Abstract

Τα ρετινοειδή, τα φυσικά ή συνθετικά παράγωγα της βιταμίνης Α (ρετινόλη), είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη και έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη in vivo, καθώς και για την διαμόρφωση της ανάπτυξης αρκετών καρκινικές κυτταρικές γραμμές του προστάτη. 9-cis-ρετινοϊκού οξέος και all-trans-ρετινοϊκού οξέος είναι τα δύο πιο σημαντικά μεταβολίτες της ρετινόλης. συνδέσεις χάσματος, που σχηματίζονται από πρωτεΐνες που ονομάζονται συνδεσινών, είναι σύνολα των μεσοκυττάρια κανάλια που επιτρέπουν την ανταλλαγή των ρυθμιστικών μορίων μικρού ανάπτυξης μεταξύ γειτονικών κυττάρων. Μεσοκυττάριου επικοινωνία είναι καθοριστική στον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης. Εξετάσαμε την επίδραση της 9-cis-ρετινοϊκού οξέος και all-trans ρετινοϊκό οξύ για το σχηματισμό και την αποδόμηση των κόμβων χάσμα καθώς και στην συνδετική επικοινωνία σε καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, LNCaP, η οποία εξέφρασε ρετροϊό εισήχθη connexin32, μια συνδετίνης εκφράζονται από τα κύτταρα του αυλού και καλά διαφοροποιημένα κύτταρα των όγκων του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το 9-cis-ρετινοϊκό οξύ και παν-τρανς ρητινοϊκό οξύ αύξησε την συναρμολόγηση των connexin32 σε μεσοκυττάριου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι περαιτέρω 9-cis-ρετινοϊκού οξέος και all-trans-ρετινοϊκό οξύ απέτρεψε ανδρογόνο ρυθμίζονται υποβάθμιση των κόμβων χάσμα, μετα-μεταφραστικά, ανεξάρτητα από μεσολαβούμενη σηματοδότηση του υποδοχέα ανδρογόνων. Τέλος, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι ο σχηματισμός του μεσοκυττάριου ευαισθητοποιημένων connexin32-κύτταρα που εκφράζουν LNCaP στην ανάπτυξη τροποποίησης επιδράσεις του 9-cis-ρετινοϊκό οξύ, all-trans-ρετινοϊκό οξύ και ανδρογόνα. Έτσι, τα αποτελέσματα των ρετινοειδών και ανδρογόνα για την ανάπτυξη και τη δημιουργία και την υποβάθμιση των κόμβων χάσμα και η λειτουργία τους μπορεί να σχετίζεται με την ικανότητά τους να ρυθμίζουν την ανάπτυξη του προστάτη και του καρκίνου του

Παράθεση:. Kelsey L, Katoch P, Johnson ΚΕ , Batra SK, Mehta PP (2012) Τα ρετινοειδή ρυθμίζουν τη διαμόρφωση και την Υποβάθμιση της Gap Κόμβων σε ανδρογόνα-Responsive ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (4): e32846. doi: 10.1371 /journal.pone.0032846

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19η Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 31 Ιανουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Kelsey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ CA113903, DOD PCRP (Department of Defense Καρκίνος του προστάτη Ερευνητικό Πρόγραμμα) 081.198, και Νεμπράσκα μέλος Grant LB506 (PPM). Με ιδιαίτερη χαρά ανακοινώνουμε την υποστήριξη της Νεμπράσκα Κέντρο Κυτταρικής Σηματοδότησης και ΝΚΜ εκπαίδευση υποτροφία στο Kristen Johnson. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα ρετινοειδή, τα φυσικά ή συνθετικά παράγωγα της βιταμίνης Α, ρυθμίζουν όχι μόνο την εμβρυϊκή ανάπτυξη, αλλά και την οργανογένεση σε ιστούς ενηλίκων [1]. Μια απαίτηση για βιταμίνη Α για πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση έχει αποδειχθεί σε πολλές μελέτες στις οποίες η ανεπάρκεια αυτής της βιταμίνης οδήγησε σε πολλαπλές αναπτυξιακές ανωμαλίες [1] – [3]. Όλα trans-ρετινοϊκό οξύ (ATRA) και 9-cis-ρετινοϊκού οξέος (9-CRA) είναι οι δύο πιο σημαντικές μεταβολίτες της βιταμίνης Α (ρετινόλη) με ποικίλες φυσιολογικές λειτουργίες [1]. Τα ρετινοειδή είναι μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων παραγόντων μεταγραφής και ασκούν πλειοτροπικές επιδράσεις τους ρυθμίζοντας την έκφραση αρκετών γονιδίων στόχων [3] – [5]. Υπάρχουν έξι υποδοχείς ρετινοειδών, ήτοι α RAR, β, γ, οι οποίες συνδέονται προς ATRA και 9-CRA, και RXR α, β, γ, τα οποία δεσμεύονται μόνο σε 9-CRA. Ρητινοειδούς ξεκίνησε σηματοδότηση ρυθμίζει αρκετές ομοιοστατικών μηχανισμών ελέγχου κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και σε ενήλικες ιστούς και ένας τέτοιος μηχανισμός ελέγχου ενδέχεται να ρυθμιστεί είναι η άμεση επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου που προκαλείται από μια ειδική κατηγορία των διασταυρώσεων κυττάρου που ονομάζεται μεσοκυττάριου (GJS) [6] – [ ,,,0],8]. διασταυρώσεις χάσμα είναι σύνολα των μεσοκυττάρια κανάλια που σηματοδοτούν επιτρέποντας την άμεση ανταλλαγή των μικρών μορίων (≤1500 Da) μεταξύ γειτονικών κυττάρων. Οι πρωτεΐνες συστατικό του GJS, που ονομάζεται συνδετίνες (CXS), κωδικοποιούνται από 21 γονίδια, τα οποία έχουν οριστεί σύμφωνα με μοριακή μάζα τους [9]. Κυττάρου-κυττάρου κανάλια είναι bicellular δομές που σχηματίζεται από την συλλογική προσπάθεια των δύο κυττάρων. Για να σχηματιστεί ένα κανάλι κυττάρου-κυττάρου GJ, CXS ολιγομερισμό πρώτα ως εξαμερών, που ονομάζεται connexons, η οποία αποβάθρα με τις connexons εμφανίζονται σε συνεχόμενα κύτταρα [10]. Πολλαπλές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων προσδίδει αξιοπιστία στην ιδέα ότι η επικοινωνία μεσοκυττάριου είναι μια σημαντική ομοιοστατική μηχανισμό ελέγχου για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης. Για παράδειγμα, μειωμένη έκφραση Cx, ή απώλεια της λειτουργίας, έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση πολλών τύπων καρκίνων, και έχουν μεταλλάξεις σε διάφορα γονίδια Cx έχουν ανιχνευθεί σε γενετικές διαταραχές που χαρακτηρίζονται από ανώμαλη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση [8], [10] – [12]

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι τα κύτταρα του αυλού του προστάτη εξέφρασε Cx32 και η έκφρασή του συνέπεσε με την απόκτηση της διαφοροποιημένης κατάσταση των κυττάρων αυτών [13], [14]. Δείξαμε ότι εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη (PCA) από μια ανδρογόνο-εξαρτώμενη κατάσταση σε μια επεμβατική, ανδρογόνο-ανεξάρτητο κράτος χαρακτηρίστηκε από την αποτυχία της Cx32 να συγκεντρώσει σε GJS [14], [15]. Έχουμε δείξει περαιτέρω ότι η επανεισαγωγή του Cx32 σε αποκρίνονται στο ανδρογόνο ανθρώπινη κυτταρική σειρά PCA, LNCaP, επιβραδύνει την ανάπτυξη των κυττάρων

in vivo

και

in vitro

[14], [16]. Στη συνέχεια, αποδείξαμε ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζεται το σχηματισμό και την αποδόμηση των GJS με μεταβολή του επιπέδου έκφρασης Cx32, μετά τη μετάφραση. Σε περίπτωση απουσίας των ανδρογόνων, ένα σημαντικό κλάσμα του Cx32 αποδομήθηκε με ενδοπλασματικού δικτύου συνδέονται αποικοδόμηση (ERAD), ενώ με την παρουσία τους το κλάσμα αυτό διασώθηκε από την υποβάθμιση [17]. Η σημασία αυτών των ευρημάτων υπογραμμίζεται από το γεγονός ότι τα ανδρογόνα παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και διατήρηση της εκκριτικής (διαφοροποίησης που σχετίζονται) συνάρτηση του αυλού των επιθηλιακών κυττάρων του φυσιολογικού προστάτη, καθώς και των κυττάρων του όγκου ως ανδρογόνων διεγείρει απόπτωση ή αποδιαφοροποίηση των κυττάρων αυτών [18], [19]

όπως ανδρογόνα, τα ρετινοειδή είναι επίσης απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη και διαμορφώνουν την εξέλιξη PCA σε ορισμένα μοντέλα ποντικού, καθώς και καταστέλλουν την ανάπτυξη των εξαρτώμενων από ανδρογόνα και – ανεξάρτητες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PCA. Πλακωδών μεταπλασία του προστάτη παρατηρήθηκε μεταξύ των απογόνων της βιταμίνης Α με ανεπάρκεια [20] και ΒΑΒγ knock out ποντικών [21]. Επιπλέον, ιστο-ειδική αδρανοποίηση της ΚΑΚα στον προστάτη οδήγησε σε πολυ-εστιακή υπερπλασία ενδοεπιθηλιακή [22]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η μειωμένη βιταμίνη Α επίπεδα ορού αυξάνουν PCA επίπτωσης και εξέλιξης, και ότι η αποκατάσταση ρετινοειδών επίπεδα μπορεί να έχουν ένα ρόλο στην αντιστροφή του κακοήθους φαινοτύπου [23], [24]. Αρκετές μελέτες, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έχουν δείξει ότι η ικανότητα των ρετινοειδών να καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και διεγείρουν διαφοροποίηση εξαρτάται ικανότητά τους να ενισχύουν την επικοινωνία μεσοκυττάριου [25] – [28]. Επειδή Cx32 εκφράζεται από αυλού των επιθηλιακών κυττάρων του φυσιολογικού προστάτη, όπου συναρμολογείται σε GJS και από επιθηλιακά κύτταρα των όγκων του προστάτη στο οποίο είναι αναποτελεσματικά συναρμολογείται σε GJS [13] – [15] και επειδή ο σχηματισμός της GJS έχει ενοχοποιηθεί στη διατήρηση της πολωμένο και διαφοροποιημένη κατάσταση των επιθηλιακών κυττάρων [29], εμείς αιτιολογημένη ότι χημειοπροληπτικές, η ανάπτυξη ανασταλτικές και pro-διαφοροποίηση των αποτελεσμάτων του 9-CRA και ATRA μπορεί να προκύψουν από την ικανότητά τους να ελέγχουν τον σχηματισμό και την υποβάθμιση των GJS. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν ο σχηματισμός και η υποβάθμιση των GJS αποτελούνται από Cx32 ρυθμίζονταν από 9-CRA και ATRA σε ανθρώπινα κύτταρα PCA. Επειδή τα ρετινοειδή έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την έκφραση του υποδοχέα ανδρογόνου (AR) σε αποκρίνονται στο ανδρογόνο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PCA [30], μπορούμε ορθολογικά ότι θα μπορούσαν να ρυθμίζουν το σχηματισμό ανδρογόνων ρυθμιζόμενα και υποβάθμιση των GJS και να επηρεάσει την ανάπτυξη αποκρίνονται στο ανδρογόνο κύτταρα PCA που εκφράζουν Cx32. Με τη χρήση κυττάρων LNCaP που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, οι οποίες εκφράζουν ρετροϊό εισήχθη Cx32 των οποίων η αποικοδόμηση είναι ανδρογονο-ρυθμιζόμενες [17], δείχνουμε ότι το 9-CRA και ATRA, όπως ανδρογόνα, να ενισχύσει την έκφραση του Cx32 και την επακόλουθη συναρμολόγηση του σε GJS. Επιπλέον, δείχνουμε περαιτέρω εδώ ότι σε αυτό το μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας, ATRA και 9-CRA πρόληψη των ανδρογόνων-οργανωμένη υποβάθμιση της GJS, ανεξάρτητα από AR σηματοδότηση με τη μεσολάβηση. Τέλος, τα ευρήματα μας δείχνουν ότι η έκφραση της Cx32 και το σχηματισμό των GJS ευαισθητοποιεί τα κύτταρα αυτά για την ανάπτυξη τροποποίηση αποτελέσματα της 9-CRA, ATRA και ανδρογόνα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανδρογόνων-αποκριτικά κύτταρα LNCaP ήταν ένα δώρο από τον Dr. Lin [31]. Ένας από τους αρκετούς κλώνους των κυττάρων LNCaP που εκφράζουν Cx32 ρετροϊικώς αρουραίου, στο εξής θα αναφέρεται ως LNCaP-32 κύτταρα, και ένας από τους διάφορους κλώνους ελέγχου που επιλέγονται σε G418 μετά από μόλυνση με ρετροϊό ελέγχου, εφεξής LNCaP-Ν κύτταρα, απομονώθηκαν όπως περιγράφεται [17] και χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη μαζί με τα μητρικά κύτταρα LNCaP, στο εξής θα αναφέρεται ως LNCaP-Ρ κύτταρα. LNCaP-Ρ κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου σε ατμόσφαιρα καλλιεργειών αέρα και υλικού /95% 5% CO2 διατηρήθηκαν εβδομαδιαία όπως περιγράφηκε προηγουμένως. LNCaP-Ν και LNCaP-32 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI που περιέχει 5% ορό εμβρύου βοοειδούς και G418 στα 200 μg /ml όπως περιγράφουν [17]. Κατά τη διάρκεια αυτών των μελετών, χρησιμοποιήσαμε δυο χωριστές παρτίδες εμβρυϊκού βόειου ορών ελήφθησαν από την Sigma και HyClone Laboratories, με σχεδόν παρόμοια επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP. Στεροειδή εξαντλημένο (απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα) ορός ελήφθη από ΗνΟΙοηε Laboratories (Salt Lake City, UT). Επίσης χρησιμοποιείται άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI για πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό [17].

Αντισώματα και ανοσοχρώση

Hybridoma M12.13 (ένα δώρο από τον Dr. Dan Goodenough, Harvard University) έχει περιγραφεί παλαιότερα [14], [16], [17], [32], [33]. Mouse αντί-occludin (κλώνος OC-3F10) ήταν από Zymed Laboratories Inc. (South San Francisco, CA). Rabbit anti-α-κατενίνης, αντι-β-κατενίνης κουνέλι, κουνελιού αντι-Cx32, και αντι-β-ακτίνης ποντικού (κλώνος C-15) ήταν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Ποντικού αντι-Ε-καδερίνης, αντι-α-κατενίνης ποντικού, τα αντισώματα αντι-β-κατενίνης ποντικού γενναιόδωρα που παρέχονται από τους Drs. Johnson και Wheelock (Έπλι Institute) και έχουν περιγραφεί [17], [32], [33]. Ένα αντίσωμα αντι-υποδοχέα AR πολυκλωνικό κουνελιού ήταν από την Santa Cruz Biotech (SC-13062, San Diego, CA). Τα κύτταρα ανοσοχρώστηκαν μετά τον καθορισμό με 2% παρα-φορμαλδεϋδη για 15 λεπτά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [32], [33]. Εν συντομία, κύτταρα (1.5 × 10

5), σπάρθηκαν σε έξι καλά συστάδες που περιέχουν γυάλινες καλυπτρίδες και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε περίπου 50-70% συρροή, ανοσοχρωματίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με διάφορα αντισώματα κατά κατάλληλα βαθμονομημένος αραιώσεις. Δευτερογενή αντισώματα (κουνέλι ή ποντίκι) συζευγμένο με Alexa 488 και Alexa 594 χρησιμοποιήθηκαν ως κατάλληλη. Εικόνες ανοσοχρωματίστηκε κύτταρα αποκτήθηκαν με Leica DMRIE μικροσκόπιο (Leica Microsystems, Wetzler, Γερμανία) εξοπλισμένο με Hamamatsu κάμερα ORCA-ER CCD (Hamamatsu-City, Ιαπωνία). Για τις μελέτες συν-εντοπισμού, σειριακό z-τομές (0,5 μm) συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό επεξεργασίας εικόνας (Volocity? Improvision, Inc? Perkin Elmer).

Λύσεις Χρηματιστήριο

Στοκ λύσεις διάφορα αντιδραστήρια παρασκευάστηκαν ως ακολούθως: 9-CRA και ATRA (ΒΙΟΜΟΕ, Plymouth, ΡΑ) παρασκευάστηκαν σε αιθανόλη σε 3 mM το καθένα και φυλάχθηκε σε δείγματα στους -80 ° C προστατευμένο από το φως. Όλα τα πειράματα που αφορούν την 9-CRA και ATRA διεξήχθησαν σε κίτρινο φως, όπως περιγράφεται [26], [27]. Στοκ διαλύματα ενός συνθετικού ανδρογόνου, μιβολερόνη (ΜΒ), (ΒΙΟΜΟΕ), και ενός φυσικού ανδρογόνου, διυδρο-τεστοστερόνη (DHT), παρασκευάσθηκαν σε 1 mM σε αιθανόλη και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C σε μικρά κλάσματα προστατευμένο από το φως. Είχαν κατάλληλα αραιωμένο με το μέσο κατά τον χρόνο της θεραπείας.

ανδρογόνα εξάντληση και άλλες θεραπείες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι καλά συστάδες που περιέχουν καλυπτρίδες από γυαλί (1.5 × 10

5 κυττάρων ανά φρεάτιο) και σε 6-cm (2 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο) ή IN10-cm πιάτα (3.5 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο) σε 2, 4 και 10 ml μέσου πλήρης καλλιέργειας, αντίστοιχα. Τα κύτταρα κατεργάστηκαν όταν περίπου 50% συρρέοντα, με αναπλήρωση με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορα αντιδραστήρια στην επιθυμητή συγκέντρωση προστίθενται από διαλύματα αποθέματος έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του διαλύτη δεν υπερέβη το 0,3%. Για να αναπτυχθεί κύτταρα κάτω από ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο, ​​φυσιολογικό μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (κόκκινο φαινόλης-ελεύθερο RPMI που περιέχει 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό). Οι έλεγχοι έλαβαν φρέσκο ​​θρεπτικό μέσο που περιέχει φυσιολογικό ορό.

Ανάλυση Western Blot και απορρυπαντικών Διαλυτότητα του Connexin32

Η κυτταρική λύση, δοκιμασία απορρυπαντικό διαλυτότητα με 1% Triton Χ-100 (ΤΧ-100) και την έκφραση επίπεδο του Cx32 αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western όπως περιγράφεται [17], [32], [33]. Εν συντομία, 5 χ 10

5 LNCaP-P, LNCaP-Ν και LNCaP-32 κύτταρα σπάρθηκαν ανά cm τρυβλίο 10 σε 10 ml πλήρους μέσου και αναπτύχθηκαν σε συρροή, μετά την οποία τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό SSK (10 mM Tris , 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM ΝΕΜ, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM ιωδοακεταμίδιο, 0.5% ΤΧ-100, ρΗ 7.4) συμπληρωμένο με το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma , St. Louis, ΜΟ). Σύνολο, απορρυπαντικό διαλυτά και αδιάλυτων εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με υπερφυγοκέντρηση στα 100000 χ g για 60 λεπτά (35.000 rpm σε υπερφυγόκεντρο Beckman αναλυτικό? Model 17 έως 65 χρησιμοποιώντας ένα στροφείο SW50.1). Το απορρυπαντικό-αδιάλυτα ιζήματα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα C (70 mM Tris /HCl, ρΗ 6.8, 8 Μ ουρία, 10 mM ΝΕΜ, 10 mM ιωδοακεταμίδιο, 2.5% SDS, και 0.1 Μ DTT). Μετά την κανονικοποίηση με βάση τον αριθμό των κυττάρων, η συνολική, ΤΧ-100-διαλυτά και αδιάλυτων κλασμάτων αναμίχθηκαν με 4 Χ ρυθμιστικό διάλυμα SDS-φόρτωσης σε μία τελική συγκέντρωση 1 × και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα (για Cx32) πριν από την SDS- PAGE ανάλυση

αναλύσεις επικοινωνία

μεσοκυττάριου επικοινωνίας δοκιμάστηκε με μικροέγχυση τις ακόλουθες φθορισμού ιχνηθετών:. Lucifer Yellow (MW 443 Da? άλας λιθίου)? Alexa Fluor 488 (MW 570 Da? Α-10436), και Alexa Fluor 594 (MW 760 Da? Α-10438). Στοκ διαλύματα των βαφών Alexa, που ελήφθη όπως υδραζίδιο άλατα νατρίου από την Molecular Probes (Carlsbad, CA), παρασκευάστηκαν σε νερό σε 10 mM. Lucifer κίτρινο μικροενέθηκε ως 2.5% υδατικό διάλυμα αποθέματος. Eppendorf InjectMan και FemtoJet συστήματα μικροένεση (μοντέλα 5271 και 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, Νέα Υόρκη), τοποθετημένα σε Leica DMIRE2 μικροσκόπιο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιήθηκαν για να microinject φθορισμού ιχνηθέτες. Οι εικόνες μικροεγχυμένων κύτταρα συνελήφθησαν με τη βοήθεια της κάμερας CCD (Retiga 2000R, FAST 1394) χρησιμοποιώντας QCapture (British Columbia, Καναδάς) και αποθηκεύονται ως αρχεία TIFF. Συνδετική μεταφορά του φθορίζοντος ιχνηθέτη προσδιορίσθηκε ποσοτικά με βαθμολόγηση του αριθμού των φθοριζόντων κυττάρων (εκτός της εγχέεται ένα) από τις εικόνες συλλαμβάνονται TIFF είτε σε 1 min (Lucifer Yellow), 3 min (Alexa 488) και 15 λεπτά (Alexa 594) μετά μικροέγχυση σε θάλαμο δοκιμής όπως περιγράφεται [14], [17], [32], [34].

εκτιμήθηκε Colony σχηματισμό και την ανάπτυξη των κυττάρων Αναλύσεις

η ανάπτυξη των κυττάρων, είτε με τη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας ή με καταμέτρηση κύτταρα όπως περιγράφεται [14], [34]. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, 2 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 cm δίσκους εις τριπλούν σε μέσο καλλιέργειας 3 ml. Μετά από 24 ώρες, ένα μέσο που περιέχει ml MB, 9-CRA και ATRA προστέθηκε στα πιάτα για να δώσει την επιθυμητή τελική συγκέντρωση. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 3-4 εβδομάδες (με μια αλλαγή μέσου κάθε 4-5 ημέρες που περιέχει την κατάλληλη συγκέντρωση του ΜΒ, DHT, 9-CRA και ATRA) όταν ορατές αποικίες. Οι αποικίες σε τρυβλία μονιμοποιήθηκαν με 3.7% ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με 0,025% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους σε PBS και φωτογραφήθηκαν. Για τη μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης, 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 cm δίσκους σε επαναληπτικές και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΜΒ, 9-CRA και ATRA είτε μόνα τους ή σε συνδυασμό, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 9-11 ημέρες με ένα αλλαγή μέσου την ημέρα 5. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν σε αιματοκυτταρόμετρο.

Αποτελέσματα

Τα ρετινοειδή Ενίσχυση Cx32 έκφραση Επίπεδο

Χρησιμοποιήσαμε LNCaP 32-κύτταρα που εκφράζουν Cx32 ρετροϊικώς αρουραίου [17], επειδή η γονική LNCaP-P και LNCaP-Ν κύτταρα στερούνται ανιχνεύσιμα επίπεδα γνωστών CXS και δεν αποτελούν λειτουργικές GJS (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Προγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι σε LNCaP-32 κύτταρα ανδρογόνα ρυθμίζεται το σχηματισμό και την αποδόμηση των GJS ελέγχοντας το επίπεδο έκφρασης της Cx32 μετά τη μετάφραση, με τη διάσωση ERAD μεσολάβηση αποικοδόμηση της [17]. Με βάση τη λογική που περιγράφηκε παραπάνω (βλέπε εισαγωγή) και την εμπειρία μας με άλλες κυτταρικές γραμμές [26], [27], LNCaP-32 κύτταρα κατεργάστηκαν με 9-CRA και ATRA επί 48 ώρες για να εξετάσει εάν επηρεάζουν το επίπεδο έκφρασης Cx32. Βρήκαμε ότι το 9-CRA και ATRA αυξημένο επίπεδο έκφρασης Cx32 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1, Α). Σημαντική βελτίωση, ωστόσο, παρατηρήθηκε μόνο σε συγκέντρωση 1 μΜ ή υψηλότερη. Όπως εκτιμάται από την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, συγκεντρώσεις υψηλότερες από 1 μΜ ήταν τοξικές για τα κύτταρα αυτά (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και ως εκ τούτου επιλέξαμε 1 μΜ 9-CRA και ATRA για τις επόμενες μελέτες. Μελέτες πορεία χρόνος έδειξε ότι η ενίσχυση με δύο ρετινοειδή συνέβη ήδη 24 ώρες μετά τη θεραπεία και έφτασε ένα πλατό στους 72 h (Σχήμα 1, Β). Η επίδραση της 9-CRA και ATRA σε επίπεδο έκφρασης Cx32 ήταν συγκρίσιμο με αυτό που παρατηρήθηκε με ένα συνθετικό ανδρογόνο, μιβολερόνη (ΜΒ), και δεν παρατηρήθηκε με RAR-ειδικών συνδετήρων, 13-CRA και tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic οξύ (ΤΤΝΡΒ), ή με 4-υδροξυ-phenretinamide (4-HPR) (Σχήμα 1 C). Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον 9-CRA και ATRA αύξησε το επίπεδο έκφρασης των άλλων πρωτεϊνών που συνδέονται διασταύρωση των κυττάρων. Βρήκαμε ότι τόσο 9-CRA και ATRA δεν είχε σημαντική επίδραση επί του επιπέδου έκφρασης των πρωτεϊνών προσφύσεως διασταύρωση Ε-καδερίνης και α- και β-κατενίνες, ωστόσο, το επίπεδο έκφρασης των σφιχτών διασταύρωση πρωτεΐνη που συνδέεται, occludin, ενισχύθηκε σε κάποιο βαθμό (Σχήμα 1 D). Επιπλέον, 9-CRA και ATRA ούτε προκάλεσε την έκφραση του ενδογενούς Cx32 σε γονικά κύτταρα LNCaP ούτε μεταβάλλεται το επίπεδο έκφρασης του ρετροϊό μεταγραμμένου mRNA Cx32 σε LNCaP-32 κύτταρα όπως μετράται με ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Cx32 εκφράζουν LNCaP-32 κύτταρα κατεργάστηκαν με 9-CRA, ATRA, MB και άλλα ρετινοειδή όπως υποδεικνύεται. Α δοσοεξαρτώμενες ενίσχυση των επιπέδων έκφρασης Cx32 κατά 9-CRA και θεραπεία ATRA επί 48 ώρες. Σημειώστε ότι σημαντική αύξηση παρατηρείται μόνο σε συγκεντρώσεις πάνω από 0,5 μΜ. B. Κινητική ενίσχυση των επιπέδων έκφρασης Cx32 κατά την επεξεργασία με 9-CRA και ATRA (1 μΜ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Σημειώστε ότι η ενίσχυση παρατηρείται ήδη στις 24 ώρες. C. Μόνο το 9-CRA και ATRA και MB αυξήσει το επίπεδο έκφρασης Cx32. Σημειώστε ότι RAR ειδικά ρετινοειδή, ΤΤΝΡΒ (tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic οξύ), και 13-CRA (13-cis-ρετινοϊκό οξύ) και το άλλο άσχετα ρετινοειδές, 4-HPR, είναι αναποτελεσματικά. Σημειώστε ότι MB (2,5 ηΜ) είναι τουλάχιστον 300-500 φορές πιο ισχυρή από 9-CRA και ATRA επί ισογραμμομοριακής βάσης. Δ Επίδραση της 9-CRA και ATRA σε adherens και σφιχτό συνδέονται διασταύρωση πρωτεϊνών. Έκφραση των προσφύσεων διασταύρωση που σχετίζονται πρωτεΐνες Ε-καδερίνης και α- και β-κατενίνες, και σφιχτό διασταύρωση πρωτεΐνη που συνδέεται, occludin, αναλύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών κυτταρικό λύμα (5 μg). Σημειώστε ότι μόνο η έκφραση της occludin φαίνεται να αλλάξει αισθητά.

Η

Τα ρετινοειδή Ενίσχυση Gap Junction Συνέλευση και επικοινωνία των στενών τμημάτων

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της 9-CRA και ATRA για τη συναρμολόγηση των Cx32 σε GJS και στην κομβική επικοινωνίας. Ταυτόχρονη με την αύξηση του επιπέδου έκφρασης Cx32, 9-CRA και ATRA αυξημένη συναρμολόγηση GJ όπως εκτιμήθηκε ανοσοκυτταροχημικώς (Σχήμα 2 Α) και βιοχημικά με ανάλυση κηλίδος Western των συνολικών και Triton X (ΤΧ) -100-αδιάλυτο εκχυλίσματα [16], [17], [35] παρασκευάστηκε σε διάφορους χρόνους μετά την αγωγή (Σχήμα 2 Β). Επιπλέον, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η ενίσχυση της συναρμολόγησης GJ συνοδεύτηκε από παράλληλη αύξηση των στενών τμημάτων επικοινωνίας, όπως μετράται με τη συνδετική μεταφορά των τριών GJ ιχνηθετών διαπερατό φθορισμού, Lucifer Yellow (ΜΒ 443), Alexa 488 (MW 570) και Alexa 594 (ΜΒ 760). Για παράδειγμα, η 9-CRA και ATRA αυξημένη μεταφορά συνδετική του Alexa 594 (MW 760) 2-3 πτυχώσεις σύγκριση με τους ελέγχους (Πίνακας 1). Επειδή E-cadherin έχει δειχθεί ότι διευκολύνει τη συναρμολόγηση των CXS σε GJS [32], [33], και η έκφραση Cx έχει δειχθεί ότι διευκολύνει τη συναρμολόγηση των σφικτών συνδέσμων [29], εξετάσαμε επίσης αν 9-CRA και ATRA αυξημένη το επίπεδο έκφρασης της Cx32 και συναρμολόγηση του σε GJS έμμεσα, διευκολύνοντας τη συναρμολόγηση των άλλων κόμβων κυττάρων όπως εκτιμήθηκε από το απορρυπαντικό-αδιαλυτότητα των συστατικών τους και των συναφών πρωτεϊνών. Βρήκαμε ότι τόσο 9-CRA και ATRA δεν είχε σημαντική επίδραση επί του επιπέδου έκφρασης της προσφύσεως διασταύρωση πρωτεΐνης Ε-καδερίνης, ωστόσο, το συγκρότημα του σφιχτά πρωτεΐνης διασταύρωση, occludin, αλλά όχι πρωτεΐνη που συνδέεται του ΖΟ-1, φάνηκε να έχουν ενισχυθεί (Σχήμα 2 Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το 9-CRA και ATRA, όπως ανδρογόνα, τη βελτίωση του επιπέδου έκφρασης Cx32, και την επακόλουθη συναρμολόγηση του σε GJS, χωρίς να μεταβάλλεται σημαντικά η έκφραση της Ε-καδερίνης, η οποία έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τη συναρμολόγηση των GJS [32], [33], [36], [37]. Όπως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας με ανδρογόνα, η συναρμολόγηση των Cx32 και occludin στο κελί διασταυρώσεις, ή αντίστροφα, φαίνεται να ρυθμίζεται συντονισμένα [17], [29], [38], [39].

Α. LNCaP-32 κύτταρα, που καλλιεργούνται είτε σε έξι καλά συστάδες ή 10-cm πιάτα, υποβλήθηκαν σε αγωγή με 9-CRA και ATRA για διάφορους χρόνους. Συνέλευση του Cx32 (πράσινο) σε GJS αξιολογήθηκε ανοσοκυτταροχημικώς. E-cadherin εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα. Σημειώστε ότι ο σχηματισμός GJ ενισχύθηκε με 9-CRA και ATRA και MB θεραπεία. B. Συνέλευση Cx32 σε GJS, των σφιχτών συνδέονται διασταύρωση πρωτεϊνών, occludin και ΖΟ-1, και adherens πρωτεΐνη διασταύρωση, Ε-καδερίνης, αξιολογήθηκε βιοχημικά με δοκιμασία αδιαλυτότητα TX100 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Σημειώστε επίσης ότι τόσο το συνολικό επίπεδο και το απορρυπαντικό αδιάλυτο κλάσμα του Cx32 αυξήθηκε σημαντικά. Σημειώστε, επίσης, ότι το απορρυπαντικό-διαλυτότητα του συνδέεται πρωτεϊνών adherens διασταύρωση, E-cadherin, δεν επηρεάζεται σημαντικά, ενώ εκείνο των σφιχτό διασταύρωση πρωτεΐνη που συνδέεται, occludin, είναι οριακά ενισχύεται. Στο (Α), οι πυρήνες (μπλε) χρωματίστηκαν με DAPI.

Η

Τα ρετινοειδή Modulate ανδρογόνων-ρυθμιζόμενη Σχηματισμός και Υποβάθμιση της Gap Κόμβων

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι Cx32 αποικοδομήθηκε κατά ανδρογόνων εξάντληση από ERAD, και ότι τα ανδρογόνα ενισχυμένο σχηματισμό GJ με την εκ νέου δρομολόγηση του ERAD στόχευση πισίνα του Cx32 στην κυτταρική επιφάνεια [17]. Με αφορμή τα στοιχεία που δείχνονται στα Σχήματα 1 και 2, έχουμε την επόμενη εξέτασε το επίπεδο έκφρασης της Cx32 και συνδετική και μη συνδετική μοίρα του την εξάντληση των ανδρογόνων με την παρουσία και απουσία της 9-CRA και ATRA. Για τις μελέτες αυτές, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ανδρογόνα εξαντλημένο (απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα), ερυθρού φαινόλης μέσο καλλιέργειας ελεύθερο κυττάρων. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [17], βρήκαμε ότι η εξάντληση των ανδρογόνων μειωμένο επίπεδο έκφρασης Cx32, η οποία εμποδίστηκε με την προσθήκη ΜΒ και DHT (Σχήμα 3 Α). Ωστόσο, βρήκαμε ότι η μείωση στο επίπεδο έκφρασης του Cx32 επίσης αποτρέπεται όταν ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο αναπληρώνονται με 9-CRA και ATRA (Σχήμα 3 Α). Επιπλέον, σε συνδυασμό με θεραπεία ΜΒ και 9-CRA ή ATRA ήταν ούτε συνεργιστική ούτε πρόσθετο σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης Cx32 (Σχήμα 3 Α). Να τεκμηριώσει τα παραπάνω δεδομένα, αξιολογήσαμε το σχηματισμό GJS ανοσοκυτταροχημικώς (Εικόνα 3 Β), βιοχημικά με τη δοκιμασία μη διαλυτότητα των απορρυπαντικών (Σχήμα 3 C), και λειτουργικά με μέτρηση της μεταφοράς κομβική του Lucifer Yellow (MW 443 Da), Alexa 488 (MW 570 Da) και Alexa 594 (ΜΒ 760 Da) (Πίνακας 2). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ανδρογόνο εξάντληση μείωσε τον αριθμό των GJS δραστικά καθώς Cx32-ειδική ανοσοχρώσης σπάνια παρατηρήθηκε σε περιοχές επαφής κυττάρου-κυττάρου, ενώ GJS ανιχνεύθηκαν εύκολα στα κύτταρα όταν ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο συμπληρώθηκε με 9-CRA και ATRA και με ΜΒ και DHT (Σχήμα 3 Β). Σύμφωνα με την ανοσοκυτταροχημική δεδομένα, συνδετική μεταφορά του Lucifer Yellow μειώθηκε σημαντικά κατά ανδρογόνων εξάντληση, η οποία εμποδίστηκε κατά την αναπλήρωση ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο με ΜΒ, ATRA και 9-CRA (Πίνακας 2). Η δοκιμασία απορρυπαντικό αδιαλυτότητας ενισχύεται περαιτέρω η ανοσοκυτταροχημικές και συνδετική μεταφορά δεδομένων (Εικόνα 3 C). Όπως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας, η εξάντληση των ανδρογόνων δεν είχε σημαντική επίδραση επί της διαλυτότητας του απορρυπαντικού του Ε-καδερίνης και β-κατενίνης και σφιχτό διασταύρωση πρωτεΐνη που συνδέεται, ΖΟ-1 (Σχήμα 3 C). Ως μάρτυρας, εξάντληση ή προσθήκη ανδρογόνων, 9-CRA και ATRA γονικής LNCaP-Ρ και G418-ανθεκτικά κύτταρα LNCaP-Ν ούτε συγκρότημα GJ επάγεται ούτε είχε οποιαδήποτε επίδραση επί τη συνδετική μεταφοράς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το 9-CRA και ATRA πρόληψη ανδρογονο-ρυθμιζόμενη αποικοδόμηση της Cx32 και ενισχύουν τον σχηματισμό GJ σε LNCaP-32 κύτταρα. Επειδή συνδυασμένη θεραπεία με ανδρογόνα και ρετινοειδή δεν ήταν ούτε συνεργιστική ούτε πρόσθετο, τα στοιχεία δείχνουν, επίσης, ότι ο σχηματισμός GJ ενισχύεται από τη διάσωση της ίδιας της πισίνας του Cx32 που έχει ως στόχο για ERAD κατά των ανδρογόνων εξάντληση.

LNCaP-32 κύτταρα, που καλλιεργούνται σε 70% συρροή είτε σε έξι καλά συστάδες ή 10-cm πιάτα, μεταφέρθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα, ανδρογόνα εξαντλημένο (Strip) μέσο. Το επίπεδο έκφρασης του Cx32 και σχηματισμό GJS αναλύθηκαν με κηλίδα Western (Α) και ανοσοκυτταροχημική ανάλυση (Β) μετά από 48 ώρες με την παρουσία και απουσία της 9-CRA και ATRA (1 μΜ) και ΜΒ (2,5 ηΜ) και DHT (10 ηΜ). C. Ο σχηματισμός GJS αναλύθηκε επίσης με ανάλυση Western blot του συνολικού, απορρυπαντικό διαλυτά και αδιάλυτων κλασμάτων όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Σημειώστε ότι Cx32 και GJS αποικοδομούνται σε ανδρογόνα-εξαντλημένο μέσο και η υποβάθμιση μπλοκάρεται κατά αναπλήρωση με 9-CRA, ATRA, MB και DHT. Σημειώστε επίσης ότι μόνο το επίπεδο έκφρασης της Cx32 και απορρυπαντικού διαλυτότητά του αλλάξει σημαντικά, ενώ εκείνο των E-cadhiern (Ε-cad), β-κατενίνης (β-CAT) και ΖΟ-1 δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Στο (Β), οι πυρήνες (πράσινο) βάφτηκαν με DAPI. Στο Α, 10 μg της συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκε.

Η

Τα ρετινοειδή βελτίωση Να Gap Junction Σχηματισμός Ανεξάρτητα από ανδρογόνων υποδοχέων Λειτουργία

Η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με 9-CRA έχει αποδειχθεί να ενισχύσει το επίπεδο έκφρασης AR [30]. Για να δοκιμαστεί εάν 9-CRA και ATRA ενισχυμένη έκφραση AR σε κανονικές και ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο, ​​μεγαλώσαμε LNCaP-32 κύτταρα σε έλεγχο, ανδρογόνο-εξαντλημένο και ανδρογόνο-εξαντλημένο συν 9-CRA, ATRA και ΜΒ που περιέχει μέσο για 48 ώρες. Όπως εκτιμάται με ανάλυση στυπώματος Western, βρήκαμε ότι ανδρογόνων εξάντληση μειώνεται τόσο το επίπεδο έκφρασης του AR και Cx32, η οποία εμποδίστηκε κατά αναπλήρωση με MB, DHT, 9-CRA και ATRA (Σχήμα 4 Α). Τα δεδομένα αυτά εγείρει την πιθανότητα ότι 9-CRA και ATRA ενισχυμένη συναρμολόγηση GJ σε ένα AR-εξαρτώμενο τρόπο – και όχι αυτοτελώς. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, υποβάλλαμε σε αγωγή LNCaP-32 κυττάρων με Casodex (βικαλουταμίδη), η οποία εμποδίζει ανδρογόνο δράση με ανταγωνισμό με ανδρογόνα για σύνδεση προς τον AR και λειτουργία [40] αναστολής, [41], και εξετάστηκε το επίπεδο έκφρασης της Cx32 και GJ σχηματισμός κατά την αγωγή με 9-CRA, ATRA και ΜΒ με την παρουσία και απουσία του Casodex σε φυσιολογικά και ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες βρήκαμε ότι η θεραπεία με Casodex προκαλείται αποικοδόμηση του AR (Σχήμα 4 Β) όπως επίσης και κατήργησε την επίδραση του ΜΒ και DHT σε έκφραση Cx32, όπως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας [17]. Ωστόσο, η υποβάθμιση του AR παρατηρήθηκε επίσης με Casodex παρουσία 9-CRA και ATRA τόσο σε ανδρογόνα εξαντλημένο και φυσιολογικό μέσο. Παρά σθεναρά μείωση του επιπέδου έκφρασης AR, διαπιστώσαμε ότι Casodex δεν είχε καμία επίδραση στις 9-CRA- και ATRA μεσολάβηση βελτίωση του επιπέδου έκφρασης Cx32. Για να τεκμηριώσει ότι η μείωση και η αύξηση στην έκφραση Cx32 συνοδευόταν από παράλληλες αλλαγές στο σχηματισμό GJ, εξετάσαμε το σχηματισμό GJS ανοσοκυτταροχημικώς σε Casodx επεξεργασμένα κύτταρα παρουσία και απουσία MB, 9-CRA και ATRA. GJS δεν σχηματίστηκαν όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Casodex σε φυσιολογικό ορό ή σε μέσο ανδρογόνα εξαντλημένο περιέχει MB ή DHT (Σχήμα 5). Από την άλλη πλευρά, βρήκαμε ότι GJS ήταν άφθονα όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Casodex μαζί με 9-CRA ή ATRA (Σχήμα 5). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο μηχανισμός με τον οποίο 9-CRA και ATRA αποτρέψει την υποβάθμιση της Cx32 και να ενισχύσει το σχηματισμό GJ κατά των ανδρογόνων εξάντληση είναι ανεξάρτητη από το επίπεδο έκφρασης AR και /ή λειτουργία ή και τα δύο.

Α. LNCaP-32 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή σε 6 πιάτα cm. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα, ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο (ST) που περιέχει 9-CRA και ATRA (1 μΜ) και ΜΒ (2,5 ηΜ) και DHT (10 ηΜ) για 24 ώρες. Κυττάρων σε μέσο που περιέχει ανδρογόνο (NS) ή ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο (ST) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Το επίπεδο έκφρασης του Cx32 και AR αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Σημειώστε ότι το επίπεδο έκφρασης των δύο Cx32 και AR μειώνει κατά ανδρογόνων εξάντληση και η μείωση μπλοκάρεται κατά την επεξεργασία με 9-CRA, ATRA, MB και DHT. Β κύτταρα, εμβολιάζονται όπως παραπάνω, 32-LNCaP υπέστησαν αγωγή με 9-CRA και ATRA (1 μΜ) και ΜΒ (2,5 ηΜ) και DHT (10 ηΜ) με την παρουσία και απουσία του Casodex (10 μΜ) σε φυσιολογικό και ανδρογόνων-εξαντλημένο μέσο. Το επίπεδο έκφρασης του Cx32 και AR εξετάστηκε μετά κηλίδωση Western. Σημειώστε ότι σε Casodex μέσο που περιέχει, το επίπεδο έκφρασης Cx32 δεν μειώνεται με την παρουσία του 9-CRA και ATRA (1 μΜ) σε ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο μέσο παρά χαμηλό επίπεδο έκφρασης AR. Αυτό δεν παρατηρείται με ΜΒ και DHT.

Η

LNCaP-32 κύτταρα, εμβολιάζονται σε έξι καλά συστάδες που περιέχουν γυάλινες καλυπτρίδες, αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε 70% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν για επιπλέον 24 ώρες σε κανονικό μέσο (NS), σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα, ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο μόνο (ST), σε φυσιολογικό ορό που περιέχει Casodex (NS + CDX), και ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο συμπληρωμένο με ΜΒ ( ST + MB), με ΜΒ και Casodex (ST + MB + CDX), με 9-CRA (ST + CRA), 9-CRA και CDX (ST + CRA + CDX), με ATRA (ST + ATRA), και με ATRA και CDX (ST + ATRA + CDX). Αποδόμηση και υποκυτταρικός εντοπισμός της Cx32 αναλύθηκαν ανοσοκυτταροχημικώς όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Σημειώστε ότι GJS (πράσινο) δεν αποικοδομούνται σε κύτταρα κατεργασμένα με 9-CRA και ATRA τόσο με την παρουσία και απουσία του Casodex ενώ αποικοδομούνται σε φυσιολογικό ορό και ανδρογόνα εξαντλημένο αλλά MB συμπληρωμένο μέσο που περιέχει Casodex.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Η

2.

Η 10.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Η

11.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Η

23.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Η

27.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Η

28.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Απλή αναζήτηση