Αφηρημένο

Ο καρκίνος του ήπατος είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο. Η βαθύτερη μηχανιστική κατανόηση του καρκίνου του ήπατος μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών. Σε προηγούμενη εργασία μας, προβλήθηκε 646 miRNAs και εντόπισε 11 που ρυθμίζουν το ήπαρ μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Η τρέχουσα μελέτη δείχνει ότι miR-525-3p είναι συχνά επάνω ρυθμισμένη σε ιστούς καρκίνου του ήπατος, και αυξημένη έκφραση του miR-525-3p μπορεί να προάγει τη μετανάστευση κυττάρων του καρκίνου του ήπατος και εισβολή. Ψευδάργυρος πρωτεΐνη δακτύλου 395 (ZNF395) είναι το άμεσο λειτουργικό γονίδιο στόχος για miR-525-3p, και είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε ιστούς καρκίνου του ήπατος. Υψηλή έκφραση του ZNF395 μπορούν να αναστείλουν σημαντικά ενώ knockdown της έκφρασης ZNF395 μπορεί να ενισχύσει σημαντικά την μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του ήπατος, υποδηλώνοντας ότι ZNF395 καταστέλλει τη μετάσταση σε καρκίνο του ήπατος. Κάτω ρύθμιση των ZNF395 μπορεί να μεσολαβήσει miR-525-3p που προκαλείται από τη μετανάστευση καρκίνο του ήπατος κυττάρων και εισβολή. Εν κατακλείδι, miR-525-3p προωθεί τη μετανάστευση του ήπατος των καρκινικών κυττάρων και εισβολή από απ ‘ευθείας στόχευση ZNF395, και το γεγονός ότι το miR-525-3p και ZNF395 δύο παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του ήπατος καθιστά πιθανούς θεραπευτικούς στόχους.

Παράθεση: Pang F, Zha R, Zhao Υ, Wang Q, Chen D, Zhang Ζ, et al. (2014) MiR-525-3p Ενισχύει τη Μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικά κύτταρα ήπατος από ρύθμιση προς τα κάτω ZNF395. PLoS ONE 9 (3): e90867. doi: 10.1371 /journal.pone.0090867

Επιμέλεια: Χονγκ Wanjin, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Biopolis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16, Αυγούστου, 2013? Δεκτές: 7 Φεβ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2014

Copyright: © 2014 Pang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από την Εθνική 973 Βασικά πρόγραμμα βασικής έρευνας (2013CB910504), Σαγκάη Γραφείο Υγείας (XYQ2011047, XBR2011039) και το έργο μέλους Κλειδί για καρκίνο του ήπατος (2012ZX10002-009013). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι μεταστάσεις είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1], [2]. Συστηματική μελέτη των μοριακών μηχανισμών της μετάστασης του καρκίνου του ήπατος είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών. μετάσταση όγκου είναι μια πολλών σταδίων σύνθετη διαδικασία στην οποία τα καρκινικά κύτταρα κινούνται στους περιβάλλοντες ιστούς ή μακρινό μετά το σπάσιμο μακριά από τον πρωτογενή όγκο. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει διέλευση κυττάρων όγκου μέσω της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) και της βασικής μεμβράνης του τοπικού αιμοφόρου αγγείου [3], [4], [5], [6], [7], που ακολουθείται από την κίνηση μέσα στο μικροπεριβάλλον ξενιστή [ ,,,0],8], [9], [10]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι εκτός από γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, μη-κωδικοποίησης RNAs όπως miRNAs παίζουν επίσης σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην διαδικασία της μετάστασης [11], [12], [13], [14], [15], [ ,,,0],16]. miRNAs είναι μονόκλωνα μικρό μη-κωδικοποίησης RNAs, και οι αλληλουχίες τους είναι πολύ συντηρημένες σε ευκαρυωτικό [17]. miRNAs ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο με σύνδεση προς στόχευση του mRNA [18], [19], [20], και έτσι να συμμετέχουν σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες [21], [22]. Meng et al [23] για πρώτη φορά ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση του miR-21 μπορεί να μεσολαβήσει καρκίνο του ήπατος εισβολή των κυττάρων με την άμεση στόχευση PTEN. Πρόσφατα, miR-151 και miR-30d έχουν βρεθεί να βρίσκεται στην γονιδιωματική εύθραυστες περιοχές και συνδέονται με τη μετάσταση καρκίνου [24], [25]. Υποξία-επαγόμενη έκφραση του miR-210 ρυθμίζει VMP1 μεσολάβηση υποξία που προκαλείται από ηπατική μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [26].

Για την ανίχνευση miRNAs που εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου του ήπατος, σε προηγούμενη μελέτη, εξετάστηκαν 646 miRNAs χρησιμοποιώντας την επούλωση των πληγών δοκιμασία με το σύστημα απεικόνισης ζωντανό κύτταρο, και 11 miRNAs βρέθηκαν να ρυθμίζουν αποτελεσματικά την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του ήπατος [27]. Σε μια προηγούμενη αναφορά [28], εντοπίσαμε κάποιες περιοχές αντίγραφο παραλλαγή αριθμός στο γονιδιωματικό DNA των 58 ζευγών ήπατος καρκινικών ιστών χρησιμοποιώντας ένα Array SNP 6.0. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι miR-525-3p γονίδιο βρίσκεται σε ένα αριθμό αντιγράφων ενισχυμένης περιοχής και θα μπορούσε να διευκολύνει τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος στην δοκιμασία transwell. Επιπλέον, miR-525-3p είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω στο ήπαρ καρκινικούς ιστούς και ρυθμίζει ήπατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της ZNF395. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το miR-525-3p και ZNF395 αντιπροσωπεύουν πιθανοί στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινο Ήπαρ όγκου δείγματα /Ηθική Δήλωση

Ανθρώπινο καρκίνο του ήπατος και δίπλα nontumorous ιστοί ελήφθησαν από τα χειρουργικά αρχεία υπόδειγμα του Qidong ήπατος Ινστιτούτο Καρκίνου, επαρχία Jiangsu, Κίνα. Όλα αυτά τα δείγματα ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση, και τα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Αναθεώρηση του συνεργαζόμενου με την ΠΟΥ Κέντρο Έρευνας στην Ανθρώπινη παραγωγής που έχει εγκριθεί από την Σαγκάη Δημοτική κυβέρνηση. Τα συγκεκριμένα δείγματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη έχουν περιγραφεί σε προηγούμενη δημοσίευση [29].

Cell Culture

ΗΕΚ-293Τ, NCI-Η1299, BxPC-3, PANC-1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, SK-HEP-1, MCF7, Α549, ΝΟΙ-Η460, Tera-1 και Tera-2 αγοράσθηκαν από την ATCC? ΗυΗ- 7 αγοράστηκε από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB), SMMC-7721 και BEL-7402 αγοράστηκαν από την τυπική καλλιέργεια τράπεζα κυττάρων διατήρηση Επιτροπή, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (ΕθνΚΤ)? MHCC-97L και ΠΝ 3 ήταν δώρα από την Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan (Σαγκάη, Κίνα)? SMMC-7721, BEL-7402, MHCC-97L και ΠΝ 3 που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσίευση [24], [30], [31], [32].

ΗΕΚ-293Τ, NCI -H1299, BxPC3, PANC1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, ΗυΗ- 7, HepG2, SK-HEP-1, SMMC-7721, 97L, LM3, BEL-7402 και MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Α549 και ΝΟΙ-Η460 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Tera1 και Tera2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 15% FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν με την παρουσία αντιβιοτικών στους 37 ° C με 2.

RNA Εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ 5% CO

(Invitrogen). cDNA συντέθηκε με το κιτ αντιδραστηρίου Prime-Script RT (Takara). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR πρόμιγμα Ex Taq (Takara). Ώριμη miRNAs ήταν αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας δοκιμασίες TaqMan miRNA (Applied Biosystems). Οι ανιχνευτές και εκκινητές που χρησιμοποιούνται για miRNA και ανίχνευση mRNA που παρατίθενται στον Πίνακα S1 και S2.

Το πλασμίδιο Vector Κατασκευάσματα

Η πρωτογενής αλληλουχία miR-525 ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό DNA των φυσιολογικών ιστών και συνδέθηκε σε ένα φορέα PGIPZ (Open Biosystem). Η αλληλουχία ZNF395 ORF ενισχύθηκε από τον φορέα ZNF395 (FulenGen) και συνδέθηκε στο φορέα pWPXL (ένα δώρο από τον καθηγητή Didier Trono). Η ZNF395 3’UTR ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό DNA των κυττάρων HK-293Τ και υποκλωνοποιήθηκε άμεσα κατάντη του κωδικονίου τερματισμού του γονιδίου της λουσιφεράσης στον φορέα αναφοράς λουσιφεράσης. Μεταλλαγμένα 3’UTR ελήφθη από το κλωνοποιημένο ZNF395 3’UTR χρησιμοποιώντας το κιτ μεταλλαξογένεσης αστραπή QuikChange τοποκατευθυνόμενη (Agilent). Τόσο η άγριου τύπου και μεταλλαγμένων 3’UTR οι αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας (Invitrogen). Οι αλληλουχίες των εκκινητών αναφέρονται στον Πίνακα S3.

Lentivirus Παραγωγής και κυττάρων Μεταγωγή

Το πλασμίδιο psPAX2 συσκευασία και το πλασμίδιο φάκελο pMD2.G ήταν δώρα του καθηγητή Didier Trono. Είτε ο φορέας pGIPZ-miR-525 ή pWPXL-ZNF395 συνεπιμολύνθηκε με psPAX2 και pMD2.G σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Οι ιοί συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και προσδιορίστηκαν οι ιικοί τίτλοι. SK-HEP-1 και SMMC-7721 κύτταρα μολύνθηκαν με 1 χ 10

6 ανασυνδυασμένο φακοϊό μονάδες μεταγωγής με την παρουσία 6 μg /mL πολυβρένιο (Sigma, ΜΟ). SMMC-7721-525, SK-HEP-1-525 και SK-HEP-1-ZNF395 είναι ομάδες σταθερών κυττάρων, τα οποία έχουν μολυνθεί με τη χρήση φακοϊού με GFP, σταθερές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε δοκιμασίες με & gt?. 95% πράσινο φθορισμό

Oligonucleotide Επιμόλυνση

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, 100 pmol του miRNA μιμούνται (Genepharma), αναστολέα (Ribobio) ή siRNA διαμολύνθηκε χρησιμοποιώντας 5 μL λιποφεκταμίνης αντιδραστήριο RNAiMax (Invitrogen). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα για δοκιμασίες transwell ή προσδιορισμούς αναφοράς λουσιφεράσης. Οι αλληλουχίες siRNA παρέχονται στον Πίνακα S4.

την επιμόλυνση απόδοση ανίχνευσης

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων χρησιμοποιώντας 100 pmol siRNA με FAM (Genepharma) και αντιδραστήριο RNAiMax (Invitrogen), μετά 20-24 ώρες, αποτελεσματικότητα μεταμόλυνσης ανιχνεύθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (FCM).

Δοκιμασίες Κυτταρικού πολλαπλασιασμού

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε από την μέτρηση κυττάρων Kit-8 κιτ δοκιμασίας (CCK-8 Dojindo Corp ). 1 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα κάθε φρεάτιο 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν με 90 μι μέσου, προστέθηκε σε κάθε 10 μL CCK-8 καλά. Μετά επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες, η απορρόφηση ανιχνεύθηκε στα 450 nm, και η τιμή OD 450 συσχετίζεται με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων.

Μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων : 5 × 10

4 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ μέσου DMEM άνευ ορού και εμβολιάζονται μέσα στον άνω θάλαμο του κάθε ενθέματος. Στη συνέχεια, 800 μι ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS προστέθηκε σε πλάκα 24 φρεατίων. Μετά από επώαση στους 37 ° C (SK-HEP-1:6-8 h? SMMC-7721:12-16 h), τα κύτταρα που μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν και βάφτηκαν για 30 λεπτά σε ένα διάλυμα βαφής που περιέχει 0.2% ιώδες κρύσταλλο και 20 % μεθανόλη. δοκιμασία εισβολή κυττάρων: Οι θάλαμοι καλύπτεται ομοιόμορφα με 40-80 μι Matrigel (BD Biosciences) αραιωμένο με DMEM σε ένα ορισμένο ποσοστό και επωάστηκαν στους 37 ° C για 2-4 ώρες. Στη συνέχεια, 1 × 10

5 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 200 μL DMEM και εμβολιάστηκαν σε άνω θαλάμους, και 800 μι ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από επώαση στους 37 ° C (SK-HEP-1 από 14-16 ώρες? SMMC-7721 16-18 h), τα κύτταρα καθηλώθηκαν και χρωματίστηκαν

Luciferase Assay Reporter

ΗΕΚ293Τ κύτταρα. καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 50 ng pLuc-3’UTR, 10 ng πλασμιδίου λουσιφεράσης Renilla και 5 pmol miR-525-3p μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα. Μετά από 48 ώρες επώαση, η δραστικότητα της λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε με τη χρήση του συστήματος διπλής λουσιφεράσης δοκιμασία ανταποκριτή (Promega).

Western Blot Δοκιμασία

Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε ένα μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad), αποκλείστηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει Tween-20 και 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα και επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα ZNF395 (Santa Cruz) (1:1000) ή β-ακτίνης (Sigma) ( 1:10000). Το σύμπλοκο αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Pierce).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student (δίπλευρη, σ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική).

Αποτελέσματα

υψηλή έκφραση του miR-525-3p Ενισχύει τη Μετανάστευση και την εισβολή των ηπατικά κύτταρα του καρκίνου

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-525-3p στην ανάπτυξη καρκίνου του ήπατος, το επίπεδο έκφρασης του miR-525-3p ανιχνεύθηκε σε 136 καρκίνο του ήπατος και σε συνδυασμό παρακείμενων noncancerous ιστούς στο ήπαρ (ΝΤ). miR-525-3p ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ιστούς καρκίνου του ήπατος (Σχήμα 1Α), με αυξητική ρύθμιση που παρατηρήθηκε στο 60% των ιστών καρκίνου του ήπατος (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση του miR-525-3p σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-525-3p είναι σχετικά υψηλή σε καρκίνο του ήπατος κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1 στο File S1). Για να εξεταστεί η βιολογική λειτουργία των miR-525 στο HCC, σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν miR-525 κατασκευάστηκε και ονομάστηκε SMMC-7721-525 και SK-HEP-1 με 525 (Σχήμα S2A στο S1 αρχείου). CCK-8 προσδιορισμούς πρότεινε ότι miR-525 δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων HCC (Σχήμα S3 σε File S1), ενώ Transwell δοκιμασίες έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του miR-525 προωθείται SK-HEP-1 και SMMC-7721 μετανάστευση και εισβολή (Εικόνα 1C, D).

(Α) miR-525-3p έκφραση προσδιορίστηκε με TaqMan πραγματικού χρόνου PCR σε καρκίνο του ήπατος και των παρακείμενων δειγμάτων noncancerous ηπατικού ιστού (ΝΤ) (n = 136). Το επίπεδο miR-525-3p έκφραση ομαλοποιήθηκε με U6b snRNA. Η σχετική έκφραση του miR-525-3p αναφέρεται σε οικόπεδο κουτί με ένα ημερολόγιο

10 κλίμακας y-άξονα. Τα άκρα των κιβωτίων ορίζουν το 25

ου και 75

ου τοις εκατό, και η γραμμή δείχνει την μέση. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ένα αντιστοιχισμένο t-test, και τα αστέρια υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικά αποτελέσματα σε Ρ & lt? 0.05 (*). (Β) Το κυκλικό διάγραμμα δείχνει τις αναλογίες των ιστών καρκίνου του ήπατος στην οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω miR-525-3p έκφραση (60%), ρυθμίζεται προς τα κάτω (5%) και αμετάβλητη (35%). (C) Transwell δοκιμασίες μετανάστευσης SMMC-7721 και τα κύτταρα SK-HEP-1 που εκφράζει miR-525 ή φορέα ελέγχου. (D) Transwell δοκιμασίες εισβολή SMMC-7721 και τα κύτταρα SK-HEP-1 που εκφράζει miR-525 ή φορέα ελέγχου. Αντιπροσωπευτικά εικόνες φαίνεται στα αριστερά, και 3 τυχαία επιλεγμένα πεδία ποσοτικοποιούνται στα δεξιά. Οι τιμές που παρουσιάζονται εδώ αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM, και τα αστέρια υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικά αποτελέσματα στην P & lt? 0,01, ** ή P & lt?. 0.001, ***

Η

MiR-525-3p μετα-μεταγραφικά ρυθμίζει προς τα κάτω ZNF395 Έκφραση με την άμεση στόχευση της 3’ΙΙΤΡ

επόμενο αναζήτησε τον προσδιορισμό των γονιδίων στόχων του miR-525-3p. Πιθανοί γονίδια στόχοι προβλέψει τη χρήση της πρόβλεψης miRNA αλγορίθμους TargetScan, Miranda και DIANA. Κοινή προβλέψεις κάθε δύο λογισμικό συνενώθηκαν και 30 υποψήφια γονίδια βρέθηκαν (Σχήμα 2Α). Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων ανιχνεύθηκαν μετά miR-525-3p μιμείται εισήχθησαν σε SK-HEP-1 και SMMC-7721. RANBP10, NACC1, IRF1, ZNF395 και MLST8 ανεστάλησαν κατά περισσότερο από 40% (Σχήμα S4 στο αρχείο S1). Για να κατανοήσουμε εάν αυτά τα πέντε γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο του ήπατος, τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων ανιχνεύθηκαν σε 12 ζεύγη δειγμάτων ήπατος καρκινικού ιστού. RANBP10, IRF1 και ZNF395 βρέθηκαν να είναι κάτω-ρυθμίζονται σε ιστούς του καρκίνου του ήπατος, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των NACC1 και MLST8 παρέμεινε αμετάβλητος (Σχήμα S5 στο S1 αρχείου).

(Α) Schema των υποψήφιων γονιδίων που παράγονται από διαφορετικούς αλγορίθμους πρόβλεψης. Κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει έναν αλγόριθμο πρόβλεψης και τον αριθμό των γονιδίων που είχε προβλεφθεί, και οι αριθμοί που αναγράφονται στις περιοχές όπου οι κύκλοι αλληλεπικαλύπτονται αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των γονιδίων που προβλέπεται από τους δύο αλγορίθμους. (Β) δοκιμασίες κηλίδος Western των επιπέδων πρωτεΐνης ZNF395 σε SMMC-7721 και SK HEP-1 κύτταρα μολυσμένα με miR525 ή φορέα ελέγχου. (C) Δυναμικό αλληλουχίες πρόσδεσης για miR525-3p εντός του ZNF395 3’UTR του ανθρώπου (HSA), χιμπαντζή (PTR), ρέζους (MML), σκύλου (CFA) και κουνελιών (Ocu). Οι ακολουθίες σπόρων υπογράμμισε. (D) λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές δομήθηκαν με την εισαγωγή του ZNF395 3’UTR και αντίστοιχα θραύσματα στην περιοχή κατάντη του γονιδίου λουσιφεράσης. Οι προβλεπόμενες αλληλουχίες πρόσδεσης για miR-525-3p δείχνεται, συμπεριλαμβανομένου του αγρίου τύπου πλήρους μήκους UTR (WT) ή μεταλλαγμένης (ΜΤ, υπογραμμισμένη) θέσεις πρόσδεσης. (Ε) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε αφού τα κύτταρα ΗΕΚ-293Τ συν-επιμολύνθηκαν με WT ή ΜΤ ZNF395 3’UTR πλασμίδια ανταποκριτές και miR-525-3p. Οι τιμές αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM, και τα αστέρια υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα σε P & lt?. 0.01, **

Η

Για να καταλάβετε αν RANBP10, IRF1 και ZNF395 είναι πιθανά γονίδια λειτουργικό στόχο της miR-525 -3p, αυτά τα γονίδια knockdown χρησιμοποιώντας siRNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παρέμβαση στην έκφραση IRF1 θα μπορούσε να αναστείλει τη μετανάστευση των SMMC-7721 και SK-HEP-1 κύτταρα, ένα φαινότυπο που είναι ασυμβίβαστο με το φαινότυπο του miR-525-3p υπερ-έκφραση. Νοκ ντάουν της ενδογενούς RANBP10 και της έκφρασης ZNF395 ήταν σε θέση να προωθήσει τη μετανάστευση SMMC-7721 και τα κύτταρα SK-HEP-1. Αυτός ο φαινότυπος είναι συνεπής με τον φαινότυπο του miR-525-3p υπερ-έκφραση. (Σχήμα S6 στο αρχείο S1). Στη συνέχεια, το RANBP10 και ZNF395 επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν σε SK-HEP-1-525 και SMMC-7721 με 525 κύτταρα για να προσδιοριστεί αν miR-525 υπερ-έκφραση θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης ZNF395 μειώθηκε σημαντικά σε SMMC-7721 – 525 και SK-HEP-1 με 525 κύτταρα (Σχήμα 2Β). Λαμβάνοντας υπόψη το επίπεδο της πρωτεΐνης RANBP10 δεν επηρεάστηκε σημαντικά (Σχήμα S7 στο S1 αρχείου). Έτσι, επελέγη ZNF395 για περαιτέρω μελέτη.

Η ZNF395 3’UTR περιέχει μία θέση σύνδεσης για miR-525-3p (προβλεπόμενο από TargetScan), και η αλληλουχία δεσμεύσεως είναι εξαιρετικά διατηρημένη σε διάφορα είδη, όπως ανθρώπινο, χιμπατζής, πίθηκο rhesus, σκύλου και κουνελιού (Σχήμα 2C). Για να προσδιορίσετε αν το miR-525-3p ρυθμίζει άμεσα ZNF395 στοχεύοντας 3’ΙΙΤΡ της, ZNF395 πλήρους μήκους 3’UTR λουσιφεράσης φορέα αναφοράς κατασκευάστηκε. δραστηριότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά μετά την συνεπιμόλυνση με τα miR-525-3p μιμούνται και λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ κατασκευάσματα. Σε αντίθεση, η σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης δεν αλλάζει σημαντικά όταν εισήχθησαν θέσεις πρόσδεσης μεταλλαγμένο (Σχήμα 2D, E), γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-525-3p θα μπορούσε να ρυθμίσει ZNF395 έκφραση με απευθείας σύνδεση με 3’ΙΙΤΡ του.

ZNF395 συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του ήπατος και μπορεί να εμποδίζουν τον καρκίνο του ήπατος κυτταρική μετανάστευση και εισβολή

ψευδαργύρου πρωτεΐνη δάκτυλο 395 είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου Krüppel C2H2-τύπου, και οι περισσότερες πρωτεΐνες σε αυτή την οικογένεια λειτουργία όπως μεταγραφικοί ενεργοποιητές ή αναστολείς. ZNF395 δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι εμπλέκονται σε καρκίνο του ήπατος ή μετάστασης όγκου. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να διερευνηθούν οι επιπτώσεις της ZNF395 για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του ήπατος και του μηχανισμού υποκειμένων στους εν λόγω αποτελέσματα. ZNF395 σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε ιστούς καρκίνου του ήπατος (Εικόνα 3Α), με ρύθμιση προς τα κάτω παρατηρήθηκε στο 62% των ιστών καρκίνου του ήπατος (Εικόνα 3Β). Για να διευκρινιστεί η επίδραση της ZNF395 στη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος και την εισβολή, τη σταθερή κυτταρική σειρά SK-HEP-1-ZNF395 ιδρύθηκε (Σχήμα S2B στο S1 File) και τα siRNA εναντίον ZNF395 διατάχθηκαν, το νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα της ZNF395-siRNAs προσδιορίστηκε από πραγματικούς -Time PCR (Σχήμα S2C σε S1 File), και την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του SK-HEP-1 και SMMC-7721 ήταν 89,5% και 97,0% (σχήμα S2 D, E, F, G στην S1 File).

(Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του ZNF395 σε ιστούς HCC ή συμφωνημένα noncancerous ιστούς (ΝΤ) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR δοκιμασίες αντίστροφης μεταγραφής. (Β) Το κυκλικό διάγραμμα δείχνει τις αναλογίες των δειγμάτων καρκίνου του ήπατος στην οποία ZNF395 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω (62%), αμετάβλητη (32%), και ρυθμίζεται προς τα πάνω (6%). έκφραση ZNF395 προσδιορίστηκε με TaqMan πραγματικού χρόνου PCR σε καρκίνο του ήπατος και των παρακείμενων ιστών noncancerous ήπατος (ΝΤ) (n = 136), και ZNF395 επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Η σχετική έκφραση των ZNF395 παρουσιάζεται σε οικόπεδο κουτί. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ένα αντιστοιχισμένο t-test. (C, D) φακοϊό μεσολάβηση υπερ-έκφραση ή siRNA που προκαλείται knockdown έκφρασης ZNF395 ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western σε SK-HEP-1. ((Ε) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-525-3p στο ZNF395 υπερ-έκφραση ή νοκ ντάουν κύτταρα SK-HEP-1. (F) μετανάστευση Transwell και εισβολή αναλύσεις της SK-HEP-1cells που εκφράζουν σταθερά ZNF395 ή φορέα ελέγχου. ( .. Ζ) Transwell μετανάστευση και την εισβολή αναλύσεις της SK-HEP-1 κύτταρα μετά το νοκ ντάουν της ενδογενούς ZNF395 Αντιπροσωπευτικά εικόνες φαίνεται στα αριστερά, και 3 τυχαία επιλεγμένα πεδία ποσοτικοποιούνται στη δεξιά μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το SEM? αστέρια υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα στην P & lt? 0,05, *? P & lt? 0,01, **? ή P & lt?.. 0.001, ***

Η

Το επίπεδο έκφρασης ZNF395 ανιχνεύθηκε με δοκιμασία κηλίδος western (Σχήμα 3C, δ) και σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης της ώριμης miR-525-3p δεν είχε προφανώς αλλάξει ZNF395 υπερ-έκφραση ή νοκ ντάουν SK-HEP-1 κύτταρα (Σχήμα 3Ε), έτσι ώστε να μπορεί να αποκλείσει το ενδεχόμενο ένα σταυρό-ρύθμιση του miR-525 από ZNF395 . η δοκιμή αυτή δείχνει ότι η υπερ-έκφραση του ZNF395 μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την SK-HEP-1 μετανάστευση και εισβολή (Σχήμα 3F), ενώ παρεμβολή με ενδογενή έκφραση ZNF395 θα μπορούσε να προωθήσει σημαντικά την μετανάστευση και την εισβολή του SK-HEP-1 κύτταρα (Σχήμα 3G) .

Αποκατάσταση ZNF395 Αναστέλλει miR-525-επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος και εισβολή

σε μια προσπάθεια να ελεγχθεί αν ZNF395 είναι η άμεση λειτουργική μεσολαβητής του miR-525 που προκαλείται από τη μετανάστευση και την εισβολή, μια ZNF395 λεντοϊού φορέας που περιέχει την ORF πλήρους μήκους, αλλά χωρίς το 3’UTR εισήχθη στην σταθερή κυτταρική γραμμή SK-Hep1-525 (Σχήμα 4Α). Σχετικά επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-525-3p δεν ήταν προφανώς αλλάξει SK-HEP-1-525 και SK-HEP-1-525-ZNF395 κύτταρα (Εικόνα 4Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλή έκφραση ZNF395 ήταν σε θέση να αντισταθμίσει miR-525 που προκαλείται από αλλαγές στην SK-HEP-1 μετανάστευση και εισβολή (Σχήμα 4C, D). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι ZNF395 είναι ένα άμεσο λειτουργικό γονίδιο στόχος για miR-525-3p.

(Α) δοκιμασίες κηλίδος Western για SK-HEP-1-φορέα ή SK ΗΕΡ-1-525-κύτταρα με ή χωρίς η επαναφορά της ZNF395. (Β) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-525-3p σε ZNF395 υπερ-έκφραση ή knockdown κυττάρων SK-HEP-1. (C, D) Transwell μετανάστευση, δοκιμασίες εισβολή για SK-HEP-1-φορέα ή SK-HEP-1 με 525 κύτταρα με ή χωρίς την επαναφορά των ZNF395. Αυτά τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με t-test του φοιτητή. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.E.M, και τα αστέρια υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα σε P & lt? 0,05, *? και P & lt?. 0.001, ***

Η

Συζήτηση

miR-525 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 19q13.42 χωρίς ένα γονίδιο υποδοχής. Το επίπεδο έκφρασης του miR-525-3p αυξήθηκε 6,8 έως 8 φορές σε δύο σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές των γεννητικών κυττάρων όγκου [33]. Wang et al [34] ανιχνεύεται έκφραση miRNA χρησιμοποιώντας miRNA μικροσυστοιχιών και διαπίστωσε ότι miR-525-3p ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε τρία ζεύγη των ιστών καρκίνου του ήπατος. Δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με τη λειτουργία και το μηχανισμό του miR-525-3p στον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, για πρώτη φορά, διαπιστώσαμε ότι η αυξημένη έκφραση του miR-525-3p προάγει μετανάστευση καρκίνο του ήπατος κυττάρων και εισβολή. ZNF395 αναγνωρίζεται ως άμεσο λειτουργικό γονίδιο στόχος για miR-525-3p.

ZNF395 είναι μέλος του τύπου ψευδαργύρου οικογένεια πρωτεϊνών δακτύλου Krüppel C2H2. Είναι ευρέως εκφράζεται και ταυτοποιήθηκε αρχικά ως παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζει τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) έκφραση? Έτσι, είναι επίσης γνωστό ως παράγοντας HPV-σύνδεσης (απευθείας) και μπορεί να δεσμεύεται με την περιοχή HPV υποκινητή [35]. ZNF395 εκφράζεται σε υποξία προκαλούμενη κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος και στα αιμοφόρα αγγεία ενήλικων ιστών γλοιοβλαστώματος [36]. Tsukahara et al [37] βρήκαν ότι ZNF395 είναι ένα σχετιζόμενο με όγκο αντιγόνο. ZNF395 δείχθηκε επίσης για τη ρύθμιση της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι για την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης [38], με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 για την προώθηση της απόπτωσης [39]. Δεν υπάρχουν αναφορές για ZNF395 που εμπλέκονται στη μετάσταση του όγκου.

Εμείς αναφέρει για πρώτη φορά ότι ZNF395 είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε ιστούς του καρκίνου του ήπατος και ότι miR-525-3p να στοχεύουν ειδικά την ZNF395 3’UTR . Υπερ-έκφραση του ZNF395 μπορούν να αναστείλουν τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος και εισβολή, ενώ η αποκατάσταση του ZNF395 αναστέλλει miR-525 με τη μεσολάβηση της μετανάστευσης των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος και εισβολή. Υπερ-έκφραση του ZNF395 και miR-525 δεν έχουν καμία επίδραση σε ΝΡ-κΒ, ΜΑΡΚ μονοπάτι, αλλά μπορεί να ρυθμίσει ΡΙ3-Κ /Akt μονοπάτι μέσω μεταβολής της κατάστασης του ρ-Akt (Σχήμα 5, Σχήμα S8 σε S1 File).

ανάλυση Western blot της ΡΙ3-Κ /Akt μονοπατιού σε SK-HEP-1-525 και SK-HEP-1-ZNF395 κύτταρα.

η

Εν ολίγοις, αυτή η μελέτη δείχνει ότι η υψηλή έκφραση του miR-525-3p προωθεί τη μετανάστευση καρκίνο του ήπατος κυττάρων και εισβολή. ZNF395 είναι μια άμεση λειτουργικό γονίδιο στόχος του miR-525-3p? miR-525-3p προάγει μετανάστευση καρκίνο του ήπατος κυττάρων και εισβολή από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της ZNF395. Το εύρημα αυτό αποκαλύπτει ένα νέο μηχανισμό της μετάστασης του καρκίνου του ήπατος και νέους στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Οι ακολουθίες των miRNA ανιχνευτές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090867.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

Ο πραγματικού χρόνου PCR εκκινητές για προέβλεψε δυνάμει υποψήφιες γονίδιο στόχο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090867.s002

(DOCX)

Πίνακα S3.

Αστάρια για το miR-525, ZNF395, ZNF395 3’ΙΙΤΡ και μεταλλαγμένα 3’ΙΙΤΡ κλωνοποίηση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090867.s003

(DOCX)

Πίνακας S4.

siRNA αλληλουχίες κατά IRF1, RANBP10 και ZNF395

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090867.s004

(DOCX)

αρχείου S1.

Συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με τα επιτευχθέντα αποτελέσματα, που περιέχει το σχήμα S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 και S8. Εικόνα S1. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-525-3p σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. miR-525-3p έκφραση προσδιορίστηκαν με TaqMan πραγματικού χρόνου PCR σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται σε U6 snRNA. Εικόνα S2. Τα επίπεδα έκφρασης σταθερών κυτταρικών σειρών υψηλής έκφρασης miR-525 και ZNF395. (Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-525 στο SMMC-7721-525 και SK-HEP-1-525, αναλύσεις ΑΒΙ TaqMan miRNA χρησιμοποιήθηκαν και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκε με U6b snRNA. (Β) Το σχετικό επίπεδο έκφρασης ZNF395 σε SK-HEP-1 ή φορέα ελέγχου, δεδομένα ομαλοποιήθηκε με GAPDH. (C) Νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα των ZNF395-siRNAs. Το μίγμα των ZNF393-siRNA-1, ZNF393-siRNA-2, και ZNF393-siRNA-3 ονομάστηκε ZNF393-siRNA-1 + 2 + 3. (D, E, F, G) Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του FAM-siRNA σε SK-HEP-1 και SMMC-7721 κύτταρα. Τα αστέρια που αναφέρεται για να δείξει τη σημασία, P & lt? 0,01, **? P & lt? 0.001, ***. Εικόνα S3. miR-525 δεν έχει σημαντικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων HCC. προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων για SMMC-7721 (Α) και SK-HEP-1 (Β) κύτταρα που έχουν μολυνθεί με φακοϊό εκφράζουν miR525 ή ελέγχου φορέα. Η μέτρηση κυττάρων kit-8 (CCK-8) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ο μέσος όρος των τιμών που απεικονίζονται όπως φαίνεται, και οι μπάρες υποδεικνύουν S.E.M εις τριπλούν. P = NS (όχι σημαντική) από Φοιτητών

t-test

. Εικόνα S4. Τα επίπεδα έκφρασης των προβλεπόμενων πιθανών υποψηφίων γονιδίου στόχου. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με GAPDH, και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E.M. Εικόνα S5. Τα επίπεδα έκφρασης υποψηφίων γονιδίων σε ιστούς καρκίνου του ήπατος. Εκφραση (Α) RANBP10, (Β) IRF1, (Γ) ZNF395, (D) NACC1 και (Ε) MLST8 προσδιορίστηκαν με ποσοτικές αναλύσεις πραγματικού χρόνου PCR σε καρκίνο του ήπατος και των παρακείμενων noncancerous ιστούς ήπατος (ΝΤ) (n = 12 ). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκε από GAPDH, τα αστέρια αναφέρεται για να δείξει τη σημασία, P & lt? 0,05, *? P & lt? 0.001, ***. Εικόνα S6. Παρεμβολές IRF1, RANBP10 και της έκφρασης ZNF395 μπορεί να αναστέλλει ή να προωθήσει SMMC-7721 και SK-HEP-1 κύτταρα της μετανάστευσης. (Α) έκφραση IRF1 Παρεμβολές θα μπορούσε να αναστείλει SMMC-7721 και SK-HEP-1 κύτταρα της μετανάστευσης. Παρεμβολές RANBP10 (Β) και ZNF395 (C) έκφραση θα μπορούσε να προωθήσει SMMC-7721 και SK-HEP-1 κύτταρα της μετανάστευσης. Εικόνα S7. έκφραση RANBP10 δεν είναι προφανώς αλλάξει miR-525 υπερεκφράζεται κύτταρα. αναλύσεις Western blot της έκφρασης RANBP10 σε SK-HEP-1 και SMMC-7721 κύτταρα μολυσμένα με miR525 ή φορέα ελέγχου. Εικόνα S8. Υπερ-έκφραση of Mir-525 και ZNF395 δεν έχουν καμία επίδραση στην NF-κΒ, ΜΑΡΚ μονοπάτι ή EMT δείκτες. ανάλυση Western blot του NF-κΒ (Α), ΜΑΡΚ (Β) μονοπάτι και EMT δείκτες (C) σε κύτταρα SK-HEP-1-525 και SK-HEP-1-ZNF395

doi:. 10.1371 /journal.pone .0090867.s005

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθηγητής Didier Trono (Σχολή Επιστημών ζωής, Ecole Polytechnique Fe’de’rale de Lausanne, 1015 Lausanne, Switzerland) για τα πλούσια δώρα των πλασμιδίων pWPXL, psPAX2 και pMD2.G.