Αφηρημένο

Andrographolide (Άντρο) καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και προκαλεί απόπτωση σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων. Taxifolin (ταξί) έχει προταθεί για την πρόληψη ανάπτυξης του καρκίνου παρόμοιο με άλλα διαιτητικά φλαβονοειδή. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήθηκαν η κυτταροτοξική και αποπτωτικά αποτελέσματα της προσθήκης Άντρο μόνο και Άντρο και ταξί μαζί σε ανθρώπινα κύτταρα DU145 καρκίνου του προστάτη. Andro ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό καρκίνου προστάτη κυττάρων με μιτωτικό σύλληψη και την ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι. Αν και η επίδραση του ταξί και μόνο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 δεν ήταν σημαντική, η συνδυασμένη χρήση του ταξί με άντρο ενίσχυσε σημαντικά την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της αυξημένης σύλληψης μιτωτικών και απόπτωση ενισχύοντας την διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης, και caspases- 7 και -9. Andro μαζί με ταξί ενισχυμένη μικροσωληνίσκων πολυμερισμού

in vitro

, και επαγόμενη από τον σχηματισμό συνεστραμμένων και επιμήκη ατράκτων στα καρκινικά κύτταρα, οδηγώντας έτσι σε μιτωτική σύλληψη. Επιπλέον, δείξαμε ότι η εξάντληση των ΜΑϋ2, ένα συστατικό του οδοφράγματος του συγκροτήματος άξονα (SAC), στην άρση της μιτωτικής μπλοκ που προκαλείται από τις δύο ενώσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα προκαλούν μιτωτική σύλληψη από την ενεργοποίηση SAC. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η αντικαρκινική δράση της Αντρο μπορεί να ενισχυθεί σημαντικά σε συνδυασμό με ταξί από διατάραξη της δυναμικής μικροσωληνίσκων και την ενεργοποίηση της SAC

Παράθεση:. Zhang ZR, Al Zaharna Μ, Wong MM-K, Chiu SK , Cheung ΗΥ (2013) Taxifolin Βελτιώνει Andrographolide-Induced Μιτωτικά σύλληψης και την απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω του άξονα Συνέλευση Checkpoint ενεργοποίησης. PLoS ONE 8 (1): e54577. doi: 10.1371 /journal.pone.0054577

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 1η του Μάη 2011? Αποδεκτές: 13 του Δεκέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο που περιγράφονται στο παρόν έγγραφο υποστηρίχθηκε εν μέρει από δύο επιχορηγήσεις από το City University του Χονγκ Κονγκ (Έργο Νο 7002714 και 7002872). Χάρη δίνονται με το Υπουργείο Υγείας, το Χονγκ Κονγκ κυβέρνηση της ΕΔΠ, για την οικονομική τους υποστήριξη μέσω του προγράμματος HKCMMS. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν επίσης την υποτροφία από τη Σχολή Μεταπτυχιακών Σπουδών, το City University του Χονγκ Κονγκ για την Μις Ζ R. Zhang. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Andrographolide (Άντρο) είναι ένα διτερπενοειδές λακτόνη που απομονώνεται από την λειτουργική βότανο

Andrographis paniculata

, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί ως λαϊκή ιατρική για τη θεραπεία λοιμώξεων του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος, του πονόλαιμου και πολλές άλλες μολυσματικές ασθένειες. Αυτή η ένωση έχει προταθεί να έχει μεγάλες δυνατότητες για τη θεραπεία του καρκίνου επειδή δείχνει δραστηριότητες κατά του καρκίνου σε άμεση και έμμεση τρόπους [1] – [5]. Andro μπορεί να αναστείλει άμεσα την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της επαγωγής του κυτταρικού κύκλου σύλληψης, απόπτωση και διαφοροποίησης, και μπορεί έμμεσα να καταστείλει την ανάπτυξη καρκίνου μέσω ανοσοδιεγερτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντι-αγγειογενετική και χημειοπροστατευτικής ιδιότητες [4]. Andro μπορεί να τροποποιήσει την ρ50 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ με ανταγωνιστικό τρόπο, και ο μηχανισμός αυτός μπορεί να είναι η αιτία των πολλαπλών δραστηριοτήτων της [6]. δραστικότητας του φαρμάκου της εξαρτάται από την συγκέντρωσή του, επειδή μπορεί να καταστείλει την απόπτωση σε πολλούς τύπους κυττάρων σε ορισμένες συγκεντρώσεις [7], [8], [9], αλλά μπορεί επίσης να προκαλέσει απόπτωση σε υψηλές συγκεντρώσεις [10], [11], [ ,,,0],12]. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι άντρο επάγει αποτελεσματικά διακοπή κύκλου κυττάρου σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων στο στάδιο G0 /G1 [10], [13], [14] και σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατώματος HepG2 στο /Μ φάση G2 [15]. πρόσφατη μελέτη μας δείχνει ότι οι επιδράσεις της Αντρο εξαρτώνται από τον τύπο του κυττάρου. Για παράδειγμα, συλλαμβάνει τον κυτταρικό κύκλο G2 /M σε αρκετές ηπατοκυτταρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές, αλλά οδηγεί σε απόπτωση σε κύτταρα HeLa [16]. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, Andro ενεργοποιεί την εξωγενή οδό του υποδοχέα θανάτου και επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων. Στους περισσότερους τύπους κυττάρων, την ενεργοποίηση της κασπάσης-τελεστές απαιτεί επίσης την ενίσχυση του σήματος μέσω ενός μιτοχόνδρια που εξαρτάται από αποπτωτικό μονοπάτι [11], [17]. Τα προ-αποπτωτικών Bcl-2 μελών της οικογένειας (Bid και Bax) πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο ως μεσολαβητές στο ρελέ του σήματος κυτταρικού θανάτου που διεγείρεται από Άντρο [11], [12].

Ο ρόλος των διατροφικών φλαβονοειδή στην πρόληψη του καρκίνου έχει επίσης συζητηθεί ευρέως. Αδιάσειστα στοιχεία από εργαστηριακές μελέτες και κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους δείχνουν ότι τα φλαβονοειδή παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόληψη του καρκίνου και τη θεραπεία [18] – [20]. Ένας σημαντικός αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι τα φλαβονοειδή μπορούν να ενισχύουν την αντικαρκινική δραστικότητα άλλων παραγόντων στη πολλαπλούς τύπους καρκίνου [21] – [24]. Taxifolin (ταξί), επίσης γνωστή ως διυδροβαλανιδίνης, έχει μια ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και έχει δραστηριότητες παρόμοιες με quercetin, η οποία ενισχύει την απόπτωση που επάγεται από μια ποικιλία αντικαρκινικών παραγόντων σε αμφότερες τις κυτταρικές και ζωικά μοντέλα [25] – [28]. Ωστόσο, η συνδυασμένη χρήση του ταξί με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες δεν έχει αναφερθεί.

Αν και άντρο έχει αναφερθεί ότι εξασκεί ένα αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [29], λεπτομερής μοριακές μελέτες του επίδρασή της στην ανδρογόνων καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού κύτταρα εξακολουθούν να λείπουν. Υποθέσαμε ότι η θεραπεία πολλαπλών στόχων είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο για να κάνει χρήση των δραστηριοτήτων αντικαρκινική φυσικές ενώσεις. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη για τον προσδιορισμό των ατομικών και συνδυασμένες επιπτώσεις των Άντρο και ταξί για τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη DU145 ανδρογόνο-ανεξάρτητες. Τα αποπτωτικά αποτελέσματα του Andro επί των κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ταξί ενισχύοντας το αποπτωτικό μονοπάτι και επάγει την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου συγκροτήματος ατράκτου (SAC).

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και χημικά

ανθρώπινα κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη DU145, αθανατοποιημένα ανθρώπινα κύτταρα προστάτη ΡΝΤ2, και φυσιολογικά ινοβλάστες ανθρώπινης ακροποσθίας Hs27 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (MD, USA). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Invitrogen, CA, USA), 0,37% διττανθρακικό νάτριο, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη 5 % CO

2 θερμοκοιτίδα αέρα. Καθαρισμένα άντρο (97%) ελήφθη από Indofine Chemical Company (NJ, USA). Ταξί που ήταν 85% καθαρό αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Corporation (MO, USA) και ένα 98% προετοιμασία καθαρό ταξί αγοράστηκε από BioBioPha (Γιουνάν, P.R.C.). Αμφότερα τα παρασκευάσματα είχαν την ίδια επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων όταν χορηγείται μόνη ή σε συνδυασμό με άντρο. Αμφότερα τα χημικά διαλύθηκαν πρώτα σε DMSO (λιγότερο από 0,1%) και στη συνέχεια αραιώνεται με πλήρες μέσο ανάπτυξης με την τελική επιθυμητή συγκέντρωση πριν από τη θεραπεία. Δείγματα σε επεξεργασία με DMSO μόνο χρησίμευσαν ως μάρτυρες όχημα. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

ΜΤΤ κυτταρικού πολλαπλασιασμού /βιωσιμότητας

δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκαν με 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -2, 5-διφαινυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ) (Invitrogen, CA, USA) δοκιμασίας. DU145 κύτταρα, κύτταρα ΡΝΤ2, και Hs27 σπάρθηκαν στα 5000 και 1000 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως, σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις άντρο, ταξί ή ένα μίγμα των δύο για ένα προκαθορισμένο χρονικό διάστημα. Στο τέλος της θεραπείας, το μέσο που περιέχει το φάρμακο απομακρύνεται και 0.5 mg /ml ΜΤΤ διαλύθηκαν στο ίδιο μέσο προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε περαιτέρω για επιπλέον 3 h. Μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου, στο τέλος της επώασης, 100 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που είχε σχηματιστεί. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο σάρωσης πολλαπλών φρεατίων (Model 550, Bio-Rad, USA). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό ελέγχου με σύγκριση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων στην ομάδα θεραπείας με τον αριθμό στην ομάδα φορέα.

Παρατήρηση κυτταρικών και πυρηνικών μορφολογία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε αποστειρωμένο καλυπτρίδες με συρροή περίπου 30%, ακολουθούμενη από 24 ώρες επώασης και η χημική επεξεργασία. Τα κύτταρα πλύθηκαν για λίγο με PBS και χρωματίστηκαν με 5 μg /ml του Hoechst 33342 (Invitrogen, CA, USA) σε μη-FBS DMEM για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα εξετάστηκαν με τη χρήση αντίθεσης φάσης και φθορισμού μικροσκόπια (Mikron Instruments, ΝΥ, USA).

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής

Έλεγχος και επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 70 % παγωμένο όλη τη νύκτα αιθανόλης στους 4 ° C. Μετά την απομάκρυνση αιθανόλης και πλύση με PBS, τα σταθεροποιημένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα χρώσης DNA που περιέχει 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και 100 μg /ml RNase Α σε PBS σε πυκνότητα περίπου 1 χ 10

6 κύτταρα /ml. Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλα 30 λεπτά στους 37 ° C σε χαμηλό φως. Το χρωματισμένο εναιώρημα κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, CA, USA). Η περιεκτικότητα σε DNA των 10.000 κύτταρα ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας ιστογράμματα DNA. Το περιεχόμενο του DNA του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων που αναλύθηκαν ήταν υπολογίζονται ΜΟϋΡΙΤ 3,0 λογισμικού (Verity Software House, ME, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Η ποσοτικοποίηση της μιτωτικής δείκτη με κυτταρομετρία ροής

Ο έλεγχος και η επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια καθίστανται διαπερατά με βραδεία προσθήκη παγωμένης μεθανόλης σε μια τελική συγκέντρωση του 90% και επωάζεται σε πάγο για 30 λεπτά. Περίπου 1 χ 10

6 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος επώασης (0.5% BSA σε PBS) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με phosphohistone H3 (Ser10) αντίσωμα (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) για 1 ώρα και στη συνέχεια με ένα συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) για άλλα 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοχρωματίστηκε κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 0,5 ml ιωδιούχου προπιδίου (5 μg /ml) σε PBS και διατηρούνται στο σκοτάδι πριν από την ανάλυση με κυτταρόμετρο ροής εντός 24 ωρών. Το σήμα από 10.000 κυττάρων μετρήθηκε για να δημιουργήσει ένα διάγραμμα διασποράς.

Ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών ρυθμού με κυτταρομετρία ροής

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με τη χρήση της Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Sigma-Aldrich) με η διαδικασία που προβλέπεται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα στα πιάτα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και πλύθηκαν, και περίπου 5 × 10

5 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ 1 χ ρυθμιστικού σύνδεσης (10 mM ΗΕΡΕ /NaOH, ρΗ 7,5, 0,14 Μ NaCl και 2,5 mM ΟαΟ

2). Στη συνέχεια, 5 μΐ 50 μg /ml Αηηβχίην FITC Conjugate (σε 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 100 mM NaCl) και 10 μΐ 100 μg /ml διάλυμα ΡΙ (σε 10 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl) προστέθηκαν στο κυτταρικό εναιώρημα. Μετά από 10 λεπτά επώασης στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου, το σήμα φθορισμού από τα κύτταρα μετρήθηκε αμέσως με ένα κυτταρόμετρο ροής.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 60% συρροή επί αποστειρωμένο κάλυμμα γλιστρά και εκτίθενται στα χημικά του ενδιαφέροντος μετά από 24 ώρες επώασης. Μετά από ένα προκαθορισμένο χρονικό διάστημα της θεραπείας με τις χημικές ουσίες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS και κατέστησαν περατά με 0,25% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά. Τα διαπερατά κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα επώασης (3% BSA σε PBS) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να εμποδίσει μη-ειδική σύνδεση του αντισώματος. β-τουμπουλίνης αντίσωμα (Cell Signaling Technology) επωάστηκε με τα κύτταρα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και κατόπιν ΡΙΤΟ-συζευγμένο IgG αίγας αντι-κουνελιού (Santa Cruz) και η χρωστική βαφή του DNA Hoechst προστέθηκαν για 1 ώρα σε χαμηλό φως. Στο τέλος της αντίδρασης, οι καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν με PBS πριν να τοποθετηθεί σε πλακίδια μικροσκοπίου με μέσο συναρμολογήσεως φθορισμού (Dako, Denmark). Τα σφραγισμένα πλακίδια εξετάστηκαν στη συνέχεια με ένα Leica SP5 συνεστιακό μικροσκόπιο (διέγερση στα 488 nm για FITC και 365 nm για Hoechst).

ανάλυση κηλίδος Western

Σύνολο κυτταρόλυμα παρασκευάζεται με λύση των κυττάρων σε RIPA ρυθμιστικό λύσης (150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 1% ΝΡ-40, και 50 mM Tris-Cl, ρΗ 7.5) συμπληρωμένο με το κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης Σετ III (Calbiochem, CA, USA) και 1 mM PMSF σε πυκνότητα 1-2 × 10

7 κύτταρα /ml ρυθμιστικού διαλύματος. Το κυτταρικό εναιώρημα αναδεύτηκε για 30 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως κυτταρικά εκχυλίσματα. Στη συνέχεια, 50 μg πρωτεϊνών από τα προϊόντα λύσης κυττάρου διαχωρίστηκαν με 12% ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, CA, USA). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 3% BSA ή άπαχο γάλα σε PBS με 0,05% Tween-20. Αυτό ακολουθήθηκε από επώαση όλη τη νύκτα με ένα αραιωμένο διάλυμα του πρωτογενούς αντισώματος έναντι α-τουμπουλίνης, κασπάσης-3, κασπάσης-7, κασπάσης-9, ρ-Cdc2 (Tyr15), κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, κυκλίνης Ε2, Myt-1, p21, PARP (Cell Signaling), Bcl-2 (Santa Cruz), Bcl-xL (Invitrogen, CA, USA), ή Cdc2 (BD) στους 4 ° C. Αυτό ακολουθήθηκε από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου με HRP-συζευγμένο αντίσωμα (IgG αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG) για 1 ώρα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο του Western Blotting λουμινόλη (Santa Cruz). Εικόνες που αναπτύχθηκε συνελήφθησαν με ΣΕΝ-4000 σύστημα τεκμηρίωσης τζελ (Fuji Film, Tokyo, Japan).

In vitro

τουμπουλίνης δοκιμασία θολότητας

Η επίδραση των φαρμάκων για πολυμερισμός μικροσωληνίσκων παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας CytoDYNAMIX ™ Screen 01 kit (Cytoskeleton Inc., CO, USA). Εν συντομία, τα φάρμακα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις παρασκευάστηκαν σε DMSO σε 10 χ δύναμη σε ρυθμιστικό G-ΡΕΜ, που περιέχει 80 mM PIPES (ρΗ 6.9), 2 mM MgCl

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP και 5% γλυκερίνη . DMSO χρησίμευσε ως έλεγχος του οχήματος. Ακολούθως, 10 μΙ 10 × ρυθμιστικού G-ΡΕΜ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας προθερμασμένο πλάκα 96-φρεατίων και αφέθηκαν να επωαστούν για 2-5 λεπτά. πρωτεΐνη τουμπουλίνης (& gt? 97% καθαρότητα) αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα G-ΡΕΜ σε συγκέντρωση περίπου 4 mg /ml και στη συνέχεια 90 μΙ του διαλύματος τουμπουλίνη προστέθηκαν στο κάθε βοθρίο περιέχει 10 μΐ του ρυθμιστικού διαλύματος. Μετά την ανακίνηση, η απορρόφηση στα 340 nm μετρήθηκε κάθε λεπτό για 60 λεπτά στους 37 ° C.

εξάντληση RNAi του ΜΑϋ2

κύτταρα DU145 σπάρθηκαν σε πλάκες 60 mm για να παρέχουν μια συρροή 50 -70% σε 24 h. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε ένα από τα δύο Mad2L1 siRNA (ΟηΟεηε, MD, USA) ή τον έλεγχο siRNA παρουσία siTran αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (ΟηΟεηε) σε μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen, CA, USA) για 24 ώρες. Τα επιμολυσμένα κύτταρα ξεπλύθηκαν μία φορά με PBS και επωάστηκαν με ϋΜΕΜ (Invitrogen, CA, USA) μέσο για 24 ώρες και περαιτέρω επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες σε μέσο που περιέχει 20 μΜ άντρο και 100 μΜ ταξί. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν μία φορά με PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη, και σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και αποθηκεύεται στους -20 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μιτωτικό δείκτη στη συνέχεια ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής με βάση σήματα από αντίσωμα έναντι φωσφο-ιστόνης Η3 (στο S10) και ιωδιούχο προπίδιο.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας την προέλευση 7.5 λογισμικό (OriginLab Corporation, MA, USA) και Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν από 3 ή 4 ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± s.d. Οι διαφορές μεταξύ των δειγμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ Student δύο δείγματος. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

άντρο είναι πολύ περισσότερο από ό, τι κυτταροτοξική ταξί στην αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη κύτταρα

Ανθρώπινα κύτταρα προστάτη DU145 καρκινώματος εκτέθηκαν σε 0 έως 50 μΜ Άντρο για 24, 48 και 72 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, μία κοινή μέθοδος για τη μέτρηση της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων ώστε να αντικατοπτρίζει τον αριθμό των κυττάρων ή τον πολλαπλασιασμό. Andro ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 σε ένα χρόνο και τη συγκέντρωση τρόπο που εξαρτάται σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (Σχήμα 1Α). Η υπολογιζόμενη IC

50 αξίες της Αντρο στα κύτταρα DU145 ήταν 42.76 ± 3.29 (24 ώρες), 13,70 ± 1,45 (48 ώρες) και 8,36 ± 0,77 μΜ (72 ώρες). Το IC

50 αξία στις 48 ώρες που λαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη ήταν μόνο ελαφρώς υψηλότερη από την τιμή (12 μΜ) έχουν αναφερθεί στο παρελθόν από Nanduri

et al.

[29]. Σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από τις IC

50 αξία, Άντρο που προκαλείται από αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία των επεξεργασμένων DU145 κυττάρων, η οποία εμφανίστηκε γύρο και συρρικνωμένο και έδειξε διόγκωση (Σχήμα S1). Αυτά τα κύτταρα παρουσίασαν επίσης συμπύκνωση χρωματίνης και κατακερματισμένη πυρήνες (Σχήμα S2).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα εύρος συγκεντρώσεων του (Α) άντρο και (Β) ταξί για την υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρακολουθήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράστηκαν ως ποσοστό της βιωσιμότητας σε σχέση με τον έλεγχο οχήματος (DMSO). Οι τιμές είναι μέση τιμή ± s

Η

Αξιολογήσαμε επίσης την κυτταροτοξικότητα των ταξί στα κύτταρα DU145 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ταξί είναι πολύ λιγότερο κυτταροτοξική σε κύτταρα DU145 από άντρο και ότι μια συγκέντρωση 500 μΜ ταξί απαιτήθηκε για να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 52% μετά από 48 ώρες έκθεσης (Σχήμα 1Β). Το αποτέλεσμα αυτής της μελέτης είναι συνεπής με την προηγούμενη έκθεση σχετικά με την κυτταροτοξικότητα των ταξί σε καρκινικά κύτταρα θηλαστικών [30].

Άντρο προκαλεί μιτωτική σύλληψη και απόπτωση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι η θεραπεία κυττάρων DU145 με Άντρο σε συγκεντρώσεις μεταξύ 0-40 μΜ οδήγησε σε συσσώρευση κυττάρων στο G2 /M αλλά μία μείωση στα κύτταρα σε G0 /G1 σε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση (Σχήμα 2Α) και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Επίσης προσδιορίζεται κατά πόσον η αύξηση της G2 /M του πληθυσμού οφειλόταν στην αύξηση μιτωτικά κύτταρα στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία άντρο. Παρακολουθήσαμε το μιτωτικό δείκτη (ο λόγος των μιτωτικών κυττάρων με το υπόλοιπο του κυτταρικού πληθυσμού) με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ανοσοχρώση με φωσφο-ιστόνης Η3, μιτωτικής δείκτη, και παρατηρήσαμε ότι άντρο προκάλεσε μια σημαντική συσσώρευση των μιτωτικών κυττάρων σε ένα δοσο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2C). Μια 11-πλάσια αύξηση στην μιτωτικά κύτταρα μετά από επεξεργασία με 40 μΜ άντρο για 24 ώρες παρατηρήθηκε όταν συγκρίθηκε με τον έλεγχο οχήματος (του πληθυσμού κυττάρων σε ορθογώνια επισημασμένα με M στα Σχήματα 2C και 2D). Μια σύγκριση ανάμεσα στο μιτωτικό δείκτη και το ποσοστό των κυττάρων G2 /M του πληθυσμού πρότεινε ότι η συσσώρευση του G2 κύτταρα /M οφειλόταν κυρίως στη μιτωτική σύλληψη (Σχήμα 2D). Αυτό το σύνολο των πειραμάτων έδειξαν ότι μετά από 24 ώρες θεραπείας με άντρο, τα κύτταρα ήταν κυρίως σε μιτωτική σύλληψη

(Α) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 0-40 μΜ άντρο για 48 ώρες.? κύτταρα (Β) εκτέθηκαν σε 40 μΜ άντρο για 0-72 ώρες. Cellular DNA χρωματίστηκε με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε με το πρόγραμμα ModFit και εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.d. (N = 3 ή 4). (C & amp? D) μιτωτικό δείκτη των κυττάρων DU145 αντιμετωπίζονται με Άντρο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 20, και 40 μΜ άντρο για 24 ώρες και μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Η3 (Ser10) αντίσωμα αντι-φωσφο-ιστόνης, συζευγμένο με FITC δευτερογενές αντίσωμα και ΡΙ, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Ένα αντιπροσωπευτικό διάγραμμα πυκνότητα των κυττάρων επισημάνθηκαν με phosphohistone Η3 έναντι του περιεχομένου του DNA στα κύτταρα. Μιτωτικός δείκτης (Μ) του κυτταρικού πληθυσμού δείχνεται στο κουτί περιοχή. (D) μιτωτικό δείκτη και το ποσοστό των κυττάρων G2 /M μετά τη θεραπεία με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις άντρο εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.d. (N = 4). * Υποδηλώνει σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο (

σ

& lt? 0,01)

Η

Επίσης εξετάσαμε τις συνθήκες που προκάλεσαν Άντρο για να επάγει απόπτωση.. Andro-επεξεργασμένα κύτταρα βάφτηκαν με Αννεξίνη V-FITC και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η μελέτη της χρονικής πορείας των αποπτωτικών συντελεστών μετά από θεραπεία με άντρο έδειξαν ότι το υψηλότερο ποσοστό πρώιμων αποπτωτικών (9.38%) παρατηρήθηκε στις 48 ώρες? Ωστόσο, στις 72 ώρες, η πρώιμη αποπτωτική ρυθμός μειώνεται, και το ποσοστό κυτταρικού θανάτου αύξηση (σχήμα 3C). Επιπλέον, αυξανόμενες συγκεντρώσεις άντρο επηρέασε τόσο νωρίς και αργά την απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήματα 3Α και 3Β). Συμπεραίνουμε ότι η θεραπεία με άντρο ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 στο G2 /M φάση και ότι περισσότερα από αυτά τα κύτταρα προχώρησαν προς την απόπτωση κατά τη διάρκεια της πλέον θεραπεία, με παρατεταμένη μιτωτική σύλληψη οδηγούν σε απόπτωση

(Α & amp? Β). Μετά την αγωγή για 48 ώρες με 0-80 μΜ άντρο, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με διπλά Annexin V-FITC αντισώματος και ΡΙ πριν αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Α) Ένα σύνολο αντιπροσωπευτικών οικόπεδα κουκίδα υποδεικνύει το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V-FITC

+ /ΡΙ

-, κάτω δεξιό πίνακα) και το ποσοστό των καθυστερήσεων αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα (Αννεξίνη V- FITC

+ /ΡΙ

+, επάνω δεξιά πάνελ). (Β) Το οικόπεδο του ποσοστού των πρώιμων αποπτωτικών και των καθυστερήσεων αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις Άντρο εκφράζονται ως μέση τιμή ± s (N = 4). (C) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 40 μΜ άντρο για 0-72 ώρες. Η γραφική παράσταση της επί τοις εκατό των πρώιμων αποπτωτικών και των καθυστερήσεων αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα κατά το χρόνο της θεραπείας εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.d. (N = 4).

Η

Επίδραση της Άντρο στην έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου, κασπάσες και Bcl-2 οικογένειας πρωτεϊνών

Για να διερευνήσουν των μοριακών μηχανισμών της μίτωσης που επάγεται από Άντρο , τα επίπεδα έκφρασης αρκετών σημαντικών ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Ανάλυση των ανοσοστυπωμάτων έδειξε ότι 24 ώρες μετά την αγωγή, ένα 5,7-φορές, 3,2 φορές και αύξηση 3 φορές σε κυκλίνη Β1, ρ21, και φωσφορυλιωμένα (Tyr15) επίπεδα πρωτεΐνης cdc25C, αντίστοιχα, παρατηρήθηκαν (Σχήματα 4A-D) , ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης του κυκλίνη Α και η κυκλίνη Ε2 μειώθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις άντρο. Clear παράλληλες μετατοπίσεις κινητικότητας λόγω της φωσφορυλίωσης του cdc25C, Myt1 και ρ21 ήταν παρόν σε 24 h (Σχήμα 4Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση της κυκλίνης Β1 ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση του άντρο. Για παράδειγμα, η έκφραση της ήταν υψηλότερη σε 40 μΜ αλλά μειώθηκε σε 80 μΜ. Ομοίως, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του Cdc25C και Myt1 ήταν η πιο έντονη μετά τη θεραπεία με 40 μΜ άντρο.

(Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν με 0-80 μΜ άντρο για 24 ή 48 ώρες. 40 μg του κυτταρικού λύματος αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12%, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και ανοσοστυπώθηκαν έναντι τα υποδεικνυόμενα αντισώματα ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα είναι η ποσοτικοποίηση των κηλίδων Western των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Η αλλαγή στο επίπεδο της κυκλίνης Β1 σε σύγκριση με τον μάρτυρα (0 μΜ) από τον ποσοτικό προσδιορισμό των κηλίδων Western σχεδιάστηκε έναντι της συγκέντρωσης του Άντρο στις 24 και 48 ώρες. (Γ) Η αλλαγή στα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων Cdc25C είχε συναρτήσει της συγκέντρωσης των Άντρο. (D) Η αλλαγή στα επίπεδα του ρ21 σχεδιάστηκε έναντι της συγκέντρωσης του άντρο. Οι τυπικές αποκλίσεις των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζονται.

Η

Επίσης εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση, κασπάσες και Bcl-2 μελών της οικογένειας με ανοσοκηλίδωση με ειδικά αντισώματα τους. Συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη διάσπαση της PARP (πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης), κασπάσης 7, 9 και 3 παρατηρήθηκαν (Σχήμα 5Α). Η προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax δεν ανιχνεύθηκε ούτε στον έλεγχο ή κατεργασμένων κυττάρων? Ωστόσο, το κράτος προ-επιβίωσης Bcl-2 ήταν εκφράζεται ασθενώς. Η έκφραση του Bcl-XL, ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, σαφώς ανιχνευθεί, αλλά ένα που μετακινείται βραδύτερα μορφή παρατηρήθηκε στα κατεργασμένα κύτταρα 48 ώρες μετά την έκθεση σε 80 μΜ άντρο (Σχήμα 5Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση ήταν περισσότερο σημαντικά επάγεται μετά από 48 ώρες της θεραπείας με 80 μΜ άντρο.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 0-80 μΜ άντρο για 24 ή 48 ώρες, συλλέχθηκαν και λύθηκαν. 40 μg του κυτταρικού λύματος διαχωρίστηκε σε 12% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα κατά (Α) κασπάση-7, -9, και -3 και υποστρώματος PARP? και (Β) οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης Bcl-XL, Bcl-2, και Βαχ. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

Η

Ταξί ενδυναμώνει τη δράση αναστολής της ανάπτυξης των Άντρο

Προτείναμε ότι Ταξί μπορεί να επηρεάσουν την κυτταροτοξική δράση των Άντρο στα καρκινικά κύτταρα.? Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε τη συνδυαστική επίδραση του Άντρου και ταξί επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, όταν εκτίθεται σε 100 μΜ ταξί χωρίς άντρο, το σχετικό ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων ήταν 93.33 ± 6.27% (μέσος όρος ± SD, η = 4), η οποία δεν ήταν σημαντικά χαμηλότερη από τον έλεγχο του οχήματος (μη επεξεργασμένα κύτταρα) . Αντίθετα, σημαντική μείωση στο ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (% του ελέγχου του αριθμού των κυττάρων = 65,6%) παρατηρήθηκε σε παρουσία 10 μΜ άντρο και μόνο, αλλά περαιτέρω προσθήκη 100 μΜ ταξί οδήγησε σε ελαφρώς χαμηλότερο ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (54,78%). Ωστόσο, η επίδραση αναστολής αύξησης του 20 μΜ Άντρο σε συνδυασμό με 100 μΜ ταξί (% του ελέγχου = 20,92 ± 1,89%) ήταν περίπου δύο φορές η επίδραση της θεραπείας με ταξί μόνο (% του ελέγχου = 39,58 ± 1,79%, η = 4) , και η διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων έλαβε χώρα όταν η ποσότητα του ταξί αυξήθηκε σε συνδυασμό με υψηλότερες συγκεντρώσεις άντρο. Μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε επίσης όταν 200 μΜ Ταξί προστέθηκε μαζί με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις Άντρο? Ωστόσο, υπήρξε μια μείωση 14,7% στον αριθμό των κυττάρων με την παρουσία του ταξί μόνο (85,27%), η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο του οχήματος. Ως εκ τούτου, σε όλες τις επόμενες έρευνες, 100 μΜ ταξί χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με διάφορες συγκεντρώσεις άντρο. Τα αποτελέσματα από την μορφολογική ανάλυση των κυττάρων που κατεργάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής συσχετίζονται καλά με τα δεδομένα που αφορούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 6Β). Τα κύτταρα κατεργάστηκαν με τις δύο ενώσεις έδειξαν περισσότερο συρρίκνωση, χαμηλότερη πυκνότητα κυττάρου, μεγαλύτερο αριθμό επιπλεόντων κυττάρων και περισσότερο πυρηνική συμπύκνωση και κατάτμηση (δεν φαίνεται) από τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με άντρο μόνο. ​​

(Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0-40 μΜ άντρο και 0, 100 ή 200 μΜ του ταξί για 48 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Δεδομένα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα εκφράστηκαν ως ποσοστό της βιωσιμότητας σε σχέση με τον έλεγχο οχήματος (DMSO) με τυπική απόκλιση (μέση ± τ.α., η = 4). * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από τον έλεγχο (

ρ

& lt? 0,01). (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ του Andro για 48 ώρες με την παρουσία ή απουσία 100 μΜ του ταξί, και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής. Bar = 50 μm. (Γ) Από τη σύγκριση της βιωσιμότητας του ΜΤΤ δοκιμασία της DU145, ΡΝΤ2 και Hs-27 κυττάρων μετά την θεραπεία με 20 μΜ Άντρο και 100 μΜ των ταξί. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι τυπικές αποκλίσεις που υποδεικνύεται.

Η

ενδιαφέρονται για δοκιμή αν η θεραπεία dual-φαρμάκου ήταν ειδική για τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με αθανατοποιημένα αλλά μη καρκινικά κύτταρα. Η δοκιμασία ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 με κύτταρα ΡΝΤ2, μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη αθανατοποιημένα με τον ιό SV40, και με Hs-27 κύτταρα, μία ανθρώπινη ακροποσθία κυτταρική σειρά ινοβλαστών, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μΜ άντρο και 100 μΜ ταξί . Υπό τις ίδιες συνθήκες, μόνο το 30,3% των κυττάρων DU145 ήταν βιώσιμα, ενώ το 48,6% και το 62,4% των ΡΝΤ2 και Hs-27 κύτταρα, αντίστοιχα, ήταν βιώσιμα (Σχήμα 6C). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι τα κύτταρα DU145 ήταν πιο ευαίσθητοι στις δύο φάρμακα από ό, τι τα άλλα δύο αθανατοποιημένες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές.

ταξί και Andro-επαγόμενη μιτωτική σύλληψη οδηγήσει στη συσσώρευση της κυκλίνης Β, cdc25C, και ρ21

για να διερευνηθεί αν η συνδυασμένη ανασταλτική δράση επί της ανάπτυξης DU145 οφειλόταν σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, τα γεγονότα του κυτταρικού κύκλου και μιτωτικό δείκτη αξιολογήθηκαν σε Andro-κατεργασμένα κύτταρα με ή χωρίς ταξί. Όταν Andro δεν ήταν παρούσα, το ποσοστό των κυττάρων σε G2 /M στις δύο ομάδες δεν ήταν σημαντικά διαφορετική. Ωστόσο, όταν η συγκέντρωση του άντρο αυξήθηκε από 10 μΜ έως 40 μΜ, το ποσοστό των κυττάρων σε G2 /M στις συνδυασμένες ομάδες θεραπείας ήταν σημαντικά υψηλότερο από το ποσοστό των κυττάρων στην ομάδα της μονοθεραπείας άντρο (Σχήμα 7Α). Επιπλέον, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη καλλιέργεια θεραπεία για 24 ώρες με 20 μΜ Άντρο σε συνδυασμό με 100 μΜ ταξί (Σχήμα 7Β). Η αναλογία των κατεργασμένων κυττάρων σε Μ φάση μετρήθηκε επίσης με τον Η3 (S10) αντίσωμα αντι-φωσφο-ιστόνης. Ο μιτωτικός δείκτης της συνδυασμένης ομάδας ήταν περίπου διπλάσιος του επιπέδου των κυττάρων σε επεξεργασία με άντρο μόνο (23,67 ± 4,21% έναντι 10,65 ± 0,22%, η = 4), ενώ οι μιτωτικοί δείκτες και στις δύο ομάδες ελέγχου δεν διαφέρουν μεταξύ τους (Σχήμα 7C), γεγονός που υποδηλώνει ότι ταξί μόνο δεν επάγει μία σύλληψη φάση Μ. Ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα αποτελέσματα των φαρμάκων στα επίπεδα έκφρασης και την τροποποίηση των cdc25C, κυκλίνη Β1, και πρωτεΐνες ρ21 (Σχήμα 7D). Η αύξηση της συγκέντρωσης του Andro αύξησε την φωσφορυλιωμένες μορφές Cdc25C 2-πλάσια, πρωτεΐνη ρ21 σχεδόν 5-φορές, και η κυκλίνη Β1 4.1-φορές (σχήματα 7Ε-G). Μετά από 100 μΜ ταξί προστέθηκε σε 20 μΜ άντρο, ο φωσφορυλίωση Cdc25C και το επίπεδο πρωτεΐνης της κυκλίνης Β 1 ήταν αυξημένα σχεδόν 2-φορές και 3,5 φορές, αντίστοιχα. Αντιθέτως, το επίπεδο έκφρασης της ρ21 δεν επηρεάσθηκε σημαντικά στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας. Ωστόσο, 40 μΜ Andro σε συνδυασμό με 100 μΜ Ταξί μείωσε την κυκλίνη Β1 και τα επίπεδα CDC25C αλλά αύξησε το επίπεδο p21 κατά 1,8 φορές σε σύγκριση με 20 μΜ Άντρο και 100 της θεραπείας μΜ ταξί. Αυτά τα πειράματα αποδεικνύουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε συσσώρευση των μιτωτικών συνελήφθησαν κυττάρων.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (Α) 0-40 μΜ άντρο για 48 h (Β) 20 μΜ άντρο για 0-48 h υπό την παρουσία ή απουσία 100 μΜ του ταξί. Cellular DNA χρωματίστηκε με ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η κατανομή του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε με το πρόγραμμα ModFit. Μέση ± s.d. (N = 4) του ποσοστού των G2 Μ κύτταρα /παρουσία ταξί (100 μΜ) και εν απουσία του ταξί (Taxi-) συγκρίθηκαν. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων, * ρ & lt? 0,01, **

σ

& lt? 0,05. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ του Andro για 24 ώρες με την παρουσία ή απουσία 100 μΜ του ταξί. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.