Αφηρημένο

Ελέγξαμε την υπόθεση ότι (i) συνώνυμο διακυμάνσεις εντός των περιοχών κωδικοποίησης, και (ii) διακυμάνσεις εντός των μη κωδικές περιοχές του HPV, επηρεάζουν καρκίνο του τραχήλου (CaCx) παθογένεια υπό την επίδραση της άθικτα γονιδιώματα HPV16. Ολόκληρο ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδιώματος του HPV 16 απομονώνει μέσα σε 70 περιπτώσεις CaCx και 25 μη-κακοήθεις δείγματα αποκάλυψε ότι συνώνυμο παραλλαγές ήταν σημαντικά υψηλότερο εντός της Ε6 (p = 0,014), Ε5 (p = 0,001) και L2 (p = 0,0002) γονίδια των στελεχών HPV 16 εντός περιπτώσεις, σε σύγκριση με προϊόντα απομόνωσης εντός μη κακοήθη δείγματα. Όλα τα 25 (100%) εξανθρωπισμένο κωδικόνια που προσδιορίζονται στο L2 ORF των δειγμάτων που αναλύθηκαν, ήταν που φιλοξενούνται από τις περιπτώσεις CaCx, ενώ 8 από τα 25 (32%) που φιλοξενούνται από HPV16 θετική μη-κακοήθεις δείγματα (p = 3.87105E-07 ). L2 (mRNA και πρωτεΐνη) έκφραση ήταν εμφανής μόνο μεταξύ περιπτώσεων με επισωματική ιικά γονιδιώματα και έκφραση L2 mRNA συσχετίζεται σημαντικά με αριθμούς αντιγράφου γονιδίου Ε2 υποδηλώνοντας έκφραση από όλες γονιδιώματα επισωματική. Μεταξύ αυτών των περιπτώσεων, ασιατική αμερικανική (ΑΑ) απομονωμένα απεικονίζονται όλα τα εξανθρωπισμένα κωδικονίων (100%? 4-6 /δείγμα) που καταγράφονται εντός L2, η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη (ρ = 2.02E-7) σε σύγκριση προς το Ευρωπαϊκό (Ε) απομονώνει (22,8%? κανένα ή 1-2 /δείγμα). Επιπλέον, η πλειοψηφία της παραλλαγής E απομονώνει εντός περιπτώσεις (54/57? 94,7%) παρουσιάζεται μια παραλλαγή (T4228C) μέσα στο σύντομο μη-κωδικοποιητική περιοχή (NCR2) μεταξύ Ε5 και L2 γονίδια, τα οποία απεικονίζει μια ασθενή δραστικότητα προαγωγέα ειδικό ως προς την έκφραση του mRNA L2 . Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια των 9 από τις 14 θέσεις πρόσδεσης miRNA (HSA-miR-548 οικογένεια), παρά τη σημαντική υπερέκφραση του miR548a-5P και miR548d-5P μεταξύ τέτοιες περιπτώσεις (28,64 και 36,25 πτυχώσεις, αντίστοιχα), σε σύγκριση με HPV αρνητικών δείγματα ελέγχου. Τα ευρήματα εξηγούν τη βιολογική σημασία των παραλλαγών της αλληλουχίας στα γονιδιώματα HPV16 και HPV16 τονίζουν ότι επισωμικού σε περιπτώσεις CaCx χρησιμοποιούν πολλαπλούς μηχανισμούς για τη διατήρηση της έκφρασης L2, δικαιολογώντας έτσι το δυνητικό ρόλο της L2 σε τέτοιες μορφές καρκίνου, σε αντίθεση με εκείνους που υποθάλπουν την ιική ολοκλήρωση.

Παράθεση: Mandal P, Bhattacharjee Β, Das Ghosh D, Mondal NR, Roy Chowdhury R, ​​Roy S, et al. (2013) διαφορική έκφραση των HPV16 L2 Gene στους καρκίνους του τραχήλου υπόθαλψη Επισωμικοί HPV16 γονιδιώματος: Επίδραση της Συνώνυμο και μη-κωδικοποίησης Παραλλαγές Περιφέρεια. PLoS ONE 8 (6): e65647. doi: 10.1371 /journal.pone.0065647

Επιμέλεια: Rui Medeiros, IPO, Inst Λιμάνι Ογκολογίας, Πορτογαλία

Ελήφθη: 2 Απρίλη, 2013? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Mandal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας (Grant Νο BT /PR8014 /Med /14/1220/2006), η κυβέρνηση της Ινδίας, και εν μέρει από την ινδική Ινστιτούτο Στατιστικής (Τειχών), και το Εθνικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Genomics (Πυρήνας Grant). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η σύνδεση των γεννητικών ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CaCx) είναι ισχυρές και ανεξάρτητες από άλλους παράγοντες κινδύνου, όπως προκύπτει από τα συνεπή ευρήματα καταγράφονται από επιδημιολογικές μελέτες που έγιναν σε πολλές χώρες [1]. Περίπου το 50% των περιπτώσεων CaCx προκαλούνται από HPV 16 [2], [3]. Στην Ινδία επίσης, η μόλυνση HPV16 είναι ο πιο κυρίαρχος τύπος που σχετίζεται με CaCx [4] – [6], και είναι επίσης το πιο διαδεδομένο είδος που προσδιορίζονται στις γενικές πληθυσμούς με βάση τα δεδομένα που διατίθενται από ορισμένες περιοχές της Ινδίας [5] – [9].

Κατά τη διάρκεια της φάσης της παροδικής μόλυνσης, επισωματική μορφή του HPV αντιγράφεται μαζί με τα διαφοροποίηση επιθηλιακών κυττάρων από την βασική μεμβράνη προς την επιφανειακή ζώνη, και ιικά σωματίδια εκεί μέσα ρίξει μακριά μαζί με τα sloughed-off επιθηλιακά κύτταρα [10] . Ωστόσο, υψηλού βαθμού τραχηλικών νεοπλασία φαίνεται να χαρακτηρίζεται από απορυθμισμένη έκφραση ιϊκού γονιδίου και άκαρπη κύκλο ζωής του ιού [11]. Ως εκ τούτου, η πιθανή μετατροπή του HPVs είναι πιθανόν να συσχετίζονται με το δυναμικό του απορύθμιση της έκφρασης των βασικών ιικών πρωτεϊνών [12] – [14], καθώς και με τη δυνατότητα να αποφευχθεί η ανοσολογική προσβολή από τον ξενιστή ώστε να παραμένουν εντός το τραχηλικό επιθήλιο ξενιστή [15].

Ενσωμάτωση των ιικών γονιδιωμάτων στο γονιδίωμα του ξενιστή, κυρίως στο εύθραυστο θέσεις [16], [17], επηρεάζει διάφορα κυτταρικά μονοπάτια της μηχανής του κυτταρικού κύκλου ξενιστή. Αυτό οδηγεί σε διάσπαση του γονιδίου ιικής Ε2, συνηθέστερα στην περιοχή που κωδικοποιεί για την περιοχή άρθρωσης της πρωτεΐνης HPV16 Ε2. Εν τη απουσία της Ε2 με γνώμονα την καταστολή, Ε6 και Ε7 υπερεκφράζονται, οδηγώντας τους μολυσμένα κύτταρα προς μετασχηματισμό. Αντίθετα, η μελέτη μας [18], καθώς και μερικοί άλλοι [19], έχουν εντοπίσει ότι ένα σημαντικό ποσοστό των ατόμων με CaCx λιμάνι ανέπαφο γονίδιο Ε2 [20]. Αυτό θα μπορούσε να είναι είτε αμιγώς ακέραια (επισωμικό) ή ταυτόχρονη, δηλαδή ένα μίγμα των άθικτων (επισωματικού) και διασπάστηκαν (ολοκληρωμένη) μορφές. Οι εν λόγω παρατηρήσεις, σημείο προς τη βιολογική αληθοφάνεια του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεσης υπό την επίδραση της HPV16 ανέπαφο γονίδιο Ε2 ή ακέραια ιικά γονιδιώματα, σε αντίθεση με διαταραχή Ε2 ή ολοκλήρωσης.

Σε περαιτέρω διερεύνηση νέων παραδειγμάτων της HPV16 σχετίζονται CaCx παθογένεση κάτω η επίδραση του επισωμικού ιικών γονιδιωμάτων με άθικτα γονίδια Ε2, αναλάβαμε γονιδίωμα ευρύ αλληλούχιση αυτών των ιικών γονιδιωμάτων εντός περιπτώσεις CaCx και μη κακοήθεις δειγμάτων, αρχικώς με εξαίρεση το γονίδιο Ε1 [21] και εν συνεχεία την ενσωμάτωση Ε1 σε αυτή τη μελέτη. Έτσι, δημιουργούνται δεδομένα αλληλουχίας σε ολόκληρο το γονιδίωμα HPV16. Η Ευρωπαϊκή παραλλαγή (Ε, 86,32%) ήταν η πιο διαδεδομένη εντός του πληθυσμού μας, τόσο μεταξύ των ελέγχων, καθώς και περιπτώσεις, που ακολουθείται από τις παραλλαγές της Ασίας και της Αμερικής (ΑΑ, 13,68%), η οποία θα καταγράφονται μόνο μεταξύ των περιπτώσεων.

οι Nonsynonymous πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNP) θεωρούνται λειτουργικά επειδή οδηγούν σε αλλαγές στο επίπεδο των αμινοξέων που θα μπορούσε να επηρεάσει λειτουργικά τις πρωτεΐνες. προηγούμενη ανάλυσή μας [21] επικεντρώθηκε σε τέτοιες παραλλαγές εντός του πιο κοινή E παραλλαγή απλότυπος E-12, με βάση τη βάση δεδομένων SIFT. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε ότι σπάνια επιβλαβή παραλλαγές μέσα στα γονίδια που εμπλέκονται στην παραγωγική μόλυνση (L1, L2, Ε2 και Ε5), πάνω από το E-12 απλότυπος φόντο ανέπαφη HPV16 απομονώνει, θα μπορούσε να είναι αιτιώδης συνάφεια για την ανάπτυξη CaCx. Συνώνυμο παραλλαγές από την άλλη πλευρά, θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει την ιογενή γονιδιακή έκφραση διαμορφώνοντας τα πρότυπα χρήσης κωδικονίου [22].

Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας δίνουν επίσης μια εικόνα για τη βιολογική σημασία των μη κωδικές περιοχές των HPV16, όπως η συμμετοχή του νουκλεοτιδικής ποικιλομορφίας εντός E2BSIV στην LCR [18], η μεθυλίωση του CpGs εντός E2BSI /II στην LCR [23] και επαναλάβετε επεκτάσεις εντός NCR-2 [21] στην παθογένεση των καρκίνων του τραχήλου που φιλοξενούν ανέπαφη HPV16 γονιδιώματα. Στόχος παρόν μας ήταν εκ νέου διερεύνηση των πολυμορφισμών μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNPs) στο πλαίσιο του ολόκληρο το γονιδίωμα του HPV16, που ενσωματώνουν το γονίδιο Ε1, μεταξύ επισωμικό HPV16 απομονώνει μέσα σε μη κακοήθεις δείγματα και περιπτώσεις CaCx. Ιδιαίτερα, τονίσαμε για τον καθορισμό του συνδέσμου συνώνυμη παραλλαγές μέσα άθικτο γονιδιώματα HPV16, αν υπάρχει, με CaCx παθογένεια και την ταυτοποίηση των γονιδίων που έτρεφε τέτοιες παραλλαγές, κατά την άποψη της βιολογικής συνάφειάς τους. Ερευνήσαμε περαιτέρω την πιθανότητα ότι το νουκλεοτίδιο παραλλαγές εντός μη κωδικές περιοχές, ειδικά τις μη μεταφραζόμενες περιοχές των γονιδιωμάτων HPV16 είναι βιολογικά σχετικές, καθώς, εκτός από εκείνες που εμπίπτουν περιοχές κωδικοποίησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα δείγματα, κακοήθεις και μη κακοήθεις, συλλέχθηκαν από τα θέματα με τη γραπτή συγκατάθεση έχει εγκριθεί από την θεσμική επιτροπή δεοντολογίας για την ανθρώπινη πειραματισμό του Ινδικού Ινστιτούτου Στατιστικής, Καλκούτα, Ινδία.

τα δείγματα και τα θέματα

λεπτομέρειες σχετικά με τα θέματα, τα δείγματα, την απομόνωση DNA, διαλογή HPV και τον προσδιορισμό των HPV16, αριθμός αντιγράφων Ε2 και η κατάσταση διακοπής περιγράφονται αναλυτικά σε προηγούμενες μελέτες μας [8], [18], [20] [21], [23], [24]. Αναλύσαμε δείγματα DNA που αποτελείται από ένα πάνελ HPV16 θετικών κακοήθων περιπτώσεων (n = 94) και HPV16 θετική κυτταρολογικά κανονικά δείγματα αναφοράς (n = 29), το οποίο υποδηλώνεται εδώ ως HPV16 θετικός μη κακοήθεις δείγματα. Από αυτούς, οι 70 κακοήθη δείγματα και 25 μη-κακοήθεις δείγματα έχουν συμπεριληφθεί από την προηγούμενη έκθεσή μας σχετικά με τα δεδομένα ακολουθίας HPV16 χωρίς τα στοιχεία για το γονίδιο Ε1 [21]. Τα κακοήθη δείγματα χαρακτηρίζονται από διάμεση ηλικία 50 έτη (εύρος = 27-60 ετών) και οι μη-κακοήθεις δείγματα από διάμεση ηλικία 34 έτη (εύρος = 27 έως 80 ετών).

Όλα τα κακοήθη δείγματα (επιβεβαιώθηκε ιστοπαθολογικά διηθητικά καρκινώματα πλακωδών κυττάρων και κλινικά διαγνωστεί ότι το στάδιο του όγκου και III ανωτέρω ως ανά ΦΥΓΩ ταξινόμηση και πλειοψηφία διαγνώστηκαν ως μετρίως διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων παθολογικά) προήλθαν από παντρεμένος υποκείμενα. Οι μη-κακοήθεις δείγματα ήταν κανονική του τραχήλου της μήτρας γρατζουνιές επιβεβαιώθηκε από τεστ Παπανικολάου και προέρχεται από τα παντρεμένα και μη έγκυες (ή, 6 μήνες μετά τον τοκετό) γυναίκες χωρίς προηγούμενο ιστορικό δυσπλασίας του τραχήλου της μήτρας /κακοήθεια. Μερικά από τα δείγματα από αυτή την ομάδα ήταν ιστοπαθολογικά επιβεβαιώθηκαν κανονική τραχηλικές βιοψίες που προέρχονται από γυναίκες που υποβάλλονται σε υστερεκτομή για διάφορους άλλους λόγους εκτός από καρκίνους όπως πρόπτωση μήτρας, ινώδεις, κύστη κλπ και χωρίς προηγούμενο ιστορικό δυσπλασίας του τραχήλου της μήτρας /κακοήθεια.

Re-αλληλουχίας του γονιδιώματος HPV16

η εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος HPV16 περιορίστηκε σε αυτά τα δείγματα (μη-κακοήθεις και περιπτώσεις) που φέρουν ακέραια ιικά γονιδιώματα με βάση (i) ανέπαφο γονίδιο Ε2, όπως καθορίζεται στο DNA επίπεδο με PCR ολόκληρου του γονιδίου Ε2 [18] και (ii) δοκιμασία Taqman για την εκτίμηση του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου Ε2 και Ε6 (επισωμικό, όταν E2 /E6 ratio≥1 και αναμιγνύεται ή ταυτόχρονη, όταν 0 & lt? E2 /E6 αναλογία & lt? 1 ) [20].

Δεκαπέντε ομάδες επικαλυπτόμενων εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για την εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος HPV16. Από αυτές, οι αλληλουχίες εναρκτήρα και PCR συνθήκες για έντεκα σειρές περιγράφηκαν νωρίτερα από το εργαστήριο μας [21]. Εκτός από αυτά, τέσσερα σετ επικαλυπτόμενων εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν εκτείνονται σε ολόκληρη την περιοχή του γονιδίου Ε1. Οι λεπτομέρειες των αλληλουχιών εναρκτήρα και PCR συνθήκες για γονιδιακή Ε1 περιγράφονται στον Πίνακα S1. Re-αλληλούχιση των HPV16 ανέπαφη γονιδιώματα έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] σε ένα ΑΒΙ Prism ™ 3100 αυτοματοποιημένο αλληλουχητή χρησιμοποιώντας χημεία χρωστικής τερματισμού. Οι ακολουθίες DNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο PolyPhred (https://droog.mbt.washington.edu/PolyPhred.html) και αλληλουχία HPV16R χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά στις ευθυγραμμίσεις [25]. Προσδιορισμός των σπάνιων παραλλαγών και την εξάλειψη των πιθανότητες λαθών αλληλουχίας έγιναν σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση από την ομάδα μας [21].

Αναγνώριση των βιολογικά σχετικών συνώνυμη παραλλαγές μέσα κωδικές περιοχές του γονιδιώματος HPV16

Η συνώνυμος παραλλαγές εντός των ORFs του HPV16 προσδιορίστηκαν από την ανάλυση των δεδομένων ακολουθίας. Η συχνότητα της χρήσης των κωδικονίων και αμινοξέων λόγω συνώνυμος παραλλαγών ταυτοποιήθηκε με βάση το πρόγραμμα «Γραφική χρήση κωδικονίου Analyzer (GCUA) διατίθενται σε https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html και τελικά εξανθρωπισμένο κωδικόνια εντός του HPV16 εντοπίστηκαν τα ORF.

Αναγνώριση βιολογικά σχετικές παραλλαγές μέσα σε μη κωδικές περιοχές του γονιδιώματος HPV 16 (μικρή μη κωδική περιοχή NCR2 μεταξύ Ε5 και L2)

οι νουκλεοτιδικές μεταβολές στα μεγάλα μη-κωδικοποίησης περιοχή HPV16, δηλαδή LCR αναλύθηκαν και αναφέρθηκε νωρίτερα [18]. Στην παρούσα ανακοίνωση, η εστίασή μας ήταν στο σύντομο μη κωδική περιοχή, NCR2, μεταξύ Ε5 και L2 περιοχές της HPV16 ενόψει της πιθανής συμμετοχής της περιοχής αυτής στη ρύθμιση της έκφρασης L2 [26]. Έχει προσδιοριστεί πρόσφατα ότι miRNAs ξενιστή είναι σε θέση να προσκρούσουν στην ιική κύκλους ζωής, τροπισμό του ιού, και την παθογένεση των ιογενών ασθενειών [27]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιώντας RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) λογισμικό, εντοπίσαμε miRNA περιοχές εντός της NCR2 του HPV16 απομονώνει και η απώλεια αυτών των θέσεων πρόσδεσης δεσμευτική, εάν υπάρχουν, υπό την επίδραση της ενιαίας παραλλαγές νουκλεοτιδίων. Επαναβεβαιώσαμε περαιτέρω την απώλεια του εν λόγω δέσμευσης, που απασχολούν miRBase [28].

απομόνωση RNA και cDNA παρασκευή

Ολικά RNAs, από τα δείγματα τραχηλικού ιστού απομονώθηκαν, καθαρίστηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen RNeasy ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα μικρογραμμάριο του συνολικού RNA από κάθε δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας τον εκκινητή (dT) 17-P3, δηλαδή, ένα ολιγο (dT) 17-εκκινητή συνδέεται με μία συνδετική αλληλουχία (5’GACTCGAGTCGACATCGA TTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ‘) [29] σε ένα 20 μλ μίγματος αντίδρασης. Εν συντομία, κάθε δείγμα RNA αναμίχθηκε με 400 ng του ολιγο- (dT) εκκινητή-Ρ3 και επωάστηκαν στους 70 ° C για 10 λεπτά. Το μίγμα (10 μλ) ψυχθεί ταχέως επί πάγου και στη συνέχεια αναμιγνύεται με ίσο όγκο ενός μίγματος 2Χ ρυθμιστικού διαλύματος ανάστροφης μεταγραφάσης, 8 mM dNTPs (με DTT), αναστολέα 20 U ΚΝάση και 50 U MultiScribe ™ ανάστροφης μεταγραφάσης (Υψηλή χωρητικότητα cDNA Αντίστροφη kit Μεταγραφή, Applied Biosystems) και αντίστροφη μεταγραφή στους 42 ° C για 60 λεπτά που ακολουθείται από την αδρανοποίηση στους 70 ° C για 10 λεπτά. Αντίστροφη μεταγραφή αντίδραση, με το mRNA και όλα τα αντιδραστήρια, αλλά δεν ανάστροφης μεταγραφάσης, διεξήχθη για τα δείγματα ως αρνητικοί έλεγχοι.

Ποσοτική PCR βασίζεται ανάλυση της έκφρασης L2 mRNA

Η έκφραση L2 mRNA προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR (qRT-PCR) σε ΑΒΙ 7900 πλατφόρμας HT PCR, μετά από σχετική ποσοτικοποίηση με την έκφραση ACTB. Για την ανίχνευση αυτή, 100 ng cDNA χρησιμοποιήθηκε σε μια 10 μΐ μείγματος αντίδρασης με

Ισχύς

SYBR® Πράσινη PCR Master Mix (Applied Biosystems) και 25 ng τόσο προς τα εμπρός (L2 (3) F: 5 ‘ΤΑΤ GGA AGT ATG GGT GTATTT Τ 3 ‘) και όπισθεν εκκινητές (L2 (1) R: 5’ ATC TGG GGG ΑΑΤ GGA AGG Τ 3 ‘). έκφραση ACTB επίσης ποσοτικά με πραγματικού χρόνου PCR σε ένα όγκο αντίδρασης 10 μΐ συμπεριλαμβανομένων 100 ng cDNA και 25 ng του προς τα εμπρός (ACTB RTF: 5 ‘ATCCGCCGCCCGTCCACAC 3’) και αντίστροφοι εκκινητές (ACTB RTR: 5 ‘TGCCGTGCTCGATGGGGTACT 3’). έκφραση ACTB χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος για να διασφαλιστεί η ακεραιότητα του συνολικού δείγματος RNA. ανάλυση καμπύλης διαστάσεως έγινε, προκειμένου να αποκλειστεί η εμφάνιση μη ειδικής ενίσχυσης και εκκινητή σχηματισμό διμερούς. Τα ΡΟΚ-έλεγχοι ήταν NTC (έλεγχος μη-πρότυπο), καθώς και ξεχωριστά κλάσματα από αντιδράσεις Αντίστροφη Μεταγραφή με (i) όλα τα αντιδραστήρια εκτός του mRNA, (ii) mRNA και όλα τα αντιδραστήρια, αλλά δεν ανάστροφης μεταγραφάσης, και (iii) HPV-αρνητικό κυτταρικό mRNA

ανάλυση ανοσοκηλίδας της έκφρασης L2

δείγματα ιστών (10 mg περίπου) ομογενοποιήθηκαν σε 100 μΙ παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κρύο πρωτεΐνη (30 mM Tris HCl?. ρΗ = 7.5, 1 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 0,67% β-μερκαπτοαιθανόλη, 0,5% CHAPS, 10% γλυκερόλη και 0.5% Triton Χ100) που περιέχει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με ανατάραξη, και επακόλουθη φυγοκέντρηση στις 12.000 rpm στους 4 ° C για 20 λεπτά, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και εκτιμήθηκε με δοκιμασία Bradford (Biorad Hercules, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τριάντα μικρογραμμάρια όλων των δειγμάτων πρωτεΐνης τρέχτηκαν σε 12,5% SDS PAGE εις διπλούν και, στη συνέχεια, μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF. Μετά μη ειδική δέσμευση, η μεμβράνη υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3:5000 αραίωση ποντικού L2 πρωτογενές αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, sc-65709? Εγείρονται έναντι των αμινοξέων 40-150 του HPV16 L2) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, η μεμβράνη και πάλι σε κατεργασία με δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (1:5000 αραίωση, γίδινο αντι-ποντικού IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) στους 37 ° C για 2 ώρες και 30 λεπτά. Η έκφραση της πρωτεΐνης L2 ανιχνεύθηκε με δοκιμασία χημειοφωταύγειας βάση, μετά την έκπλυση της μεμβράνης. Η έκφραση της ACTB πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Mouse μονοκλωνικό ACTB πρωτογενές αντίσωμα (αραίωση 2:5000, Abcam, ab6276) και δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (1:5000 αραίωση, γίδινο αντι-ποντικού IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις ACTB έκφραση πρωτεΐνης . Πυκνομετρική ανάλυση της κάθε ζώνης του L2 και ACTB πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό IMAGE J (https://rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html). έκφραση της πρωτεΐνης L2 εκπροσωπήθηκε από την άποψη της σχετικής πυκνότητας της κάθε ζώνης του L2 κανονικοποιούνται με την αντίστοιχη ταινία πρωτεΐνης ACTB (περιοχή της L2 πρωτεϊνική ζώνη /περιοχή πρωτεϊνική ζώνη ACTB).

Σχετική ποσοτικοποίηση των ώριμων miRNAs από TaqMan miRNA πραγματικού χρόνου PCR

TaqMan mirna Δοκιμασίες για miR-548α-5P και miR-548d-5P έγιναν, χρησιμοποιώντας cDNA που παρασκευάζεται από συνολικό RNA δείγματα, χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές miRNA από τις TaqMan mirna Αναλύσεις και αντιδραστήρια από TaqMan® mirna Reverse Transcription Kit (ΑΒΙ? Cat # 4366596). Οι 15 μλ αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής συνίστατο από 10 ng ολικού RNA, 5 υ MultiScribe ανάστροφης μεταγραφάσης, 0.5 mM από κάθε dNTP, 1 Χ ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφής, 4 αναστολέας U RNase, και ύδατος άνευ νουκλεάσης. Αυτό πραγματοποιήθηκε στους 16 ° C για 30 λεπτά και στους 42 ° C για 30 λεπτά, τερματίστηκε στους 85 ° C για 5 λεπτά. Για real-time PCR της TaqMan Mirna Αναλύσεις, χρησιμοποιήσαμε 0,5 μl 20 × TaqMan Mirna Δοκιμασία Primer, 1,33 μl μη αραιωμένου cDNA, 5 μl 2 × TaqMan Οικουμενική PCR Master Mix και 3.17 μλ ύδατος άνευ νουκλεάσης. Το πρόγραμμα PCR πραγματικού χρόνου που περιλαμβάνονται αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και ανασύνδεση σε 60 ° C για 1 λεπτό. Τα ΡΟΚ-έλεγχοι ήταν NTC (έλεγχος μη-πρότυπο). Κάθε δοκιμασία διεξήχθη τουλάχιστον δύο φορές, με τρεις επαναλήψεις ανά δείγμα σε κάθε δοκιμασία, για την οπτική πλάκες των 96 φρεατίων μικροαμπέρ χρησιμοποιώντας 7900 ΗΤ PCR System (ΑΒΙ). Σχετική έκφραση των miRNAs υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας RNU6b (δοκιμασία ελέγχου TaqMan miRNA) όπως και η ενδογενής ελέγχου, και βαθμονομείται με τα δείγματα ελέγχου.

Στατιστικές αναλύσεις

Η σύνδεση των διαφόρων νουκλεοτιδικών αλλαγών εντός της ιικό γονιδίωμα, με CaCx παθογένεση, προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τεστ chi-square, κατά περίπτωση. Γι ‘αυτό σύγκριση μεταξύ των περιπτώσεων και μη κακοήθεις ομάδα μετά την προσαρμογή για το μέγεθος των αντίστοιχων ΑΠΑ. Λάθος ποσοστά ανακάλυψη 0.05 ελήφθησαν για τη διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές με τη χρήση της Benjamini και μέθοδος Hochberg του [30] .Η διαφορά στο ποσοστό των ανθρωποποιημένων κωδικονίων και SNPs σε NCR2 μεταξύ των περιπτώσεων CaCx και μη-κακοήθεις δείγματα, καθώς και μεταξύ των ΑΑ και Ε παραλλαγές ήταν καθορίζεται επίσης από chi-square test. mRNA έκφραση L2 και πυκνομετρία βάση την ανάλυση των στοιχείων έκφρασης L2 πρωτεΐνη εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. δοκιμασία Kolmogorov-Smirnov διεξήχθη για να διαπιστωθεί κατά πόσον οι μεταβλητές της δοκιμής, όπως έκφραση L2 mRNA και της πρωτεΐνης, που ακολουθείται κανονική κατανομή. Δύο δείγμα t-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει τις ενώσεις φαινοτύπου ασθένειας με τις μεταβλητές που ακολούθησε κανονική κατανομή. Μια τιμή ρ μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης διεξήχθη για να προσδιοριστεί η σχέση του αριθμού αντιγράφων του Ε2 με έκφραση L2 mRNA. οικόπεδα κουτί κατασκευάστηκαν για να παρατηρήσει τη διαφορά στην κατανομή των miRNAs εκφράσεων μεταξύ των διαφόρων κατηγοριών των τραχηλικών δειγμάτων. Kolmogorov-Smirnov τεστ προσδιορίζονται miRNAs έκφραση ως μεταβλητή δεν ακολουθεί κανονική κατανομή. Επομένως, μη παραμετρικό τεστ (Mann-Whitney U test) διεξήχθη για να μελετήσει συσχέτιση της έκφρασης miRNAs με το φαινότυπο της νόσου. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με τη χρήση πακέτων λογισμικού SPSS (έκδοση 16.0 για Windows) και R (www.r-project.org)

Αποτελέσματα

παραλλαγές νουκλεοτιδίου εντός Ε1 ORF:. Τύπο και τη συχνότητα

Οι διακυμάνσεις νουκλεοτιδίων εντός των ORFs του γονιδιώματος HPV16, εκτός από τα Ε1, έχουν αναφερθεί νωρίτερα από το εργαστήριο μας [21]. Ενιαία παραλλαγές νουκλεοτιδίου καταγράφηκαν σε 20 θέσεις εντός Ε1 ORF (Πίνακας 1). Των μεμονωμένων παραλλαγές νουκλεοτιδίων, 19 ήταν bi-αλληλομόρφων αλλαγές φραγή ένα, το οποίο ήταν τρι-αλληλομόρφων. Η συχνότητα των διακυμάνσεων κυμαίνονταν μεταξύ 0,01 και 0,45 και με βάση ελάχιστο αλληλόμορφο συχνοτήτων (MAFs) ταξινομήθηκαν ως πολυμορφισμοί (MAF≥0.05) και παραλλαγές χαμηλής συχνότητας (MAF & lt? 0,05). Από τα 20 παραλλαγές εντός του ORF, υπήρχαν 9 (45%) μη συνώνυμες παραλλαγές και 11 (55%) συνώνυμος παραλλαγές κατανεμημένα σε όλη την γονιδίου Ε1.

Η

μεταβολές μη συνώνυμων αμινοξέων σε όλες ORFs του γονιδιώματος HPV16

Νωρίτερα, καταγράψαμε 110 μη-συνώνυμη παραλλαγές που διανέμονται σε όλη την ΑΠΑ του HPV16, εκτός Ε1 [21]. Τέτοιες παραλλαγές παρέμεινε αμετάβλητη, ακόμη και μετά την αύξηση του μεγέθους του δείγματος σε 70 περιπτώσεις και 25 μη κακοήθεις δείγματα. Έτσι, ολόκληρο ανάλυση αλληλουχίας του γονιδιώματος του HPV16 μας ανέπαφη ιικών γονιδιωμάτων αποκάλυψε συνολικά 119 μη συνώνυμες παραλλαγές. Το ποσοστό αυτών των παραλλαγών εντός Ε1 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των περιπτώσεων (0,08%) και μη-κακοήθεις δείγματα (0,11%). Πολλαπλές διορθώσεις δοκιμές έγιναν, μετά την ένταξη των μη-συνώνυμη διακυμάνσεις εντός Ε1 ORF μαζί με εκείνες των άλλων ΑΠΑ. Τέτοια ανάλυση νέου επιβεβαίωσε ότι το ποσοστό των μη συνώνυμες διακυμάνσεις L2 ORF ήταν σημαντικά υψηλότερη σε περιπτώσεις, σε σύγκριση με HPV16 θετική μη κακοήθεις ομάδα (Πίνακας 2).

Η

αλλαγές συνώνυμων αμινοξέων και εξανθρωπισμένα κωδικόνια στις διάφορες ORFs του γονιδιώματος HPV16

Ένα σύνολο 124 συνώνυμος παραλλαγές καταγράφηκαν κατανεμημένα περιοχών κωδικοποίησης των γονιδιωμάτων HPV16 άθικτων απομόνωσης. Το ποσοστό των συνώνυμη παραλλαγές ήταν σημαντικά υψηλότερο στις περιπτώσεις σε σύγκριση με μη-κακοήθεις δείγματα για Ε6 (υποθέσεις = 0,104%, μη κακοήθη δείγματα = 0,026%, p = 0,014), Ε5 (υποθέσεις = 0,296%, μη κακοήθη δείγματα = 0.064 %, ρ = 0,001) και L2 (υποθέσεων = 0,22%, μη-κακοήθεις δείγματα = 0,121%, ρ = 0.0002) ORF (Πίνακας 3). Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του εργαλείου GCUA (https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), για τον εντοπισμό των ανθρωποποιημένα κωδικόνια εντός Ε5, Ε6 και L2 ORFs υπό την επίδραση των συνώνυμη παραλλαγές.

Υπήρχαν 25 ανθρωποποιημένα κωδικόνια στο L2 και 2 όπως κωδικόνια τόσο Ε5 και Ε6 (Πίνακας S2). Παρατηρήθηκε ότι όλα τα 25 (100%) εξανθρωπισμένο κωδικόνια που προσδιορίζονται εντός L2 ORF από τα δείγματα που αναλύθηκαν ήταν φιλοξενούνται από τις περιπτώσεις CaCx, ενώ 8 από τα 25 (32%) που φιλοξενούνται από HPV16 θετική μη κακοήθη δείγματα. Έτσι, η συχνότητα του εξανθρωπισμένου κωδικονίων στο L2 ORF ήταν σημαντικά υψηλότερη (ρ = 3.87105E-07) σε περιπτώσεις CaCx, σε σύγκριση με HPV16 θετική μη-κακοήθεις δείγματα. Δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές στις συχνότητες των ανθρωποποιημένα κωδικόνια στην Ε5 και Ε6 ORF που, μεταξύ των περιπτώσεων CaCx και HPV16 θετική μη-κακοήθεις δείγματα (Πίνακας 4).

Η

Είμαστε κατατάσσονται περαιτέρω την HPV16 άθικτο απομονώσεις σε Ε και ΑΑ των παραλλαγών που μετά από ένα σύστημα ταξινόμησης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από το εργαστήριο μας [21]. Μετά την καταχώριση των πρόσθετων δειγμάτων στην παρούσα μελέτη απέτυχε να καταγράψει παραλλαγές AA μεταξύ των μη-κακοήθεις δείγματα, ενώ μεταξύ των περιπτώσεων ανέπαφη CaCx Ε2, το ποσοστό των ΑΑ και Ε παραλλαγές ήταν 18,6% (13/70) και 81,4% (57 /70), αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, γίνεται μια προσπάθεια να συγκρίνουν τις παραλλαγές ΑΑ και Ε από την άποψη της ανθρωποποιημένα κωδικόνια στο L2 ORF μεταξύ μόνο περιπτώσεις CaCx. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι όλες οι παραλλαγές ΑΑ (13 /13.100%) έτρεφε ανθρωποποιημένα κωδικόνια στην περιοχή L2 ενώ μόνο λίγες παραλλαγές Ε (13/57, 22,8%) έτρεφε όπως κωδικόνια και αυτή η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική (p = 2.02E-7) . Ο αριθμός των κωδικονίων εξανθρωπισμένου ήταν επίσης σαφώς διαφορετική μεταξύ των δύο παραλλαγών. Χαρακτηριστικά, κάθε παραλλαγή AA έτρεφε 4-6 ανθρωποποιημένα κωδικόνια σε αντίθεση με κάθε παραλλαγή Ε που έτρεφε καμία ή το πολύ 2 ανθρωποποιημένα κωδικόνια.

Η διαφορική έκφραση της L2 mRNA μεταξύ των περιπτώσεων CaCx υπόθαλψη επισωμικά (καθαρό ή ταυτόχρονη) και ολοκληρωμένων γονιδιωμάτων HPV16

προηγούμενη μελέτη μας, έχουμε επιβεβαιώσει την ακεραιότητα του γονιδίου Ε2 αναλύοντας την παρουσία του ιικού μεταγραφής (Ε7-E1∧E4) που παράγει το καταστολέα Ε2, με APOT (ενίσχυση του ιού θηλώματος ογκογόνο μεταγραφής) -συζευγμένων-ποσοτική-RT-PCR του Ε7 και Ε4 (ένθετα με το γονίδιο Ε2) γονίδια [31]. Με βάση την εν λόγω ανάλυση, τα δείγματα χαρακτηρίστηκαν ως καθαρό επισωμικά ή ταυτόχρονη (επισωμικό και ενσωματωμένο) με άθικτα γονίδια Ε2, και να ενσωματωθεί με διαταράσσεται γονίδια Ε2. Η μελέτη [31] έδειξε επίσης ότι αυτοί οι δύο τύποι καρκίνων διέφεραν στην έκφραση των Ε7 και Ε2 mRNA. Ως εκ τούτου, καθορίζεται έκφρασης L2 mRNA, με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο στις 23 επισωμικού /ταυτόχρονη HPV16 θετικές περιπτώσεις CaCx, και σύγκριση των στοιχείων με εκείνη των 11 ολοκληρωμένων υποθέσεων CaCx. Δεν έκφραση L2 καταγράφηκε μεταξύ των ολοκληρωμένων περιπτώσεις, σε αντίθεση με την ξεχωριστή έκφραση L2 mRNA σε επισωματική /ταυτόχρονη περιπτώσεις CaCx (Εικόνα 1), η οποία ήταν αρκετά παρόμοια με εκείνη που καταγράφηκε στην περίπτωση έκφρασης Ε2 σε προηγούμενη μελέτη μας [31]. Όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν, απεικόνισε την έκφραση των μεταγραφημάτων ACTB mRNA ως εσωτερικός έλεγχος. Περαιτέρω ανάλυση παρέλειψε να αποκαλύψει σημαντικές (p = 0,224, t-test) διαφορές στην έκφραση L2 mRNA μεταξύ ΑΑ [μέσος όρος (L2 C

Τ /ACTB C

T) ± sd = 0,834 ± 0,127] και Ε [σημαίνουν (L2 C

Τ /ACTB C

T) ± sd = 0,904 ± 0,128] παραλλαγές (Σχήμα 2). Η αναλογία, L2 C

T /ACTB C

T, βρέθηκε επίσης να συσχετίζεται σημαντικά με τους αριθμούς αντιγράφων Ε2 (p = 0.004? R

2 = 0.336), εντός των περιπτώσεων επισωματικό CaCx (Εικόνα 3 ), που δικαιολογεί την έκφραση της L2 από επισωματικά ιικά γονιδιώματα.

(Α) ενίσχυση οικοπέδου με βάση την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης HPV16 L2. L2 μεταγράφεται στο Ε2 άθικτο /επισωμική (επισωμικά ή ταυτόχρονη), αλλά στο Ε2 διακοπεί /ολοκληρωμένο περιπτώσεις. καμπύλη (Β) διαστάσεως που απεικονίζει την πρώτη παράγωγο καμπύλη τήξης για την αντίδραση που χαρακτηρίζουν την έκφραση του L2 (Tm του 80,5 ° C). (Γ) Ενίσχυση οικοπέδου με βάση την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης ACTB. ACTB εκφράζεται τόσο από επισωμικά και ολοκληρωμένη HPV16 θετικών περιπτώσεων. (D) καμπύλη διαστάσεως που απεικονίζει την πρώτη παράγωγο καμπύλη τήξης για την αντίδραση που χαρακτηρίζουν την έκφραση του ACTB (Tm του 81,0 ° C).

Η

Σχετική έκφραση L2 mRNA αντιπροσωπεύεται από μέση L2 C

Τ /ACTB C

Τ.

Η

Η διαφορική έκφραση της πρωτεΐνης L2 ανάμεσα περιπτώσεις CaCx υπόθαλψη επισωμικά (καθαρό ή ταυτόχρονη) και ολοκληρωμένα γονιδιώματα HPV16

Εμείς καθορίζεται L2 πρωτεΐνη έκφραση με ανάλυση ανοσοστυπώματος, σε ένα υποσύνολο 12 περιπτώσεις CaCx (ολοκληρωμένο ή Ε2 διακοπεί περιπτώσεις CaCx = 4, ασιατική αμερικανική επισωματική ή Ε2 περιπτώσεις άθικτο CaCx = 3 και ευρωπαϊκή επισωματική ή Ε2 περιπτώσεις άθικτο CaCx = 5) από το σύνολο που χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση της έκφρασης L2 mRNA. έκφραση L2 καταγράφηκε μεταξύ των περιπτώσεων επισωματική CaCx, AA και Ε παραλλαγή απομονώσεις, ενώ τέτοια έκφραση δεν μπορούσαν να ταυτοποιηθούν μεταξύ των ολοκληρωμένων υποθέσεων CaCx (Σχήμα 4). Όλα τα δείγματα CaCx, ανεξάρτητα από επισωματική ή ολοκληρωμένη, απεικόνισε την έκφραση της πρωτεΐνης ACTB (ενδογενής έλεγχος). Η ιδιότητα του εξανθρωπισμένου κωδικονίων εντός της ΑΑ και παραλλαγή Ε απομονώνει δειγμάτων που αποκαλύπτουν την έκφραση της πρωτεΐνης L2 απεικονίζεται στον Πίνακα 5. έκφραση πρωτεΐνης L2 ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση των αποτελεσμάτων ανοσοστυπώματος από λογισμικό IMAGE J (http: //rsb.info.nih. gov /θ /docs /index.html) και καμία σημαντική διαφορά (p = 0,562, t-test) καταγράφηκε μεταξύ ΑΑ [μέση (περιοχή της L2 πρωτεϊνική ζώνη /περιοχή πρωτεϊνική ζώνη ACTB) ± sd = 2.66 ± 1.85] και παραλλαγές Ε [μέση (περιοχή της L2 πρωτεϊνική ζώνη /περιοχή πρωτεϊνική ζώνη ACTB) ± sd = 1,95 ± 0,61], όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5.

Άνω πίνακας απεικονίζει την έκφραση L2. Λωρίδες 1 και 2: HPV16 Ε2 θετικά δείγματα διασπάστηκαν /ολοκληρωμένη περίπτωση CaCx (D1 και D2)? Οι διαδρομές 3, 5, και 7: HPV16 θετική Ε2 ανέπαφη /επισωμική (επισωμικά ή ταυτόχρονη) Ευρωπαϊκή παραλλαγές (EV1, EV2, EV3, αντίστοιχα)? Λωρίδες 4, 6 και 8: HPV16 θετική Ε2 ανέπαφη /επισωμική (επισωμικά ή ταυτόχρονη) ασιατική αμερικανική παραλλαγές (AAV3, AAV2, AAV1, αντίστοιχα). Κάτω πίνακας απεικονίζει έκφραση ACTB μεταξύ όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Οι δείγμα λεπτομέρειες απεικονίζονται στον Πίνακα 5.

Η

Η

θέσεις πρόσδεσης miRNA σε σύντομο χρονικό περιοχή κωδικοποίησης μη (NCR2) και η απώλεια αυτών των θέσεων πρόσδεσης λόγω της παρουσίας των SNPs στο NCR2 της CaCx περιπτώσεις

Μια σύντομη μη-κωδικοποίησης περιοχή (NCR2) υπάρχει συνήθως μεταξύ των πλαισίων ανοικτής ανάγνωσης Ε5 και L2 των HPVs. NCR2 χαρακτηρίζεται από μια ασθενή δράση προαγωγέα που ρυθμίζεται αυστηρά από τη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων και χρησιμοποιούνται μόνο για μετεγγραφής που δίδουν τον ελάσσονα πρωτεΐνη καψιδίου L2 του HPV16 [26]. Μια άλλη μελέτη ανέφερε 13 μεταγραφές του HPV16 σε τραχήλου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή W12 (φιλοξενεί επισωμικό γονιδιωμάτων HPV16), εκ των οποίων 6 μεταγραφές βρέθηκαν να συμπεριλάβει την NCR2 και L2 [32]. Εν όψει του γεγονότος ότι οι υποθέσεις CaCx φιλοξενούν γονιδιώματα επισωμικό HPV16 εξέφρασαν επίσης το γονίδιο L2, εμείς εστιάστηκε στην αποκρυπτογράφηση των παραγόντων που θα μπορούσαν να σχετίζονται με την έκφραση L2 σε τέτοιες περιπτώσεις CaCx. Με τη χρήση RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) λογισμικό, εντοπίσαμε θέσεις πρόσδεσης στο NCR2 (nt 4.139 – 4234) του HPV16 ανέπαφη απομονώσεις, που αντιστοιχεί σε 14 ανθρώπινα miRNAs (HSA-miR-3148, HSA -miR-3174, HSA-miR-3613-3p, HSA-miR-3916, HSA-miR-495, HSA-miR-548α-5P, HSA-miR-548b-5P, HSA-miR-548c-5P, HSA -miR-548d-5P, HSA-miR-548h-5P, HSA-miR-548i-5P, HSA-miR-548j-5P, HSA-miR-548w-5P, HSA-miR-548y-5ρ) (Σχήμα 6 ). Τέτοιες θέσεις δέσμευσης miRNA επιλέχθηκαν με βάση την ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια (MFE≤7) και βαθμολογία υβριδισμού (≥140) (Πίνακας S3) σύμφωνα με τα πρότυπα που χρησιμοποιούνται συνήθως για το σχηματισμό των miRNA: mRNA υβρίδιο. resequenced δεδομένα μας αποκάλυψε την εμφάνιση ενός SNP (T4228C) (Σχήμα S1) στην παραλλαγή NCR2 του Ε ανέπαφη απομονώσεις μόνο, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε απώλεια της 9ης θέσεων σύνδεσης miRNA στις αντίστοιχες μεταγραφές (HSA-miR-548α-5ρ, HSA -miR-548b-5P, HSA-miR-548c-5P, HSA-miR-548d-5P, HSA-miR-548h-5P, HSA-miR-548i-5P, HSA-miR-548j-5P, HSA-miR -548w-5P, HSA-miR-548y-5ρ) (Σχήμα 6), τα οποία ανήκαν στην HSA-miR-548 οικογένεια των miRNAs. Είναι ενδιαφέρον ότι, το ποσοστό των περιπτώσεων Ε2 ανέπαφη CaCx (54/70, 77%) που φιλοξενούν SNPs στις θέσεις σύνδεσης miRNA εντός της NCR2 ήταν σημαντικά υψηλότερη (ρ = 0.007) σε σύγκριση με εκείνη των μη-κακοήθων δείγματα (12/25, 48%) . Μέσα Ε2 περιπτώσεις άθικτο CaCx, παρατηρήθηκε επίσης ότι κανένα από ΑΑ οι παραλλαγές (0/13, 0%) έτρεφε ένα SNP στις θέσεις πρόσδεσης miRNA στην NCR2. Έτσι, καμία απώλεια miRNA θέσεις στο NCR2 δέσμευσης παρατηρήθηκε σε παραλλαγές ΑΑ.

(Α) απεικονίζει τα NCR2 (θέσεις νουκλεοτιδίων 4139 – 4236) που βρίσκεται μέσα σε 5 ‘UTR του γονιδίου L2, με μία μόνο νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός (SNP) στη θέση 4228 (Τ προς C). (Β), το λογισμικό RegRNA με βάση την αναγνώριση των δεκατεσσάρων θέσεων πρόσδεσης miRNA μέσα NCR2 με την απώλεια των θέσεων δέσμευσης που αντιστοιχεί σε εννέα miRNAs (

*) της HSA-miR-548family λόγω του SNP (T4228C).

Η

Προηγούμενη μελέτη από το εργαστήριο μας [21] αποκάλυψε την εμφάνιση των διακυμάνσεων επανάληψης εντός του NCR2.