Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι ασθενείς που διαγιγνώσκονται με μεταστατικό καρκίνο έχουν σχεδόν ομοιόμορφα κακή πρόγνωση. Οι διαθέσιμες θεραπείες για τους ασθενείς με την ασθένεια δεν είναι συνήθως θεραπευτική και έχουν παρενέργειες που περιορίζουν την θεραπεία που μπορεί να δοθεί. Μια θεραπεία που είναι επιλεκτικά τοξικό για τους όγκους θα μεγιστοποιήσει τα ευεργετικά αποτελέσματα της θεραπείας και την ελαχιστοποίηση των παρενεργειών, διευκολύνοντας δυνητικά αποτελεσματική θεραπεία που θα χορηγηθεί.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Είμαστε η υπόθεση ότι ο όγκος-τροπικός ιδιότητα των βλαστοκυττάρων ή προγονικά κύτταρα θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για να παραδώσει επιλεκτικά ένα θεραπευτικό γονίδιο για μεταστατικούς στερεούς όγκους, και ότι η έκφραση ενός κατάλληλου διαγονιδίου σε τόπους του όγκου θα μπορούσε να μεσολαβήσει θεραπείες της μεταστατικής νόσου. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε εγχέεται HB1.F3.C1 κύτταρα που μετατρέπονται για να εκφράσουν ένα ένζυμο που ενεργοποιεί αποτελεσματικά το αντικαρκινικό προφάρμακο CPT-11 ενδοφλεβίως σε ποντικούς που φέρουν όγκους διαδίδονται νευροβλάστωμα. Τα κύτταρα HB1.F3.C1 μετανάστευσαν επιλεκτικά σε θέσεις όγκου, ανεξάρτητα από το μέγεθος ή την ανατομική θέση των όγκων. Τα ποντίκια στη συνέχεια κατεργάζεται συστηματικά με CPT-11, και η αποτελεσματικότητα της θεραπείας παρακολουθήθηκε. Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το συνδυασμό των κυττάρων που εκφράζουν το HB1.F3.C1 CPT-11-ένζυμο ενεργοποίησης και αυτό προφάρμακο που παράγονται χωρίς όγκο επιβίωση 100% των ποντικών για & gt? 6 μήνες (

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου).

Συμπεράσματα

Τα νέα και σημαντικό εύρημα της μελέτης αυτής είναι ότι μπορεί να είναι δυνατόν να αξιοποιηθεί το όγκο-tropic ιδιότητα των βλαστικών ή προγονικών κυττάρων να μεσολαβούν αποτελεσματικές, όγκος εκλεκτικό θεραπεία για μεταστατικούς όγκους, για τα οποία δεν είναι ανεκτή θεραπευτική θεραπείες είναι διαθέσιμες σήμερα

Παράθεση:. Aboody KS, ο Μπους RA, Γκαρσία Ε, Μετς MZ, Najbauer J, Justus ΚΑ, et al. (2006) Ανάπτυξη ενός όγκου-επιλεκτική προσέγγιση για να μεταχειριστεί μεταστατικό καρκίνο. PLoS ONE 1 (1): e23. doi: 10.1371 /journal.pone.0000023

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Hans Clevers, Πανεπιστήμιο της Ουτρέχτης, Ολλανδία

Ελήφθη: 8 Αυγ, 2006? Αποδεκτές: 10 του Αυγ 2006? Δημοσιεύθηκε: 20η Δεκεμβρίου 2006

Copyright: © 2006 Aboody et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (CA113446, CA79763, CA76202, και CA21765)? . Σταματήστε Ίδρυμα Καρκίνου, Phi Beta Psi γυναικεία αδελφότητα, η Rosalinde και Arthur Ίδρυμα Gilbert, Neidorf Ίδρυμα Οικογένειας, Marcus Ιδρύματος, και η αμερικανική Λιβάνου Συρίας Associated Charities (ALSAC)

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχει.

Εισαγωγή

το νευροβλάστωμα είναι η πιο κοινή εξωκρανιακό στερεών όγκων σε παιδιά. Τυπικά, οι ασθενείς διαγνώστηκαν με νόσο υψηλού κινδύνου επιδεικνύουν καλή αρχική ανταπόκριση στη θεραπεία, αλλά όσο το 80% αυτών των ασθενών υποτροπιάζουν με μεταστατική νόσο που είναι ανθεκτική στη θεραπεία. Όπως και άλλοι στερεοί όγκοι, όταν νευροβλαστώματα μετάσταση, είναι πολύ δύσκολο να αντιμετωπιστεί, και η πλειοψηφία των παιδιών με μεταστατικό νευροβλάστωμα πεθαίνουν από τη νόσο τους [1] – [3]. Επί του παρόντος διαθέσιμες θεραπείες έχουν αποτελεσματικότητα κατά του όγκου, αλλά παράγουν επίσης ανεπιθύμητες παρενέργειες στο φυσιολογικό ιστό, περιορίζοντας την αγωγή που μπορεί να χορηγηθεί. είναι νέες και αποτελεσματικές προσεγγίσεις για την αγωγή του νευροβλαστώματος που απαιτούνται

Η προσέγγιση που περιγράφεται στην μελέτη αυτή βασίζεται σε αξιοποίηση του όγκου τροπισμό ιδιότητα του HB1.F3.C1 κυττάρων [4] – [16]. για να παραδώσει ένα αποτελεσματικός θεραπευτικός παράγοντας επιλεκτικά στους όγκους. Ο ειδικός στόχος της μελέτης ήταν να δείξει ότι η ενδοφλέβια χορήγηση των κυττάρων HB1.F3.C1 εκφράζουν το CPT-11 (ιρινοτεκάνη) καρβοξυλεστεράση -activating ενζύμου κουνελιού (ΠΑΑ), θα αυξήσει σημαντικά την αντικαρκινική δράση των ανεκτές δόσεις της CPT-11 σε ποντίκια φέρουν διαδίδονται όγκους νευροβλάστωμα. Η προσέγγιση που περιγράφεται μπορεί επίσης να προσαρμοστεί για την ανάπτυξη θεραπείας για ασθενείς με άλλους τύπους μεταστατικών συμπαγών όγκων.

Νευρικά βλαστικά κύτταρα (NSCs) ή προγονικών κυττάρων (NPC) του σώματος και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) έχουν πρόσφατα ερευνηθεί ως οχήματα παράδοσης για την αγωγή υποδόρια ξενομοσχεύματα, καθώς επίσης και για τη θεραπεία όγκων στο κεντρικό νευρικό σύστημα ή τους πνεύμονες προκλινικών μοντέλων. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που προσπαθούν να εκμεταλλευτούν την αξιοσημείωτη όγκο τροπισμό αυτών των κυττάρων να αναπτυχθούν θεραπείες για μεταστατικό, διαδίδονται στερεών όγκων. Δεδομένου ότι δεν είναι διαθέσιμες αποτελεσματικές θεραπείες για τις περισσότερες μεταστατικών όγκων, αποδεικνύοντας ότι τα βλαστικά ή προγονικά κύτταρα του εμβρύου ή ενηλίκου προέλευσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να βελτιώσει την πρόγνωση των ασθενών με μεταστατική νόσο μοιραία θα είναι ιδιαίτερα σημαντική.

Η κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη (HB1.F3.C1) προήλθε από εμβρυϊκά κύτταρα τελεγκεφάλου. Πρωτογενή κύτταρα απαθανατίστηκε από ρετροϊική εισαγωγή του V-

myc

γονίδιο που απαιτείται για να στηρίξει το δυναμικό αναπαραγωγής τους [17]. Μετά αθανατοποίηση, τα κύτταρα HB1.F3.C1 αναπαράγουν

in vitro

να σχηματίσουν πανομοιότυπα θυγατρικά κύτταρα ή μπορεί να διεγείρονται για να διαφοροποιηθούν σε άλλα κύτταρα νευρωνικής γράμμωσης, έτσι εμφανίζουν χαρακτηριστικά και των δύο βλαστικών κυττάρων και των προγονικών κυττάρων. Από HB1.F3.C1 κύτταρα χορηγούνται συστηματικά μεταναστεύουν και να εντοπίσουν

in vivo

σε θέσεις παθολογίας συμπεριλαμβανομένων των όγκων, προτείναμε να αξιοποιήσει αυτή την ιδιότητα για να παραδώσει επιλεκτικά ΠΑΑ για να ενεργοποιήσετε την αντικαρκινική προφάρμακο CPT-11 [18] – [20]. Υποθέσαμε ότι η αυξημένη μετατροπή αυτού του προφαρμάκου στο δραστικό μεταβολίτη της (SN-38) στους όγκους θέσεις θα αύξανε εκλεκτική αντικαρκινική δραστικότητα. Εμείς χορηγείται ενδοφλεβίως μεταγωγή από αδενοϊό κύτταρα HB1.F3.C1 εκφράζουν μία εκκρινόμενη μορφή της ΠΑΑ σε ποντίκια που φέρουν διαδίδονται νευροβλάστωμα. Τα ποντίκια στη συνέχεια κατεργάζεται συστηματικά με CPT-11 και τη μακροπρόθεσμη επιβίωση των ζώων παρακολουθήθηκε. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι η νέα ενζύμου /προφαρμάκου προσεγγίσεις για θεραπεία με χρήση βλαστικών ή προγονικών κυττάρων ως οχήματα παράδοσης μπορούν να έχουν χρησιμότητα στη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου.

Μέθοδοι

Tumor Κυτταρικές Γραμμές

Οι τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ΝΒ-1691, ΝΒ-1643, και SK-Ν-AS [21], [22]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την Ογκολογική Ομάδα Παιδιατρικής και την American Type Culture Collection και αντανακλούν διαφορετικά φαινοτύπων νευροβλάστωμα και γονότυπους: Ν

myc

ενισχύεται, Ν

myc

μη ενισχυμένο /υπερεκφράζεται, Ν-

myc

μη ενισχυμένη έκφραση /χαμηλού επιπέδου,

MDM2

ενισχύεται, και διαφορετικές αναλογίες των πυρηνικών /κυτταροπλασματικής ρ53. Κάθε τύπος πειράματος περιγράφεται λεπτομερώς παρακάτω έγινε με όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές? Τα αποτελέσματα από αντιπροσωπευτικά πειράματα φαίνονται. Τρεις κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν ότι τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν δεν περιορίζονταν σε μία μόνο κυτταρική σειρά? Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και με τις τρεις κυτταρικές γραμμές. κυτταρικές γραμμές όγκου αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 10% CO

2.

HB1.F3.C1 Κυτταρική Γραμμή

Ο HB1. F3.C1 κυτταρική γραμμή είναι ένα πολυδύναμο, κλωνοποιημένη κυτταρική σειρά που δημιουργήθηκε από αθανατοποίηση κυττάρων που λαμβάνονται από την τελεγκεφάλου ενός ανθρώπινου εμβρύου της κύησης 15 εβδομάδων, με τη χρήση ενός ρετροϊού που κωδικοποιεί το V-

myc

γονίδιο [17] , [23]. Τα πρωτογενή κύτταρα που λαμβάνονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Παθολογίας Τμήματος Ανατομική του Βανκούβερ Γενικό Νοσοκομείο, με άδεια για τη χρήση εμβρυϊκών ιστών που χορηγούνται από την Κλινική Επιτροπή Ερευνών Screening συμμετέχουν άνθρωποι από το Πανεπιστήμιο της Βρετανικής Κολομβίας. HB1.F3.C1 είναι μια καθιερωμένη, καλά χαρακτηρισμένα, σταθερή κυτταρική γραμμή [23] – [27]. HB1.F3.C1 κύτταρα αυτο-ανανέωση

in vitro

, είναι μη-ογκογονικά και είναι πολυδύναμα στο ότι μπορούν να επαχθούν για να διαφοροποιηθούν σε νευρώνες, ολιγοδενδροκύτταρα, αστροκύτταρα και [17]. Η χρήση αυτής της κυτταρικής γραμμής παρακαμφθεί το σημαντικό πρόβλημα της περιορισμένης διαθεσιμότητας μεγάλων ποσοτήτων πρωτογενών κυττάρων και μεγιστοποιείται αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των πειραμάτων. Η κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε ϋΜΕΜ με 10% FCS στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 10% CO

2.

Μεταγωγή HB1.F3.C1 κυττάρων να εκφράζουν ΠΑΑ

Replication με ανεπάρκεια αδενοϊό που εκφράζει μία εκκρινόμενη μορφή του RCE υπό τον έλεγχο του υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού (CMV) (AdCMVrCE) κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], [20], [28]. κύτταρα HB1.F3.C1 συν-καλλιεργήθηκαν με AdCMVrCE για 24 ώρες πριν από την ενδοφλέβια ένεση. Η δοκιμασία δραστικότητας ενζύμου που χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό του επιπέδου έκφρασης του ΠΑΑ από HB1.F3.C1 κύτταρα μεταδιεγείρονται με αδενοϊό έχει επίσης αναφερθεί προηγουμένως [20].

Μετανάστευση HB1.F3.C1 Cell, Injection και Localization

για να εξεταστεί αν τα κύτταρα HB1.F3.C1, χορηγείται με ενδοφλέβια ένεση, μεταναστεύουν προς διαδίδονται εστιών του όγκου στα ποντίκια, τα κύτταρα όγκου νευροβλαστώματος εγχύθηκαν ενδοφλεβίως στις φλέβες της ουράς των ποντικών και αφέθηκαν να σπείρουν και να αναπτύξουν όγκους για δύο μήνες. κύτταρα HB1.F3.C1 (2 × 10

6) στη συνέχεια με ένεση

μέσω

την ίδια διαδρομή και τα όργανα συλλέχθηκαν 3-4 ημέρες αργότερα για να αξιολογήσει τη μετανάστευση σε μακροσκοπική και μικροσκοπική όγκων.

Για θεραπευτική πειράματα, HB1.F3.C1 κύτταρα χορηγήθηκαν 2 εβδομάδες μετά την έγχυση των κυττάρων νευροβλαστώματος. Σε αυτό το χρονικό σημείο, οι όγκοι είναι μικροσκοπικές και μη ανιχνεύσιμα με το μάτι ή με

in vivo

απεικόνισης. Συνεπής με την έναρξη της θεραπείας σε αυτό το χρονικό σημείο, προτείνουμε ότι η πιο πιθανή ενδεχόμενη κλινική χρησιμότητα της περιγραφόμενης προσέγγισης θα είναι η εξάλειψη της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου μετά από συμβατική θεραπεία. Αυτό το πειραματικό πρωτόκολλο αντανακλά πιο άμεσα ότι η πιθανή εφαρμογή.

Σε τόσο τη μετανάστευση και θεραπευτικές μελέτες, 2 × 10

6 HB1.F3.C1 κύτταρα μετάγονται με αδενοϊό σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 20 ήταν προ-σημασμένο με CM-με Dil (χλωρομεθυλβενζαμιδο-1,1′-διοκταδεκυλ-3,3,3 ‘, 3’-tetramethylindocarbocyanine υπερχλωρικό, Molecular Probes, Eugene, OR) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές με PBS και εγχέεται στην ουραία φλέβα των ποντικών που φέρουν όγκο. CM-με Dil επιλέχθηκε επειδή είναι μη-διαχεόμενο δυνάμει δέσμευση από τα κυτταρικά θειόλες ομοιοπολική της, και έχει αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλο για την επισήμανση και

in vivo

εντοπισμό των κυττάρων για τουλάχιστον 10 εβδομάδες [29] , [30]. Σε πειράματα που περιλαμβάνονται στο παρόν έγγραφο, τα ποντίκια ενέθηκαν με CM-με Dil-επισημασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν 3-4 ημέρες μετά την επισήμανση και την ένεση.

ES1

e εστεράσης ανεπάρκεια σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID)

Το πλάσμα ποντικών SCID περιέχει υψηλά επίπεδα ενός καρβοξυλεστεράση τρωκτικό που ενεργοποιεί CPT-11 [31], [32]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε εστεράσης-ανεπαρκή ποντίκια SCID για όλες

in vivo

θεραπευτικές μελέτες [33]. Αυτά τα ζώα έχουν επίπεδα εστεράσης στο πλάσμα συγκρίσιμα με εκείνα του ανθρώπινου πλάσματος. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ένα AALAAC διαπιστευμένο εγκατάσταση και τους δόθηκε τροφή και νερό κατά βούληση.

RT-PCR /PCR

Ο μυελός των οστών συλλέχθηκε από την κνήμη του κανονικού και ποντίκια που φέρουν όγκους, και το RNA εκχυλίστηκε για ανίχνευση RT-PCR του υδροξυλάσης τυροσίνης (ΤΗ), ένα δείκτη κυττάρων νευροβλαστώματος. DNA εκχυλίστηκε από ένα ξεχωριστό κλάσμα του μυελού των οστών για PCR του ν-

myc

γονίδιο για τον εντοπισμό HB1.F3.C1 κύτταρα. έχουν Primer αλληλουχιών και συνθήκες RT-PCR για την ΤΗ έχουν δημοσιευθεί προηγουμένως [21]. Χρησιμοποιήθηκαν πρότυπες μέθοδοι για v-

myc

ενίσχυση χρησιμοποιώντας ένα έναυσμα 5′-CCTTTGTTGATTTCGCCAAT-3 ‘και έναν αντίστροφο εκκινητή 5′-AGTTCTCCTCCTCCTCCTCG-3’, με ένα στάδιο αναδιάταξης 62,5 ° C για 1 λεπτά για 30 κύκλους. Ο θετικός έλεγχος για TH ήταν RNA που εξάγεται από NB-1691 κύτταρα, και για το V-

myc

γονίδιο ήταν DNA από κύτταρα HB1.F3.C1. Οι αρνητικοί μάρτυρες δεν περιείχαν RT ή καθόλου DNA, για TH και V-

myc

αντιδράσεις, αντίστοιχα.

Ιστοχημείας, ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμού Imaging

Όργανα συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 4 % παραφορμαλδεϋδη /PBS, ρΗ 7,4 και κρυοπροστατεύτηκε σε 30% σακχαρόζη. Σταθερή ιστοί στη συνέχεια ενσωματώνονται σε OCT, σειριακά υποβλήθηκαν σε κρυοτομή (10 μm), αποψυχθεί τοποθετημένο πάνω σε γυάλινες πλάκες και αποθηκεύθηκαν ξηρά σε -20 ° C. Για συνήθη ιστολογική εξέταση, τομές ιστών χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη δια προτύπων μεθόδων.

παρουσία κυττάρων HB1.F3.C1 στο νευροβλαστώματος loci όγκο ή σε φυσιολογικό ιστό εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Σε τομές παρασκευάστηκαν όπως αναφέρθηκε λεπτομερώς παραπάνω, οι πυρήνες όλων των κυττάρων βάφτηκαν με DAPI (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη? Sigma Biochemical, St. Louis, ΜΟ? Μπλε φθορισμός), και ανιχνεύεται με τη χρήση φίλτρων επιφθορισμού διέγερσης /εκπομπής 340 -380 /420 nm (LP) (UV-2Α, Nikon). κύτταρα HB1.F3.C1, επισημασμένα με CM-με Dil (κόκκινο φθορισμό), ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρα διέγερσης /εκπομπής των 540 έως 580 nm και 600-660 nm (Y-2Ε /C), χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse TE2000-U μικροσκόπιο (Nikon Instruments, Melville, Νέα Υόρκη) είναι εξοπλισμένα με ένα SPOT RT Slider ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Διαγνωστικά Όργανα, Sterling Heights, MI). Για την ανίχνευση ανθρώπινων όγκων νευροβλαστώματος σε ιστούς ποντικού, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού το οποίο αναγνωρίζει την ανθρώπινη πρωτεΐνη μιτοχονδριακή (Chemicon, Temecula, CA). Οι τομές μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, ξεπλύθηκαν, διαπερατά με 0,3% Triton Χ-100 /PBS, 30 λεπτά και επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού (5% BSA + 3% φυσιολογικό ορό αλόγου + 0.1% Triton Χ-100 , 1 h). Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν διαδοχικά με πρωτογενές αντίσωμα (αραίωση 1:100) για 16 ώρες στους 4 ° C, βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα IgG αντι-ποντικού (Vector Laboratories, Burlingame, CA) για 2 ώρες, και αβιδίνη-ΡΙΤΟ (Vector Laboratories) για 1 ώρα. Τομές ιστού βάφτηκαν αντίθετα με DAPI και τοποθετημένα με φθορίζοντα μέσο στερέωσης (ϋΑΚΟ). Ο φθορισμός FITC ανιχνεύτηκε με φίλτρο επιφθορισμό (465 έως 495 nm διέγερση, 515-555 nm εκπομπή? Β-2Ε /C).

Για τη συνήθη ιστολογική αξιολόγηση της παρουσίας όγκων σε διάφορα όργανα, τμήματα ιστού κηλιδώθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Δίπλα τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϋπεροξειδάσης-3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρώση ομοίως όπως οι ιστοί υποβάλλονται σε επεξεργασία για χρώση φθορισμού, εκτός από το ότι μετά από διαπερατοποίηση, ενδογενείς υπεροξειδάσες σβήστηκαν με 0,3% υπεροξείδιο του υδρογόνου /PBS για 30 λεπτά. αντιδραστικότητα αντισώματος στα ανθρώπινα μιτοχόνδρια στη συνέχεια ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Vectastain ABC

Elite

κιτ (Vector Laboratories) και ένα κιτ υποστρώματος υπεροξειδάσης (Vector Laboratories) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

χαμηλής και υψηλής εικόνες μεγέθυνση ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse TE2000-U μικροσκόπιο (Nikon Instruments, Melville, Νέα Υόρκη) είναι εξοπλισμένα με φωτεινού και φωτισμό φθορισμού. Εικόνες καταγράφηκαν και αποθηκεύτηκαν χρησιμοποιώντας SPOT προχωρημένους και Adobe Photoshop λογισμικό.

τροποποιημένο κύτταρο Boyden Επιμελητήριο Μετανάστευση Δοκιμασία

Τροποποιημένο δοκιμασίες θάλαμο Boyden χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η

in vitro

τροπισμός του κύτταρα HB1.F3.C1 να καρκινικών κυττάρων-ρυθμισμένα μέσα ή για τον έλεγχο των μέσων ενημέρωσης, με τη χρήση τυποποιημένων μεθόδων. Εν συντομία, τα κύτταρα HB1.F3.C1 μεταγωγή με ένα ΜΟΙ 0, 5, 10 ή 20 AdCMVrCE θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε DMEM που περιέχει 5% BSA. Τα κύτταρα (3 χ 10

4 κύτταρα /100 μΙ) τοποθετήθηκαν σε άνω θαλάμων και νευροβλαστώματος κυττάρων-ρυθμισμένο μέσο σε κάτω θαλάμους. Το νευροβλάστωμα κύτταρο-ρυθμισμένο μέσο σε αμφότερα τα άνω και κάτω θαλάμους περιελάμβανε τον έλεγχο χημειοκίνηση χωρίς μια κλίση χημειοελκτικό. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 4 ώρες σε μια συσκευή επώασης κυτταρικής καλλιέργειας στους 37 ° C και 5% CO

2. Ο αριθμός των μετανάστευσαν HB1.F3.C1 κυττάρων στον κατώτερο θάλαμο του κάθε φρεατίου ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας βαφή CyQuant GR φθορισμού (Chemicon) και έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Μελέτες σε ζώα

Διάχυτη νευροβλάστωμα παρήχθη με την έγχυση 5 × 10

5 NB-1691, NB-1643, ή κύτταρα SK-Ν-AS σε η ουρά φλέβες των ποντικών. Συνήθως αυτά τα ποντίκια απαιτούν ευθανασία -75 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων νευροβλαστώματος. Ακαθάριστο όγκων σε πολλαπλά όργανα είναι ορατά κατά τη νεκροψία. Αυτό μεταστατικό μοντέλο νευροβλαστώματος έχει καλώς χαρακτηριστεί και είναι ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη όσον αφορά την πορεία της νόσου και τη συμμετοχή οργάνων [34]. Επιπλέον, το μοντέλο ανακεφαλαιώνει την κλινική μοτίβο των μεταστατικών νευροβλαστώματος από το ότι οι όγκοι αναπτύσσονται σε πολλαπλές θέσεις, συμπεριλαμβανομένων των επινεφριδίων, μυελού των οστών και το ήπαρ.

Κάθε ομάδα θεραπείας περιλάμβανε 10 ποντικούς, παρακολουθούνται καθημερινά ως προς την παρουσία της νόσου ή κακή υγεία. Το εβδομαδιαίο πρόγραμμα χορήγησης των κυττάρων HB1.F3.C1 και CPT-11 (7,5 mg /kg) απεικονίζεται στο Σχήμα 8. Αυτή η αγωγή για 2 διαδοχικές εβδομάδες, ακολουθούμενη από μια περίοδο ανάπαυσης 2 εβδομάδων και στη συνέχεια ένα άλλο 2- εβδομάδων πορεία της θεραπείας. Όλα τα πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από το City of Hope ή του Αγίου Jude Παιδική Research Hospital IACUC. Όταν τα ποντίκια φάνηκε να είναι σε ταλαιπωρία ή αγωνία, όπως κρίνεται από ανεξάρτητο προσωπικό φροντίδα των ζώων χωρίς τη γνώση του σχεδιασμού του πρωτοκόλλου, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία. Όλα τα ευθανασία ποντίκια ελέγχθηκαν ως φέρει τον όγκο με νεκροψία. Το τελικό σημείο για τη θεραπευτική μελέτης ήταν μακροχρόνια επιβίωση.

κύτταρα SK-Ν-AS (5 × 10

5) μετάγονται να εκφράσουν λουσιφεράση ενέθηκαν σε φλέβες της ουράς.

Μία μήνες μετά την ένεση των κυττάρων όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με λουσιφερίνη και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης Xenogen IVIS, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πολλαπλούς όγκους ήταν παρόντα στο 100% των ποντικών.

Δύο αντιπροσωπευτικά ποντίκια φαίνεται.

Η

Ανθρώπινο νευροβλάστωμα τα κύτταρα του όγκου χορηγείται με ενδοφλέβια ένεση για να παράγουν διαδίδονται όγκους.

σε κατάλληλο χρόνο μετά την ένεση των κυττάρων νευροβλάστωμα, νευρικά βλαστικά κύτταρα ή νευρικά προγονικά κύτταρα που μετατρέπονται με αδενοϊό να εκφράσει ένα ένζυμο ενεργοποίησης προφαρμάκου (σε αυτή τη μελέτη, μια εκκρινόμενη μορφή της καρβοξυλεστεράση κουνελιού [ΠΑΑ]) εγχέονται ενδοφλεβίως.

Μετά μετανάστευση των βλαστοκυττάρων ή προγονικά κύτταρα για να εστιών του όγκου και μια καθυστέρηση 3-4 ημέρες για να επιτραπεί η έκφραση σχετικά υψηλό επίπεδο του ενζύμου ενεργοποίησης προφαρμάκου στο εξωκυτταρικό περιβάλλον στις καρκινικές περιοχές, οι ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με το προφάρμακο (σε αυτή τη μελέτη, CPT-11).

το προφάρμακο ενεργοποιείται επιλεκτικά σε εστίες όγκων, για να αυξηθεί το θεραπευτικό δείκτη του προφαρμάκου

η

(Α) ανατμηθέντες ήπατος από ένα αντιπροσωπευτικό ζώο με ηπατικές μεταστάσεις.? το ζώο θυσιάστηκε δύο ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων HB1.F3.C1 στη φλέβα της ουράς.

(Β) χαμηλής και (Γ) μεγέθυνση υψηλής ισχύος ενός τμήματος του όγκου-εμπλέκονται ήπατος, χρωματίστηκαν με . αιματοξυλίνη και ηωσίνη

Tumor κύτταρα φαίνεται σκούρο μοβ (μαύρα βέλη)? . Φυσιολογικούς ιστούς φαίνεται ροζ

(δ) Το τμήμα του ήπατος βάφονται με ένα αντι-ανθρώπινο μιτοχονδριακό αντισώματος πρωτεΐνης και με αιματοξυλίνη

μικρομεταστάσεων όγκων λεκέ σκούρο καφέ (κόκκινα βέλη).? φυσιολογικό ιστό του ήπατος είναι μωβ.

(Ε) μικροσκοπία ανοσοφθορισμού του τμήματος του ήπατος.

HB1.F3.C1 κύτταρα CM-ΟίΙ-επισημανθεί πριν από την ένεση και να είναι εμφανείς, όπως ερυθρά αιμοσφαίρια.

Το τμήμα ήπατος βάφονται με DAPI? Οι εστίες των όγκων προσδιορίζονται από τους τομείς της πυκνά-συσκευασμένα καρκινικών κυττάρων πυρήνες DAPI-βάφονται.

Τα κόκκινα βέλη δείχνουν εξαγγειωμένα κύτταρα HB1.F3.C1 εγγύς σε ηπατική φλέβα (v).

Ένθετο είναι μεγάλη μεγέθυνση ενός με Dil-επισημασμένου κυττάρου HB1.F3.C1 εντός του όγκου. (F-Η) τμήμα του ήπατος από ένα ζώο που φέρει τον όγκο που έλαβαν CM-με Dil-επισημασμένα κύτταρα HB1.F3.C1 χρωματίστηκε με FITC-συζευγμένο ειδικό ανθρώπινο μιτοχονδριακό αντίσωμα.

(F) Red CM-ΟίΙ σημασμένο HB1.F3.C1 κύτταρα.

(G) Το ίδιο τμήμα που δείχνει FITC-επισημασμένο (πράσινο) ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και κύτταρα HB1.F3.C1.

(Η) Επικάλυψη των (ερυθρά CM-με Dil HB1.F3.C1) F και G (πράσινο FITC HB1.F3.C1 και καρκινικά κύτταρα).

κύτταρα HB1.F3.C1 (πορτοκαλί /κίτρινο κύτταρα υποδεικνύεται με λευκά βέλη) μετανάστευσαν στην ηπατική μικρομεταστάσεων (πράσινα κύτταρα) και διεισδύσει την παρέγχυμα του όγκου στην εγγύτητα ενός αιμοφόρου αγγείου (bv, λευκό διακεκομμένες γραμμές)

ράβδοι κλίμακας:. 1 cm (Α), 2 mm (Β), 500 μm (C), 200 μm (F, G), 100 μm (D, E, H), 10 μm (Ε ένθετο).

Η

X-ray εικόνα οπίσθιων άκρων ενός ποντικού με προχωρημένο στάδιο νευροβλαστώματος (Ημέρα 82? αριστερό πίνακα, γραμμή κλίμακας: 1 cm)

Επιβεβαίωση της μάζας του όγκου ως ανθρώπινα SK-N-AS κύτταρα νευροβλαστώματος διεξήχθη με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ανθρώπινης μιτοχόνδρια (δεν δείχνεται. )

Οι CM-με Dil-επισημασμένα κύτταρα HB1.F3.C1 (ερυθρά αιμοσφαίρια, με ένεση στη φλέβα της ουράς 3 ημέρες πριν την θυσία) εντοπίζεται σε όγκο στον μυελό (δεξί πάνελ.? κλίμακα bar:. 200 μm)

Η

σύμφωνη ανίχνευση V- ​​

myc

(κύτταρα HB1.F3.C1) με PCR και Θ έκφρασης (κύτταρα νευροβλάστωμα) με RT-PCR σε δείγματα μυελού των οστών.

δείγματα μυελού των οστών απομονώθηκαν από ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα HB1.F3.C1 αναλύθηκαν για την παρουσία του ν-

myc

(HB1.F3.C1 κύτταρα) ή την έκφραση του TH (NB-1643 κύτταρα).

κύτταρα HB1.F3.C1 ήταν παρόντες στο μυελό των οστών μόνο όταν τα καρκινικά κύτταρα ήταν επίσης παρόντες.

κύτταρα HB1.F3.C1 δεν είχαν ανιχνευθεί στο μυελό των οστών των μη φέρουν όγκο ζώα.

Οι θετικοί έλεγχοι (+) έχουν ϋΝΑ που εξάγεται από τα κύτταρα HB1.F3.C1 για v-

myc

, και RNA που εκχυλίζεται από ΝΒ -1691 κύτταρα για TH

Οι αρνητικοί έλεγχοι. (-) δεν περιείχε DNA ή RNA εκμαγείο, αντίστοιχα

Η

Κανονικό και φέροντες όγκο συλλέχθηκαν τα όργανα, τεμαχίστηκαν, και χρωματίστηκαν με. DAPI. κύτταρα HB1.F3.C1 δεν ανιχνεύθηκαν σε φυσιολογικό (Α) του εγκεφάλου, (Β) νεφρό, (Γ) της καρδιάς, (D) έντερο, ή (Ε) ιστού δέρματος.

Σπάνια, ενιαία, HB1. κύτταρα F3.C1 (λευκά βέλη) παρατηρήθηκαν σε (F) των πνευμόνων, (G) του ήπατος και (H) σπλήνα

ράβδοι κλίμακας:. 200 μm (Α-Ε), 100 μm (F-Η) .

η

οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων ± SEM των φρεατίων εις τριπλούν σε τροποποιημένη δοκιμασίες θάλαμο Boyden.

η

Μια μέρα πριν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπείες, τα κύτταρα μετάγονται με το κατασκεύασμα AdCMVrCE (βλέπε κείμενο).

το πρόγραμμα θεραπείας βασίστηκε στην χρονική πορεία της έκφρασης της εκκρινόμενης μορφής του ΠΑΑ, μετά από αδενοϊική μεταγωγή των κυττάρων HB1.F3.C1 (Danks, αδημοσίευτη παρατήρηση) και σε ένα χρονοδιάγραμμα της χορήγησης της CPT-11 που έχει αποδειχθεί ότι είναι σχετικά αποτελεσματική για τους ασθενείς νευροβλάστωμα [35].

η

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό GraphPad Prism (San Diego, CA). Οι αναλύσεις των αποτελεσμάτων κυτταρικής μετανάστευσης (μέσος αριθμός κυττάρων ± S.E.M.) Του μη μεταδιηγερμένα κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που έχουν υποστεί μεταγωγή με αδενοϊό. Αυτά τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μία δίπλευρη

t-τεστ

. Ανάλυση των Kaplan-Meier για σύγκριση επιβίωση των 10 ποντικών ανά ομάδα χρησιμοποιώντας log-rank (Mantel-Haenszel) μέθοδο.

Αποτελέσματα

Mouse Μοντέλο μεταστατικού Νευροβλάστωμα

Ενδοφλέβια ένεση 5 × 10

5 NB-1691, NB-1643, ή SK-Ν-AS ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος παράγει διαδίδονται νευροβλάστωμα στο 100% των SCID ποντίκια εστεράσης ανεπάρκεια. Η διαδίδονται φύση των όγκων είναι εμφανής στο σχήμα 1 σε δύο ποντικούς που έλαβαν ενέσεις στην φλέβα της ουράς των κυττάρων SK-N-AS σε μεταγωγή για να εκφράζουν λουσιφεράση. Ένα μήνα μετά την ένεση των κυττάρων νευροβλαστώματος, η λουσιφερίνη υπόστρωμα λουσιφεράσης εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά να απεικονίσει όγκους

in situ

. Σε συμφωνία με δημοσιευμένες αναφορές, οι όγκοι ήταν παρόντες σε πολλαπλά όργανα και ανατομικές θέσεις, όπως στην κοιλιά, του μυελού των οστών, το ήπαρ, τους πνεύμονες και [21], [34]. Δεδομένου ότι το 100% των ποντικών που ενέθηκαν με κύτταρα νευροβλαστώματος αναπτύσσουν διάχυτη ασθένεια που τελικά οδηγεί σε θάνατο, το μοντέλο αυτό διευκόλυνε την αξιολόγηση των θεραπευτικών πειράματα που διεξήχθησαν σύμφωνα με το σχήμα στο Σχήμα 2. Αυτό το σχήμα παρουσιάζει η υπόθεση που πρόκειται να ελεγχθεί. Ποντικοί εγχύθηκαν με κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος ανάπτυξη πολλαπλών όγκων. Δύο εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων νευροβλαστώματος, τα κύτταρα HB1.F3.C1 μεταδιεγείρονται με αδενοϊό που κωδικοποιεί ένα ένζυμο ενεργοποίησης προφαρμάκου που χορηγείται ενδοφλεβίως. Τρεις ημέρες αργότερα, μετά HB1.F3.C1 κύτταρα έχουν εντοπισμένη κατά προτίμηση σε θέσεις όγκου και της ενεργοποίησης προφαρμάκου ενζύμου (ΠΑΑ σε αυτή τη μελέτη) εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα, προφάρμακο (CPT-11) χορήγηση εκκινεί, δίνεται σε μια προκαθορισμένη βέλτιστη πρόγραμμα. Η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της προφάρμακο μόνο μπορεί στη συνέχεια να συγκριθεί με συν-χορήγηση κυττάρων HB1.F3.C1 και προφάρμακο, χρησιμοποιώντας την επιβίωση σαν τελικό σημείο.

Εντοπισμός του HB.F3.C1 Cells να όγκου νευροβλαστώματος σε Liver

για να επιβεβαιώσετε πρώτα ότι HB1.F3.C1 κύτταρα μεταναστεύουν και εντοπίζεται σε διαδίδονται όγκους νευροβλάστωμα, τα ποντίκια με καθιερωμένες ΝΒ-1643 όγκοι υπέστησαν ενδοφλέβια έγχυση με 2 × 10

6 CM-σημασμένα με Dil HB1.F3. κύτταρα C1. Μετά από 3 ημέρες, η κανονική και φέροντες όγκο συλλέχθηκαν τα όργανα και σε τομή, και αξιολογήθηκαν μικροσκοπικά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, πολλαπλούς όγκους ήταν εμφανής από βαριά επιθεώρηση στο ήπαρ ενός αντιπροσωπευτικού ποντικού (πίνακας Α), και επίσης με μικροσκοπική αξιολόγηση των τμημάτων αιματοξυλίνη /ηωσίνη χρωματίζονται (πάνελ Β και C, μωβ περιοχές) και χρώση ανοσοϋπεροξειδάσης των ανθρωπίνων μιτοχονδριακή πρωτεΐνη (πίνακας D, καφέ περιοχές). κύτταρα HB1.F3.C1 συν-εντοπισμένη με αυτά εστίες όγκων, όπως αποδεικνύεται από τα CM-με Dil-σημασμένα, τα ερυθρά κύτταρα φαίνεται στον πίνακα Ε Αυτός ο πίνακας δείχνει επίσης την εξαγγείωση των κυττάρων HB1.F3.C1 και τη μετανάστευση τους μακριά από το ηπατική φλέβα (ν). Πίνακας F δείχνει HB1.F3.C1 NSCs (CM-με Dil-επισημασμένο, κόκκινο) και το πάνελ G απεικονίζει ίδιο τμήμα βάφονται με ανθρώπινο μιτοχονδριακό αντίσωμα-FITC (ανθρώπινα NSCs και καρκινικά κύτταρα, πράσινο). Πάνελ Η, μία επικάλυψη πάνελ F και G, αποδεικνύει συν-εντοπισμό των κυττάρων HB1.F3.C1 (πορτοκαλί /κίτρινο, που υποδεικνύεται με λευκά βέλη) και κυττάρων όγκου (πράσινο), σε θέσεις ακριβώς δίπλα και σε απόσταση από το αιμοφόρο αγγείο (bv). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για όγκους σε πολλαπλές άλλα όργανα, συμπεριλαμβανομένου του ωοθήκη (δεν φαίνεται) και του μυελού των οστών (Εικόνα 4).

HB1.F3.C1 Cells εντοπίζεται σε νευροβλάστωμα μεταστάσεων σε Bone Marrow

από μυελού των οστών είναι μια συχνή περιοχή της νευροβλάστωμα μετάστασης και του μυελού των αναρροφήσεις ή βιοψίες χρησιμοποιούνται για να τεκμηριώσουν το στάδιο της νόσου σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν τα κύτταρα HB1.F3.C1 διεισδύσει επίσης όγκους σε αυτό το site. Το αριστερό τμήμα του Σχήματος 4 δείχνει την ακτινογραφία του μηριαίου οστού του ποντικού που φέρει μια μακροσκοπική όγκο που προήλθε από το μυελό των οστών. Αυτό το ζώο εγχύθηκε ενδοφλεβίως με CM-με Dil-επισημασμένα κύτταρα HB1.F3.C1 και ευθανασία τρεις ημέρες αργότερα. Η περιοχή του οστού που υποδεικνύεται από τον κόκκινο ορθογώνιο στη συνέχεια σε επεξεργασία για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Το δεξί πάνελ του Σχήματος 4 δείχνει καθαρά κύτταρα HB1.F3.C1 (ερυθρός φθορισμός) διηθούν το μυελό που φέρει όγκο, τεκμηριώνοντας ότι αυτά τα κύτταρα μετανάστευσαν προς και συν-εντοπισμένη με μακροσκοπική όγκους (Σχήμα 4), καθώς και μικροσκοπικά όγκοι (Σχήμα 3 ). Ωστόσο, ενώ ενδιαφέρον, θεωρήσαμε πιο σημαντικό και σχετικό να καταδειχθεί μετανάστευση κυττάρων HB1.F3.C1 σε μικροσκοπική όγκους στον μυελό των οστών (Σχήμα 5), όπως της νόσου σε υποτροπή πιστεύεται ότι προέρχονται από υπολειπόμενα κύτταρα όγκου που υπάρχουν στο μυελό ή στην πρωτοβάθμια περιοχές. Επίσης, είναι απαραίτητο για την επιτυχή κλινική εφαρμογή αυτής της προσέγγισης για να δείξει ότι τα κύτταρα HB1.F3.C1 δεν υπάρχουν σε φυσιολογικό ιστό (σχήματα 5, 6).

Molecular Αποδείξεις για HB1.F3.C1 Κυττάρων και όγκου κυττάρων συν-εντοπισμό σε Bone Marrow

για να αντιμετωπιστεί το πρώτο από αυτά τα δύο ερωτήματα, αξιολογήσαμε μετανάστευση κυττάρων HB1.F3.C1 σε καρκινικά κύτταρα στο μυελό των οστών, με χρήση ευαίσθητης μοριακή προσέγγιση για την ανίχνευση της παρουσίας του ένας ελάχιστος αριθμός όγκων κυττάρων ή /και κυττάρων HB1.F3.C1. Για το σκοπό αυτό, συλλέξαμε μυελού από ποντικούς που είχαν ενεθεί ενδοφλεβίως με κύτταρα ΝΒ-1691, που ακολουθείται από HB1.F3.C1 κύτταρα δύο εβδομάδες αργότερα. Όπως σημειώνεται παραπάνω, σε αυτό το «στάδιο» της ασθένειας, οι όγκοι δεν είναι ανιχνεύσιμα στο μικροσκόπιο. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε PCR για την ανίχνευση της V-

myc

παρούσα σε HB1.F3.C1 κύτταρα γονίδιο και RT-PCR για την ανίχνευση υδροξυλάσης της τυροσίνης (ΤΗ), ένα δείκτη κυττάρων νευροβλαστώματος. Τα δεδομένα στο Σχήμα 5 δείχνουν ότι είτε και τα δύο V-

myc

και Θ ή κανένας από αυτούς τους δείκτες ανιχνεύθηκαν σε οποιαδήποτε δεδομένη μυελό. Εάν ο μυελός περιείχε τα καρκινικά κύτταρα όπως υποδεικνύεται από ένα ανιχνεύσιμο σήμα για τα κύτταρα ΤΗ, HB1.F3.C1 (ένα θετικό σήμα για v-

myc

) ήταν επίσης παρόντες. Αντίθετα, όταν δεν ανιχνεύτηκαν κύτταρα νευροβλαστώματος, τα κύτταρα HB1.F3.C1 ήταν ομοίως μη ανιχνεύσιμη. Αυτή η «συν-εντοπισμό» συνέβη μέσα σε 1 ώρα μετά την ένεση και παρέμεινε για τουλάχιστον 7 ημέρες. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα στα σχήματα 3 και 4, και δείχνουν ότι τα κύτταρα HB1.F3.C1 μεταναστεύουν ταχέως σε καρκινικά κύτταρα

in vivo

.

Λίγοι HB1.F3.C1 κύτταρα είναι παρόντα σε φυσιολογικό ιστό

για θεραπεία όγκων να είναι επιλεκτικό, ήταν επίσης απαραίτητο να δείξει ότι τα κύτταρα HB1.F3.C1 δεν μεταναστεύουν σε άλλους φυσιολογικούς ιστούς. Κατά συνέπεια, 2 × 10

6 CM-με Dil-σημασμένα κύτταρα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε ποντικούς που φέρουν ΝΒ-1643 όγκοι και μετά από 3 ημέρες, όλα τα όργανα συλλέχθηκαν και εκτιμήθηκαν για την παρουσία των κυττάρων HB1.F3.C1. Το Σχήμα 6 καταδεικνύει ότι λίγοι, αν υπάρχουν, τα κύτταρα HB1.F3.C1 ήταν παρόντες σε φυσιολογικό εγκέφαλο, τα νεφρά, την καρδιά, το έντερο ή τον ιστό του δέρματος (πάνελ Α-Ε, αντίστοιχα). Περιστασιακά, παρατηρήθηκε μία μόνο κύτταρο στον πνεύμονα, του ήπατος ή της σπλήνας (πάνελ F-Η, αντίστοιχα), αλλά όχι την εστίαση του CM-με Dil φθορισμός παρατηρήθηκε σε οποιοδήποτε φυσιολογικό ιστό οποιασδήποτε από πέντε ποντικούς που εξετάστηκαν. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα HB1.F3.C1 μετανάστευσαν επιλεκτικά σε κύτταρα νευροβλαστώματος μετά από ενδοφλέβια ένεση.

Θεραπευτική αποτελεσματικότητα για την θεραπεία του μεταστατικού Νευροβλάστωμα

Αφού διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα HB1.F3.C1 είναι από όγκο tropic

in vivo

, αξιολογήσαμε την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα των νευρικών βλαστικών μας /προγονικών κυττάρων-κατευθυνόμενη ενζύμου προφαρμάκου (NDEPT) προσέγγιση για την θεραπεία, χρησιμοποιώντας HB1.F3.C1 κύτταρα μεταδιεγείρονται να εκφράζουν μια εκκρινόμενη μορφή ενός καρβοξυλεστεράση κουνέλι (ΠΑΑ) και η αντικαρκινική προφάρμακο CPT-11. Επιβεβαιώσαμε την πρώτη, χρησιμοποιώντας τροποποιημένα δοκιμασίες θαλάμου Boyden, ότι αδενοϊική μεταγωγή και έκφραση των ΠΑΑ δεν μεταβάλλει τις ιδιότητες τροπική των κυττάρων HB1.F3.C1 (Σχήμα 7). Προσδιορίσαμε επίσης ότι το μέγιστο επίπεδο έκφρασης του ΠΑΑ συνέβησαν 3-4 ημέρες μετά την μεταγωγή (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια μεταγωγή κύτταρα HB1.F3.C1 με ελλειμματικό αναπαραγωγής αδενοϊό που κωδικοποιεί RCE, και ενέθηκαν ενδοφλεβίως των μετατραπέντων κυττάρων σε ποντικούς που φέρουν όγκους διαδίδονται SK-Ν-AS. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με το πρωτόκολλο που φαίνεται σχηματικά στο Σχήμα 8. Όπως φαίνεται στο σχήμα, τέσσερις ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων HB1.F3.C1 + AdCMVrCE (τρεις ημέρες μετά την έγχυση των κυττάρων HB1.F3.C1), ξεκινήσαμε θεραπεία με CPT-11 (7,5 mg /kg) σε ένα καθημερινό πρόγραμμα × 5, ένα βέλτιστο σχήμα χορήγησης για τους ασθενείς με νευροβλάστωμα. Αυτή η αγωγή επαναλήφθηκε την επόμενη εβδομάδα, που ακολουθείται από μια περίοδο ανάπαυσης 2 εβδομάδων και, στη συνέχεια, ένα άλλο 2-εβδομάδων πορεία της θεραπείας. Το γράφημα Kaplan-Meier στην Εικόνα 9 δείχνει τα δεδομένα επιβίωσης των ποντικών χωρίς θεραπεία σε σύγκριση με ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με CPT-11 μόνο, ή με τον συνδυασμό των κυττάρων που εκφράζουν HB1.F3.C1 RCE και CPT-11.