μεταγραφής.

Η

Μας εξέπληξε για το ξεδίπλωμα δραστηριότητα MAZ, όπως ανέφερε πρόσφατα ότι MAZ σταθεροποιηθεί το μυϊκό

KRAS

τετραπλών [24]. Ωστόσο, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη το γεγονός ότι MAZ έχει έξι δάχτυλα του ψευδαργύρου μπορεί να αλληλεπιδράσει με το DNA σε ένα πολύπλοκο τρόπο, όπως παρατηρείται με qTBP42 και CBF-Α [40], [41]. Αυτές οι πρωτεΐνες διαταράσσουν την διμερή τετραπλών που σχηματίζεται από την του Fmr1 d (CGG)

n επανάληψη, αλλά επίσης σταθεροποιούν το τελομερές τετραπλών d (TTAGGG)

n. CBF-4 και qTBP42 έχουν τέσσερις περιοχές RNP αλλά μόνο δύο εμπλέκονται σε G4-σύνδεση DNA. Έχει αποδειχθεί ότι διαφορετικοί συνδυασμοί RNP είναι υπεύθυνα για είτε του σταθεροποιητικού ή αποσταθεροποιητικής δράσης.

ODNs δόλωμα G4-DNA που μιμούνται

HRAS

τετραπλών αναστέλλουν τη μεταγραφή και την ανάπτυξη των κυττάρων

Λαμβάνοντας υπόψη ότι

HRAS

μεταγραφή ενεργοποιείται από μια συνδυασμένη δράση των MAZ και Sp1 και ότι

qhras

-1 και

qhras

-2 συνδέονται με MAZ (

qhras

-1 συνδέεται επίσης με SP1), σχεδιάσαμε μια στρατηγική δόλωμα κατά

HRAS

ογκογονίδιο. Εμείς αιτιολογημένη ότι αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια που μιμούνται τετραπλά

qhras

-1 ή

qhras

-2 (G4-κράχτες) θα πρέπει να απομονώνουν MAZ και αναστέλλουν

HRAS

μεταγραφής, καθώς και την ανάπτυξη των κυττάρων ( Σχήμα 8c).