Αφηρημένο

β-lapachone, ένα σημαντικό συστατικό σε ένα εκχύλισμα αιθανόλης των

Tabebuia avellanedae

φλοιός, είναι ένα πολλά υποσχόμενο δυναμικό θεραπευτικό φάρμακο για διάφορες όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα, την κύρια αιτία της θάνατοι σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Στο πρώτο μέρος αυτής της μελέτης, διαπιστώσαμε ότι αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται στον πνεύμονα καρκινικών κυττάρων με υψηλές συγκεντρώσεις β-lapachone διαμεσολαβήθηκε από αυξημένη ενεργοποίηση του παράγοντα JNK προ-αποπτωτικών και μειωμένη ενεργοποίηση της κυτταρικής επιβίωσης /πολλαπλασιασμού παράγοντες ΡΙ3Κ, ΑΚΤ, και ERK. Επιπλέον, η τοξικότητα β-lapachone συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση και την δραστηριότητα του ΝΑϋ (Ρ) Η κινόνης οξειδορεδουκτάσης 1 (NQO1) στα κύτταρα του όγκου. Στο δεύτερο μέρος, βρήκαμε ότι η FDA εγκεκριμένο μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη σουλινδάκη φαρμάκου και των μεταβολιτών του, θειώδες σουλινδάκ και σουλφονικό σουλινδάκ, αυξημένη έκφραση NQO1 και δραστηριότητα στις κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα CL1-1 και CL1-5, η οποία έχουν χαμηλότερα επίπεδα NQO 1 και χαμηλότερη ευαισθησία σε β-lapachone μεταχείρισης από τις κυτταρικές γραμμές Α549, και ότι η αναστολή της NQO1 είτε θεραπεία δικουμαρόλη ή NQO1 siRNA knockdown ανέστειλε αυτή σουλινδάκη επαγόμενη αύξηση των β-lapachone κυτταροτοξικότητα. Εν κατακλείδι, η σουλινδάκη και οι μεταβολίτες της συνεργικά να αυξήσει τις αντικαρκινικές ιδιότητες της β-lapachone κατά κύριο λόγο από την αύξηση της δραστικότητας του NQO 1 και της έκφρασης, και αυτά τα δύο φάρμακα μπορεί να παρέχει μια νέα συνδυαστική θεραπεία για καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Kung HN, Weng TY, Liu YL, Lu KS, Chau YP (2014) η σουλινδάκη Ενώσεις Διευκόλυνση την κυτταροτοξικότητα της β-Lapachone με αυξητική ρύθμιση του NAD (P) H Quinone Οξειδορεδουκτάσης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (2): e88122. doi: 10.1371 /journal.pone.0088122

Επιμέλεια: Gergely Szakacs, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 2 του Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 5, Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Kung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις (NSC 101 έως 2320-B-002-020-my3, NSC 98 έως 2.320-B-715-001-my3 (YPC) και NSC 101 έως 2320-B-002-008) από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο , Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

β-Lapachone, ένα φυσικό o-ναφθοκινόνη αρχικά προέρχονται από

Λαπάχο

δέντρα στη Νότια Αμερική, έχει πολλά υποσχόμενη δράση κατά των όγκων σε διάφορα κύτταρα του όγκου [1] – [6] και έχει δοκιμάζονται ως αντι-όγκου υποψήφιο φάρμακο στη φάση Ι /ΙΙ /ΙΙΙ κλινικές δοκιμές σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα χημειοθεραπείας [1], [7]. αντικαρκινική δράση της πιστεύεται ότι οφείλεται στη μείωση δύο ηλεκτρονίων των β-lapachone καταλύεται από ΝΑΟ (Ρ) Η: κινόνη οξειδορεδουκτάσης (NQO1, DT-διαφοράση), χρησιμοποιώντας NAD (Ρ) Η ή NADH ως πηγή ηλεκτρονίων [ ,,,0],1], [8], [9]. Με την παρουσία του NQO1, β-lapachone υφίσταται αναγωγή σε ένα ασταθές υδροκινόνη, η οποία υποβάλλεται ταχέως οξείδωση δύο σταδίων πίσω στη μητρική ένωση, διαιωνίζοντας μια μάταιη κύκλο οξειδοαναγωγής και με αποτέλεσμα την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), συμπεριλαμβανομένων των υπεροξειδίων [ ,,,0],8], [10] – [12]. Αυτά τα δραστικά είδη μπορούν να οξειδώσουν τις ομάδες θειόλης του μιτοχονδριακού δυναμικού συγκρότημα μετάβαση πόρου, με αποτέλεσμα την αύξηση της μιτοχονδριακής διαπερατότητας εσωτερική μεμβράνη, μειώνεται αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, με αποτέλεσμα το θάνατο του κυττάρου [13], [14]. Επειδή NQO1 είναι περισσότερο εντόνως εκφρασμένος σε διάφορα στερεά καρκίνους σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς [15], β-lapachone μπορεί επιλεκτικά να σκοτώσει αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, υψηλότερη έκφραση NQO1 ή δραστηριότητα σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να τα καθιστούν πιο ευαίσθητα σε β-lapachone. Προκειμένου να αυξηθεί η κλινική αποτελεσματικότητα της β-lapachone, πολλές μέθοδοι έχουν εξετασθεί για αύξηση της έκφρασης NQO 1 ή δραστηριότητα σε καρκινικά κύτταρα [3], [5], [16] – [19].

σουλινδάκ ένα Food and Drug Administration (FDA) μη-στεροειδές αντι-φλεγμονώδες φάρμακο (NSAID) για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας, αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα, ουρική αρθρίτιδα, ή της ρευματοειδούς αρθρίτιδας [20] – [23]. αντι-φλεγμονώδη δράση του οφείλεται στην αναστολή της σύνθεσης των προσταγλανδινών [24], τα οποία προκαλούν φλεγμονή και πόνο στο σώμα. Η σουλινδάκη έχει επίσης βρεθεί να μπλοκάρουν την κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη-φωσφοδιεστεράσης, ένα ένζυμο που αναστέλλει την φυσιολογική οδό σηματοδότησης απόπτωσης, και αυτό ανασταλτική δράση επιτρέπει στο αποπτωτικό μονοπάτι σηματοδότησης να προχωρήσει ομόφωνα, με αποτέλεσμα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και τη μείωση της συχνότητας εμφάνισης διαφόρων όγκων, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του οισοφάγου, του στομάχου, του προστάτη, της ουροδόχου κύστης, των ωοθηκών, και καρκίνων του πνεύμονα [25], [26]. Στους ανθρώπους, η σουλινδάκη ανάγεται προς το δραστικό αντιφλεγμονώδες μεταβολίτη, θειώδες σουλινδάκ υποβάλλεται σε επανοξείδωση 2-βήμα προς sulindac σουλφόνη [27], [28]. Και οι τρεις ενώσεις έχουν δειχθεί ότι έχουν χημειοπροστατευτική επιδράσεις. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, σουλινδάκη έχει χρησιμοποιηθεί για να αυξήσει τις αντικαρκινικές επιδράσεις κάποιων αντιδραστηρίων ή καταπονήσεις, συμπεριλαμβανομένων bortezomib [4], το υπεροξείδιο του υδρογόνου [29], και το οξειδωτικό στρες [30]. Είναι σημαντικό ότι, η σουλινδάκη και οι μεταβολίτες της τροποποιούν την έκφραση του multioxidative ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων των S-τρανσφεράσες γλουταθειόνης και NQO1, η τελευταία είναι το βασικό ρυθμιστή της β-lapachone-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα [28], [31], [32], και η σουλινδάκη μπορούσε ως εκ τούτου να έχει μια συνεργική επίδραση κατά του όγκου με β-lapachone

ο καρκίνος του πνεύμονα, ο καρκίνος μεγάλες παγκοσμίως, είναι τώρα η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με [33] – [35].. Σύμφωνα με έκθεση του Υπουργείου Υγείας, Εκτελεστικό Yuan, ROC (Ταϊβάν) που δημοσιεύθηκε το 2010, το ποσοστό θνησιμότητας για τον καρκίνο του πνεύμονα είναι 20%, στην κορυφή της λίστας όλων των θανάτων από καρκίνο. Το κόστος της υγειονομικής περίθαλψης για την αντιμετώπιση της νόσου των πνευμόνων αυξάνεται δραματικά κάθε χρόνο και απειλεί να συντρίψει τις υπηρεσίες δημόσιας υγείας [36]. Για να πάρετε μια καλύτερη θεραπεία στόχου, οι ερευνητές προσπάθησαν να προσδιορίσουν βασικές διαφορές μεταξύ καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα, όπως η μετάλλαξη ή υπερέκφραση των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

EGFR, ras

, και

VEGF

[37] – [39]. Δυστυχώς, η σημερινή χημειοθεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα δεν διαθέτουν επαρκή εξειδίκευση, αποτελεσματικότητα, και την ετερογένεια θεραπεία είναι επίσης ένα μεγάλο θέμα [40]. Είναι επομένως επιτακτική ανάγκη για νέα θεραπευτικά φάρμακα ή νέους συνδυασμούς φαρμάκων να παρέχουν πιο αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Από NQO1 υπερέκφραση έχει παρατηρηθεί τόσο κυτταρική γραμμή μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) [41], [42], β-lapachone θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικό φάρμακο για καρκίνους του πνεύμονα. Ωστόσο, ορισμένα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα παρουσιάζουν έκφραση κατώτερο NQO1 ή δραστηριότητα και ως εκ τούτου θα μπορούσε να είναι ανθεκτικός σε β-lapachone τοξικότητα. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε πρώτα την σχέση μεταξύ τοξικότητας β-lapachone και τα επίπεδα NQO 1 σε κυτταρικές σειρές NSCLC, τότε προσδιορίζεται το μονοπάτι σηματοδότησης που εμπλέκονται στο θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από υψηλές συγκεντρώσεις β-lapachone. Χρησιμοποιήσαμε επίσης χαμηλότερες συγκεντρώσεις β-lapachone να διερευνήσει κατά πόσον η σουλινδάκη και οι μεταβολίτες της θα μπορούσε να διευκολύνει την αντικαρκινική δράση των β-lapachone με την αύξηση της έκφρασης NQO1 ή δραστηριότητα σε καρκίνο των πνευμόνων κυτταρικές σειρές με χαμηλά επίπεδα NQO1 και να ελέγχεται η σημασία της NQO1 σε αυτή την θεραπεία συνδυασμού . Βρήκαμε ότι η τοξικότητα του β-lapachone σχετιζόταν με το επίπεδο έκφρασης NQO1 ή δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις β-lapachone νεκρά κύτταρα με μείωση φωσφορυλίωση ΡΙ3Κ, ΑΚΤ, και ERK και ενεργοποίηση JNK. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα των χαμηλών συγκεντρώσεων β-lapachone αυξήθηκε κατά συνδυασμό με sulindac και των μεταβολιτών της, μια διαδικασία που περιλαμβάνει προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ή δραστικότητας του NQO1.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Οι ανθρώπινες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές CL1-1, CL1-5, και Α549, καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 μονάδες /ml πενικιλίνης και 100 mg /ml στρεπτομυκίνης (όλα από την Gibco). Οι κυτταρικές γραμμές ήταν δώρα από τον Dr. PC Yang, Εθνικό Ταϊβάν University Hospital [43], του οποίου εργαστήριο CL1-5 κύτταρα επελέγησαν από γονικά κύτταρα CL1-1 για μεγαλύτερη μεταστατικό δυναμικό χρησιμοποιώντας ένα σύστημα transwell.

Κυττάρων Βιωσιμότητα Δοκιμασίες

CL1-1, CL1-5, ή κύτταρα Α549 (1×10

4) σπάρθηκαν επί 24 ώρες στους 37 ° C σε μια πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λιμοκτονία για 14 h σε RPMI 1640 που περιείχε 2% ορό εμβρύου μόσχου, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, και 100 mg /ml στρεπτομυκίνης. Μετά από 6 ώρες προκατεργασία με μέσο ή την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του σουλινδάκ ή των μεταβολιτών της (όλα από την Sigma), τα κύτταρα επωάστηκαν για 12 ώρες με ή χωρίς την ενδεικνυόμενη συγκέντρωση του β-lapachone υπό τη συνεχή παρουσία της σουλινδάκης ή των μεταβολιτών της και στη συνέχεια βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε.

χρησιμοποιήθηκαν δύο δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας. Στον προσδιορισμό χρώσης με κρυσταλλικό ιώδες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, χρωματίστηκαν με 0.4% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά, και πλύθηκε με Η

2O, τότε αλκοόλη 50% οξύ χρησιμοποιήθηκε για τη διάλυση του δεσμευμένου κρυσταλλικού βιολετί και η OD στα 550 nm μετράται σε αναγνώστη ELISA. Στην δοκιμασία ΜΤΤ, 10 μΐ ΜΤΤ (0,5 mg /ml) (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες, στη συνέχεια το προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε σε 100 μΙ DMSO στους 37 ° C για 30 λεπτά και η OD στα 570 nm μετράται σε αναγνώστη μικροπλάκας.

πορτοκαλί της ακριδίνης (AO) Χρώση

Τα κύτταρα (5×10

4) καλλιεργήθηκαν σε συγκάλυψη διαφάνειες σε 24 φρεατίων πλάκες επωάστηκαν για 14 ώρες σε RPMI 1640 που περιείχε 2% ορό εμβρύου μόσχου, προεπωάστηκαν με θειώδες σουλινδάκ για 6 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς β-lapachone για 24 ώρες, στη συνέχεια αμέσως μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), και χρωματίστηκαν για 10 λεπτά με 0.5 ml του ΑΟ (10 mg /ml σε PBS) (Sigma). Μετά από αρκετές πλύσεις με PBS, τα κύτταρα εξετάζονται σε ΒΗ-2 ανεστραμμένο μικροσκόπιο της Olympus εξοπλισμένο με ένα συνημμένο φθορισμού.

Ανίχνευση της απόπτωσης και Μέτρηση ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου

Για την ανίχνευση απόπτωσης, κύτταρα ( 1×10

6) υποβλήθηκαν σε αγωγή για 3, 6, ή 9 ώρες με 5 μΜ β-lapachone, μετά πλύθηκαν με παγωμένο PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη με 0,05% θρυψίνη-0.02% EDTA, χρωματίστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C με Αννεξίνη V-FITC (10 μg /ml) (Strong Biotech Corporation, AVK050, Taipei, Ταϊβάν), και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε ένα κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη (Becton Dickinson).

για να μετρηθεί ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου, τα κύτταρα επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 37 ° C με 2 mM Fluo-4 /ΑΜ (Molecular Probes), πλύθηκαν με PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής FACSan χρησιμοποιώντας την παράμετρο FL1H.

αναλύσεις Western Blot

τα επεξεργασμένα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 10 μg /ml αναστολέα πρωτεάσης (Sigma), και στη συνέχεια το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για ανοσοκηλίδωση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη δοκιμασία Bradford, και τα δείγματα που περιέχουν 20 μg πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10 ή 12% SDS-PAGE, και κατόπιν μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P για 2 ώρες στα 200 V (Millipore) σε ένα Trans-Blot ηλεκτροφορητική κυττάρων Transfer. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε RT με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS-0.2% Tween 20 (PBS-T), στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες σε RT με αντισώματα έναντι NQO1 (Cell Signaling), ΡΙ3 κινάσης ή ρ-κινάσης ΡΙ3 (Millipore), η ΑΚΤ ή ρ-ΑΚΤ (Epitomics), ΕΚΚ, ρ-ERK, JNK, ή ρ-ΙΝΚ (Cell σηματοδότηση), GAPDH (Genetex) ή β-ακτίνης (Abcam) αραιωμένο 1:1000 σε 1% BSA. Μετά την έκπλυση για 30 λεπτά σε RT με PBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Perkin-Elmer, Boston, ΜΑ? 1:5000 αραίωση σε PBST), τότε συνδεδεμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε με τη χρήση της ECL Western blotting αντιδραστήριο (Amersham), χημική φωταύγεια ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα φιλμ Fuji Ιατρικές ακτίνων Χ (Tokyo, Japan) και προσδιορίζεται ποσοτικά με την εικόνα γέλη αναλύσεις με Image Pro λογισμικού. Η ένταση της ζώνης ενδιαφέροντος διαιρέθηκε με ότι για β-ακτίνη ή ΟΑΡϋΗ (έλεγχοι φόρτωσης) και την τιμή αυτή ρυθμίζεται σύμφωνα με εκείνη που παρατηρείται χωρίς θεραπεία.

παρεμβολή RNA

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (siNeg) ή siRNA που στοχεύει NQO1 (siNQO1) (Applied Biosystems) με τη χρήση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης XtremeGene siRNA (Roche), τότε τα επίπεδα των υποδεικνυόμενων μεταγραφές και οι πρωτεΐνες εξετάστηκαν με πραγματικό χρόνο PCR (με χρήση των εκκινητών που καταγράφονται στον πίνακα S1 ), RT-PCR, και κηλίδωση Western, και τα κύτταρα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται σε πειράματα.

Reverse Transcription-PCR

Ολικό RNA εξήχθη με ΤπζοΙ (Invitrogen) και μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ SuperScript II αντίστροφη μεταγραφή (Invitrogen), στη συνέχεια PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:. NQO 1 (F, TCCTCAGAGTGGCATTCTGC? R, TCTCCTCATCCTGTACCTCT) ή GAPDH (F, CAACTACATGGTTTACATGTTC? R, GCCAGTGGACTCCACGAC)

δραστικότητας του NQO 1 Δοκιμασία

Για να μετρηθεί η ενδογενής δραστηριότητα NQO1 σε κυτταρικά εκχυλίσματα, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (25 mM Tris, ρΗ 7,5, 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT). Το μίγμα της αντίδρασης δοκιμασία (τελικός όγκος 200 μΐ) περιείχε 25 mM Tris ρΗ 7,5, 0,01% Tween 20, 0.7 mg /ml του BSA, 40 μΜ 2,6-διχλωροινδοφαινόλη (DCPIP? Sigma), 5 μΜ FAD, 200 μΜ ΝΑϋΗ, 50 μg του κυτταρικού εκχυλίσματος, και είτε 10 μΜ δικουμαρόλη ή μέσο. Η μείωση της DCPIP απορρόφηση στα 600 nm σε απουσία ή παρουσία του δικουμαρόλη μετρήθηκε σε διαστήματα 5 sec για 60 δευτερόλεπτα και η δραστηριότητα εκφράζεται ως σχετική δραστικότητα, με τη δραστηριότητα ελέγχου δοθεί μια τιμή 1.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM για τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με δοκιμή Scheffe, με τα ρ & lt? 0,05 (* ή #), ρ & lt? 0.005 (**) ή ρ & lt? 0.001 (***) εξετάζεται στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

NQO1 έκφραση και δραστηριότητα σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα σχετίζεται με την β-lapachone Τοξικότητα

για να συγκρίνετε την κυτταροτοξικότητα της β-lapachone για διάφορα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, τρεις κυτταρικές σειρές, CL1-1 , CL1-5, και Α549, επωάστηκαν για 12 ώρες με β-lapachone (0 έως 10 μΜ), στη συνέχεια, την κυτταρική επιβίωση μετρήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, χρησιμοποιώντας 1-5 μΜ β-lapachone, τα κύτταρα Α549 έδειξε ένα σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης από τα κύτταρα CL1-1 και CL1-5, αλλά δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των διαφορετικών κυττάρων χρησιμοποιώντας 10 μΜ μορφολιδίον β- lapachone. Από δραστικότητας του NQO 1 έχει συσχετίζεται θετικά με β-lapachone κυτταροτοξικότητα στον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές [8], [9], [44], εξετάσαμε αν η ευαισθησία των διαφορετικών καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών σε β-lapachone τοξικότητα συνδέθηκε με ενδοκυτταρικά NQO1 έκφρασης. Τα Σχήματα 1Β-D έδειξε δραστικότητα του NQO 1 (Εικ. 1Β), τα επίπεδα NQO 1 RNA (Εικ. 1 C), και τα επίπεδα πρωτεΐνης NQO1 (Εικ. 1ϋ) σε CL1-1, CL1-5, και Α549 κύτταρα και έδειξαν ότι, υπό κανονικές καλλιέργεια συνθήκες, οι τρεις τιμές ήταν υψηλότερες σε κύτταρα Α549 και το χαμηλότερο στα κύτταρα CL1-5. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση της ευαισθησίας των Α549, κύτταρα CL1-1, και CL1-5 με τη θεραπεία με 0-10 μΜ β-lapachone για 3, 6, 12, ή 24 ώρες με χρήση χρώσης crystal violet και διαπίστωσε ότι το ποσοστό επιβίωσης των CL1- 5 κύτταρα ήταν υψηλότερη από εκείνη των CL1-1 κύτταρα σε όλα τα χρονικά σημεία 4, και ότι τα κύτταρα Α549 έδειξε το χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα αντιστοιχούσαν καλά με τα ενδοκυτταρικά επίπεδα NQO 1 στις τρεις κυτταρικές σειρές, όπως η ευαισθησία σε β-lapachone ήταν υψηλότερη σε κύτταρα με υψηλότερα επίπεδα NQO1. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το επίπεδο NQO1 ή δραστηριότητα παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην β-lapachone κυτταροτοξικότητας για τον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών.

(Α) Ποσοστό επιβίωσης των καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές CL1-1, CL1-5, και Α549 . Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0-10 μΜ β-lapachone για 12 ώρες, στη συνέχεια η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία χρώσης crystal violet και εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής για καλλιέργειες χωρίς β-lapachone. (Β-D) Τα επίπεδα δραστικότητας του NQO 1 (Β), τα επίπεδα έκφρασης του RNA NQO1 (C), και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης NQO1 (D) στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα τρία αναπτύσσονται υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας. (Ε) Ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων Α549 (αριστερό πάνελ), CL1-1 κύτταρα (κέντρο πάνελ), και CL1-5 κύτταρα (δεξιά πάνελ) επωάστηκαν με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του β-lapachone για 3, 6, 12, ή 24 ώρες εξετάστηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους και εκφράζεται ως ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD για 3 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εις τριπλούν.

Η

Σε επόμενα πειράματα, αφού β-lapachone μόνο ήταν πολύ αποτελεσματική στην θανάτωση κυττάρων Α549 και θελήσαμε να εξεταστεί αν σουλινδάκη ή του μεταβολίτες είχε μια συνεργιστική δράση με β-lapachone, επικεντρωθήκαμε σε κύτταρα CL1-1 και CL1-5. Επιπλέον, δεδομένου ότι το μεγαλύτερο διαφορά στην επιβίωση των κυττάρων CL1-1 και CL1-5 παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις β-lapachone από 2 έως 5 μΜ, χρησιμοποιήσαμε 5 μΜ β-lapachone να μελετηθεί η επίδραση του και μόνο β-lapachone και 2 μΜ β-lapachone να μελετήσει συνεργιστικά αποτελέσματα της σουλινδάκης και β-lapachone.

Αναγνώριση του αποπτωτικά μονοπάτι σηματοδότησης Διέγερση με β-lapachone

για να διερευνήσουν τον υποκείμενο μηχανισμό που εμπλέκεται στην τοξικότητα β-lapachone, 5 μΜ β-lapachone χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την αποπτωτική οδό σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από β-lapachone σε κύτταρα CL1-1 και CL1-5. Χρησιμοποιώντας χρώση Annexin V, θάνατο κυττάρου σε β-lapachone επεξεργασμένου CL1-1 και CL1-5 αποδείχθηκε να συμβεί με απόπτωση (Σχήμα 2Α). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου επίσης έδειξε ότι η αναλογία sub G0 /G1 (αποπτωτικά κύτταρα) αυξήθηκαν σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα S1A). Σε μελέτες μέτρησης ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου, μια αύξηση παρατηρήθηκε μετά από 1 ή 2 ώρες αγωγής β-lapachone στα δύο κύτταρα CL1-1 και CL1-5 (Σχήμα 2Β, βέλος), όπως φαίνεται κατά την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μονοπατιού με β-lapachone [6], [45]. Η επιβίωση ποσοστό των κυττάρων, μετρήθηκε με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ, ήταν μόνο εν μέρει αποκατασταθεί με την προσθήκη 0-10 μΜ ΒΑΡΤΑ (Molecular Probes), ένα ενδοκυτταρικό ασβέστιο χηλικοποιητής, κατά τη διάρκεια της επώασης για 24 ώρες με 5 μΜ β-lapachone (Σχήμα 2C), δείχνοντας ότι η αυξημένη ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου δεν ήταν ο μόνος παράγοντας που εμπλέκονται στην β-lapachone-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο αυτών των κυττάρων. Αν και καλπαΐνη και κασπάσης 3, τα συστατικά του αποπτωτικού μονοπατιού σηματοδότησης, ενεργοποιήθηκαν με επεξεργασία με 5 μΜ β-lapachone για 0-9 h (Σχήμα S1B), όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 Συμπληρωματική, κασπάσες και καλπαΐνη δεν συμμετείχαν στο καρκίνο του πνεύμονα που προκαλείται από β-lapachone, όπως 1 ώρα προεπεξεργασίας με τον αναστολέα κασπάσης τηγάνι zVAD ή τον αναστολέα καλπαΐνης ALLM ή ΑΙΧΝ (όλα από την Sigma) δεν αναστέλλει τη δράση (Εικόνα S2) τον κυτταρικό θάνατο. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) μειώθηκε με κατεργασία για 3, 6, ή 9 ώρες με β-lapachone (Σχήμα S1c), αλλά ενδοκυτταρική H

2O

2 επίπεδα δεν είχαν μεταβληθεί από β -lapachone θεραπεία για 3 ή 6 ώρες (Σχήμα S1D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι β-lapachone προκαλεί απόπτωση και των δύο κυττάρων CL1-1 και CL1-5 με μείωση της ΜΜΡ.

(Α) CL1-1 κυττάρων (αριστερό πλαίσιο) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά πάνελ) επωάστηκαν με 5 μΜ β-lapachone για 0, 3, 6, ή 9 ώρες, στη συνέχεια εξετάστηκαν για απόπτωση χρησιμοποιώντας αννεξίνη V. (Β) CL1-1 κυττάρων (αριστερό πλαίσιο) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά πάνελ) επωάστηκαν με 5 μΜ β-lapachone για τον υποδεικνυόμενο χρόνο, τότε ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση Fluo-4 και κυτταρομετρία ροής. Η ένταση της χρώσης Fluo-4 αυξήθηκε με κατεργασία β-lapachone, ειδικά σε 1 h (βέλη). (Γ) CL1-1 κυττάρων (αριστερό πλαίσιο) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά πάνελ) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν για 24 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του ΒΑΡΤΑ-ΑΜ, ένα ενδοκυτταρικό ασβέστιο χηλικοποιητής, και /ή 5 μΜ μορφολιδίον β- lapachone επιβίωση, τότε των κυττάρων μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ και εκφράζεται ως ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με την β-lapachone μόνος

Η

Για τον προσδιορισμό των μονοπατιών σηματοδότησης ενεργοποιούνται σε β-lapachone πνεύμονα που προκαλείται από τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων, τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων μορφών PI3K, ΑΚΤ, και η MAPKs ERK και JNK σε CL1-1 και CL1-5 κύτταρα εξετάστηκαν. θεραπεία β-lapachone για 10-180 min αυξημένη φωσφορυλίωση JNK, αλλά μειώθηκε φωσφορυλίωση ERK (Εικόνα 3Α) και της ΡΙ3Κ και ΑΚΤ (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, σε συγκεντρώσεις 1, 2, ή 5 μΜ, ο αναστολέας JNK SP600125 διασωθεί μερικώς κύτταρα από τοξικότητα που επάγεται από 24 ώρες επώαση με β-lapachone (Σχήμα 3C), δείχνοντας ότι ΙΝΚ παίζει σημαντικό ρόλο στην πνευμονική θάνατο των καρκινικών κυττάρων που επάγεται με β-lapachone.

(Α) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) επωάστηκαν με 5 μΜ β-lapachone για τον υποδεικνυόμενο χρόνο, τότε τα επίπεδα του p-ERK, ΕΚΚ , ρ-JNK και JNK μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. (Β) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) επωάστηκαν με 5 μΜ β-lapachone για 0, 3, 6, ή 9 ώρες, στη συνέχεια τα επίπεδα του p-ΡΙ3Κ και ρ-ΑΚΤ εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. (Γ) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του αναστολέα JNK sp600125 για 6 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 5 μΜ β-lapachone για 24 h.Cell επιβίωση μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ και εκφράζεται ως ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα * ρ & lt?. 0.05 (D) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 10 μΜ δικουμαρόλη, τότε μέσον ή 5 μΜ β-lapachone προστέθηκε και τα κύτταρα επωάζονται για 9 ώρες και τα επίπεδα ρ-ΡΙ3Κ και ρ-ΑΚΤ μετρήθηκαν με κηλίδωση Western.

η

προκειμένου να καθοριστεί αν NQO1 ήταν βασικό ρυθμιστή σε β-lapachone μεσολάβηση πνεύμονα θάνατο των καρκινικών κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες με 10 μΜ δικουμαρόλη, ένας ειδικός αναστολέας NQO 1, και αυτό είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση περίπου 67% και 77% της δραστηριότητας του NQO 1 σε CL1- 1 και CL1-5 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα S3A). Δικουμαρόλη αγωγή ανέστειλε σημαντικά την μείωση στην φωσφορυλίωση του ρ-ΡΙ3Κ και ρ-ΑΚΤ που προκαλείται από 9 ώρες της θεραπείας β-lapachone (Σχήμα 3D), παρεμπόδισε την αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου που επάγεται από 1 ώρα θεραπείας β-lapachone (Σχήμα S3b) , και αξιοσημείωτα ανέστειλε την αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από 6 ώρες επώαση με β-lapachone, όπως φαίνεται με χρώση αννεξίνης V (Σχήμα 4Α) και πορτοκαλί της ακριδίνης (AO) χρώση (Σχήμα 4Β).

(Α) CL1 -1 κύτταρα (κορυφή) ή CL1-5 κύτταρα (κάτω) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν για 6 ώρες με 5 μΜ β-lapachone ή /και 10 μΜ δικουμαρόλη, στη συνέχεια χρωματίζονται με αννεξίνη V-FITC και ο φθορισμός αννεξίνης V μετράται με κυτταρομετρία ροής. (Β) μορφολογικές αλλαγές μετά τη φαρμακευτική αγωγή. CL1-1 ή CL1-5 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (CTL) ή επωάστηκαν για 24 ώρες με 5 μΜ β-lapachone με ή χωρίς 10 μΜ δικουμαρόλη, στη συνέχεια χρωματίζονται με πορτοκαλί της ακριδίνης να παρατηρήσουμε την μορφολογία του πυρήνα του κυττάρου. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm.

Η

Η σουλινδάκη και οι μεταβολίτες της Αύξηση την κυτταροτοξική δράση του β-lapachone μέσω της ενεργοποίησης του NQO1

Η σουλινδάκη NSAID και των μεταβολιτών της, θειώδες σουλινδάκ (η μειωμένη μορφή) και σουλφονικό σουλινδάκ (η οξειδωμένη μορφή), είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την έκφραση ορισμένων multioxidative ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων NQO1 [31], [32]. Επειδή τα επίπεδα NQO 1 και δραστικότητα αρνητικά που συνδέονται με την κυτταροτοξικότητα του β-lapachone, έχουμε την επόμενη διερευνηθεί κατά πόσον η σουλινδάκη και οι μεταβολίτες της θα μπορούσε να αυξήσει την κυτταροτοξικότητα της β-lapachone για κύτταρα με χαμηλή έκφραση NQO1 και χαμηλότερη ευαισθησία β-lapachone, όπως CL1-1 και τα κύτταρα CL1-5.

για να καθοριστεί εάν η σουλινδάκη και των μεταβολιτών της μπορούν να τροποποιήσουν την έκφραση NQO1 στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις 100 και 250 μΜ για τη θεραπεία κύτταρα CL1-1 και CL1-5 για 6, 12, ή 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, σε CL1-1 κύτταρα, και οι δύο συγκεντρώσεις σουλινδάκης ή μεταβολίτη ρυθμίζεται αυξητικά τα επίπεδα πρωτεΐνης NQO1 σε όλα τα χρονικά σημεία 3, ενώ, σε κύτταρα CL1-5, τα αποτελέσματα ήταν πιο περίπλοκη, μια αύξηση να δει μετά από επώαση για 12 ή 24 ώρες με 100 μΜ, αλλά όχι 250 μΜ, σουλινδάκη, σε όλα τα τρία χρονικά σημεία και με τα δύο συγκεντρώσεις σουλφονικό σουλινδάκ ή 100 μΜ σουλινδάκη σουλφίδιο, και με 250 μΜ θειώδες σουλινδάκ για 6 ώρες (12 και 24 ώρες δεν δοκιμάστηκε) (Εικόνα 5Α). NQO1 ενζυμική δραστικότητα αυξήθηκε επίσης και από τα τρία χημικά (Σχήμα 5Β). Όπως φαίνεται στην Εικόνα S4, στα 100 και 250 μm, οι τρεις φάρμακα δεν είχε σημαντική επίδραση στο ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων CL1-1 και CL1-5 μετά από επώαση με σουλινδάκ ή sulindac σουλφόνη για 54 ώρες ή με θειώδες σουλινδάκ για 12 ώρες. Προκειμένου να εξεταστεί η συνεργική δράση σουλινδάκης ή των μεταβολιτών της και β-lapachone στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, CL1-1 και CL1-5 κύτταρα επωάστηκαν με 0, 50, 100, ή 250 μΜ σουλινδάκη ή οι μεταβολίτες για 6 ώρες, στη συνέχεια με 2 μΜ β-lapachone υπό τη συνεχή παρουσία της σουλινδάκης ή μεταβολίτη για 12 ώρες, και το ποσοστό επιβίωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν μόνο β-lapachone, η επιβίωση των δύο κυτταρικές σειρές μειώθηκε κατά 10-40% όταν συν-επεξεργάζονται με β-lapachone συν σουλινδάκη, 20-40% με β-lapachone συν sulindac σουλφόνη, και 30-60% με β-lapachone συν θειώδες σουλινδάκ (Σχήμα 6Α). Η μείωση της ταυτόχρονης θεραπείας που προκαλείται ήταν μεγαλύτερη με κύτταρα CL1-5 ό, τι με CL1-1 κύτταρα, δηλαδή ήταν μεγαλύτερη με τα κύτταρα που εκφράζουν χαμηλότερα επίπεδα NQO 1 (Σχήμα 6Α)? Επιπλέον, δεν απαιτείται επιπλέον επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας σε σύγκριση με την β-lapachone μόνος παρατηρήθηκε με Α549 κύτταρα (Σχήμα S5) που εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα NQC1. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η σουλινδάκη μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των κυττάρων με χαμηλά επίπεδα NQO 1 σε β-lapachone κυτταροτοξικότητα. Χρησιμοποιώντας χρώση AO και μικροσκοπία φθορισμού, 6 ώρες προεπεξεργασία με 100 ή 250 μΜ θειώδες σουλινδάκ, που ακολουθείται από προσθήκη 2 μΜ β-lapachone για 12 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μείωση σε CL1-1 και CL1-5 κυτταρική πυκνότητα σε σύγκριση με β-lapachone μόνος (Σχήμα 6Β), και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα με το συνδυασμό των β-lapachone και είτε σουλινδάκ ή σουλφονικό σουλινδάκ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή κύτταρα CL1-5 (δεξιά) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν με 100 ή 250 μΜ σουλινδάκ, σουλφονικό, ή θειώδες σουλινδάκ για 6, 12, ή 24 ώρες, στη συνέχεια τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. (Β-D) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (CTL) ή επωάστηκαν με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του σουλινδάκη (Β), σουλφονικό σουλινδάκ (C), ή θειώδες σουλινδάκ (D ) για τον υποδεικνυόμενο χρόνο, μετρήθηκε έπειτα δραστικότητας του NQO 1. *: P & lt? 0,05, **: p & lt? 0,01, ***: p & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

(Α) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (. δεξιά) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για 6 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του σουλινδάκ, σουλφονικό, και θειώδες σουλινδάκ, κατόπιν 2 μΜ β-lapachone προστέθηκε για 12 ώρες, στη συνέχεια κυτταρική επιβίωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους και εκφράζεται ως εκατοστιαία αναλογία επιβίωση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. *: Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με την β-lapachone μόνο. (Β) Δύο σετ από κάθε τύπο κυττάρων αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν για 6 ώρες με 100 ή 250 μΜ θειώδες σουλινδάκ, κατόπιν 2 μΜ Β-lapachone προστέθηκε σε ένα σύνολο και η επώαση συνεχίστηκε για 12 ώρες, στη συνέχεια η μορφολογία εξετάστηκε από ακριδίνης χρώση πορτοκαλί. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm.

Η

NQO1 διαδραματίζει καίριο ρόλο στην σουλινδάκη που προκαλείται Αύξηση β-lapachone κυτταροτοξικότητα για τα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

Αν και NQO1 έκφρασης και δραστηριότητας αυξήθηκαν κατά σουλινδάκη και οι μεταβολίτες της, αν NQO1 ήταν μια σημαντική συμβολή στην σουλινδάκη που προκαλείται από αύξηση της β-lapachone κυτταροτοξικότητα εξακολουθεί να απαιτείται έρευνα. Χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι για να αναστέλλουν την δράση του ενζύμου ή πρωτεΐνη έκφραση του NQO1, ενός αναστολέα NQO 1 και NQO1 siRNA knockdown.

δικουμαρόλη έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί για να αναστέλλει ειδικά την έκφραση και τη δραστηριότητα των NQO1 [44]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, η προκατεργασία των κυττάρων με 100 ή 250 μΜ η σουλινδάκη (Σχήμα 7Α), σουλφονικό σουλινδάκ (Σχήμα 7Β), ή θειώδες σουλινδάκ (Σχήμα 7C), που ακολουθείται από προσθήκη 2 μΜ β-lapachone για 12 ώρες αύξησε την κυτταροτοξικότητα του β-lapachone και για τα δύο κύτταρα CL1-1 και CL1-5 και αυτά τα αποτελέσματα ήταν σημαντικά μειωμένες με προσθήκη 10 μΜ δικουμαρόλη.

CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) αφέθηκαν μη επεξεργασμένα ή προκατεργάστηκαν για 6 ώρες με 100 ή 250 μΜ σουλινδάκη (Α), σουλφονικό σουλινδάκ (Β), ή θειώδες σουλινδάκ (C) με ή χωρίς 10 μΜ δικουμαρόλη, τότε επωάστηκαν για περαιτέρω 12 ώρες με ή χωρίς την προσθήκη 2 μΜ β-lapachone, τότε κυτταρική επιβίωση μετρήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους και εκφράζεται ως ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. *: Ρ. & Lt? 0,05

Η

Η χρήση siRNA νοκ ντάουν του NQO1, κατά τις ημέρες 1 έως 3 μετά NQO1 siRNA επιμόλυνση των κυττάρων CL1-1 και CL1-5, καμία αλλαγή στην κυτταρική ανάπτυξη ή τη μορφολογία των κυττάρων παρατηρήθηκε (Σχήμα S6). Αποτελεσματικότητα της knockdown σε κύτταρα CL1-1 και CL1-5 καταδείχθηκε για την έκφραση του RNA με RT-PCR (Σχήμα 8Α) και σε πραγματικό χρόνο-PCR (Σχήμα S7) και για την έκφραση της πρωτεΐνης με κηλίδωση Western (Σχήμα 8Β και C), που δείχνει ότι NQO1 siRNA μειωτικά σημαντικά την έκφραση NQO1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8D, NQO1 siRNA διαμόλυνση ανέστειλε σημαντικά την αύξηση της δραστηριότητας του ενζύμου που επάγεται σε NQO1 CL1-1 κύτταρα με επώαση επί 6 ή 24 ώρες με 100 ή 250 μΜ η σουλινδάκη (αριστερό πάνελ), σουλφονικό σουλινδάκ (κεντρικό πάνελ), ή η σουλινδάκη σουλφίδιο (δεξί πάνελ). Όταν τα κύτταρα επιμολυσμένα για 24 ώρες με siNQO1 ή ελέγχου siRNA προκατεργάστηκαν για 6 ώρες με σουλινδάκ ή οι μεταβολίτες του, τότε συν-επεξεργάζονται για 12 ώρες με φάρμακο συν 2 μΜ β-lapachone, τα αποτελέσματα επιβίωσης ποσοστό κυττάρων έδειξε αποτελέσματα ότι η επιμόλυνση με NQO1 siRNA προκάλεσε σημαντική μείωση στην κυτταροτοξικότητα των συνδυασμών β-lapachone με σουλινδάκη (Σχήμα 9Α), σουλφονικό σουλινδάκ (Σχήμα 9Β), ή θειώδες σουλινδάκ (Σχήμα 9C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι NQO1 παίζει σημαντικό ρόλο στην αύξηση της β-lapachone-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από σουλινδάκη ή των μεταβολιτών της.

(Α-Γ) CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή κύτταρα CL1-5 (δεξιά) επιμολύνθηκαν για 1 έως 3 ημέρες με έλεγχο siRNA (CTL) ή siRNA που στοχεύει NQO 1, τότε η έκφραση RNA μετρήθηκε με PCR (Α) και η έκφραση της πρωτεΐνης με κηλίδωση Western (Β και C). (D) CL1-1 κύτταρα επιμολυσμένα για 2 ημέρες με έλεγχο siRNA ή NQO1 siRNA επωάστηκαν μόνο του ή με 100 ή 250 μΜ σουλινδάκ, σουλφίδιο, ή sulindac σουλφόνη επί 6 ή 24 ώρες, έπειτα δραστικότητας του NQO 1 μετρήθηκε. *: Ρ & lt? 0,05, ***: ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με τα πανομοιότυπα επεξεργασμένα κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA

Η

CL1-1 κύτταρα (αριστερά) ή CL1-5 κύτταρα (δεξιά) επιμολύνθηκαν. με έλεγχο siRNA (-) ή NQO1 siRNA (+) για 24 ώρες, στη συνέχεια αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν για 6 ώρες με 100 ή 250 μΜ σουλινδάκη (Α), σουλφονικό σουλινδάκ (Β), ή θειώδες σουλινδάκ (C), τότε