Αφηρημένο

Η θρόμβωση είναι κοινή στον καρκίνο των ωοθηκών. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων με ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων δεν έχει κριτικά εξετάστηκαν. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, διερευνήσαμε αλληλεπιδράσεις αιμοπεταλίων σε μια σειρά κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών με διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό [ΟΑΥ-80, 59m, SK-OV-3, Α2780, A2780cis]. Τα αιμοπετάλια προσκολλώνται στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με την πιο σημαντική προσκόλληση στην κυτταρική γραμμή 59m. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα επάγονται ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων [έκφραση Ρ-σελεκτίνη] σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, με την πιο σημαντική ενεργοποίηση φαίνεται σε απόκριση στην κυτταρική γραμμή 59m. Οι ανταγωνιστές των αιμοπεταλίων [cangrelor, MRS2179, και απυράση] ανέστειλε προκαλούμενη ενεργοποίηση 59m κύτταρο υποδηλώνει μια διαμεσολαβούμενη P2Y12 και Ρ2Υ1 υποδοχέα μηχανισμός της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων εξαρτάται από την απελευθέρωση ADP από 59m κύτταρα. Α2780 και 59m κύτταρα ενίσχυσε PAR-1, PAR-4, και ΤχΑ2 μεσολάβηση υποδοχέα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην ADP, επινεφρίνη, κολλαγόνο ή επαγόμενη ενεργοποίηση. Ανάλυση των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών μετά από θεραπεία με πλυμένα αιμοπετάλια ή έκλυσης αιμοπεταλίων έδειξε μια λεπτή αλλά έγκυρη ρύθμιση προς τα άνω των αντι-αποπτωτικών, αντι-autophagy προ-αγγειογενετικές, προ-κυτταρικού κύκλου και μεταβολικών γονιδίων. Έτσι, ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό τηρούν και να ενεργοποιούν τα αιμοπετάλια διαφορικά, ενώ και οι δύο αιμοπετάλια και έκλυσης αιμοπεταλίων μεσολαβούν σήματα προ-επιβίωσης και pro-αγγειογενετική στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Παράθεση:. Egan K, Crowley D, Smyth P , O’Toole S, Spillane C, Martin C, et al. (2011) προσκόλληση αιμοπεταλίων και αποκοκκίωση Προκαλέστε Pro-Επιβίωση και Pro-αγγειογενετική σηματοδότηση στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (10): e26125. doi: 10.1371 /journal.pone.0026125

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: May 10, 2011? Αποδεκτές: 20 του Σεπτεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Egan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Επιστημών Ιρλανδία [SFI] ως μέρος του Ινστιτούτου Βιοϊατρικών Diagnostics [BDI-2 Κέντρου για την Επιστήμη αριστείας και Τεχνολογίας (CSET)]. KE υποστηρίζεται μέσω του Εθνικού Βιοφωτονική και πλατφόρμα απεικόνισης, η Ιρλανδία, και χρηματοδοτείται από το πρόγραμμα της ιρλανδικής κυβέρνησης για την Έρευνα στον Τρίτο Ιδρύματα επίπεδο, Cycle 4, Εθνικό Σχέδιο Ανάπτυξης 2007-2013. DC υποστηρίζεται από το Ερευνητικό Συμβούλιο Υγείας (Ιρλανδία) Πρόγραμμα Υποτρόφων: Μοριακής Ιατρικής – από τα γονίδια για να λειτουργήσει. BF και LMcE υποστηρίζονται από το Ίδρυμα Emer Casey, την Ιρλανδία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους γυναικών [1]. Είναι η πιο κοινή γυναικολογική κακοήθεια και έχει την υψηλότερη θνησιμότητας σε αναλογία περίπτωση όλων των γυναικολογικών κακοηθειών. Το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης είναι το αποτέλεσμα των διαγνώσεων προχωρημένο στάδιο. Οι περισσότεροι ασθενείς είναι ασυμπτωματικοί μέχρις ότου η νόσος έχει μεταστάσεις [2]. Εξάπλωση του καρκίνου των ωοθηκών έχει θεωρηθεί να συμβεί κυρίως στο περιτόναιο [3]. Ωστόσο, αυτοψία και απεικόνισης μελέτες [4], καθώς και αποδεικτικά στοιχεία για την παρουσία των μικρομεταστάσεων στις αναρροφήσεις των οστών των ασθενών με πρώιμο στάδιο καρκίνου των ωοθηκών [5] δείχνουν ότι η αιματογενής μετάσταση είναι πιο συχνή από ό, τι εθεωρείτο μέχρι σήμερα.

Κατά τη διάρκεια της αιματογενή διάχυση, η ικανότητα των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων να αλληλεπιδρούν με τα αιμοπετάλια πιστεύεται ότι προάγει την επιβίωση τους κατά την κυκλοφορία και ως εκ τούτου διευκολύνουν τη μετάσταση. Πειράματα προκλινικά ζωικά έχουν δείξει ότι φαρμακολογικώς [6] ή γενετικώς [7] που προκαλείται από θρομβοκυτταροπενία, καθώς και ελαττώματα στην λειτουργία των αιμοπεταλίων [7] – [10] συνδέονται με μειωμένη μετάσταση. Η αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με αιμοπετάλια πιστεύεται ότι προσδίδουν μια σειρά από πλεονεκτήματα που προωθούν την επιτυχή μετάσταση, συμπεριλαμβανομένης της προστασίας από την ανοσολογική επίθεση και διαφυγή του ανοσοποιητικού επιτήρησης [11], [12], την απελευθέρωση της ανάπτυξης, αγγειογόνου και αγγειακά παράγοντες διαπερατότητας κατά την διάρκεια ενεργοποίηση και αποκοκκίωση [13]

Θρόμβωση και θρομβοκυττάρωση είναι συχνές επιπλοκές του καρκίνου των ωοθηκών και συνδέονται με κακή πρόγνωση [14] – [16]., τονίζοντας τη σημασία των αιμοπεταλίων στην παθολογία του καρκίνου των ωοθηκών. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση μεταξύ των αιμοπεταλίων και των ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων δεν έχει μελετηθεί καλά. Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να χαρακτηρίσει την αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων με κύτταρα των ωοθηκών, χρησιμοποιώντας μια κανονική κυτταρική γραμμή ωοθήκης [ΟΑΥ-80] και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα γραμμές με διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες και μεταστατικό δυναμικό [59m, SK-OV-3, Α2780, και A2780cis].

Αρχικά, μελετήσαμε την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα υπό στατικές συνθήκες για να καθορίσει εάν υπάρχει μια συγκολλητική αλληλεπίδραση μεταξύ των αιμοπεταλίων και των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Δεύτερον, αξιολογήθηκε η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να επάγουν την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και αποκοκκίωση [έκφραση Ρ-σελεκτίνης]. Μετά τη διαπίστωση ότι τα αιμοπετάλια προσκολλώνται στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα είναι ικανά να επάγουν την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και αποκοκκίωση, έχουμε την επόμενη αξιολογηθούν οι αλλαγές έκφρασης γονιδίων στο επίπεδο μεταγραφικό σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με αιμοπετάλια ή έκλυσης αιμοπεταλίων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν απόκλιση αλληλεπιδράσεις μεταξύ αιμοπεταλίων και κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, όχι μόνο από την άποψη της προσκόλλησης και της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων, αλλά επίσης και σε αλλαγές γονιδιακή έκφραση σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με πλυμένα αιμοπετάλια ή έκλυσης αιμοπεταλίων. Πολλαπλές αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν μεταξύ των αιμοπεταλίων και του καρκίνου των ωοθηκών που περιλαμβάνουν κύτταρα παράγοντες που απελευθερώνονται από τα αιμοπετάλια και τα καρκινικά κύτταρα, καθώς και η άμεση αλληλεπιδράσεις κυττάρου αιμοπετάλια ωοθηκών. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί σε μια προ-επιβίωσης, προ-αγγειογενετική σήμα για την καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

συλλογή αίματος για τη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Βασιλικό Κολλέγιο Χειρουργών στην επιτροπή δεοντολογίας η Ιρλανδία και η γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους χορηγούς πριν από την φλεβοτομία.

αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich [St Louis, MO, USA], εκτός εάν εάν υποδεικνύεται διαφορετικά. Το κολλαγόνο [διαλυτό δέρμα μόσχου], αδενοσίνη-5′-διφωσφορικό, επινεφρίνη, και το αραχιδονικό οξύ ελήφθησαν από BioData [Horsham, ΡΑ, USA]. Alexa Fluor-488-σημασμένο φαλλοειδίνη, Calcein ΑΜ, και ινωδογόνου λήφθηκαν από την Invitrogen [Carlsbad, CA, USA]. Φυκοερυθρίνη [ΡΕ] σημασμένα αντι ανθρώπινο Ρ-σελεκτίνης [IgG ποντικού], ΡΕ-επισημασμένο ισοτυπικό έλεγχο IgG ποντικού, και ΡΕ-επισημασμένο αντι ανθρώπινο CD42a [ποντικού IgG] αντισώματα αγοράστηκαν από Βϋ Pharmingen [San Diego, CA, USA].

κυτταρικές σειρές

Μια επιλογή από κυτταρικές σειρές επιθηλιακής προέλευσης των ωοθηκών επιλέχθηκαν για να συμπεριληφθούν σε αυτή τη μελέτη ως επιθηλιακών καρκίνων των ωοθηκών είναι η πιο κοινή ιστολογικό τύπο. ΟΑΥ-80 [ένα δώρο από το Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA] αντιπροσωπεύει ένα μη-ογκογονικά φυσιολογικό ανθρώπινο επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ωοθηκών, η οποία έχει αθανατοποιηθούν με διαμόλυνση με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί για το γονίδιο μεγάλου Τ SV40. Τα κύτταρα ΟΑΥ-80 διατηρήθηκαν σε ένα μίγμα 1:01 μέσου 199 και MCDB-105 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 0,2 IU /ml της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ινσουλίνης, όπως συνιστάται από Fox Chase. 59m [ευρωπαϊκή συλλογή κυτταρικών καλλιεργειών (ECACC), Σαλίσμπουρι, Ηνωμένο Βασίλειο] αντιπροσωπεύει ένα ογκογονικά ανθρώπινα ωοθήκης επιθηλιακό καρκίνωμα του τύπου ενδομητριοειδές με σαφείς κυτταρικά συστατικά, που αρχικά απομονώθηκε από ασκίτη ενός ασθενής ηλικίας 65 ετών με μεταστατικό καρκίνο των ωοθηκών. κύτταρα 59m διατηρήθηκαν σε DMEM, 1 g /L γλυκόζη, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, όπως συνιστάται από ECACC. SK-OV-3 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA] αντιπροσωπεύει μία ογκογόνο ανθρώπινο ωοθηκών επιθηλιακά αδενοκαρκίνωμα, που αρχικά απομονώθηκε από ασκίτη ενός ασθενής ηλικίας 64 ετών με μεταστατικό καρκίνο των ωοθηκών. SK-OV-3 καλλιεργήθηκε με μέσο McCoy 5Α, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου [Invitrogen, Ολλανδία], 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, όπως συνιστάται από την ATCC. Α2780 [ECACC, Salisbury, UK] προέρχεται από ένα ωοθηκικό ορώδες επιθηλιακού ιστού του όγκου σε ένα μη επεξεργασμένο ασθενή. Η κυτταρική γραμμή σισπλατίνη ανθεκτική A2780cis αναπτύχθηκε από χρόνια έκθεση του σισπλατίνη ευαίσθητη Α2780 κυτταρική γραμμή γονέα σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσον RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, όπως συνιστάται από ECACC. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε πρότυπες συνθήκες σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C.

παρασκεύασμα αιμοπεταλίων

αίμα ελήφθη από υγιείς δότες που δεν είχαν λάβει φάρμακα είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τη λειτουργία των αιμοπεταλίων επί τουλάχιστον 10 ημέρες. Το αίμα συλλέγεται με διάτρηση φλέβας μέσω βελόνας πεταλούδα 19-gauge χωρίς αιμοστατικό επίδεσμο, για να αποφευχθεί η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Τα αιμοπετάλια παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, για την παρασκευή πλούσιου σε αιμοπετάλια πλάσμα [PRP], το αίμα συλλέχθηκε σε μια σύριγγα που περιέχει 3.2% κιτρικό τρινάτριο ως αντιπηκτικό [10% όγκο /όγκο, τότε σε φυγοκέντρηση σε 170 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για την παρασκευή των πλυμένων αιμοπεταλίων, το αίμα συλλέχθηκε σε κιτρικό οξύ-Δεξτρόζη [ACD: 38 mM κιτρικό οξύ, 75 mM κιτρικό νάτριο, 124 mM ϋ-γλυκόζη] ως αντιπηκτικό [15% όγκο /όγκο]. Το αίμα φυγοκεντρήθηκε στα 170 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. PRP οξινίστηκε σε ρΗ 6,5 με ACD, και PGE

1 [1 μΜ] προστέθηκε για να αποφευχθεί η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης. Τα αιμοπετάλια σφαιριοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στα 720 g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το σφαιρίδιο αιμοπεταλίων επανασχημάτισε εναιώρημα εντός ρυθμιστικού JNL [130 mM NaCl, 10 mM κιτρικό νάτριο, 9 mM NaHCO

3, 6 mM ϋ-γλυκόζη, και 0.9 mM MgCl

2, 0.81 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, και 10 mM Tris, ρΗ 7,4] σε μια συγκέντρωση 2.5 × 10

8 /mL και συμπληρωμένο με 1,8 mM ΟαΟ

2

δοκιμασίας προσκόλλησης. αιμοπεταλίων

Η δοκιμασία προσκόλλησης αιμοπεταλίων έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, τα κύτταρα των ωοθηκών σπάρθηκαν σε πλάκα [Nunc, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Γερμανία] 96 φρεατίων σε συγκέντρωση 5 × 10

4 /ml και αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής. Τα πλυμένα αιμοπετάλια [1,5 × 10

8 /ml] προεγκατεστημένο με Calcein ΑΜ [2 μg /ml] αφέθηκαν να προσκολληθούν στα κύτταρα για 45 λεπτά στους 37 ° C. Η συνολική φθορισμός [485/535 nm] ανά φρεάτιο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια Victor2 ™ μετρητή multilabel Wallac 1420 [Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ., USA] αναγνώστη πλάκας. Η πλάκα πλύθηκε τρεις φορές, 100 κ.εκ. JNL προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας, και διαβάστηκε το υπόλοιπο φθορισμού. % Προσκόλληση αιμοπεταλίων υπολογίστηκε ως [υπόλοιπες φθορισμός – κενό] /[συνολικός φθορισμός – κενό] × 100. Επικόλληση αιμοπεταλίων σε κύτταρα ωοθηκών φωτογραφήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού. Όταν συρροή, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 7 mM EDTA σε PBS Dulbecco, πλύθηκαν δύο φορές, και επανεναιωρήθηκαν σε JNL συμπληρωμένο με 1,8 mM ΟαΟ

2. Κύτταρα [1 × 10

5 /ml] επωάστηκαν σε BSA επικαλυμμένα με πολυ-L-λυσίνη ολίσθησης για 45 λεπτά στους 37 ° C. Μετά προσκόλληση, πλυμένα αιμοπετάλια [50 × 10

6 /μl] προστέθηκαν στο πλακίδιο και επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και περατά με 0,1% Triton Χ-100. Τα αιμοπετάλια και τα κύτταρα των ωοθηκών βάφτηκαν με Alexa Fluor-488 φαλλοειδίνη [41,25 ηΜ,], για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αιμοπετάλια ειδικά χρωματίστηκαν με φυκοερυθρίνη σημασμένο αντίσωμα αντι-ανθρώπινο CD42a [1,25 μg /ml] για 2 ώρες στους 37 ° C. Οι πλάκες τοποθετούνται και απεικονίστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού.

Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων

Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να επάγουν την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων (έκφραση Ρ-σελεκτίνης) εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας που βασίζεται τροποποιημένη από Nylander et al [19]. Σε ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 100 μΙ, 10 μΙ PRP επωάστηκε με τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [0 – 1,5 × 10

6 /ml,] παρουσία ενός αντισώματος Ρ-σελεκτίνης αντι ανθρώπινο ΡΕ-επισημασμένο [1,25 μg /ml] ή ένα κατάλληλο έλεγχο ισοτόπου [1.25 μg /ml]. Όλες οι επωάσεις διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Η αντίδραση στη συνέχεια τερματίστηκε με 1 ml ρυθμιστικού JNL πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα BD FACS Calibur [Becton Dickinson, Palo Alto, CA, USA] μέσα σε 1 ώρα. Το όργανο ορίστηκε για τη μέτρηση του μεγέθους [εμπρόσθια σκέδαση, FSC], διακριτότητα [πλευρική σκέδαση, SSC] και φθορισμού των κυττάρων. Χρησιμοποιώντας ένα αρχείο καταγραφής FSC ως προς log SSC οικόπεδο τελεία, μια πύλη δισδιάστατη ανάλυση συντάχθηκε σε όλο τον πληθυσμό των αιμοπεταλίων, και ένα ιστόγραμμα φθορισμού [συνδεθείτε FL2 έναντι αρίθμηση] λήφθηκε για 10000 εκδηλώσεις αιμοπεταλίων για κάθε δείγμα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest Pro και εκφράστηκαν ως ποσοστό των αιμοπεταλίων που ήταν Ρ-σελεκτίνης θετικά σε σχέση με τον έλεγχο ισότυπο.

Απομόνωση έκλυσης αιμοπεταλίων

Τα πλυμένα αιμοπετάλια [2,5 × 10

8 /ml] διεγέρθηκαν με τόσο TRAP [υποδοχέα πεπτίδιο ενεργοποίησης θρομβίνη, 20 μΜ] και το κολλαγόνο [190 μg /ml] και αναδεύεται σε ένα ελαφρύ μετάδοση BioData ΡΑΡ-4 συσσωματώσεως [Horsham, ΡΑ, USA] στους 37 ° C για 15 λεπτά. Το συνολικό αιμοπεταλίων φυγοκεντρήθηκε στα 720 g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια αναρροφάται και διηθείται μέσω ηθμού σύριγγας με μία μεμβράνη 0,22 μm PVDF για την απομάκρυνση μικροσωματιδίων αιμοπεταλίων.

ΜΤΤ

δοκιμασία

Για να βελτιστοποιηθεί η συγκέντρωση των έκλυσης αιμοπεταλίων για την έκθεση των κυττάρων του όγκου, μία σειρά ΜΤΤ δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρου [Roche Diagnostics Ltd, Ηνωμένο Βασίλειο] διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για να προσδιορισθεί η μέγιστη συγκέντρωση που θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε κύτταρα χωρίς αρνητική επίπτωση στην κυτταρική ανάπτυξη ή την επιβίωση. Τα κύτταρα εμβολιάζονται σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 96 φρεατίων σε 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες ώστε να επιτραπεί κυτταρική προσκόλληση. Μόλις συνδεθεί στις πλάκες, μέσο ανάπτυξης αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν σύντομα με 200 μΐ προ θερμαίνεται PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε σειριακές αραιώσεις έκλυσης αιμοπεταλίων από 1:10 έως 1:10,000 σε πλήρη μέσα, μέσο ελεύθερο ορού ή ρυθμιστικού JNL να επιτρέπει βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης που πρέπει να χρησιμοποιούνται σε επακόλουθες μελέτες που βασίζονται γονιδιακής έκφρασης.

Πλένονται έκθεση έκλυσης αιμοπεταλίων /αιμοπεταλίων για την έκφραση του γονιδίου ανάλυση

Η βέλτιστη συγκέντρωση του έκλυσης αιμοπεταλίων [προσδιορίστηκε με ΜΤΤ] εφαρμόσθηκε στις κυτταρικές γραμμές και τα επίπεδα της απόπτωσης συγκρίθηκαν έναντι κυττάρων που αναπτύσσονται σε πλήρη μέσα ενημέρωσης μόνο χρησιμοποιώντας ένα Roche Apodirect ΤΟΥΝΕΛ /προπιδίου κιτ ιωδιούχο. Όπως παρατηρήθηκε η αραίωση του έκλυσης αιμοπεταλίων σε πλήρη μέσα αύξησης 1:1000 να είναι η υψηλότερη συγκέντρωση της έκλυσης αιμοπεταλίων σε πλήρη μέσα τα οποία δεν έχουν επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη /βιωσιμότητα για όλες τις κυτταρικές σειρές και στη συνέχεια δείχθηκε να έχει ως αποτέλεσμα μη σημαντική διαφορά στην απόπτωση σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύσσονται σε πλήρη μέσα ενημέρωσης και μόνο προσδιορίστηκε ότι ήταν κατάλληλο για να προχωρήσει με τη συγκέντρωση αυτή. Δεδομένου ότι η έκλυσης αιμοπεταλίων παρασκευάζεται από ίδια σκευάσματα πλύθηκε αιμοπεταλίων, η αραίωση του έκλυσης αιμοπεταλίων 1:1000 ενημερώνει άμεσα τη χρήση μιας αραίωσης 1:1000 πλυμένων αιμοπεταλίων για συγκριτική μελέτη. Βέλτιστες συγκεντρώσεις έκλυσης αιμοπεταλίων και πλυμένα αιμοπετάλια [1:1000] ανεστάλησαν πλήρως μέσα καλλιέργειας και εφαρμόζονται σε καλλιεργημένα κύτταρα σε 75 cm

2 φιάλες εις τριπλούν. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε προϊόν έκλυσης ή πλυμένα αιμοπετάλια για 6 ώρες μετά τις οποίες το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα. ανάλυση μεταγραφικό διεξήχθη χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Εξόνιο Arrays.

RNA εκχύλιση

Τα κύτταρα πλύθηκαν εν συντομία σε PBS, τρυψινοποιήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθεί το υπερκείμενο. RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ [Qiagen Ltd., West Sussex, UK] σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ποσότητα RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια νανο-Drop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο [Wilmington, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής] και την ποιότητα με ένα Nano δοκιμασία μικοτσίπ Agilent Bioanalyser 2100 και RNA 6000 [Santa Clara, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής]. Το RNA αποθηκεύθηκε στους -80 ° C.

συστοιχία Affymetrix

100 ng του συνολικού RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα ελέγχου και κύτταρα εκτίθενται σε πλυμένα αιμοπετάλια /έκλυσης αιμοπεταλίων σημάνθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Ambion Expression WT [ ,,,0],Ambion /Life Technologies, Austin, TX, USA], συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων επισήμανσης από τον Kit Affymetrix Gene Chip πολυ-Α RNA ελέγχου. Όπως προτείνεται από Affymetrix /Ambion, σε κάθε βήμα του πρωτοκόλλου παρασκευής δείγματος, η πρόοδος παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας τόσο το Agilent 2100 Bioanalyzer και το φασματοφωτόμετρο Nanodrop. Ποιοτικός έλεγχος [QC] απαιτείται αξιολόγηση μετά την πρώτη RNA κύκλο καθαρισμού, μετά τον δεύτερο κύκλο μονής αλυσίδας καθαρισμού cDNA και μετά από ssDNA κατακερματισμό. Παρασκευασμένα κατακερματισμένη ssDNA υβριδοποιήθηκε στο Affymetrix Human εξόνιο 1,0 ST Array στους 45 ° C για 16 ώρες ακόλουθα πρωτόκολλα Affymetrix για τους GeneChip WT Terminal Labeling, GeneChip Hybridization Ελέγχου και GeneChip Hybridization, Wash, και κιτ Stain [Affymetrix, Santa Clara, USA] . Μετά τον υβριδισμό, τα τσιπς πλύθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το ρευστονικής Station Affymetrix GeneChip με κατάλληλο πρωτόκολλο δοκιμασίας 64 μορφή. Μετά από χρώση και το πλύσιμο βήματα του σαρωτή Affymetrix GeneChip 3000 και Affymetrix GeneChip Λογισμικό Λειτουργικό χρησιμοποιήθηκε για τη διαχείριση και την επεξεργασία των δεδομένων έκφρασης. Τα δεδομένα από 45 συστοιχίες εξόνιο ήταν υπόκεινται σε έλεγχο ποιότητας σειρά εκτελούνται χρησιμοποιώντας την έκφραση Affymetrix Console. Όλοι οι έλεγχοι ήταν εντός των παραμέτρων που προτείνονται από Affymetrix. Μετά την επιτυχή αξιολόγηση πρότυπα ελέγχου ποιότητας, τα δεδομένα chip στη συνέχεια αναλύθηκαν σε βάθος με τη χρήση λογισμικού ανάλυσης Biotique Συστήματα XRAY. Κάθε κυτταρική γραμμή εξετάστηκε κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες? ανάπαυσης, κύτταρα που εκτίθενται σε αιμοπεταλίων έκλυσης, και τα κύτταρα εκτίθενται σε πλυμένα αιμοπετάλια. Κάθε κυτταρική γραμμή και την κατάσταση αναλύθηκε εις τριπλούν. Το λογισμικό που χρησιμοποιείται για να συγκρίνουμε τις δύο ομάδες έκθεσης κατά τον έλεγχο ανάπαυσης και τα γονίδια που παρουσιάζουν θετική ή αρνητική μεταβολή φορές μεγαλύτερη από 1,5 και η σημασία της p ≤ 0,05 εξετάζονται.

Fluidigm επικύρωση

γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε με τη χρήση υψηλής απόδοσης Fluidigm του qPCR 48,48 δυναμικό σύστημα συστοιχίας. Επελέγησαν Γονίδια εμφανίζοντας τις πιο σημαντικές αλλαγές φορές εκτός από τα γονίδια που εμπλέκονται σε βιολογικώς σχετικό οδούς για επικύρωση. δοκιμασίες έκφρασης PCR TaqMan® πραγματικό χρόνο χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με το σύστημα μικροροής Biomark Fluidigm του. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα δεδομένα της έκφρασης Affymetrix. Το RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] σε 100 μλ αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις περιείχαν 10 μΐ ρυθμιστικού [10 ×], 4 μλ δεοξυνουκλεοτιδίου τριφωσφορικού [25 ×], 10 μΙ τυχαίων εκκινητών [10 ×], 5 μΐ multiscribe ενζύμου RT [50 U /μl], 21 μΙ άνευ νουκλεάσης νερό και 50 μΐ συνολικού RNA εκχυλίζεται [20 ng /μl]. Πριν από την Fluidigm, υψηλής απόδοσης qPCR, ένα βήμα προ-ενίσχυσης εκτελέστηκε ακόλουθα πρωτόκολλα Fluidigm? 1 ml προσδιορισμού TaqMan για καθένα από τα γονίδια του ενδιαφέροντος που προσδιορίζονται μέσω της ανάλυσης XRAY και ενδογενείς έλεγχοι συνενώθηκαν και γίνονται σε ένα τελικό όγκο 100 ml σε 1 × ΤΕ Ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ 8,0. 1,25 ml από κάθε δείγμα προστέθηκε σε 2,5 ml Preamp Master Mix [ΑΒ] και 1,25 ml συνενώθηκαν μίγματος δοκιμασίας για να δώσει ένα όγκο αντίδρασης 5 ml. Αυτό το μίγμα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε 14 κύκλους ενίσχυσης στους 95 ° C, 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C, 4 λεπτά πριν να αραιωθεί 1:05 με ϋΝΑση και RNase ελεύθερη H

20 για να δώσει ένα τελικό όγκο 25 ml του προ- ενισχυμένο cDNA. δεδομένων Fluidigm αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Fluidigm Real-Time PCR ανάλυση [ver3.02] για να δώσει σχετικές τιμές ποσοτικοποίηση βαθμονομηθεί με τα φυσιολογικά κύτταρα [ΟΑΥ-80]. Διπλώστε αλλαγές επέστρεψε από την ανάλυση Affymetrix σχεδιάστηκαν έναντι εκείνων που υπολογίζονται από τα δεδομένα Fluidigm και τη συσχέτιση μεταξύ των τιμών υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism [ver 5.02].

Τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση [EMT] ανάλυση της έκφρασης σε αιμοπετάλια cloaked /έκλυσης επεξεργασμένα κύτταρα

Η διαδικασία της ΕΜΤ είναι κρίσιμη στο μεταστατικό καταρράκτη, διευκολύνοντας την είσοδο των κυττάρων στο αγγειακό σύστημα. Το RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] σε 100 μλ αντιδράσεις όπως παραπάνω. Ένας συνδυασμός από τους κύριους παίκτες στη διαδικασία EMT [20] και επιπλέον γονίδια που εντοπίστηκαν στο εργαστήριο μας ως αναπόσπαστο μέρος της διαδικασίας EMT [τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται] εξετάστηκαν ως μέρος του προφίλ για EMT σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών: Akt-1, ΑΙ_ϋΗ1 Α1, Cdh1, PIK3CA, SNAIL1, ΣΑΛΙΓΚΆΡΙ 2, TWIST 1, βιμεντίνη, ZEB1, Zeb 2, TLR 4, MyD88 χρησιμοποιώντας αστάρι TaqMan και ανιχνευτές [Life Technologies /Applied Biosystems: αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης], σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση εξετάστηκε σε κύτταρα κατεργασμένα έκλυσης αιμοπεταλίων και αιμοπεταλίων και συγκρίνεται με ηρεμία ωοθηκών καρκινικά κύτταρα για όλες τις κυτταρικές γραμμές [ΟΑΥ-80, 59m, SK-OV-3, Α2780 και A2780cis]. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως οικόπεδο ηφαίστειο της τιμή p έναντι φορές αλλαγή. Οι αριθμοί δοκιμασία προσχώρησης για τα γονίδια που εξετάστηκαν φαίνεται παρακάτω:

GAPDH – Hs99999905_m1

ΑΚΤ1 – Hs00178289_m1

ALDH1A1 – Hs00167445_m1

PIK3CA – Hs00180679_m1

SNAIL1 – Hs00195591_m1

SNAIL2 – Hs00950344_m1

ZEB1 – Hs01566407_m1

ZEB2 – Hs00207691_m1

TWIST – Hs00361186_m1

βιμεντίνης – Hs00958116_m1

Cdh1 – Hs01023895_m1

MyD88 – Hs00182082_m1

TLR4 – Hs00152939_m1

Στατιστικά

τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5.0 λογισμικό [GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA]. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής.

Αποτελέσματα

συγκόλληση των αιμοπεταλίων στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα κάτω από στατικές συνθήκες

συγκόλληση των αιμοπεταλίων στο κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, υπό στατικές συνθήκες ποσοτικοποιήθηκε με βάση την φθορίζουσα ανίχνευση του επισημασμένου αιμοπεταλίων [Σχήμα 1Α]. Επικόλληση αιμοπεταλίων στο Α2780 [2.4 ± 0.2%, η = 8], A2780cis [3,0 ± 0,2%, η = 8] και 59m [3,4 ± 0,3%, η = 8] κυττάρων ήταν σημαντική σε σύγκριση με τον αρνητικό BSA ελέγχου [1,0 ± 0,1%, Ν = 8]. Επικόλληση αιμοπεταλίων να ΟΑΥ-80 [1,8 ± 0,2%, η = 8] και SK-OV-3 [1,3 ± 0,2%, η = 8] κύτταρα δεν ήταν σημαντική σε σύγκριση με BSA. Πρόσφυση σε όλα τα 5 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα ήταν χαμηλότερη από ό, τι με το θετικό έλεγχο ινωδογόνου [5,9 ± 0,4%, η = 8]. εικόνες μικροσκοπία φθορισμού καταδεικνύουν σαφώς προσκόλληση αιμοπεταλίων στις κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών Α2780 και 59m [Σχήμα 1Β και Γ]. Συνεπής με την δοκιμασία προσκόλλησης αιμοπεταλίων, σχήμα S1 επιδεικνύει την ελάχιστη προσκόλληση αιμοπεταλίων στην κυτταρική γραμμή ΟΑΥ-80.

[A] αιμοπεταλίων προσκόλληση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ποσοτικοποιήθηκε με βάση την ανίχνευση φθορισμού των επισημασμένων αιμοπεταλίων. Επικόλληση αιμοπεταλίων στο ινωδογόνο και BSA χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες ± [n = 8 + SEM, * = ρ & lt? 0,05 vs. BSA]. μικροσκοπία φθορισμού εικόνες των αιμοπεταλίων τήρηση Α2780 [Β] και τα κύτταρα 59m [C], υπό στατικές συνθήκες [εκπρόσωπος της n = 3]. Ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και αιμοπετάλια χρωματίστηκαν για ακτίνη [πράσινο], αιμοπετάλια χρωματίστηκαν ειδικά για CD42a [κόκκινο /κίτρινο].

Η

ωοθηκών καρκινικά κύτταρα επάγουν την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο

Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να επάγουν την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ποσοτικοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [0 – 1,5 × 10

6 κύτταρα /ml] προστέθηκαν σε PRP και ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων αξιολογήθηκε με βάση την έκφραση Ρ-σελεκτίνης. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων [Σχήμα 2]. Οι δύο μεταστατικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών? SK-OV-3 [1,5 × 10

6 κύτταρα /ml, 47 ± 10,2% των αιμοπεταλίων Ρ-σελεκτίνης θετικότητα, η = 3] και 59m [1,5 × 10

6 κύτταρα /ml, 51 ± 18% Ρ-σελεκτίνη θετικότητα n = 6] προκάλεσε την πιο σημαντική ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Η χαμηλότερη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων παρατηρήθηκε σε απάντηση στο μη μεταστατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών Α2780 [1,5 × 10

6 κύτταρα /ml, 16.1 ± 5.2% Ρ-σελεκτίνη θετικότητα, η = 6]. A2780cis [a ανθεκτική σισπλατίνη κόρη κυτταρική γραμμή να Α2780] κατέδειξε υψηλότερη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων από ό, τι η μητρική κυτταρική γραμμή του [1,5 × 10

6 κύτταρα /ml, 28,1 ± 12,2% Ρ-σελεκτίνη θετικότητα, η = 3]. Τα αθανατοποιημένα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών γραμμή ΟΑΥ-80 την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων επίσης επάγεται [1,5 × 10

6 κύτταρα /ml, 32.5 ± 7.8% των αιμοπεταλίων Ρ-σελεκτίνης θετικότητα, η = 3], αλλά σε μικρότερο βαθμό από ό, τι 59m και SK-OV-3 κύτταρα.

ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων [έκφραση Ρ-σελεκτίνης] επάγεται από μια σειρά κυτταρικών γραμμών ωοθηκών σε ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων [0,1-1,5 × 10

6 /ml] μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, με βάση την επιφανειακή έκφραση της Ρ-σελεκτίνης αιμοπεταλίων. Η πιο σημαντική ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων παρατηρήθηκε σε απάντηση των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές SK-OV-3 και 59m.

Η

P2Y12 /υποδοχέα Ρ2Υ1 και ADP /ανταγωνιστές ΑΤΡ αναστέλλει την ενεργοποίηση αιμοπεταλίων που προκαλείται από τον καρκίνο των ωοθηκών 59m κύτταρα

από 59m κύτταρα προκάλεσε την πιο σημαντική ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η επίδραση μιας σειράς αναστολέων αιμοπεταλίων στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων που επάγεται ωοθηκών καρκινικών κυττάρων. 59m καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [1,5 × 10

6 κύτταρα /ml, απόκριση κανονικοποιημένη στην ενεργοποίηση 100%] προστέθηκαν σε PRP προ-αγωγή με αναστολείς και της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής [έκφραση Ρ-σελεκτίνης]. Οι συγκεντρώσεις των αναστολέων επιλέχθηκαν με βάση την προκαταρκτική κυτταρομετρία ροής και συσσωματομετρία αιμοπεταλίων αποτελέσματα που έδειξαν να είναι ανταγωνιστικές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανταγωνιστές έναντι θρομβίνης [ιρουδίνη], ιντεγρίνη αIIbβ3 [ReoPro και RGDS πεπτιδίου], Cox-1 [ασπιρίνη], και ασβέστιο [EDTA], δεν είχε επίδραση στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων που επάγεται 59m κυττάρου [Εικόνα 3]. Μετά την αγωγή με τον ανταγωνιστή P2Y12 [cangrelor, 1 μΜ], ο ανταγωνιστής Ρ2Υ1 [MRS2179, 10 μΜ], ή η ADP /ΑΤΡάσης (απυράσης, 10 μονάδες /ml), η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με την παρουσία 59m ωοθηκών καρκινικών κυττάρων μειώθηκε σημαντικά [ ,,,0],1 μΜ Cangrelor – 92,4 ± 0,64% αναστολή, σ & lt? 0.001? 10 μΜ MRS2179 – 71,4 ± 10,52% αναστολή, p = 0,01? 10 μονάδες /ml απυράση, 91,8 ± 3,7% αναστολή, σ & lt? 0.001]. Αυτό υποδηλώνει μια ADP εξαρτώμενη μηχανισμός της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων από 59m κύτταρα, πιθανώς διαμεσολαβείται από την απελευθέρωση ADP από τα κύτταρα εντός υπερκειμένου τους [Εικόνα 3].

Αυτό υποδηλώνει ένα μηχανισμό ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων εξαρτάται από την αιμοπεταλίων υποδοχέων P2Y12 και Ρ2Υ1 και ADP που απελευθερώνεται από 59m κυττάρων σε υπερκείμενο τους. Άλλοι ανταγωνιστές των αιμοπεταλίων όπως η ιρουδίνη, EDTA, αμπσιξιμάμπη, RGDS, και ασπιρίνη δεν είχε επίδραση στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων που προκαλείται από κύτταρο 59m.

Η

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα ενισχύουν TRAP [υποδοχέα θρομβίνης πεπτίδιο ενεργοποίησης], PAR 4 αγωνιστής, και προκαλείται από οξύ ενεργοποίηση αραχιδονικό αιμοπεταλίων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο

Δεδομένου ότι η θρόμβωση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλούς αγωνιστές

in vivo

, είμαστε δίπλα ρώτησε αν ωοθηκών καρκινικά κύτταρα διαμορφώνονται αγωνιστή [TRAP, PAR 4 αγωνιστή, αραχιδονικό οξύ, ADP, επινεφρίνη και κολλαγόνο] επαγόμενη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Για τον προσδιορισμό αυτό, αξιολογείται η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων συν-επωάστηκαν με χαμηλές συγκεντρώσεις των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και χαμηλές συγκεντρώσεις αγωνιστή. Χρησιμοποιήθηκαν αιμοπεταλίων συγκεντρώσεις αγωνιστή που έδωσε ≤20% ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων [έκφραση Ρ-σελεκτίνης]. Σε χαμηλές κυτταρικές συγκεντρώσεις [0,5-1 × 10

5 κύτταρα /ml], 59m καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα ενισχύεται PAR-1 [TRAP], PAR-4 [PAR4 αγωνιστής] και του υποδοχέα ΤχΑ2 [αραχιδονικό οξύ] ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με τη μεσολάβηση [P -selectin έκφραση], αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην ADP, επινεφρίνη, κολλαγόνο ή επαγόμενη ενεργοποίηση [Σχήμα 4]. Για παράδειγμα, σε απόκριση σε 1 μΜ TRAP και 1 × 10

5 59m κύτταρα /ml, η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ήταν 44 ± 12,16% Ρ-σελεκτίνης θετικότητα [n = 3, Σχήμα 3], σε σύγκριση με 4,4 ± 1,6% Ρ-σελεκτίνης θετικότητα [1 × 10

5 59m κύτταρα /ml και μόνο, η = 3] και 5,1 ± 1,3% Ρ-σελεκτίνης θετικότητα [μόνα 1 μΜ TRAP, n = 3]. Αντίστροφα, σε απόκριση σε 1 μΜ ADP και 1 × 10

5 59m κύτταρα /ml, η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ήταν 17,3 ± 6,2% Ρ-σελεκτίνης θετικότητα [n = 3, Εικόνα 4] σε σύγκριση με 2,4 ± 1,4% [1 × 10

5 59m κύτταρα /ml και μόνο, η = 3] και 14,73 ± 5,3% [1 υΜ ADP και μόνο, η = 3]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν επίσης παρατηρηθεί σε απόκριση σε Α2780 κύτταρα [1 – 5χ 10

5 κύτταρα /ml], αλλά υψηλότερες συγκεντρώσεις Α2780 κυττάρων που απαιτείται για να προκαλέσει ένα παρόμοιο αποτέλεσμα με 59m κύτταρα [τα δεδομένα δεν απεικονίζονται]. Τα δεδομένα δείχνουν μια συνεργική σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων PAR-1, με τη μεσολάβηση υποδοχέα ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων PAR4, και ΤχΑ2 και Α2780 /59m επάγεται. Αυτή η συνεργική αλληλεπίδραση αναστέλλεται επίσης από την cangrelor ανταγωνιστή P2Y12 [τα δεδομένα δεν απεικονίζονται].

Η ενεργοποίηση λαμβάνει χώρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο [n = 3, + SEM]. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, 59m [0,5-1 × 10

5 /ml], τα κύτταρα σημαντικά ενισχύεται TRAP, PAR4 αγωνιστή, και επαγόμενη από οξύ ενεργοποίηση [έκφραση Ρ-σελεκτίνης] αραχιδονικό αιμοπεταλίων. Αυτό υποδηλώνει μια συνεργική σχέση μεταξύ των PAR-1, PAR-4, και η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων που προκαλείται υποδοχέα ΤΧΑ2 και 59m επαγόμενη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρούνται για κύτταρα Α2780 [1-5 × 10

5 κύτταρα /ml, τα δεδομένα δεν φαίνονται]

Η

ανάλυση της σειράς Έκφραση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε επεξεργασία με πλυμένα αιμοπετάλια ή έκλυσης αιμοπεταλίων χρησιμοποιώντας Affymetrix συστοιχίες εξόνιο

Όλες οι συστοιχίες περάσει, QC, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Affymetrix QC. Biotiques X-Ray λογισμικό plug-in για το Microsoft Excel χρησιμοποιήθηκε για να ανακρίνουν τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των θεραπειών και τύπων κυττάρων [Fold αλλαγή & gt? 1.5 και p & lt? 0.05]. Αναλυτική αυστηρότητας ήταν χαλαρή να πάει πάσο αλλαγές & gt? 1.5 για να φιλοξενήσει λεπτή αλλά σημαντική βιολογική διαφοροποίηση [p & lt? 0.05] που εξαρτιόταν από τη θεραπεία. Οι πίνακες 1, 2, 3, 4 απεικονίζουν τις μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης που παρατηρείται σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έκλυσης αιμοπεταλίων /πλυμένα αιμοπετάλια.

Η

Η

Σε ΟΑΥ 80-κυττάρων, μετά από θεραπεία με πλυμένα αιμοπετάλια ή έκλυσης αιμοπεταλίων, επτά γονίδια ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, με τη μεγαλύτερη διαφορά παρατηρείται σε απόκριση σε πλυμένα αιμοπετάλια. Οι ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που συνδέεται με τη μετάσταση καρκίνου των ωοθηκών [SERPINB2 /PAI2], μεταβολικές δραστηριότητες [IDI1, PMM2] και την έκφραση του γονιδίου /μεταγραφή [PCGF6, ZNF267].

κύτταρα 59m επίσης παρουσίασαν γονιδιακής έκφρασης αλλάζει μετά τη θεραπεία με αιμοπεταλίων έκλυσης και πλυμένα αιμοπετάλια. Οι βιολογικές διαδικασίες επηρεάζονται εμπλέκονται αντι-αυτοφαγία, μονοπάτια αντι-αποπτωτικών και προ-αγγειογενετική σηματοδότηση [TRAF2, CCL2, TNFAIP2, PDGFb].