Abstract

1α-25 (ΟΗ)

2 βιταμίνη D

3 (1-25D), ένα ενεργό ορμονικής μορφής βιταμίνης D

3, είναι ένα πολύ γνωστό χημειοπροληπτική και προ-διαφοροποίηση παράγοντα. Έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη αρκετές. συνδέσεις χάσματος, που σχηματίζονται από πρωτεΐνες που ονομάζονται συνδεσινών (Cx), είναι σύνολα του κυττάρου-κυττάρου κανάλια, τα οποία επιτρέπουν την ανταλλαγή των ρυθμιστικών μορίων μικρού ανάπτυξης μεταξύ γειτονικών κυττάρων. επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου που προκαλείται από μεσοκυττάριου κανάλια είναι ένας σημαντικός ομοιοστατική μηχανισμό ελέγχου για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης. Ερευνήσαμε την επίδραση της 1-25D στο σχηματισμό και την υποβάθμιση του μεσοκυττάριου σε μια κυτταρική γραμμή που αποκρίνονται στο ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη, LNCaP, η οποία εκφράζει ρετροϊούς εισαχθεί Cx32. Connexin32 εκφράζεται από τα αυλού και καλά διαφοροποιημένα κύτταρα του φυσιολογικού προστάτη και του προστάτη όγκους. Τα αποτελέσματά μας τεκμηριώνουν ότι 1-25D ενισχύει την έκφραση της Cx32 και την επακόλουθη συναρμολόγηση του σε διασταυρώσεις χάσμα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι 1-25D αποτρέπει ανδρογόνων-ρυθμίζονται υποβάθμιση της Cx32, μετα-μεταφραστικά, ανεξάρτητα από τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μεσολάβηση σηματοδότησης. Τέλος, τα ευρήματά μας τεκμηριώνουν ότι ο σχηματισμός του μεσοκυττάριου ευαισθητοποιεί Cx32-κύτταρα που εκφράζουν LNCaP στα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του 1-25D και αλλάζει τη μορφολογία τους. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις των 1-25D σε κύτταρα LNCaP μπορεί να σχετίζεται με την ικανότητά της να διαμορφώνει την συναρμολόγηση του Cx32 σε χασμοσυνδέσμων

Παράθεση:. Kelsey L, Katoch Ρ, Ray Α, Mitra S, Chakraborty S, Lin MF, et al. (2014) Η βιταμίνη D

3 Ρυθμίζει το σχηματισμό και την Υποβάθμιση της Gap Κόμβων σε ανδρογόνα-Responsive ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (9): e106437. doi: 10.1371 /journal.pone.0106437

Επιμέλεια: Μιχαήλ Koval, Emory University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Νοεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 6 του Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4η Σεπτεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Kelsey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA113903, DOD PCRP PC-081198 και PC-111867, Νεμπράσκα μέλος Grant LB506 και R0-1DE12308. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ρόλος της βιταμίνης D

3, και δραστική μορφή ορμονικής 1α-25 της (ΟΗ)

2 βιταμίνη D

3 (1-25D), ως αντι-νεοπλασματική, pro -differentiating, και προ-αποπτωτικά παράγων έχει τεκμηριωθεί σε μια ευρεία ποικιλία των φυσιολογικών και κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PCA) [1] – [4]. Οι δράσεις του 1-25D επιτυγχάνονται μέσω σύνδεσης με τον υποδοχέα της βιταμίνης D, ένα από τα μέλη της υπεροικογένειας πυρηνικών υποδοχέων, η οποία εκφράζεται σε μια ευρεία ποικιλία κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των προστάτη. Ο υποδοχέας της βιταμίνης D ετεροδιμερίζεται με τον υποδοχέα RXR και δεσμεύεται με το στοιχείο απόκρισης υποδοχέα της βιταμίνης D για να αλλάξει την έκφραση του γονιδίου [1]. Με βάση την παρατήρηση ότι τα ποσοστά θνησιμότητας PCA στις ΗΠΑ είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την γεωγραφικώς έκθεσης σε ακτινοβολία προσπίπτουσα υπεριώδης από τον ήλιο, και ότι το υπεριώδες φως είναι απαραίτητο για τη βιταμίνη D

3 σύνθεσης στο δέρμα, ένα ρόλο για αυτή την βιταμίνη σε φθίνουσα ο κίνδυνος ανάπτυξης PCA έχει προταθεί [5], [6]. Πολυάριθμες

in vitro μελέτες δείχνουν

συνεπής ανασταλτική της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης-επαγωγικές επιδράσεις της βιταμίνης D

3 σε κύτταρα καρκινώματος του προστάτη, και μελέτες σε ζώα δείχνουν ότι όχι μόνο μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης PCA δρώντας ως ένας παράγοντας χημειοπροληπτική αλλά επίσης καταστέλλει την μετάσταση [7] – [10]

διασταύρωση Gap (GJ) s είναι σύνολα του κυττάρου-κυττάρου κανάλια που σηματοδοτούν μη κανονικώς, επιτρέποντας την άμεση ανταλλαγή των μικρών μορίων (≤1500Da) μεταξύ. οι κυτταροπλασματικές εσωτερικό των συνεχόμενων κυττάρων [11]. Οι πρωτεΐνες συστατικό του GJS, που ονομάζεται συνδετίνες (CXS), κωδικοποιούνται από 21 γονίδια, τα οποία έχουν οριστεί σύμφωνα με μοριακή μάζα τους [12]. Κυττάρου-κυττάρου κανάλια είναι bicellular δομές που σχηματίζεται από την συλλογική προσπάθεια των δύο κυττάρων. Για να σχηματιστεί ένα κανάλι GJ κυττάρου-κυττάρου, CXS πρώτα ολιγομερισμός στο ενδοπλασματικό δίκτυο ή το δίκτυο trans-Golgi ως εξαμερές, που ονομάζεται connexon, το οποίο αποβάθρες με την connexon εμφανίζεται σε μια συνεχόμενη κυττάρου [13], [14]. Πολλαπλές γραμμές απόδειξης δανείζουν τώρα αξιοπιστία στην ιδέα ότι η επικοινωνία μεταξύ κυττάρων που προκαλείται από μεσοκυττάριου κανάλια είναι μια σημαντική ομοιοστατική μηχανισμό ελέγχου για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης και για τον περιορισμό προώθηση των όγκων. Για παράδειγμα, μειωμένη έκφραση Cx, ή απώλεια της λειτουργίας GJ, έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση πολλών τύπων καρκίνου και ασθενειών [15] – [19]. Επίσης, οι μεταλλάξεις σε αρκετά γονίδια Cx έχουν ανιχνευθεί σε γενετικές διαταραχές που χαρακτηρίζονται από ανώμαλη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης [13], [20].

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η έκφραση του Cx32, η οποία εκφράζεται από την αυλική κύτταρα του προστάτη, συνέπεσε με την απόκτηση της διαφοροποιημένης κατάσταση των αυλού κυττάρων [21], [22]. Επιπλέον, τεκμηριωμένο ότι η εξέλιξη της PCA από μια ανδρογόνο-εξαρτώμενη κατάσταση σε μια επεμβατική, ανδρογόνο-ανεξάρτητο κράτος χαρακτηρίζεται από την παρεκκλίνουσα διακίνηση Cx32 ή /και διαταραγμένη συναρμολόγηση σε GJS [22] – [24]. Επιπλέον, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η αναγκαστική έκφραση Cx32 σε αποκρίνονται στο ανδρογόνο ανθρώπινη κυτταρική σειρά PCA, LNCaP, καθυστέρηση ανάπτυξης των κυττάρων

in vivo

και

in vitro

[22]. Έχουμε, επίσης, δείξει ότι σε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν Cx32, ο σχηματισμός και η υποβάθμιση των GJS ρυθμίζονταν από τα ανδρογόνα, τα οποία ελέγχεται το επίπεδο έκφρασης Cx32 μετά τη μετάφραση με την πρόληψη της υποβάθμισης της από το ενδοπλασματικό δίκτυο συνδέεται υποβάθμιση (ERAD) [25]. Τα ανδρογόνα που απαιτείται για να διατηρηθεί το εκκριτικό (διαφοροποίηση-συναφή) λειτουργία των επιθηλιακών κυττάρων του αυλού του φυσιολογικού προστάτη ως εξάντληση των ανδρογόνων με χειρουργική ή χημικά μέσα πυροδοτεί απόπτωση ή /και αποδιαφοροποίηση των κυττάρων αυτών [26] – [29]. πρόσφατες μελέτες μας έχουν δείξει ότι τα ρετινοειδή, τα οποία ρυθμίζουν επίσης τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων του προστάτη επιθηλιακών [28], [30], την ενίσχυση και την συναρμολόγηση των Cx32 σε GJS [31]. Οι μελέτες αυτές προσδίδουν αξιοπιστία στην ιδέα ότι ο σχηματισμός και η υποβάθμιση του GJS μπορεί να συνδέεται με τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων του αυλού του προστάτη.

Όπως ανδρογόνων και ρετινοειδή, βιταμίνη D

3 είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη και έχει επίσης τεκμηριωθεί για να διαμορφώνει PCA εξέλιξης [7], [9]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η βιταμίνη D κατέστειλε προστατική επιθηλιακή νεοπλασία σε διαγονιδιακά ποντίκια Nkx3.1 /ΡΤΕΝ [32]. Επιδημιολογικές, κυτταρική καλλιέργεια, και κλινικές μελέτες έχουν ενοχοποιήσει αντικαρκινική επιδράσεις της 1-25D για PCA και έχει προταθεί ότι είναι ένας ισχυρός παράγων χημειοπροληπτικός [3], [4]. Ωστόσο, σε αντίθεση με τον καρκίνο του παχέος εντέρου [1], [33], το δυναμικό της αποτελεσματικότητας του 1-25D στην χημειοπροφύλαξη του PCA έχει παραμείνει αμφιλεγόμενη παρά τις πολυάριθμες μελέτες σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών του PCA και η χρήση της σε κλινικές δοκιμές [1], [2]. Προγενέστερες μελέτες, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έχουν δείξει ότι οι ανασταλτικές της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης-επαγωγικές επιδράσεις του χημειοαποτρεπτικών παραγόντων μπορεί να σχετίζεται με την ικανότητά τους να ενισχύουν την επικοινωνία μεσοκυττάριου [34] – [38]. Τα κύτταρα του αυλού φυσιολογικό προστάτη εκφράζουν Cx32 και σχηματίζουν μεγάλες GJS και την πρόοδο της PCA συνοδεύεται από απώλεια της ικανότητας σχηματισμού GJS [22], [23]. Σχηματισμός GJS έχει ενοχοποιηθεί για τη διατήρηση του πολωμένη και διαφοροποιημένη κατάσταση των επιθηλιακών κυττάρων [39]. Οι μελέτες μας ώθησε να εξετάσει την επίδραση της 1-25D επί του συγκροτήματος του Cx32 σε GJS σε ανδρογόνα ανταποκρίνεται ανθρώπινη PCA κυτταρική σειρά LNCaP. Επειδή 1-25D έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την έκφραση του AR σε κύτταρα LNCaP [40], μπορούμε ορθολογικά ότι θα μπορούσε να ρυθμίζουν τον σχηματισμό ανδρογόνων-ρυθμιζόμενη και η υποβάθμιση των GJS και να επηρεάσει την ανάπτυξη αποκρίνονται στο ανδρογόνο κύτταρα PCA που εκφράζουν Cx32. Με τη χρήση κυττάρων LNCaP που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, τα οποία εκφράζουν ρετροϊό εισαχθεί Cx32 [25], δείχνουμε ότι 1-25D ενισχύει την συναρμολόγηση του Cx32 σε GJS. Επιπλέον, δείχνουμε επίσης ότι 1-25D αποτρέπει ανδρογόνων-ρυθμίζονται υποβάθμιση της GJS μετα-μεταφραστικά, ανεξάρτητα από AR-μεσολάβηση σηματοδότησης. Τέλος, τα ευρήματα μας δείχνουν ότι ο σχηματισμός των GJS ευαισθητοποιεί τα κύτταρα LNCaP στην ανάπτυξη-ανασταλτικές επιδράσεις της 1-25D και αλλάζει τη μορφολογία τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανδρογόνων -responsive ανθρώπινη κυτταρική σειρά PCA, LNCaP, αναπτύχθηκε όπως περιγράφεται [41], [42]. LNCaP-32 κύτταρα, μία από τις αρκετές κλώνων των κυττάρων LNCaP που εκφράζουν Cx32 ρετροϊικώς μεταγωγή αρουραίου και LNCaP-Ν κύτταρα, ένα από τα πολλά κλώνους ελέγχου που επιλέγονται σε G418 μετά από μόλυνση με τον ρετροϊό ελέγχου, έχουν περιγραφεί [25], [ ,,,0],31]. Γονικά κύτταρα LNCaP, στο εξής θα αναφέρεται ως LNCaP-Ρ κύτταρα, αναπτύχθηκαν σε RPMI που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου σε ατμόσφαιρα αέρα 5% CO

2/95% ενώ LNCaP-Ν και τα κύτταρα LNCaP-32 διατηρήθηκαν σε RPMI που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου που περιείχε G418 στα 200 μg /ml, όπως περιγράφεται [25], [31]. Στεροειδή εξαντλημένο (απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα) στον ορό και φαινόλη-κόκκινο-ελεύθερο RPMI ελήφθησαν από ΗνΟΙοηε Laboratories (Salt Lake City, UT).

Αντισώματα και Ανοσοβαφή

Οι πηγές των δύο μονοκλωνικών και πολυκλωνικά αντισώματα έναντι Cx32 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [24], [25], [31], [43], [44]. Mouse αντί-occludin (κλώνος OC-3F10) ήταν από την Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA). Αντισώματα κουνελιού έναντι α- και β-κατενίνης και αντι-β-ακτίνης ποντικού (κλώνος C-15) ήταν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (Ε-cad), α-κατενίνης, β-κατενίνης, γενναιόδωρα που παρέχονται από τους Drs. Johnson και Wheelock (Έπλι Institute), έχουν περιγραφεί [25], [43], [44]. Ένα αντίσωμα αντι-υποδοχέα AR πολυκλωνικό κουνελιού ήταν από την Santa Cruz Biotech (SC-13062, San Diego, CA). Τα κύτταρα (1.5 × 10

5), σπάρθηκαν σε έξι καλά συστάδες που περιέχουν γυάλινες καλυπτρίδες και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε περίπου 50% συρροή, ανοσοχρωματίστηκαν με διάφορα αντισώματα, όπως περιγράφεται [24], [25], [31], [ ,,,0],43] – [45]. Δευτερογενής αντισώματα (κουνέλι ή ποντικός), συζευγμένο με Alexa 488 και Alexa 594, χρησιμοποιήθηκαν όπως ενδείκνυται. Εικόνες ανοσοχρωματίστηκε κύτταρα αποκτήθηκαν με Leica DMRIE μικροσκόπιο (Leica Microsystems, Wetzler, Γερμανία) εξοπλισμένο με Hamamatsu ORCA-Er2 CCD κάμερα (Hamamatsu-City, Ιαπωνία) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό επεξεργασίας εικόνας (Volocity, Έκδοση 6.3? Improvision, Inc? Perkin Elmer) όπως περιγράφεται [43] – [45].

Λύσεις Χρηματιστήριο

συνθετικό ανδρογόνο μιβολερόνης (MB) και ένα φυσικό ανδρογόνων διυδρο-τεστοστερόνη (DHT), 1-25D και Casodex ( βικαλουταμίδη) αγοράστηκαν από την Biomol (ENZO Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY). Στοκ διαλύματα των ΜΒ και DHT παρασκευάστηκαν σε 1 mM σε αιθανόλη και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C σε μικρά κλάσματα προστατευμένο από το φως. Στοκ διάλυμα 1-25D (10 μΜ) παρασκευάστηκε σε αιθανόλη και φυλάχθηκε σε δείγματα στους -80 ° C προστατευμένο από το φως. Στοκ διάλυμα Casodex (10 mM) παρασκευάστηκε σε DMSO και αποθηκεύεται σε κλάσματα στους -20 ° C. Είχαν κατάλληλα αραιωμένο στο μέσο κατά τον χρόνο της θεραπείας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κίτρινο φως, όπως περιγράφεται [36], [37].

ανδρογόνων εξάντληση και άλλες θεραπείες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι και συστάδες με γυάλινες καλυπτρίδες (1,5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) και σε 6-cm (2 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο) και 10-cm πιάτα (3.5 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο) σε 2, 4 και 10 ml πλήρους μέσου , αντίστοιχα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναπλήρωση με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορα αντιδραστήρια στην επιθυμητή συγκέντρωση, όταν φθάσει το 50% συρροή. Οι έλεγχοι κατεργάστηκαν με αιθανόλη έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του διαλύτη δεν υπερέβη το 0,1%. Όταν τα κύτταρα ήταν να αναπτύσσονται υπό συνθήκες ανδρογόνου εξαντλημένο κανονικού μέσου κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο RPMI που περιέχει 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό). Οι έλεγχοι έλαβαν φρέσκο ​​ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο μέσο που περιέχει φυσιολογικό ορό. Χρησιμοποιήσαμε φαινόλης-ερυθρό μέσου άνευ επειδή ερυθρού φαινόλης έχει τεκμηριωθεί ότι έχει στερεοειδογόνο επιδράσεις στην ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών που αποκρίνονται ορμόνη, συμπεριλαμβανομένης LNCaP [46], [47].

Ανάλυση Western Blot και απορρυπαντικών Διαλυτότητα του Connexin32

κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε 10 cm δίσκους σε επαναληπτικές σε 10 ml πλήρους μέσου και αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής με την παρουσία και απουσία διαφόρων αντιδραστηρίων. Η κυτταρική λύση, δοκιμασία απορρυπαντικό-διαλυτότητα με 1% Triton Χ-100 (TX100) και το επίπεδο έκφρασης του Cx32 αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western όπως περιγράφεται [25], [43], [44]. Εν συντομία, μετά από λύση σε ρυθμιστικό SSK (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM ΝΕΜ, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM ιωδοακεταμίδιο, 1% ΤΧ100, ρΗ 7,4 ), σύνολο, απορρυπαντικό διαλυτά και αδιάλυτων εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με υπερφυγοκέντρηση στα 100000 χ g για 60 λεπτά (35.000 rpm σε υπερφυγόκεντρο Beckman αναλυτικό? Model 17 έως 65 χρησιμοποιώντας ένα στροφείο SW50.1). Το απορρυπαντικό-αδιάλυτα ιζήματα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα C (70 mM Tris /HCl, ρΗ 6.8, 8 Μ ουρία, 10 mM ΝΕΜ, 10 mM ιωδοακεταμίδιο, 2.5% SDS, και 0.1 Μ DTT). Μετά την κανονικοποίηση με βάση τον αριθμό των κυττάρων, οι συνολικές και TX100-διαλυτά και αδιάλυτων κλασμάτων αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό 4xSDS φόρτωση σε μια τελική συγκέντρωση 1χ και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα πριν από την ανάλυση SDS-PAGE. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με C-ψηφίο (Li-ΕΤΠ, Lincoln, NE) χρησιμοποιώντας SuperSignal WestFemto μέγιστη ευαισθησία του υποστρώματος (Thermo Scientific? Rockford, IL).

Αναλύσεις Επικοινωνία

μεσοκυττάριου επικοινωνίας αναλύθηκε από μικροέγχυση Lucifer Yellow (MW 443 Da? αλάτι λιθίου), Alexa Fluor 488 (MW 570 Da? Α-10436), και Alexa Fluor 594 (MW 760 Da? Α-10438) με τη χρήση συστημάτων μικροέγχυσης Eppendorf InjectMan και FemtoJet (μοντέλα 5271 και 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, Νέα Υόρκη) τοποθετημένα σε Leica DMIRE2 μικροσκόπιο. Μετά τη λήψη των εικόνων μικροεγχυμένων κυττάρων με τη βοήθεια της κάμερας CCD (Retiga 2000R, FAST 1394) χρησιμοποιώντας QCapture (British Columbia, Καναδάς), τη διαπερατότητα των διαφόρων φθοριζόντων ιχνηθετών ποσοτικώς με τη σημείωση του αριθμού των φθοριζόντων κυττάρων σε 1 λεπτό (Lucifer Yellow ), 3 λεπτά (Alexa 488) και 15 λεπτά (Alexa 594) μετά μικροέγχυση σε θάλαμο δοκιμής όπως περιγράφεται [22], [25], [43], [48].

Colony σχηματισμό και την ανάπτυξη των κυττάρων Αναλύσεις

η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε είτε με προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας ή μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων, όπως περιγράφεται [22], [48]. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, 1 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 cm δίσκους εις τριπλούν σε μέσο καλλιέργειας 3 ml. Μετά από 24 ώρες, ένα μέσο που περιέχει ml 1-25D, ΜΒ ή DHT προστέθηκε στα πιάτα για να δώσει την επιθυμητή τελική συγκέντρωση. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 21 ημέρες, με μια αλλαγή μέσου κάθε 4 ημέρες που περιέχει την κατάλληλη συγκέντρωση των παραπάνω αντιδραστηρίων, όταν ορατές αποικίες. Οι αποικίες σε τρυβλία μονιμοποιήθηκαν με 3.7% ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με 0,025% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους σε PBS και φωτογραφήθηκαν. Για τη μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης, 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 cm δίσκους σε επαναληπτικές και κατεργάζεται με 1-25D περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες με ένα αλλαγή μέσου την ημέρα 5. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν σε αιματοκυτταρόμετρο.

Αποτελέσματα

Η βιταμίνη D

3 βελτιώνει Cx32 έκφραση Επίπεδο

Χρησιμοποιήσαμε LNCaP 32-κύτταρα που εκφράζουν ρετροϊό μεταγωγή αρουραίου Cx32 περιγράφηκε προηγουμένως [25], [31]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι σε LNCaP-32 κύτταρα ανδρογόνα ρυθμίζεται το σχηματισμό GJS, μετα-μεταφραστικά, ελέγχοντας το επίπεδο έκφρασης της Cx32 με αναστολή ERAD μεσολάβηση αποικοδόμηση της [25]. μετέπειτα μελέτες μας έδειξαν ότι τα ανδρογόνα ρυθμιζόμενη αποικοδόμηση του Cx32 καταργήθηκε με all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) και 9-cis ρετινοϊκό οξύ (9-CRA) [31]. Έτσι εξορθολογισμός ότι 1-25D μπορεί να ενεργήσει παρόμοια με ATRA και 9-CRA. Με βάση τις προηγούμενες μελέτες που δείχνουν την επίδραση της βιταμίνης D στην ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP [10], [49] – [52], υποβάλλαμε σε αγωγή LNCaP 32-κυττάρων με διάφορες συγκεντρώσεις 1-25D να εξετάσει την επίδρασή της επί του επιπέδου έκφρασης του Cx32 . Βρήκαμε ότι 1-25D αυξημένο επίπεδο έκφρασης Cx32 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Σημαντική βελτίωση παρατηρήθηκε ακόμη και σε συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 1 ηΜ (Σχήμα 1Β, αριστερό γράφημα). Συγκεντρώσεις υψηλότερες από 10 ηΜ ήταν τοξικές για τα κύτταρα αυτά, όπως αξιολογείται από την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Για τις επόμενες μελέτες που επιλέξαμε 10 nM 1-25D. μελέτες πορεία του χρόνου έδειξε ότι μια σημαντική αύξηση στο επίπεδο έκφρασης Cx32 συμβεί το νωρίτερο 12 ώρες μετά τη θεραπεία με 1-25D και έφτασε ένα οροπέδιο σε 72 ώρες (Σχήμα 1CD, δεξιό γράφημα). Η επίδραση της 1-25D στο επίπεδο έκφρασης Cx32 ήταν τόσο ισχυρή όσο συνθετικών ανδρογόνων, MB, και 9-CRA. Επιπλέον, σε συνδυασμό με θεραπεία 1-25D και ΜΒ ήταν πιο αποτελεσματική στην αύξηση του επιπέδου έκφρασης Cx32 (Σχήμα 2AB). Η βιταμίνη D

3 είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την έκφραση του επιπέδου E-cad, ένα συστατικό πρωτεΐνης του ενώσεων προσφύσεως, σε καρκινικά κύτταρα κόλου [33]. Για να προσδιοριστεί εάν 1-25D επηρεάζονται επίσης το επίπεδο έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται adherens διασταύρωση, μετρήσαμε το επίπεδο έκφρασης της Ε-CAD και οι συναφείς πρωτεΐνες του α- και β-κατενίνες 72 ώρες μετά τη θεραπεία με 1-25D. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 1-25D δεν είχε καμία επίδραση στο επίπεδο έκφρασης της Ε-CAD και α- και β-κατενίνες (Σχήμα 2C). Όπως μετράται με ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR, 1-25D ούτε προκάλεσε την έκφραση του ενδογενούς Cx32 σε LNCaP-P ή LNCaP-Ν κύτταρα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ούτε μεταβάλλεται το επίπεδο έκφρασης της ρετροϊούς μεταγράφηκε mRNA Cx32 σε LNCaP-32 όπως τεκμηριώνεται στο παρελθόν [25].

Α. Η δοσοεξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης Cx32 επίπεδο κατά 1-25D θεραπεία για 48 ώρες. B. Η ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης των δεδομένων που εμφανίζονται στην Α Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα του Mean 4-17 πειράματα. Σημειώστε ότι σημαντική βελτίωση παρατηρείται ακόμη και σε 1 ηΜ. Οι αστερίσκοι (**) δείχνουν P αξία των ≤0.0001. Ένα δύο

t

τεστ ουρά Student χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αξίας P υποθέτοντας άνισες διακύμανσης. Γ Κινητική ενίσχυση των επιπέδων έκφρασης Cx32 κατά την κατεργασία με 1-25D (10 ηΜ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Σημειώστε ότι η ενίσχυση παρατηρείται ήδη από 12 ώρες και οροπέδια σε 72 ώρες. Δ Ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης των δεδομένων που εμφανίζονται στο C. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο και το τυπικό σφάλμα του Mean 3 – 11 πειράματα. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει P αξία των ≤0.0016, και αστερίσκοι (**) δείχνουν P αξία των ≤0.0001. Ένα δύο ουρά του Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αξίας P υποθέτοντας άνισες διακύμανσης.

Η

Cx32 εκφράζουν LNCaP-32 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το 1-25D, 9-CRA, DHT και ΜΒ, όπως υποδεικνύεται. Α συνδυασμένη θεραπεία με 1-25D με ΜΒ ή 9-CRA είναι πιο αποτελεσματική στην αύξηση του επιπέδου έκφρασης Cx32 από τη θεραπεία με το ενιαίο παράγοντα μόνο. B. Η ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης των δεδομένων που εμφανίζονται στην Α Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα του Mean 4-13 πειράματα. Οι αστερίσκοι (**) δείχνουν P αξία των ≤0.0001. Ένα δύο

t

τεστ ουρά Student χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αξίας P υποθέτοντας άνισες διακύμανσης. Γ Επίδραση της 1-25D on που σχετίζονται πρωτεΐνες προσκόλλησης διασταύρωση. Η έκφραση των πρωτεϊνών προσφύσεως διασταύρωση Ε-καδερίνης (Ε-cad), α-κατενίνη (α-cat), και β-κατενίνη (β-cat) αναλύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών κυτταρικό λύμα (10 μg). Σημειώστε ότι δεν υπάρχει καμία επίδραση.

Η

Η βιταμίνη D

3 βελτιώνει Gap Junction Συνέλευση και επικοινωνία των στενών τμημάτων

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της 1-25D για τη συναρμολόγηση των Cx32 σε GJS. Βρήκαμε ότι, ταυτόχρονα με την αύξηση του επιπέδου έκφρασης Cx32, 1-25D αυξήθηκε επίσης συγκρότημα GJ όπως εκτιμήθηκε με ανοσοκυτταροχημική ανάλυση (Σχήμα 3Α) και βιοχημικά με ανάλυση στυπώματος Western του συνόλου, TX100-διαλυτές και αδιάλυτων εκχυλίσματα σε 48 ώρες μετά την κατεργασία (Σχήμα 3BC). Αυτή η βιοχημική μέθοδος βασίζεται στην αρχή ότι CXS, που έχουν ενσωματωθεί στη GJS, να γίνει αδιάλυτο στο TX100 ενώ CXS που δεν έχουν ενσωματωθεί στο GJS παραμένουν διαλυτές [53]. Αυτή η δοκιμασία έχει αναπαραγώγιμα δειχθεί να μετρήσει το συγκρότημα του CXS σε GJS όπως τεκμηριώνεται από προηγούμενες μελέτες [24], [25], [53]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ενίσχυση της συναρμολόγησης GJ συνοδεύτηκε από 2-3 φορές παράλληλη αύξηση συνδετική επικοινωνία, όπως καθορίζεται από τη συνδετική μεταφορά των τριών GJ ιχνηθετών διαπερατό φθορισμού, Lucifer Yellow (ΜΒ 443), Alexa 488 (MW 570), και Alexa 594 (MW 760). Για παράδειγμα, 1-25D αυξημένη μεταφορά συνδετική της Alexa 594 κατά 2-3 πτυχές σε σύγκριση με τους ελέγχους (Πίνακας 1). Η επίδραση της 1-25D επί συνδετική επικοινωνία ήταν τόσο ισχυρή όσο συνθετικών ανδρογόνων, MB, και το φυσικό DHT ανδρογόνων (Πίνακας 1). Για να προσδιορίσετε αν 1-25D επηρεάζεται το συγκρότημα των άλλων κομβική συγκροτήματα, εξετάσαμε επίσης το απορρυπαντικό-διαλυτότητα των προσφύσεων και σφιχτό συνδέονται διασταύρωση πρωτεϊνών. Η λογική πίσω από αυτές τις μελέτες ήταν ότι το E-CAD έχει δειχθεί ότι διευκολύνει τη συναρμολόγηση των CXS σε GJS [43], [44], [54], και η έκφραση Cx έχει δειχθεί ότι διευκολύνει τη συναρμολόγηση των σφιχτών συνδέσεων και των συστατικών πρωτεϊνών τους [39]. Βρήκαμε ότι 1-25D δεν είχε καμία επίδραση επί της διαλυτότητας της Ε-CAD και συναφείς πρωτεΐνες της, α- και β-κατενίνης, και σφιχτό συνδέονται διασταύρωση πρωτεϊνών, ΖΟ-1 και occludin, σε ΤΧ-100 υποδηλώνοντας ότι η συναρμολόγηση τους δεν ήταν ενισχύεται περαιτέρω στους αντίστοιχους κόμβους κύτταρο (Σχήμα 3Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι 1-25D, όπως ανδρογόνα και ρετινοειδή, ενισχύει το επίπεδο έκφρασης του Cx32, και την επακόλουθη συναρμολόγηση του σε GJS, χωρίς ευδιάκριτα μεταβολή του επιπέδου έκφρασης άλλων σχετιζόμενων πρωτεϊνών διασταύρωση των κυττάρων.

LNCaP -32 κύτταρα, που καλλιεργούνται είτε σε έξι καλά συστάδες ή 10-cm πιάτα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1-25D (10 ηΜ), ΜΒ (5 nm) και 1-25D συν ΜΒ για 48 ώρες. Α Συνέλευση του Cx32 (πράσινο) σε GJS αξιολογήθηκε ανοσοκυτταροχημικώς. E-CAD εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα και οι πυρήνες είναι σε μπλε χρώμα. Bar = 20 μΜ. Σημειώστε ότι ο σχηματισμός GJ ενισχύθηκε κατά την κατεργασία με 1-25D και ΜΒ. δοκιμασία διαλυτότητας Β TX100- χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί το συγκρότημα του Cx32 σε GJS, των σφιχτών συνδέονται διασταύρωση πρωτεϊνών, occludin (Occl) και ΖΟ-1 και την πρωτεΐνη adherens διασταύρωση, Ε-καδερίνης (Ε-CAD) και α-κατενίνης (α-cat). T = συνολικό κλάσμα? S = διαλυτό κλάσμα και I = αδιάλυτο κλάσμα. Γ Ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης Cx32 φαίνεται στο Β Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα του Mean 4-17 πειράματα. Να σημειωθεί ότι τόσο το συνολικό επίπεδο και το απορρυπαντικό αδιάλυτο κλάσμα του Cx32 αυξήθηκε σημαντικά. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα του Mean 3-11 πειράματα. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει P αξία των ≤0.0016, και αστερίσκοι (**) δείχνουν P αξία των ≤0.0001. Ένα δύο

t

τεστ ουρά Student χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αξίας P υποθέτοντας άνισες διακύμανσης. Σημειώστε την απουσία επίδραση στην σχετίζονται πρωτεΐνες adherens διασταύρωση, E-cad, και σφιχτό συνδέονται διασταύρωση πρωτεϊνών, occludin (Occl).

Η

Η βιταμίνη D

3 ρυθμίζει ανδρογόνων-ρυθμιζόμενη Σχηματισμός και υποβάθμιση της Gap Κόμβων

Προηγούμενες μελέτες με LNCaP-32 κύτταρα είχαν δείξει ότι ανδρογόνων εξάντληση προκαλείται υποβάθμιση του Cx32 από ERAD, και ότι τα ανδρογόνα ενισχυμένη σχηματισμό GJ με την εκ νέου δρομολόγηση του ERAD στόχευση πισίνα του Cx32 στην επιφάνεια του κυττάρου , καθιστώντας δεκτικά για συναρμολόγηση GJ [25]. Σε μεταγενέστερες μελέτες, δείξαμε ότι ο σχηματισμός ανδρογόνων-ρυθμίζεται και η υποβάθμιση των GJS αποτράπηκε από 9-CRA και ATRAs [31]. Εμείς εξορθολογισμός ότι 1-25D θα μπορούσε να ενισχύσει τη συναρμολόγηση GJ από τη διάσωση της ERAD στόχευση πισίνα του Cx32, όπως 9-CRA και ATRA. Επομένως, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης της Cx32 και συναρμολόγηση του σε GJS κατά ανδρογόνων εξάντληση με την παρουσία και απουσία του 1-25D σε LNCaP-32 κύτταρα. Για τις μελέτες αυτές, χρησιμοποιήσαμε ανδρογόνο εξαντλημένο (απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα) και φαινόλης-ερυθρό-ελεύθερο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας για να αυξηθεί κύτταρα επειδή ερυθρού φαινόλης έχει ασθενή επίδραση στερεοειδογόνο [46]. Όπως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας [25], βρήκαμε ότι τα ανδρογόνα εξάντληση μείωσε το επίπεδο έκφρασης του Cx32 εντός 12 h, η οποία όχι μόνο εμποδίστηκε με την προσθήκη ΜΒ, αλλά επίσης και από 1-25D (Σχήμα 4AB). Επιπλέον, σε συνδυασμό με θεραπεία ΜΒ και 1-25D φάνηκε να είναι πιο αποτελεσματική στην αύξηση του επιπέδου έκφρασης Cx32 (Σχήμα 4Α, άνω κηλίδα). Βρήκαμε επίσης ότι η εξάντληση των ανδρογόνων μείωσε το επίπεδο έκφρασης του AR, το οποίο επίσης εμποδίζεται κατά την κατεργασία με όχι μόνο ανδρογόνων, αλλά και με 1-25D (Σχήμα 4Α, κηλίδα κάτω). Να τεκμηριώσει τα παραπάνω στοιχεία, εκτιμήσαμε περαιτέρω το σχηματισμό GJS ανοσοκυτταροχημικώς (Σχήμα 5Α) και λειτουργικά μετρώντας την κομβική μεταφορά του Εωσφόρου κίτρινο, Alexa 488 και Alexa 594 (Πίνακας 2). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GJS ήταν μόλις παρατηρήθηκε σε κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε ανδρογόνα εξαντλημένο μέσο όπως αξιολογείται από την έλλειψη Cx32 ειδικής ανοσοχρώσης σε περιοχές επαφής κυττάρου-κυττάρου, ενώ είχαν παρατηρείται εύκολα όταν ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο συμπληρώθηκε με 1-25D και MB (Σχήμα 5Α). Λειτουργικοί προσδιορισμοί έδειξαν ότι η συνδετική μεταβίβαση του Lucifer Yellow, Alexa 488 και Alexa 594 μειώθηκαν σημαντικά κατά την εξάντληση των ανδρογόνων, η οποία εμποδίστηκε κατά την αναπλήρωση ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο με ΜΒ και 1-25D (Πίνακας 2), τεκμηριώνοντας έτσι τα ανοσοκυτταροχημική δεδομένων.

LNCaP-32 κύτταρα, εμβολιάζονται σε δίσκους 10 εκ, άλλαξαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα (ανδρογόνα-εξαντλημένο) μέσο (ST). Το επίπεδο έκφρασης του Cx32 και AR προσδιορίστηκαν με ανάλυση Western blot (Α) υπό την παρουσία και απουσία του 1-25D (10 ηΜ) και ΜΒ (5 ηΜ). Σημειώστε ότι Cx32 και AR αποδομούνται την εξάντληση των ανδρογόνων και της υποβάθμισης μπλοκάρεται κατά 1-25D θεραπεία. Π.Χ. Ποσοτικές αναλύσεις του επιπέδου έκφρασης Cx32 (Β) και AR (C) των δεδομένων που εμφανίζεται στην Α Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από 5-11 πειράματα. Οι αστερίσκοι (**) δείχνουν P αξία των ≤0.0001. Ένα δύο ουρά του Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αξίας P υποθέτοντας άνισες διακύμανσης.

Η

LNCaP-32 κύτταρα, εμβολιάζονται σε έξι και συστάδες ή 10 εκατοστά πιάτα, άλλαξαν σε ξυλάνθρακα -stripped, ανδρογόνο-εξαντλημένο μέσο (ST). συναρμολόγηση GJ και το επίπεδο έκφρασης του Cx32 προσδιορίστηκαν με ανοσοκυτταροχημικές (Α) και Western blot (Β) αναλύσεις με δοκιμασία TX100-διαλυτότητα υπό την παρουσία και απουσία του 1-25D (10 ηΜ) και ΜΒ (2,5 ηΜ). Στο (Α), Cx32 είναι σε πράσινο και E-CAD είναι κόκκινο και οι πυρήνες (μπλε) χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. μπαρ κλίμακα στην Α = 20 μΜ. Στο (Β), Τ = ολική κλάσμα? S = διαλυτό κλάσμα και I = αδιάλυτο κλάσμα. TX100-διαλυτά και αδιάλυτα κλάσματα καθώς και ανοσοκυτταροχημική ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν 24 ώρες μετά την απογύμνωση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Σημειώστε ότι οι GJS υποβαθμιστεί κατά των ανδρογόνων εξάντληση και την υποβάθμιση μπλοκάρεται κατά 1-25D θεραπεία (Α). Σημειώστε επίσης ότι η TX100-διαλυτό κλάσμα του Ε-CAD (Ε-cad), β-κατενίνης (β-CAT) και ΖΟ-1 δεν επηρεάζεται. Σημειώστε επίσης ότι ανδρογόνο εξάντληση αυξάνει το διαλυτό κλάσμα του occludin (Β) χωρίς να επηρεάζει τα συνολικά επίπεδα occludin όπως ποσοτικοποιείται σε D. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει τιμή Ρ της ≤0.0016 και αστερίσκους (**) δείχνουν την τιμή Ρ του ≤0.0001. Ένα δύο ουρά του Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αξίας P υποθέτοντας άνισες διακύμανσης.

Η

Τα στοιχεία ανοσοκυτταροχημικές και συνδετική μεταφορά περαιτέρω ενισχύεται από την δοκιμασία TX100-διαλυτότητα ( Εικόνα 5BC). Εξετάσαμε επίσης την επίδραση των ανδρογόνων-εξάντληση στο απορρυπαντικό-διαλυτότητα του E-cad και β-κατενίνης και σφιχτό-διασταύρωση που σχετίζονται πρωτεΐνες, ΖΟ-1 και occludin. Συνεπής με προηγούμενες μελέτες μας [25], τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξάντληση των ανδρογόνων αύξησε το απορρυπαντικό-διαλυτότητα του occludin αλλά όχι της ΖΟ-1 και Ε-CAD και β-κατενίνης (Σχήμα 5BD). Εξετάσαμε επίσης την επίδραση του ΜΒ και 1-25D είτε μόνα τους ή σε συνδυασμό για το σχηματισμό GJS σε γονική LNCaP-P και G418-ανθεκτικά κύτταρα LNCaP-Ν και βρέθηκε ότι δεν είχαν καμία επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι 1-25D αποτρέπει ανδρογόνο ρυθμίζονται αποδόμηση της Cx32 και ενισχύει το σχηματισμό GJ σε LNCaP-32 κύτταρα. Επειδή συνδυασμένη θεραπεία με ανδρογόνα και 1-25D δεν αύξησε τη συναρμολόγηση GJ περαιτέρω, είναι πιθανό ότι το συγκρότημα ενισχύθηκε με τη διάσωση του ίδιου πισίνα του Cx32 που στοχεύονται για ERAD κατόπιν ανδρογόνων εξάντληση. Επιπλέον, όπως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας, η συναρμολόγηση και απορρυπαντικό-διαλυτότητα του Cx32 και occludin στο κελί διασταυρώσεις, ή αντίστροφα, φαίνεται να ρυθμίζεται συντονισμένα [25].

1-25D Βελτιώνει Gap Junction Σχηματισμός Ανεξάρτητα από ανδρογόνων υποδοχέων Λειτουργία

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι 1-25D εμπόδισε την υποβάθμιση του AR μετά την εξάντληση των ανδρογόνων (Εικόνα 4Α, κηλίδα κάτω). Επίσης επεξεργασία των κυττάρων LNCaP με 1-25D είχε αποδειχθεί ότι ενισχύει το επίπεδο έκφρασης AR [40]. Έτσι, εξετάζεται η πιθανότητα ότι η επίδραση του 1-25D για την ενίσχυση της διάταξης GJ εξαρτάται από την λειτουργία του AR και μόνο – και όχι στην ανεξάρτητη επίδραση του 1-25D. Για να ελέγξετε αυτήν την έννοια, θα αντιμετωπίζονται LNCaP-32 κύτταρα με αντι-ανδρογόνα, Casodex (βικαλουταμίδη), για να εμποδίσει δράση των ανδρογόνων [55], [56]. Τόσο ανδρογόνων εξάντληση και η θεραπεία με Casodex προκαλείται αποικοδόμηση του AR (Σχήμα 6Α, άνω κηλίδα, Σχήμα 6Β) και κατήργησε την επίδραση του ΜΒ και DHT σε επίπεδο έκφρασης Cx32 (Σχήμα 6Α, κηλίδα κάτω? Σχήμα 6Β) ως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας [25], [31]. Ωστόσο, βρήκαμε ότι Casodex δεν είχε καμία επίδραση στην ενίσχυση του επιπέδου έκφρασης Cx32 που προκύπτει από τη θεραπεία με 1-25D σε ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο (Σχήμα 6AB). Για να τεκμηριώσει αυτά τα δεδομένα, εξετάσαμε έπειτα το σχηματισμό GJS ανοσοκυτταροχημικώς σε κύτταρα κατεργασμένα με Casodex με την παρουσία και απουσία του ΜΒ ή 1-25D. Βρήκαμε ότι GJS δεν σχηματίστηκαν όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Casodex σε φυσιολογικό ορό ή σε μέσο απεμπλουτισμένο ανδρογόνο περιέχει ΜΒ όπως παρατηρήθηκε σε προηγούμενες μελέτες μας (Σχήμα 7) [25], [31]. Από την άλλη πλευρά, βρήκαμε ότι GJS είχαν άφθονα σχηματίζονται όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Casodex και 1-25D (Σχήμα 7). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ο μηχανισμός με τον οποίο 1-25D αποτρέπει την αποικοδόμηση του Cx32 και ενισχύει το σχηματισμό GJ κατόπιν ανδρογόνων εξάντληση είναι ανεξάρτητη από AR.

LNCaP-32 κύτταρα, εμβολιάστηκαν σε 6-cm πιάτα, αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν για επιπλέον 24 ώρες σε κανονικό μέσο (NS), ανδρογόνο-εξαντλημένο μέσο μόνο (ST), κανονικό ορό συμπληρωμένο με Casodex (CDX? NS + CDX), ανδρογόνο-εξαντλημένο μέσο συμπληρωμένο με ΜΒ (ST + ΜΒ), MB και Casodex (ST + MB + CDX), 1-25D (ST + 1-25D), 1-25D και Casodex (ST + 1-25D + CDX) και σε φυσιολογικό ορό με 1-25D (NS + 1-25D ).