Αφηρημένο

Σκοπός

Η PI3K /AKT /mTOR μονοπάτι συχνά απορυθμίζεται σε καρκίνους και αναστολή της mTOR έχει αποδείξει την ικανότητά τους να διαμορφώνουν οδούς προ-επιβίωσης. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η ικανότητα του everolimus αναστολέα mTOR να ενισχύσει την επίδραση κατά των όγκων των ιρινοτεκάνη σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC).

Πειραματικός Σχεδιασμός

Οι συνδυαστικές επιδράσεις του everolimus και irinotecan ήταν αξιολογούνται

in vitro

και

in vivo

σε κυτταρικές σειρές CRC φιλοξενούν συνήθως βρίσκονται μεταλλάξεις στο

PIK3CA

,

KRAS

και /ή

BRAF

. Φαρμακοκινητικά κατευθυνόμενη δοσολογία πρωτόκολλα του everolimus και ιρινοτεκάνη καθιερώθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των in vivo αντικαρκινική επίδραση των παραγόντων. Στο τέλος της θεραπείας, 3-6 όγκων ανά σκέλος θεραπείας συλλέχθηκαν για ανάλυση βιοδείκτη από μεταβολισμική NMR.

Αποτελέσματα

Το everolimus και ιρινοτεκάνη /SN38 απέδειξε συνεργική αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις σε πολλαπλές κυτταρικές CRC γραμμές

in vitro

. συνδυασμένες επιδράσεις του everolimus και ιρινοτεκάνη προσδιορίστηκαν σε μοντέλα ξενομοσχεύματος CRC χρησιμοποιώντας κλινικά σχετικές πρωτόκολλα δοσολογίας. Το everolimus επέδειξε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μόνο και όταν συνδυάζεται με ιρινοτεκάνη σε ΗΤ29 και ξενομοσχεύματα HCT116 όγκου. Μεταβολομική ανάλυση έδειξε ότι οι όγκοι ΗΤ29 ήταν πιο μεταβολικά ανταπόκριση από όγκους HCT116. Το everolimus προκάλεσε μία μείωση στη γλυκόλυση και στους δύο τύπους όγκου ενώ θεραπεία με ιρινοτεκάνη είχε ως αποτέλεσμα μια βαθιά συσσώρευση λιπιδίων σε όγκους ΗΤ29 υποδεικνύοντας μία κυτταροτοξική δράση.

Συμπεράσματα

Η ποσοτική ανάλυση της ανάπτυξης του όγκου και μεταβολομική στοιχεία έδειξαν ότι ο συνδυασμός του everolimus και ιρινοτεκάνη ήταν πιο επωφελής για το

BRAF /PIK3CA

μεταλλαγμένο ξενομοσχεύματα ΗΤ29 όγκων, η οποία είχε ένα προσθετικό αποτέλεσμα, από τα

KRAS /PIK3CA

μεταλλαγμένο ξενομοσχεύματα HCT116 όγκου, η οποία είχε λιγότερο από προσθετικό αποτέλεσμα

Παράθεση:. Bradshaw-Pierce EL, Pitts TM, Kulikowski G, Selby Η Merz aL, Gustafson DL, et al. (2013) Αξιοποίηση Ποσοτικών In Vivo Φαρμακολογίας προσεγγίσεις για την εκτίμηση Συνδυασμός Επιδράσεις Το everolimus και ιρινοτεκάνη στο ποντίκι Ξενομοσχεύματος μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (3): e58089. doi: 10.1371 /journal.pone.0058089

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 31ης Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Bradshaw-Pierce et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη Novartis International AG και το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Καρκίνου P30 Grant CA046934. Novartis είχε κάποια συμβολή στο σχεδιασμό της μελέτης, αλλά δεν παίζουν ρόλο στην ανάλυση της συλλογής δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχω διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις . Ένα τμήμα του κόστους των μελετών παρεσχέθη από τη Novartis. Novartis παρείχε επίσης όλες everolimus για τις μελέτες. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Δεν υπάρχει προς το παρόν σημαντική έμφαση στην ανάπτυξη νέων παραγόντων για την διαταράξει μονοπάτια μεταγωγής σήματος σημαντική εξέλιξης του καρκίνου. Η κλινική χρήση αυτών των μοριακώς στοχευμένων παραγόντων περιλαμβάνει συχνά συνδυασμούς με άλλους θεραπευτικούς τρόπους και διάφορες κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει τα οφέλη της προσθήκης ρυθμιστές μεταγωγής σήματος (ΕΕΜ) για χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία [1] – [5]. Η επιτυχής ανάπτυξη των φαρμακευτικών θεραπειών και στρατηγικές θεραπείας απαιτεί την προσεκτική χρήση των προκλινικά μοντέλα και προσεκτική ερμηνεία των δεδομένων.

Η χρήση των ποσοτικών προσεγγίσεων, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης των φαρμακοκινητικών δεδομένων και ποσοτικές μετρήσεις της απόκρισης, είναι κρίσιμη για την κατανόηση μηχανισμούς δράσης και τη βελτίωση της μεταφραστικής έρευνας φαρμακολογία [6]. Ένα κοινό μειονέκτημα των

in vivo

φαρμακολογικές μελέτες είναι η χρήση των δόσεων και /ή χρονοδιαγράμματα που δεν είναι κλινικά εφικτές οποία μπορεί να οδηγήσει σε παραπλανητικά αποτελέσματα της αποτελεσματικότητας ή /και της ανάπτυξης των βιολογικών δεικτών που συχνά αποτυγχάνουν να μεταφράσει στην κλινική σύνθεση. Εδώ παρουσιάζουμε μια μελέτη όπου θα προσδιορίζεται ποσοτικά το όφελος από την προσθήκη ενός μικρού μορίου ΕΕΜ, everolimus (Novartis, East Hanover, NJ), με το πρότυπο χημειοθεραπεία, ιρινοτεκάνη (Pfizer Inc, New York, NY), χρησιμοποιώντας δόσεις και χρονοδιαγράμματα σε προκλινικές μας μοντέλα αναμένεται να αποδώσει ανοίγματα φάρμακο που προσεγγίζει εκείνες που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς

το everolimus (40-

O

– (2-υδροξυαιθυλ) -ραπαμυκίνη, RAD001 /δισκία Afinitor®). είναι ένας από του στόματος βιοδιαθέσιμο αναστολέας του στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR), η οποία επί του παρόντος εγκριθεί για τη θεραπεία του προχωρημένου νεφροκυτταρικού καρκινώματος και προοδευτική νευροενδοκρινείς όγκους παγκρεατικής προέλευσης (ΡΝΕΤ) [7], [8]. mTOR, μια κινάση σερίνης /θρεονίνης, είναι ένα κεντρικό ρυθμιστής οδών που σηματοδοτούν την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τον μεταβολισμό και την αγγειογένεση [7], [9]. δραστηριότητα του mTOR διαμεσολαβείται από τον παράγοντα σηματοδότηση ανάπτυξης, θρεπτικά συστατικά και ενέργεια μελών, καθώς και υποξικό στρες. Επιπλέον, mTOR παίζει βασικό ρόλο στη φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ οδός η οποία συχνά απορυθμίζεται και εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη σε αρκετές μορφές καρκίνου, που καθιστούν ελκυστικό θεραπευτικό στόχο [10], [11]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι PIK3CA μεταλλάξεις ή δραστηριότητα ΑΚΤ προσδίδουν ευαισθησία σε θεραπεία mTOR [12] – [15].

PIK3CA

είναι το γονίδιο που κωδικοποιεί το ΡΙ3Κ ρ110 καταλυτική υπομονάδα και μεταλλάξεις (εξόνιο 9 και εξόνιο 20) μπορεί να βρεθεί στο 10-30% των CRC [11], [16], [17].

CRC είναι το τρίτο πιο κοινό είδος καρκίνου, αντιπροσωπεύει σχεδόν το 10% όλων των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται στις ΗΠΑ [18]. Ενώ πρώιμο στάδιο CRC έχει ένα ευνοϊκό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών, το προχωρημένο στάδιο της νόσου με απομακρυσμένες μεταστάσεις έχει ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο το 10%, υποδεικνύοντας την ανάγκη για βελτίωση θεραπευτικά σχήματα για τη μεταστατική CRC (mCRC). Ιρινοτεκάνη (Camptosar®) είναι ένα πρότυπο του χημειοθεραπευτικού παράγοντα που χρησιμοποιείται φροντίδα για τη θεραπεία της mCRC. Υποθέσαμε ότι το everolimus θα ενισχύσει ιρινοτεκάνη θεραπεία λόγω της διαφοροποίησης των δραστών σχετικά με τις οδούς προ-επιβίωσης και με στόχο να αξιολογήσει το συνδυασμό σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού της CRC που φιλοξενεί το δύσκολο για τη θεραπεία ταυτόχρονη

PIK3CA

και

KRAS

ή

BRAF

μεταλλάξεις. Επιπλέον, λόγω των γνωστών μεταβολικών επιδράσεων της αναστολής mTOR μονοπάτι, έχουμε ποσοτικά αξιολόγησε τα μεταβολικά προφίλ των όγκων που έλαβαν θεραπεία με κλινικά σχετικές δόσεις του everolimus και irinotecan με πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό φασματοσκοπία (NMR).

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

η ιρινοτεκάνη για

in vivo

μελέτες ελήφθη από το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Νοσοκομειακής Φαρμακευτικής (Aurora, CO) και SN38 για

in vitro

μελέτες αγοράστηκε από LKT εργαστήρια (St. Paul, MN). Το everolimus παρασχέθηκε ως ένα αιώρημα από τη Novartis. διαλύματα παρακαταθήκης SN38 για

in vitro

πειράματα έγιναν σε DMSO (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Όλα τα άλλα υλικά που χρησιμοποιούνται αγοράστηκαν είτε από την Fisher Scientific ή Sigma (St Louis, ΜΟ) εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Cell Culture

κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου όγκου, HCT8, ΗΤ29, LS180 και HCT116, ήταν αγοράστηκαν από την Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού τύπου, (Manassas, VA), και διατηρήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού (BD Falcon, San Jose, CA) σε RPMI (Gibco) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) και πενικιλλίνη (100 μονάδες /mL) -streptomycin (100 μg /mL? Life Technologies). Τα κύτταρα συνήθως ελέγχονται για mycoplsma χρησιμοποιώντας MycoAlert (Lonza). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Όλα

in vitro

φαρμακευτικές αγωγές έγιναν με τη χρήση του πλήρους μέσου ανάπτυξης.

κυτταροτοξικότητα και Συνδυασμός Επιδράσεις

κυτταροτοξικά αποτελέσματα προσδιορίστηκαν με τη χρήση της σουλφοροδαμίνης Β (SRB) δοκιμασία. Εν συντομία, 5000 βιώσιμα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα πριν από την έκθεση με διαφορετικές συγκεντρώσεις των φαρμάκων. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις everolimus (0-200 ηΜ), SN38 (0-8 ηΜ), και συνδυασμούς των δύο. Μετά από 72 ώρες επωάσεως, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στερεώθηκαν με ψυχρή 10% τριχλωροοξικό οξύ επί 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν με νερό και χρωματίζονται με 0.4% SRB επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι με 1% οξικό οξύ και λεκέ διαλυτοποιήθηκε με 10 mM tris σε θερμοκρασία δωματίου και να διαβάσει σε μια OD 565 nm. Τα αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο του isobolographic Chou και Talalay, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Cambride, UK). Το προκύπτον Δείκτη Συνδυασμού (CI) χρησιμοποιήθηκε ως ποσοτικό μέτρο του βαθμού αλληλεπίδρασης μεταξύ των διαφόρων φαρμάκων. Μια τιμή CI ίση με το 1 δηλώνει προσθετικότητα? CI μεγαλύτερη από 1, ο ανταγωνισμός? CI μικρότερη από 1, συνέργεια.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων 24 ώρες πριν από την αγωγή με κάθε μόνες ή σε συνδυασμό για 24 ώρες φαρμάκου. Τα κύτταρα αποξέστηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης, ΕϋΤΑ, NaF, και ορθοβαναδικού νατρίου. Η συνολική πρωτεΐνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη Pierce 660 nm Protein Assay (Pierce, Rockford, IL). Τριάντα μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης φορτώθηκε σε γέλη κλίση 4-12%, ηλεκτροφορήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη χρησιμοποιώντας το σύστημα iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με Licor Ρυθμιστικό Δέσμευσης (Licor, Lincoln, ΝΕ) πριν από την ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με ένα από τα ακόλουθα αντισώματα: pS6RP, tS6RP, ρΑΚΤ, takt, pERK, Terk, ρ21, PARP , ακτίνη και α-τουμπουλίνης (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000 εκτός από pERK, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στο 1:2000. Μετά την επώαση πρωτογενές αντίσωμα, κηλίδες πλύθηκαν σε TBS-Tween (0,1%), στη συνέχεια επωάστηκαν με το κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα σε 1:15,000 (Licor, Lincoln, ΝΕ) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις επιπλέον πλύσεις, τα στυπώματα αναπτύχθηκαν με χρήση του Licor Οδύσσεια (Licor, Lincoln, ΝΕ).

Ζώα

Θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια, ηλικίας 5 έως 10 εβδομάδων, αγοράστηκαν από την National Cancer Ινστιτούτο. Τα ζώα στεγάστηκαν 3-5 ανά κλωβό σε πολυανθρακικό κλουβιά και διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 h φως. δόθηκε τροφή και νερό

κατά βούληση

. Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) και διεξάγονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, και τα ζώα στεγάστηκαν σε μια εγκατάσταση διαπιστευθεί από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων .

Για τις μελέτες που φέρουν όγκο, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε ένα μείγμα 1:01 του RPMI και Matrigel (BD Bioscience) ελεύθερο ορού. Ένα εκατομμύριο κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε κάθε πίσω πλευρό των ποντικών. Οι όγκοι των όγκων, που μετράται από την ψηφιακή δαγκάνες, υπολογίστηκαν με

V

(mm

3) = μήκος χ (πλάτος)

2 x 0,5236.

Φαρμακοκινητική μελέτη

Μια φαρμακοκινητική μελέτη του everolimus διεξήχθη σε ποντίκια που φέρουν ΗΤ29 όγκους (μέσος όγκος -300 mm

3). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 2.5 ή 10 mg /kg everolimus ημερησίως για 7 ημέρες από του στόματος καθετηριασμό. Τρία ποντίκια ανά επίπεδο δόσης θυσιάστηκαν με καρδιακή ραβδί αφαίμαξη στα 30 λεπτά, 2, 4, 6 και 24 ώρες μετά τη χορήγηση του φαρμάκου την ημέρα 7. πλάσματος και όγκου ιστών καταψύχθηκαν ακαριαία εντός υγρού N

2 και αποθηκεύτηκε στους -70 ° C έως ότου αναλυθεί.

Το everolimus μετρήθηκε στο πλάσμα και όγκους με LC δοκιμασία /MS /MS. Τα αναλυτικά πρότυπα, ο ποιοτικός έλεγχος (QC) και αγνώστων ήταν όλα παρασκευάστηκαν με προσθήκη 200 μΐ άγνωστο ή εμπλουτισμένου κενό πλάσματος ή ομογενοποίημα όγκου (100 mg /ml σε νερό) δείγματα σε ένα σωλήνα 1.5 ml μικροφυγοκέντρου. Τα δείγματα εκχυλίστηκαν με την προσθήκη 1 ml μεθυλο-τριτ-βουτυλαιθέρα (ΜΤΒΕ) ακολουθούμενα από 10 λεπτά αναμείκτη περιδίνησης. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 10 λεπτά και το υπερκείμενο συλλέγεται και 900 μΙ μεταφέρθηκαν σε ένα καθαρό γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα. Δείγματα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού χρησιμοποιώντας περιστροφικό εξατμιστήρα που ακολουθείται από επαναιώρηση σε 100 μΐ 50% ακετονιτρίλιο /50% 10 mM οξικό αμμώνιο και μεταφέρονται σε φιαλίδια αυτόματου δειγματολήπτη για ανάλυση. Τα φάσματα μάζας για εκχυλίζεται δείγματα ελήφθησαν σε 3.200 Q-TRAP φασματόμετρο μάζας τριπλού τετραπόλου MDS Sciex (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) με μία πηγή Turbo Ψεκασμός ιόντος διασυνδέεται με ένα σύστημα Series δυαδική αντλία SL HPLC Agilent 1200 (Santa Clara , CA) .Τα κάτω και άνω όρια ποσοτικού προσδιορισμού για τη δοκιμασία ήταν 1 και 5000 ηΜ, αντίστοιχα. Ορθότητα και η ακρίβεια (% RSD) με βάση την ανάλυση των προτύπων και των δειγμάτων QC για αυτή την ανάλυση ήταν 90,7% και 5,5% για το πλάσμα και το 93,0% και 4,2% για όγκο. Πρόσθετες λεπτομέρειες μπορούν να βρεθούν στο συμπλήρωμα S1 (τμήμα SA.1.).

Θεραπευτικές Μελέτη

Όταν ΗΤ29 και HCT116 όγκοι έφθασαν έναν μέσο όγκο ~325 mm

3 ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες θεραπείας (η = 9-10 ποντικοί ανά ομάδα): (i) οχήματα, (ii) 5 mg /kg everolimus (RAD) από του στόματος καθετηριασμό (ΡΟ) ημερησίως, (iii) 10 mg /kg ιρινοτεκάνη (IRI) μια φορά την εβδομάδα με ενδοφλέβια (IV) ένεση στην φλέβα της ουράς, και (iv) ένα συνδυασμό RAD και IRI. Το everolimus, αραιωμένο σε αποστειρωμένο νερό, και ιρινοτεκάνη, αραιωμένο σε αποστειρωμένο 0.9% φυσιολογικό ορό, χορηγήθηκαν σε 4 mL /kg. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 28 ημέρες. Οι όγκοι νεοπλασίας και τα βάρη σώματος μετρήθηκαν 2-3 φορές την εβδομάδα. Την ημέρα 28 της θεραπείας 3-6 ζώα ανά ομάδα θυσιάστηκαν, περίπου 24 ώρες μετά τη θεραπεία everolimus, και οι όγκοι συλλέχθηκαν για ανάλυση μεταβολομική.

Μεταβολομική NMR-Based

Για μεταβολομική ανάλυση, τα ζώα ήσαν νηστικά για 4 ώρες και στη συνέχεια έλαβαν 250 mg /kg [1-

13C] γλυκόζης (Cambridge Isotopes, Cambridge, ΜΑ) με ένεση IV 60 λεπτά πριν από την συγκομιδή του όγκου. Snap-κατεψυγμένα δείγματα όγκου υποβλήθηκαν σε διαδικασία εκχύλισης οξέος δύο φάσεων (χρησιμοποιώντας 8% υπερχλωρικό οξύ) είχαν καθοριστεί προηγουμένως και εκτενώς δημοσιευθεί [19] – [22]. Περαιτέρω λεπτομέρειες μπορούν επίσης να βρεθούν στο συμπλήρωμα S1 (τμήμα SA.2.).

Ανάλυση Δεδομένων

Το πλάσμα και οι φαρμακοκινητικές παράμετροι του όγκου υπολογίστηκαν από μη διαμερισματική ανάλυση με WinNonlin. δεδομένων everolimus στο πλάσμα ήταν ταιριάζει σε ένα μοντέλο δύο διαμερισμάτων με απορρόφηση πρώτης τάξης και προσομοιώσεις των συγκεντρώσεων στο πλάσμα, σε kg δόση /5 mg everolimus έγιναν από την έκδοση SAAM II 2.1 (Η Epsilon Group, Charlottesville, VA /Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον) .

η μονόδρομη ANOVA αναλύσεις με ένα Tukey post-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημασία μεταξύ πολλαπλών ομάδων. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το Prism έκδοση 4.02.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Όλα τα ποσοτικά σύνολα μεταβολομική δεδομένα που περιλαμβάνονται στην προσαρμοσμένη μεταβολικών ροών αναλυτές και διεπαφές δεδομένων και παρουσιάζονται ως μεταβολικό χάρτες θερμότητας [23].

Τα στοιχεία από την in vivo μελέτη πρότυπο για την αξιολόγηση του θεραπευτικού οφέλους από την προσθήκη του everolimus σε ιρινοτεκάνη. Το μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν παρόμοιο με ένα προηγουμένως δημοσιευθεί μοντέλο για την αξιολόγηση της θεραπείας συνδυασμού [24]. Ορισμένες τροποποιήσεις έγιναν και τα στοιχεία του μοντέλου μπορεί να βρεθεί στο συμπλήρωμα S1 (τμήμα SA.3.) Και Συμπλήρωμα S2. Όλα τα μοντέλα πραγματοποιήθηκε με δεδομένα όγκου του όγκου μεμονωμένων ζώων και διαμορφώθηκε με την έκδοση SAAM II 2.1.

Αποτελέσματα

In Vitro Δραστηριότητα

Τα συνεργιστικά αποτελέσματα του everolimus (RAD) και SN38 αξιολογήθηκαν σε κυτταρικές σειρές CRC, ΗΤ29 (

BRAF

mt?

PIK3CA

mt? p53 mt), HCT116 (

KRAS

mt,

PIK3CA

mt ), HCT8 (

KRAS

mt) και LS180 (

KRAS

mt?

PIK3CA

mt). Για όλες τις

in vitro πειράματα

SN38 χρησιμοποιήθηκε στη θέση της ιρινοτεκάνης αφού SN38 είναι ο ενεργός μεταβολίτης της ιρινοτεκάνης. ΗΤ29 κύτταρα ήταν η πιο ευαίσθητη σε SN38 και everolimus και η προσθήκη του everolimus σε SN38 παρέχεται γενικά ένα έντονα συνεργικό αποτέλεσμα σε ΗΤ29, HCT8 και τα κύτταρα HCT116 με τιμές CI κυμαινόμενες από & lt? 0,1 έως 0,7 (Σχήμα 1). Η προσθήκη του everolimus για τη θεραπεία SN38 στα κύτταρα LS180 ήταν λιγότερο σαφής ως τιμές CI κυμαίνονταν ευρέως 0,3 – 1,4. κηλίδα Western αναλύσεις δείχνουν ότι σε χαμηλές συγκεντρώσεις, everolimus (20 ηΜ) είναι ικανή να αναστείλει ριβοσωματική φωσφο-S6 κινάση (pS6RP) σε όλες τις κυτταρικές σειρές και SN38 (4 ηΜ) προκαλεί αύξηση του ρ21 σε HCT116 και HCT8 κύτταρα (Σχήμα 2) . Δεν p21 ήταν μετρήσιμη σε κύτταρα ΗΤ29 σε δόσεις του everolimus και ιρινοτεκάνη μεταχειρισμένα. Μια μικρή ποσότητα του διασπασμένου PARP (MW 89) παρατηρήθηκε σε SN38 αγωγή HCT8 κύτταρα, αλλά όχι σε ΗΤ29 ή HCT116.

Οι συνδυαστικές αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν σε ΗΤ29, HCT116, HCT8 και κύτταρα LS180 να εκτιμήσει δυναμικό προσθετική ή συνεργιστική αλληλεπίδραση. Η αναστολή της ανάπτυξης μετρήθηκε με τη δοκιμασία sulforhodmine Β (SRB) μετά από 72 ώρες επωάσεως με SN38 (0, 2, 4 ή 8 ηΜ) και RAD (0, 2, 20 ή 200 ηΜ – υποδεικνύεται από τα triangels κάτω από τις γραφικές παραστάσεις). Τα στοιχεία για τις γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση τουλάχιστον 3 ξεχωριστά πειράματα. Ο δείκτης συνδυασμού (CI) τιμές υπολογίστηκαν για για όλους τους συνδυασμούς και οι τιμές ± την τυπική απόκλιση παρουσιάζονται στους πίνακες που ακολουθούν χρωματιστό κάθε γράφημα .. Το CV% για τις επαναλήψεις κυμαίνονταν από 5-40% και κατά μέσο όρο ~ 20%, ως εκ τούτου, εμείς καθορίζεται ότι η CI τιμές & gt? 1.2 θεωρούνται ανταγωνιστικές, 1.2 & gt? CI & gt? 0,8 είναι προσθετικές, και CI & lt? 0,8 είναι συνεργιστική. Σημειώστε ότι SN38 χρησιμοποιείται σε

in vitro δοκιμασίες

αντί της ιρινοτεκάνης, δεδομένου ότι είναι ο ενεργός μεταβολίτης.

Η

Akt, ρ-Akt, PARP, διασπασμένη PARP, συνολικός ριβοσωμική S6 κινάση ( S6), ριβοσωμικό φωσφο-S6 κινάση (PS6), ΕΚΚ, ρ-ERK, ρ21 και α-τουμπουλίνης μετρήθηκαν σε όλες τις γραμμές μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με RAD (20 ηΜ), SN38 (4 ηΜ) ή του συνδυασμού του δύο. Τα μοριακά βάρη που παρουσιάζονται δίπλα στο όνομα της πρωτεΐνης σε παρένθεση. Σημειώστε ότι SN38 χρησιμοποιείται σε

in vitro

δοκιμασίες αντί ιρινοτεκάνη, δεδομένου ότι είναι ο ενεργός μεταβολίτης.

Η

Φαρμακοκινητικές-κατευθυνόμενη δοσολογία του Everolimus και ιρινοτεκάνη

Για

in vivo

μελέτες, ιδρύσαμε δόσεις του everolimus και ιρινοτεκάνη για χορήγηση σε ποντίκια που θα δώσουν τα ανοίγματα στο ή κάτω από κλινικά εφικτά επίπεδα. Ανθρώπινα φαρμακοκινητικές πληροφορίες σχετικά με το everolimus [25], [26] και ιρινοτεκάνη /SN38 [27] – [30]. Συγκεντρώθηκαν από τη βιβλιογραφία και παρουσιάζονται στους Πίνακες 1 και 2 αντίστοιχα

Η

Για να προσδιοριστεί η κατάλληλη δόση του everolimus σε ποντίκια, πραγματοποιήσαμε μια φαρμακοκινητική μελέτη του everolimus σε ΗΤ29 ποντίκια που φέρουν όγκο. Τα σταθερής κατάστασης προφίλ πλάσματος και του όγκου συγκέντρωσης-χρόνου παρουσιάζονται στο συμπλήρωμα S3 Σχήματα SC.2. Α & amp? Β και μη διαμερισματικής φαρμακοκινητικές παραμέτρους που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και τον Πίνακα Γ.1 σε συμπλήρωμα S3. Τα δεδομένα έδειξαν ότι μια δόση των 10 mg /kg σε ποντίκια οδηγεί σε σταθερή κατάσταση έκθεσης ελεύθερα στο πλάσμα (AUC

ss, δωρεάν = 116 ng * hr /mL) η οποία είναι στην περιοχή από αυτή που παρατηρείται σε ανθρώπους σε κλινικά χρησιμοποιούμενων δόσεων από 5 έως 10 mg /kg ανά ημέρα (AUC

ss, δωρεάν = 60-178 ng * hr /mL). τιμές δέσμευσης πρωτεΐνης πλάσματος κατά 99% και 75% χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό δωρεάν συγκεντρώσεις στο πλάσμα σε ποντικούς και ανθρώπους αντίστοιχα [31], [32]. Ωστόσο, για τις in vivo μελέτες αποτελεσματικότητας, έχουμε επιλέξει να χρησιμοποιήσει μία δόση των 5 mg /kg (AUC

ss, δωρεάν = 37 ng * h /mL) είναι προσεκτικοί για την επίτευξη πολύ δραστηριότητα και μόνο παράγοντα, η οποία θα μπορούσε να το κάνει δύσκολο να εκτιμηθούν οι επιπτώσεις συνδυασμού. Προηγούμενες μελέτες του everolimus σε ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου HCT116 αποδειχθεί δραστηριότητα μοναδικός παράγοντας (45-55% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου) του everolimus σε 10-12 mg /kg [33], [34].

Σε δεδομένα vivo

SN38 αξιολογήθηκε να καθορίσει τη δόση της ιρινοτεκάνης που θα χρησιμοποιηθούν, δεδομένου ότι είναι ο ενεργός μεταβολίτης της ιρινοτεκάνης και καρβοξυλεστεράση μετατροπή της ιρινοτεκάνης για SN38 κυμαίνεται μεταξύ ποντικών και ανθρώπων. Με βάση τα δεδομένα του ανθρώπου και των φαρμακοκινητικών ποντικού που συγκεντρώθηκαν από τα δεδομένα της βιβλιογραφίας [27] – [30], [35] – [40], επιλέξαμε μια δόση των 10 mg /kg της ιρινοτεκάνης να χορηγείται ενδοφλεβίως μία φορά την εβδομάδα (Πίνακας 2). Μια δόση /kg iv 10 mg ήταν εκτίμηση για να δώσει μια ελεύθερη έκθεση του SN38 στην περιοχή από αυτή που παρατηρήθηκε σε ανθρώπους (ποντίκια: AUC

ελεύθερη = 7,5 έως 25,8 ng * hr /mL? Ανθρώπους: AUC

ελεύθερη = 4,4 – 18,6 ng * hr /mL για δόσεις που κυμαίνονται 125 έως 350 mg /m

2). τιμές δεσμευτικές πρωτεΐνες του πλάσματος SN38 από 96,6 έως 98,6% για τα ποντίκια και 98% για τον άνθρωπο χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό ελεύθερο κλάσμα από τις συνολικές συγκεντρώσεις του [37].

ξενομοσχεύματος όγκου Response to Το everolimus και ιρινοτεκάνη Θεραπεία

Η αποτελεσματικότητα του everolimus, ιρινοτεκάνη και συνδυασμός των δύο προσδιορίστηκε σε ΗΤ29 και HCT116 όγκων ξενομοσχευμάτων. Το Σχήμα 3Α δείχνει τα προφίλ ανάπτυξης του όγκου όλων των ομάδων θεραπείας για τους δύο τύπους όγκων. Το everolimus προκάλεσε παρόμοια και στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,05 vs. ομάδα ελέγχου) αναστολή της ανάπτυξης τόσο ΗΤ29 (μέση αναστολή ανάπτυξης όγκου, TGI = 40%) και HCT116 (μέσος TGI = 44%) των όγκων, ενώ η ιρινοτεκάνη προκάλεσε σημαντική αναστολή ανάπτυξης σε μόνο ΗΤ29 όγκους (μέσος όρος TGI = 39%? p & lt? 0,05). Η προσθήκη του everolimus στο irinotecan μείωσε σημαντικά τον όγκο των ΗΤ29 (μέσος TGI = 64%) και HCT116 (μέσος TGI = 61%) ξενομοσχεύματα όγκου (Ρ & lt? 0,05 έναντι μάρτυρα).

(Α) ΗΤ29 και HCT116 όγκου καμπύλες ανάπτυξης ξενομόσχευμα. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 28 ημέρες με οχήματα, RAD, IRI, ή το συνδυασμό της RAD + IRI. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± SEM 9-12 όγκων ανά ομάδα.

* P & lt? 0,05 έναντι του οχήματος. (Β) Φαρμακοκινητικές-φαρμακοδυναμικής μοντελοποίησης διεξήχθη επί να εκτιμηθεί ποσοτικά η ένταση του συνδυασμού RAD + IRI σε ΗΤ29 και HCT116 όγκων ξενομοσχευμάτων. Αυτή είναι μια γραφική αναπαράσταση του όρου αλληλεπίδρασης (ψ) για το συνδυασμό RAD + IRI. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει την τιμή ψ για ένα μεμονωμένο όγκο. ψ τιμές & gt? 1.3 είναι συνεργιστική, 1.3 & gt? ψ & gt? 0.7 είναι πρόσθετο, 0.7 & gt? ψ & gt? 0 είναι λιγότερο από ό, τι πρόσθετο, και ψ & lt? 0 είναι ανταγωνιστικά

Η

Μοντελοποίηση των προφίλ ανάπτυξης του όγκου και την επίδραση της θεραπείας αποκάλυψε ότι ο συνδυασμός του everolimus και ιρινοτεκάνη ήταν κατά μέσο όρο πρόσθετο (μέσος όρος ψ =. 0.9) σε όγκους ΗΤ29 (Σχήμα 3Β). Κάθε όγκος διαμορφώθηκε μεμονωμένα και από τα 10 ΗΤ29 όγκους, 1 έδειξε μια συνεργιστική απόκριση, 8 παρουσίασαν απόκριση προσθέτου και 1 ήταν λιγότερο από προσθετικό, αλλά όχι ανταγωνιστική. ψ αντιπροσωπεύει τον όρο που χρησιμοποιείται στο μαθηματικό μοντέλο για να περιγράψει τη συνδυαστική επίδραση, όπου ψ & gt? 1.3 είναι συνεργιστική? 1.3 & gt? ψ & gt? 0.7 αντιπροσωπεύει μια αλληλεπίδραση πρόσθετο, 0.7 & gt? ψ & gt? 0 είναι λιγότερο από προσθετικό αποτέλεσμα και ψ & lt? 0 είναι ανταγωνιστική. Λεπτομέρειες για την μοντελοποίηση και ατομικών δεδομένων όγκου και κρίσεις μπορούν να βρεθούν στο συμπλήρωμα S1, τμήμα SA.3., Και Συμπλήρωμα S2. Τα προφίλ ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων HCT116 ήταν πολύ πιο μεταβλητή από τους όγκους ΗΤ29. Ως εκ τούτου, αν και η μέση αναστολή της ανάπτυξης του όγκου της θεραπείας συνδυασμού φαίνεται παρόμοια στις δύο τύπους όγκου (TGI = 64% έναντι 61%), σε HCT116 όγκων το όφελος ήταν κατά μέσο όρο λιγότερο από προσθετικό (μέσος όρος ψ = 0.5). Και πάλι, κάθε προφίλ ανάπτυξης όγκου διαμορφώθηκε μεμονωμένα και 3 όγκων έδειξαν μία πρόσθετη επίδραση, 5 ήταν λιγότερο από προσθετικό και 2 ήταν ανταγωνιστική.

μετρήθηκαν Τα αποτελέσματα του everolimus, ιρινοτεκάνη και ο συνδυασμός των δύο επί του μεταβολισμού του όγκου σε ένα υποσύνολο των ζώων στο τέλος της μελέτης. Μεταβολικό προφίλ προσδιορίστηκαν από

1 Η-,

13C- και

31P- NMR. Το Σχήμα 4 δείχνει μεταβολική θερμότητα χάρτες που απεικονίζουν μεταβολικές αλλαγές μεταξύ των ομάδων θεραπείας σε σχέση με την ομάδα ελέγχου σε ΗΤ29 και HCT116 ξενομοσχεύματα. Οι επιδράσεις του everolimus στο μεταβολισμό της γλυκόζης, η μείωση στο γαλακτικό και γλυκόλυση, ήταν παρόμοιες σε ΗΤ29 όγκους και HCT116, συνεπής με την απόκριση της ανάπτυξης του όγκου που παρατηρήθηκε στους δύο τύπους όγκων. όγκοι ΗΤ29 εμφάνισαν πιο έντονη απόκριση σε θεραπεία με ιρινοτεκάνη, η οποία είναι ως επί το πλείστον σχετίζεται με τη συσσώρευση λιπιδίων, ειδικά πολυ-ακόρεστα και φωσφολιπίδια, τα οποία μπορεί να σχετίζονται με αυξημένη κυτταρική αποδόμηση και νέκρωση. Και πάλι, αυτό είναι συνεπές με τα προφίλ ανάπτυξης όγκου των ΗΤ29 και όγκων HCT116 η οποία έδειξε ότι οι όγκοι ΗΤ29 ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία με ιρινοτεκάνη ενώ οι όγκοι HCT116 δεν το έκανε. Ο συνδυασμός του everolimus με ιρινοτεκάνη συσχετίστηκε με αυξημένη συσσώρευση λιπιδίων, η υποβάθμιση της μεμβράνης (αυξημένη GPC και μειωμένη PC /GPC) και σε κάποιο βαθμό μειωμένη γλυκόλυση σε όγκους ΗΤ29. Η ίδια απόκριση δεν παρατηρήθηκε σε όγκους HCT116, παρά τη μέση αναστολή της ανάπτυξης του όγκου της θεραπείας συνδυασμού αποδίδοντας περίπου το ίδιο αποτέλεσμα. Συνολικά, ΗΤ29 όγκους ήταν πιο μεταβολικά ανταποκρίνεται σε όλες τις θεραπείες από όγκους HCT116.

1 Η-,

13C-, και τα στοιχεία

31Ρ-NMR παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM 3- 6 μετρήσεις. Οι μεταβολίτες, οι αναλογίες τους και μεταβολικές ροές ομαδοποιήθηκαν με βάση την βιοχημική ενδιαφέρον τους. Για την ομάδα ελέγχου, όλα τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του μεταβολίτη δίνεται ως μπιοί ανά γραμμάριο υγρού βάρους κυττάρων και αναλογίες μεταβολίτη είναι αδιάστατη. Οι μεταβολικές οδοί που διαταράσσεται από την επεξεργασία παρουσιάζονται ως κίτρινο χάρτες. Μια μείωση στην μεταβολική τελικό σημείο υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα, ενώ μια αύξηση κατά πράσινες κηλίδες. Η στατιστική σημαντικότητα για τις αλλαγές μεταβολίτη βασίζονται σε πολυπαραγοντική ανάλυση των μεταβολικών ροών με p & lt? 0,02. Το διαδραστικό μεταβολικό βάση δεδομένων συστοιχία προφίλ ήταν προσαρμοσμένη βάση [23].

Η

Συζήτηση

Η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων και θεραπευτικών στρατηγικών απαιτεί τη χρήση των προκλινικών μοντέλων. Συχνά, η εντυπωσιακή προκλινική δραστηριότητα των πολλά υποσχόμενων νέων παραγόντων και συνδυασμούς παραγόντων δεν μεταφράζεται σε βιώσιμες κλινικές θεραπείες. Ορθολογικό σχεδιασμό της μελέτης με ποσοτικές παραμέτρους είναι κρίσιμη για την αποτελεσματική μετάφραση των στρατηγικών συνδυασμού και βιολογικών δεικτών της αποτελεσματικότητας [6], [41]. Ο γενικός στόχος της μελέτης που περιγράφεται στο παρόν ήταν να καθοριστεί ποσοτικά η συνδυαστική επίδραση του everolimus και ιρινοτεκάνη θεραπεία σε μοντέλα ποντικών CRC, υπόθαλψη δύσκολο να αντιμετωπιστεί γονότυπους, χρησιμοποιώντας φαρμακοκινητικές καθοδηγούμενη δοσολογικά σχήματα. Με βάση την ανθρώπινη και ποντικού φαρμακοκινητικές πληροφορίες, ιδρύσαμε δόσεις του everolimus και ιρινοτεκάνη να χρησιμοποιηθεί σε προκλινικές

in vivo μελέτες που

αποδώσει εκθέσεις στην περιοχή από εκείνες που παρατηρήθηκαν σε ανθρώπους. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι έχουμε διορθωμένο συνολικές συγκεντρώσεις για τις ελεύθερες ή μη συνδεδεμένα κλάσματα όταν γίνονται συγκρίσεις των φαρμακοκινητικών δεδομένων μεταξύ ποντικών και ανθρώπων. Αυτό είναι κρίσιμης σημασίας, δεδομένου ότι η δεσμευτική συχνά τις πρωτεΐνες του πλάσματος ποικίλλει μεταξύ των ειδών και στη θεωρία μόνο το αδέσμευτο κλάσμα του φαρμάκου είναι διαθέσιμη για αλληλεπίδραση με τον στόχο ενδιαφέροντος.

Δοκιμάσαμε το everolimus και ιρινοτεκάνη συνδυασμό

in vivo

σε δύο μοντέλα κυτταρική σειρά ξενομοσχεύματος του CRC, ΗΤ29 και HCT116. Ο συνδυασμός ήταν καλά ανεκτή και σημαντικές αλλαγές σωματικού βάρους δεν παρατηρήθηκαν (συμπλήρωμα S3 Εικόνα SC.2.). Αξιολόγηση της τέλος των δεδομένων όγκου μελέτης από κάθε είδος όγκου δείχνει ότι η θεραπεία με everolimus και ιρινοτεκάνη οδηγούν σε στατιστικά σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και ο βαθμός της απόκρισης φαίνεται παρόμοια στους δύο τύπους. Ωστόσο, εδώ θα δείξουμε ότι μέσω της αξιολόγησης του προφίλ ανάπτυξης του κάθε όγκου, ο όγκος ως συνάρτηση του χρόνου, είμαστε σε θέση να διευκρινίσει διαφορές στην ανάπτυξη και την αντίδραση μεταξύ των δύο τύπων όγκου. Μέσω μαθηματικών μοντέλων του ελέγχου, μόνο τα χέρια πράκτορα και ο συνδυασμός της μελέτης ήμασταν σε θέση να εκτιμηθεί ποσοτικά η αλληλεπίδραση των δύο ενώσεων και βρήκαν ότι στους όγκους ΗΤ29,

BRAF

και

PIK3CA

μεταλλαγμένα, ο συνδυασμός ήταν πρόσθετης ύλης και σε όγκους HCT116,

KRAS

και

PIK3CA

μεταλλαγμένα, ο συνδυασμός ήταν αρκετά μεταβλητή, αλλά λιγότερο από το πρόσθετο μέσο όρο. Εκτός από την αξιολόγηση της ανάπτυξης του όγκου θα αξιολογείται ποσοτικά τα αποτελέσματα των θεραπειών στο μεταβολισμό του όγκου χρησιμοποιώντας μεταβολισμική NMR-based.

Μεταβολικά, ΗΤ29 ξενομοσχεύματα ήταν πιο ευαίσθητα από τα ξενομοσχεύματα HCT116. ΗΤ29 όγκους, αλλά όχι των όγκων HCT116, στην ιρινοτεκάνη ομάδα εμφανίζεται μία τυπική μεταβολική υπογραφή για κυτταροτοξική θεραπεία, συσσώρευση λιπιδίων και φωσφολιπιδίων, μια ένδειξη κυτταροτοξικότητας /νέκρωση [42]. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τα προφίλ ανάπτυξης όγκου, το οποίο δείχνει ΗΤ29 όγκους ανταποκρίνονται σε θεραπεία με ιρινοτεκάνη (TGI = 39%, ρ & lt? 0,05), αλλά όχι των όγκων HCT116 (TGI = 17%). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν επίσης με τις

in vitro

στοιχεία, τα οποία δείχνουν ΗΤ29 κύτταρα (IC50 = 3 nM) είναι πιο ευαίσθητα από τα κύτταρα HCT116 (IC50 & gt? 300 nM) στη θεραπεία SN38. Σύμφωνα με προσομοιώσεις μας (Συμπλήρωμα S2), τα ελεύθερα συγκεντρώσεις του SN38 στο πλάσμα κυμαίνονταν από 1300 έως 7.25e-4 ηΜ σε μία περίοδο 24 ωρών με μέση συγκέντρωση 4-18 ηΜ, η οποία είναι αρκετά κάτω από το κατ ‘εκτίμηση IC50 για HCT116 κύτταρα. Παρά την ομοιότητα σε όγκο προφίλ αναστολή της ανάπτυξης του everolimus αγωγή ΗΤ29 όγκους και όγκους HCT116 (TGI = 41% έναντι 44%, αντίστοιχα), ΗΤ29 όγκους εμφανίστηκε ελαφρώς περισσότερο μεταβολικά ανταπόκριση από όγκους HCT116. Μερικά μείωση της γλυκόλυσης μετρήθηκε σε δύο ΗΤ29 και HCT116 όγκους, αλλά η αύξηση της GPC και κάποια συσσώρευση λιπιδίων παρατηρήθηκε επίσης σε όγκους ΗΤ29. In vitro, ΗΤ29 κύτταρα ανταποκρίνονται περισσότερο στη θεραπεία everolimus από κύτταρα HCT116, όπως η IC50 για τον πολλαπλασιασμό ήταν μικρότερη (1,2 ηΜ έναντι 25 ηΜ) και μεγαλύτερη αναστολή ρ-S6RP παρατηρήθηκε στα 20 ηΜ.

In vivo,

παρόμοιες απαντήσεις σε αναστολή της π-S6RP και κυκλίνη D1 παρατηρήθηκαν σε ΗΤ29 και των όγκων HCT116 (συμπλήρωμα S3 Εικόνα SC3 και SC4)? Ωστόσο, τα μέτρα της π-S6RP δεν μπορεί να είναι ένα χρήσιμο μέτρο για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας. Μια προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία everolimus σε αμφότερες τις ευαίσθητες και ανθεκτικές γραμμές μπορεί να οδηγήσει σε συνολική αποφωσφορυλίωση S6K1 και S6 [33].

εικάζουν ότι μερικές από την αποτελεσματικότητα του everolimus παρατηρήθηκε σε όγκους HCT116 μπορεί να σχετίζεται με αντιαγγειογόνο δράση του everolimus. Αντιαγγειογόνο δράση του everolimus έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [33], [43] και έχει αντιαγγειογενετικές επιπτώσεις θα είναι πολύ πιο δύσκολο να ανιχνευθεί με ολόκληρο μεταβολισμική όγκου, όπως εκτελείται εδώ, αφού το κλάσμα των ενδοθηλιακών κυττάρων σε σύγκριση με συνολικό ιστό του όγκου είναι αρκετά μικρό. Περαιτέρω απόδειξη για να υποστηρίξει αυτό μπορεί να προέρχεται από everolimus φαρμακοκινητικά δεδομένα. Οι ελεύθερες συγκεντρώσεις πλάσματος που παράγεται στη δόση 5 mg /kg σε ζώα μας κυμαίνονταν από 0,2 έως 6 ηΜ (C

min έως C

max) με μέσο ελεύθερο συγκέντρωση (C

ss, avg) περίπου 1.5 ηΜ, η οποία θα ήταν αρκετή για να αναστείλει την ανάπτυξη ΗΤ29, αλλά όχι HCT116 και, προηγούμενα δεδομένα αναφέρουν ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα του everolimus έναντι VEGF και bFGF διεγερμένα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) με τιμές IC50 από 0.1-0.8 ηΜ [33].