Αφηρημένο

Ιστορικό

Η επιδημιολογική σύνδεση της κεφαλής και του τραχήλου με καπνού χωρίς καύση (ST) τονίζει η πρέπει να ξετυλίξουν των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, και να προσδιορίσει φαρμακολογικά ασφαλή μέσα για την έγκαιρη παρέμβαση και πρόληψη της υποτροπής της νόσου. Guggulsterone (GS), ένα biosafe nutraceutical, αναστέλλει την ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι που διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη HNSCC. Ωστόσο, το δυναμικό της GS για την καταστολή ST και νικοτίνη (κύριο συστατικό του ST) που προκαλείται HNSCC παραμένει ανεξερεύνητο. Υποθέσαμε GS να καταργήσει τα αποτελέσματα της ST και νικοτίνη στην απόπτωση στα κύτταρα HNSCC, εν μέρει από την ενεργοποίηση της PI3K /Akt μονοπατιού και τους μεταγενέστερους στόχους του, Bax και Bad.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ST και θεραπεία νικοτίνη είχε σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ, ΡϋΚ1, Akt, και κατάντη του πρωτεΐνες – Raf, ΟδΚ3β και PS6 ενώ GS προκάλεσε μια φορά μείωση εξαρτώμενη ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. ST και θεραπεία νικοτίνη είχε επίσης ως αποτέλεσμα την επαγωγή της Bad και Bax φωσφορυλίωση, αύξησε τη σύνδεση της Bad με 14-3-3ζresulting της δέσμευσης του στο κυτταρόπλασμα του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα, εμποδίζοντας έτσι προ-αποπτωτική λειτουργία του. Αξίζει να σημειωθεί ότι, GS προ-επεξεργασία ανέστειλε ST /νικοτίνη που προκαλείται από την ενεργοποίηση της PI3K /Akt μονοπατιού, και ανέστειλε την Akt μεσολάβηση φωσφορυλίωση του Bax και Bad.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, η θεραπεία της GS όχι μόνο ανέστειλε πολλαπλασιασμός, αλλά επίσης προκάλεσε απόπτωση με την κατάργηση των επιδράσεων του ST /νικοτίνης επί ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν ένα σκεπτικό για το σχεδιασμό μελλοντικών μελέτες για την αξιολόγηση του δυναμικού χημειοπροληπτικές της GS στο ST /συνδέονται νικοτίνης καρκίνο κεφαλής και τραχήλου

Παράθεση:. Macha MA, Matta Α, Chauhan SS, Siu KWM, Ralhan Ε (2011 ) Guggulsterone Στόχοι καπνού χωρίς καύση Induced PI3K /AKT οδό σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. PLoS ONE 6 (2): e14728. doi: 10.1371 /journal.pone.0014728

Επιμέλεια: Madhuri Kango-Singh, Πανεπιστήμιο του Dayton, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Ιουλίου του 2010? Αποδεκτές: 14 του Δεκέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 24 Φεβρουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Macha et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Muzafar Α . Macha είναι αποδέκτης ενός Senior Research Fellowship του Συμβουλίου της Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας (CSIR), Νέο Δελχί, Ινδία. Ajay Matta είναι ο αποδέκτης μιας MITACS Επιτάχυνση Fellowship, Οντάριο, Καναδάς. Ranju Ralhan αναγνωρίζει με ευγνωμοσύνη την υποστήριξη της Sonshine Κέντρο Ιωσήφ και Mildred για Κεφαλής και Ασθένειες Λαιμός, ο Άλεξ και η Simona Shnaider Εργαστήριο Μοριακής Ογκολογίας, Temmy Latner /Dynacare, και το Τμήμα Ωτορινολαρυγγολογία-Head and Neck Surgery, Mount Sinai Hospital του Πανεπιστημίου του Τορόντο . K.W. Michael Siu αναγνωρίζει χρηματοδότηση από το Ινστιτούτο του Οντάριο για την Έρευνα του Καρκίνου (OICR), υποστήριξης και υποδομής από το Οντάριο Έρευνας και Ανάπτυξης Ταμείο Πρόκληση και AB SCIEX. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κεφαλής και τραχήλου ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) παραμένει μια σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας σε όλο τον κόσμο με τα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης περίπου 50%, αμαυρώθηκε από συχνή υποτροπή ή σχηματισμό της δεύτερης πρωτοπαθών όγκων (10-25% του περιπτώσεις) [1], [2]. Σε παγκόσμια κλίμακα, η χρήση των προϊόντων καπνού είναι ο κύριος παράγοντας κινδύνου, με την κατανάλωση (ST) χωρίς καύση του καπνού που συνδέονται με την υψηλή συχνότητα εμφάνισης της HNSCC [3] – [5]. ST χρησιμοποιείται σε πολλαπλές μορφές και συγκεκριμένα naswar, Gutkha, khaini (ένα μίγμα ST με ασβέστη) και έχει ή με ινδοκάρυδο λίρες, έχουν ταξινομηθεί ως καρκινογόνο για τον άνθρωπο από τη Διεθνή Υπηρεσία Έρευνας στον Καρκίνο (IARC) [6], [7] . Η συσχέτιση του καπνίσματος με HNSCC είναι ευρέως γνωστό, αλλά η σχέση μεταξύ της χρήσης ST και καρκίνου κεφαλής και τραχήλου αναδύεται. Σε μια πρόσφατη έκθεση, Stepanov

et al.

[8] εντοπίστηκαν 23 πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (PAH) στο ST, εκτός από νιτροζαμίνες και νικοτίνης, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενες μελέτες [7]. Η νικοτίνη ενισχύει τον πολλαπλασιασμό, επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου και αναστέλλει την απόπτωση σε ορισμένους τύπους ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και επάγει την αγγειογένεση in vivo με παρατεταμένη ενεργοποίηση των οδών μιτογονικής [9] – [11]. Η νικοτίνη έχει αναφερθεί ότι αναστέλλουν την απόπτωση που επάγεται από οπιοειδή και γενοτοξικό στρες που προκαλείται από ετοποσίδη, σισπλατίνη, ή ακτινοβολία UV στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [12], [13]. Επιπλέον, η νικοτίνη ενεργοποιεί ΡΙ3Κ /Akt μονοπατιού και αναστέλλει την προ-αποπτωτική λειτουργίες του Βαχ και Bad μέσω φωσφορυλίωσης [14], [15]. Τα ευρήματα αυτά μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσον ST (khaini) προκαλεί Akt ενεργοποίηση του PI3K /μονοπατιού σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα.

Επίσης, ο εντοπισμός των φαρμακολογικά ασφαλή chemopreventive παράγοντες που μπορεί να καταστείλει ST /νικοτίνης που προκαλείται PI3K /Akt μονοπατιού στο HNSCC είναι πιθανό να έχει τη δυνατότητα να αποτρέψει ST που προκαλείται από το κεφάλι και το λαιμό καρκινογένεση. Guggulsterone (GS), (4,17 (20) -pregnadien- 3,16-διόνη), ένα συστατικό της ινδικής Ayurvedic φάρμακα φυτικής

Commiphora mukul

είναι ένα φαρμακευτικό προϊόν διατροφής biosafe με αντι-νεοπλασματικές ιδιότητες [16] – [18]. GS έχει αναφερθεί ότι επάγουν απόπτωση, καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή, αγγειογένεση, μετάσταση και αντίστροφη της αντίστασης στα φάρμακα, καθιστώντας το ένα πιθανό συμπληρωματικό αντικαρκινικό παράγοντα [19] – [24]. GS δεσμεύεται με farnesoid υποδοχέα Χ και έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν την έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόπτωση (IAP1, ΧΙΑΡ, Bfl-1 /Α1, Bcl-2, cFLIP, survivin), τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (κυκλίνη D1, c-Myc), αγγειογένεση και μετάσταση (ΜΜΡ-9, COX-2, VEGF) [25]. Αυτή η στερόλη ασκεί βιολογικές επιδράσεις της με ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής – πυρηνικού παράγοντα κάππα Β (ΝΡκΒ), STAT-3 και C /EBP άλφα, και υποδοχείς στεροειδούς – υποδοχέων γλυκοκορτικοειδών και του υποδοχέα ανδρογόνων. Η ομάδα μας και άλλοι απέδειξαν πρόσφατα αντικαρκινική δράση της GS στις γραμμές HNSCC και κυττάρου μυελώματος με αναστολή NFκB και STAT3? μεταγενέστερες μελέτες ανέφεραν παρόμοια αποτελέσματα σε άλλες κυτταρικές γραμμές καρκίνου και σε ζωικά μοντέλα του παχέος εντέρου και του καρκίνου του δέρματος [19], [24], [26].

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα σε θεραπεία με ST /νικοτίνη και αδρανοποίηση του από GS. Περαιτέρω θα αμφισβητηθεί η ενεργοποίηση της Akt και κατάντη των στόχων της (PS6, ΟδΚ3β και Raf), από ST /νικοτίνης σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα (SCC4) από προ-θεραπεία με GS.

Αποτελέσματα

Επίδραση του ST και νικοτίνη ενεργοποιούν το PI3K /Akt μονοπατιού σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα

η κινητική δόση και το χρόνο της ST και της νικοτίνης (εθιστικό συστατικό του καπνού) θεραπεία στο κεφάλι και το λαιμό καρκινικά κύτταρα (SCC4 και HSC2 ), προσδιορίστηκαν με ΜΤΤ δοκιμασία (Σχήμα 1Α και 1Β). Παρόμοια κινητική παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και τα αποτελέσματα για SCC4 κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 1. Η έκθεση σε ST και η νικοτίνη αύξησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και στις δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο με μία βέλτιστη δόση 20 μg /ml για ST και 10 μΜ για νικοτίνη. Οι βέλτιστες δόσεις έχουν χρησιμοποιηθεί σε όλα τα μετέπειτα πειράματα. Για να διερευνηθεί η επίδραση της ST ή της νικοτίνης επί της οδού των Akt σε κύτταρα HNSCC, αμφότερα τα κύτταρα SCC4 και HSC2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μg /ml του ST ή με νικοτίνη (10 μΜ) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα ή φυλάσσονται χωρίς θεραπεία, και την ενεργοποίηση Akt (Akt φωσφορυλίωση σε Ser-473 και Ser-309) προσδιορίστηκε στα εκχυλίσματα πρωτεΐνης με κηλίδωση Western. Τόσο ST και νικοτίνη αυξήθηκε ταχέως φωσφορυλίωση της Akt χωρίς να επηρεάζει τα συνολικά επίπεδα Akt και στα δύο κύτταρα HSC2 και SCC4 (Σχήμα 2Α και 2Β αντίστοιχα). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι ST και νικοτίνη ενεργοποιούν Akt σε δόσεις που θα μπορούσε να είναι φυσιολογικά σχετικό. Περαιτέρω, η ανάλυση Western Blot μας έδειξαν τόσο ST και νικοτίνη προκάλεσε μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση στην φωσφορυλίωση των δύο ανάντη κινάσες, ΡΙ3Κ και PDK1, καθώς και οι κατάντη στόχοι, Raf, ΟδΚ3β, και PS6 σε κύτταρα SCC4 (Σχήμα 2Α και 2Β ), η οποία αντανακλά την ταχεία έναρξη της αυξημένης φωσφορυλίωσης Akt. Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (SCC4 και HSC2) ως εκ τούτου, τα δεδομένα μόνο για SCC4 κύτταρα έχουν δειχθεί εδώ.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (Α) ST (1-500 μg /ml), ( Β) νικοτίνη (1-100 μΜ) για 24-96 ώρες. Το Σχήμα απεικονίζει μέσος όρος τριών πειραμάτων που έγιναν ανεξάρτητα.

Η

κύτταρα SCC4 (2-3 × 10

6) υποβλήθηκαν σε αγωγή με (Α) ST (20 μg /ml) ή (Β) νικοτίνη ( 10 μΜ), για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα και τα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων (60 μg πρωτεΐνης) αναλύθηκαν σε 10% SDS-PAGE, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και μη εξειδικευμένη σύνδεση παρεμποδίστηκε με 5% άπαχο γάλα για όλη τη νύχτα. Η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανίχνευση με φωσφο-ειδικά αντισώματα για pAkt (thr-309), pAkt (Ser-473). pGSKβ3, pRaf, pPDK1 και Akt χρησιμοποιώντας βελτιωμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας. Κηλίδωση Western για την α-τουμπουλίνης έγινε για να δείξει ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης.

Η

Επίδραση των Guggulsterone στο ST και η νικοτίνη που προκαλείται από την ενεργοποίηση της PI3K /Akt μονοπατιού

Τόσο ST και προκαλείται από τη νικοτίνη διέγερση Akt μονοπάτι, ως εκ τούτου, διερευνήσαμε την επίδραση της GS στις ST και νικοτίνη επαγόμενη ενεργοποίηση της Akt μονοπατιού. κύτταρα SCC4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GS (50 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους και τα εκχυλίσματα τους σε πρωτεΐνες ελέγχθηκαν για ενεργοποίηση Akt. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, GS ανέστειλε την ενεργοποίηση της Akt, ανάντη κινάσες ΡΙ3Κ, ΡϋΚ1, καθώς και τα κατάντη πρωτεΐνες, Raf, ΟδΚ3β και PS6. Η τυποποίηση δόση του αναστολέα ΡΙ3Κ /Akt, LY294002, διεξήχθη δια κατεργασίας των κυττάρων SCC4 με διαφορετικές συγκεντρώσεις του αναστολέα (0.5-10 μΜ) για 1 ώρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, LY294002 (10 μΜ) ανέστειλε πλήρως την έκφραση του ενεργοποιημένου Akt? ενώ δεν παρατηρήθηκε επίδραση επί των συνολικών Akt επίπεδα έκφρασης. κύτταρα SCC4 προ-αγωγή με GS για 4 ώρες ή LY294002 (10 μΜ) για 60 λεπτά, ακολουθούμενη από ST (20 μg /ml) για 6 ώρες ή νικοτίνη (10 μΜ) για 4 ώρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η GS, καθώς και LY294002 μπλοκάρει ST και ενεργοποίηση Akt μονοπάτι επαγόμενων από τη νικοτίνη (Σχήμα 3C), αν και δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στην έκφραση του συνολικού Akt και ΟδΚ3β σε αυτά τα χρονικά σημεία.

SCC4 κύτταρα ( 2-3 × 10

6) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με () GS Α (50 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα και /ή (Β) με LY294002 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 1 ώρα. (C) κύτταρα SCC4 (2-3 × 10

6) προ-επεξεργασία με 50 μΜ GS για 4 ώρες ή με LY294002 (10 μΜ) για 1 ώρα και διεγείρονται με ST (20 μg /ml) για 6 ώρες , ή με νικοτίνη (10 μΜ) για 4 ώρες. Εξήντα μικρογραμμάρια πρωτεϊνών από εκχυλίσματα ακέραιων κυττάρων διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και ακολούθησε αποκλεισμός με 5% άπαχο γάλα για όλη τη νύχτα. Η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανίχνευση με ειδικά αντισώματα χρησιμοποιώντας ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας.

Η

Guggulsterone και ΡΙ3Κ-ειδικός αναστολέας LY294002 μπλοκ ST και επάγεται νικοτίνη Bad και Bax φωσφορυλίωση

Τόσο ST και νικοτίνη ισχυρά διεγείρεται φωσφορυλίωση της σερίνης της Bad και Bax με τρόπο που εξαρτάται χρόνου (Σχήμα 4Α και 4Β) έχοντας σαν αποτέλεσμα κατάργηση της προ-αποπτωτική λειτουργία τους. Για να αποδειχθεί λειτουργικό ρόλο της Akt ως φυσιολογική ST και νικοτίνη ενεργοποιούνται Bax και Bad κινάση, LY294002, ένας ειδικός αναστολέας της ΡΙ3Κ που μπορεί να μπλοκάρει το /Akt μονοπάτι σηματοδότησης ΡΙ3Κ, χρησιμοποιήθηκε. κύτταρα SCC4 προ-επεξεργασία με LY294002 (10 μΜ) για 60 λεπτά ή 50 μΜ GS για 4 ώρες ακολουθούμενο από ST (20 μg /ml) για 6 ώρες ή με νικοτίνη (10 μΜ) για 4 ώρες. GS καθώς και LY294002 μπλοκάρει ST και νικοτίνη που προκαλείται Βαχ και φωσφορυλίωση της Bad (Σχήμα 4Α και 4Β). Καμία επίδραση επί της έκφρασης του συνόλου των Bad και Bax παρατηρήθηκε σε αυτά τα χρονικά σημεία. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αναστολή της ST και νικοτίνη που προκαλείται από Bax και Bad φωσφορυλίωση από GS μπορεί να αποκαταστήσει την προ-αποπτωτική λειτουργία αυτών των μορίων.

κύτταρα SCC4 (2-3 × 10

6) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ( Α) ST (20 μg /ml) ή (Β) νικοτίνη (10 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. κύτταρα SCC4 προ-επεξεργασία με LY294002 (10 μΜ) για 60 λεπτά, ή 50 μΜ GS για 4 ώρες, ακολουθούμενη από ST (20 μg /ml) για 4 ώρες, ή με νικοτίνη (10 μΜ) για 4 ώρες, και ολόκληρο β-κυττάρων εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν. Εξήντα μικρογραμμάρια πρωτεϊνών από εκχυλίσματα ακέραιων κυττάρων διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και ακολούθησε αποκλεισμός με 5% άπαχο γάλα για όλη τη νύχτα. Η έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια μέθοδο και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα εναντίον ρΒΑϋ και PBAX. Οι κηλίδες γδύθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται για Bax και Bad πρωτεΐνες.

Η

Akt είναι συν-εντοπίζεται με Bax στο κυτταρόπλασμα

Για να αξιολογηθεί ένα πιθανό άμεσο ρόλο για Akt ως φυσιολογική κινάση Bax, υπο-κυτταρική κατανομή της Akt και Βαχ εκτιμήθηκαν με χρώση ανοσοφθορισμού. Βαχ είχε αρχικά συν-εντοπισμένη με Akt στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων SCC4 (Σχήμα 5Α) υποδηλώνοντας ότι και οι δύο ST και νικοτίνη ενεργοποιηθεί Akt έχει τη δυνατότητα να φωσφορυλιώνουν άμεσα και αδρανοποιούν Bax σε κύτταρα SCC4.

Η φωσφορυλίωση του Βαχ και Bad οδηγεί σε κατακράτηση αυτών των πρωτεϊνών σε κυτοσόλιο και αποτυχία να στοχεύουν τα μιτοχόνδρια

Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ST και νικοτίνη μπορεί να προκαλέσει (Ser-184) και Bad (Ser-136) φωσφορυλίωση Βαχ, και φωσφορυλίωση σε αυτές τις θέσεις σαν αποτέλεσμα αδρανοποίηση του προ-αποπτωτική λειτουργία του Βαχ και Bad. Είναι γνωστό ότι η προ-αποπτωτική δραστηριότητα του Βαχ και Bad εξαρτάται από κυτοσολικό ή μιτοχονδριακό εντοπισμό. Για να ελεγχθεί αν η φωσφορυλίωση του Βαχ και κακά αποτελέσματα υπο-κυτταρικό εντοπισμό του, τα κύτταρα SCC4 κρατήθηκαν ακατέργαστα ή κατεργασμένα με GS (50 μΜ) για 4 ώρες, ST (20 μg /ml) επί 6 ώρες και νικοτίνη (10 μΜ) για 4 h. Υπο-κυτταρικά κλασματοποιήσεις εκτελέσθηκαν για να απομονωθούν τα μιτοχόνδρια και κυτοσόλιο όπως περιγράφεται υπό υλικό και μεθόδους. Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα SCC4, η πλειοψηφία των Βαχ και Bad βρέθηκε στο κυτοσόλιο, και μόνο μια μικρή ποσότητα αυτών των πρωτεϊνών, εντοπίστηκε στα μιτοχόνδρια (Σχήμα 5Β). Σε GS παρατηρήθηκαν κατεργασμένα κύτταρα πλειονότητα των πρωτεϊνών αυτών στο μιτοχονδριακό κλάσμα. Σε αντίθεση, τόσο ST και κύτταρα επεξεργασμένα νικοτίνη, Βαχ και Bad είχαν παρατηρείται κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 5Β).

Αξιοσημείωτα, προ-επεξεργασία των κυττάρων με SCC4 GS (50 μΜ) για 4 ώρες, ακολουθούμενη με ST (20 μg /ml) αγωγή για 6 ώρες ή νικοτίνη (10 μΜ) για 4 ώρες, έδειξε μια μετατόπιση στην εντόπιση της Βαχ και Bad και την πλειοψηφία αυτών των πρωτεϊνών παρατηρήθηκε στο μιτοχονδριακό κλάσμα (Σχήμα 5Β). Για να επιβεβαιωθεί η καθαρότητα των υποκυτταρικών κλασμάτων που λαμβάνονται, ηλεκτρική αφυδρογονάση, μία πρωτεΐνη αποκλειστικά στο μιτοχόνδρια, αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. ηλεκτρική αφυδρογονάση, ανιχνεύθηκε μόνο στο μιτοχονδριακό κλάσμα και όχι στο κυτοσόλιο (Σχήμα 5Β), επιβεβαιώνοντας την καθαρότητα των μιτοχονδριακών και κυτοσολικά κλάσματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την εξασφάλιση ίσων πρωτεΐνη φόρτωση σε όλες τις λωρίδες.

κύτταρα SCC4 (5 × 10

3) απλώθηκαν σε καλυπτρίδες και επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης Βαχ και ένα αντίσωμα κουνελιού κατά της ανθρώπινης αντισώματα ΑΚΤ. Alexa flour®594 συζευγμένο αντι-κουνελιού (κόκκινο) και ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη συζευγμένη (πράσινο) δευτερεύοντα αντισώματα αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει Akt (κόκκινο) και Βαχ (πράσινο) μοτίβα εντοπισμού χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Panel (i) DAPI χρώση των πυρήνων σε μπλε χρώμα? (Ii) κυτταροπλασματική έκφραση του Βαχ? (Iii) κυτταροπλασματική έκφραση του Akt πρωτεΐνη? και (iv) συγχωνεύθηκαν μικροφωτογραφία (ii) και (iii) που δείχνει συν-εντοπισμό των Βαχ και Akt. (Β) Η φωσφορυλίωση των Βαχ στο (Ser-184) και Bad (Ser-136) οδηγεί σε κατακράτηση Βαχ και Bad σε κυτοσόλιο. κύτταρα SCC4 κρατήθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 50 μΜ GS για 4 ώρες, ST (20 μg /ml) για 6 ώρες, 10 μΜ νικοτίνη για 4 ώρες. κύτταρα SCC4 προ-επεξεργασία με 50 μΜ GS για 4 ώρες, που ακολουθείται από ST για 6 ώρες ή με νικοτίνη για 4 ώρες. Cytoplasmic (C) και Μιτοχονδριακή (Μ) εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους και διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρονται τα ηλεκτρολογικά επί μεμβράνη PVDF και ακολούθησε αποκλεισμός με 5% άπαχο γάλα για όλη τη νύχτα. Οι κηλίδες επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα έναντι Βαχ και Bad. Η έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας. Η καθαρότητα των υποκυτταρικών κλασμάτων που λαμβάνονται προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Western Blot για μιτοχονδριακή πρωτεΐνη, ηλεκτρικό αφυδρογονάση. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

ST και επαγόμενη νικοτίνη Bad φωσφορυλίωση ενισχύει την αλληλεπίδραση με 14-3-3ζ

Bad φωσφορυλίωση (ser-136) προωθεί την μετατόπιση του από μιτοχόνδρια σε κυτοσόλιο και αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη 14-3-3 ικρίωμα. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον ST ή νικοτίνη επηρεάζει σύνδεση της Bad, κύτταρα SCC4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ST (20 μg /ml) ή νικοτίνη (10 μΜ) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Συν-ανοσοκαταβύθιση 14-3-3ζ και Bad έδειξε μια εξαρτώμενη αύξηση του χρόνου σε δεσμευμένη ρΒΑϋ στα ανοσοσύμπλοκα (ΙΡ) του 14-3-3ζ υποδεικνύοντας σύνδεσης μεταξύ 14-3-3ζ και ρΒΑϋ (Εικόνα 6Α και 6Β), για την επεξεργασία με ST και νικοτίνη, αντίστοιχα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε δοκιμασίες αντίστροφης ανοσοκαταβύθιση, στύπωση Western έγινε για 14-3-3ζ σε ανοσοσύμπλοκα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα ρΒΑϋ, επιβεβαιώνοντας την αλληλεπίδραση του 14-3-3ζ με ρΒΑϋ (Σχήμα 6Α και 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ST και νικοτίνη επαγόμενη φωσφορυλίωση της Bad οδήγησε σε διαχωριστικούς Bad στο κυτταρόπλασμα, λειτουργικά αποκλεισμού προ-αποπτωτική λειτουργία του.

SCC4 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με (Α) ST (20 μg /ml) ή (Β) με νικοτίνη (10 μΜ) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα, και προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. 14-3-3ζ ανοσοκατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα και η δεσμευμένη πρωτεΐνη ρΒΑϋ συν-καθιζάνει με 14-3-3ζ προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Αντίστροφη προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης πραγματοποιήθηκαν στην οποία ρΒΑϋ ανοσοκαταβυθίστηκε, που ακολουθείται από κηλίδωση Western ανάλυση 14-3-3ζ χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα έναντι αυτής της πρωτεΐνης. (C) Σχήμα δείχνει το υποθετικό μοντέλο για την αναστολή του ST /νικοτίνης που προκαλείται από την ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι με GS. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν θεραπεία με ST ή /και τη νικοτίνη ενεργοποιεί Akt (φωσφορυλιωμένο στο Ser-473 και Ser-309) με αποτέλεσμα φωσφορυλίωση του κατάντη στόχους της Raf, ΟδΚ3β και PS6, ενώ η αγωγή GS αναστέλλει την ενεργοποίηση του Akt μονοπατιού. Είναι ενδιαφέρον ότι, προ-θεραπεία του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυττάρων με GS αναστέλλει την ενεργοποίηση του Akt και κατάντη στόχοι της (Raf, ΟδΚ3β, και PS6) σχετικά με την έκθεση σε ST /νικοτίνη. GS προεπεξεργασίας απελευθερώνει επίσης Bad από ανασταλτική δράση του 14-3-3ζ, ενεργοποιώντας έτσι ενδογενούς οδού της απόπτωσης. Έτσι, τα αποτελέσματά μας απέδειξαν GS ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για ST-επαγόμενη κεφαλής και λαιμού καρκινογένεση.

Η

Συζήτηση

Καπνός σε διάφορες μορφές είναι ένας από τους κύριους αιτιολογικών παραγόντων για την ανάπτυξη και εξέλιξη της HNSCC. Η ανώμαλη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, την αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση σε ST συνδέονται κεφαλής και του τραχήλου καρκινογένεση έχει αναφερθεί από την ομάδα μας και άλλοι [27] – [31]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε την ενεργοποίηση της Akt σε κύτταρα HNSCC αγωγή με ST /νικοτίνη, αποδεικνύεται από παρατεταμένη φωσφορυλίωση της Akt στην σερίνη 473 και θρεονίνη 308, καθώς και οι μεταγενέστεροι υποστρώματα της (PS6, ΟδΚ3β, pRaf), σε ένα εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπος. Τόσο ST και νικοτίνη προκάλεσε επίσης την φωσφορυλίωση του ανάντι ΡϋΚ1 κινάσης (Ser241) και ρ85 υπομονάδα του άλλου ανάντη κινάση, ΡΙ3Κ σε κύτταρα SCC4. Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζονται από τις προηγούμενες εκθέσεις που δείχνουν ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt σε καλλιεργημένα φλοιώδεις νευρώνες, η κανονική ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα και μικρές αεραγωγών σε απόκριση σε θεραπεία νικοτίνης [11], [32] – [34]. Περαιτέρω, δείξαμε τόσο ST και νικοτίνη ενεργοποιηθεί Akt, επαγόμενη Bad (Ser136) και φωσφορυλίωση Βαχ (Ser 184) με αποτέλεσμα κυτταροπλασματική κατακράτηση αυτών των πρωτεϊνών. Ωστόσο, η θεραπεία με LY294002, ένας αναστολέας της ΡΙ3Κ /Akt, αναστέλλεται ισχυρά ST και φωσφορυλίωση επάγεται νικοτίνη του Bad (Ser-136) και Bax (Ser-184) με αποτέλεσμα μιτοχονδριακή επανατοπικοποίηση αυτών των πρωτεϊνών, ενισχύοντας περαιτέρω την παρατήρηση μας ότι η ST και νικοτίνη που προκαλείται φωσφορυλίωση της Bad (Ser-136) και Bax (Ser-184), με την ενεργοποίηση της PI3K /Akt. Είναι ενδιαφέρον, τόσο ST και η νικοτίνη που προκαλείται φωσφορυλίωση της Bad (Ser-136) σε κύτταρα SCC4 αυξημένη συνεργασία της με 14-3-3ζ όπως αποκαλύπτεται από δοκιμασίες συν-IP. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παγίδευση του Bad στο κυτταρόπλασμα, αναστέλλοντας έτσι την ενδογενή οδό της απόπτωσης. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν φωσφορυλίωση είτε Ser112 ή Ser136 διευκολύνει το σχηματισμό ενός συμπλόκου μεταξύ Bad και 14-3-3s στο κυτταρόπλασμα, μπλοκάροντας την αλληλεπίδραση τους με Bcl2 /Bcl-XL στο μιτοχόνδρια [35], [36].

Πρόσφατα, αποδείξαμε υπερέκφραση του PI Συνθάσης, ΡΙ3-Κ και κυκλίνης D1 στο ST αντιμετωπίζονται κύτταρα από το στόμα αλλοιώσεων και καρκίνου του στόματος [37]. Περαιτέρω, η ανάλυση κλινικών δειγμάτων από το στόμα leukoplakic αλλοιώσεις χωρίς δυσπλασία, με δυσπλασία και προφορικές πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (OSCCs), που παρείχε την πρώτη απόδειξη της αυξημένης έκφρασης του PI συνθετάση στα πρώτα στάδια του στόματος και τα προκαρκινικά στάδια του καρκίνου και η συσχέτιση της με την αποδιαφοροποίηση του όγκου και του καπνού κατανάλωση [37]. Εδώ στην επεκτείναμε τα ευρήματα αυτά να αποδείξουν GS θα μπορούσε να αναστείλει την επαγωγή της PI3K /Akt από ST και η νικοτίνη.

Έτσι, αναστέλλοντας την επαγωγή της Akt δραστηριότητας από συστατικά του καπνού ST μπορεί να είναι μια πολύτιμη προσέγγιση για την άμβλυνση των επιπτώσεων της καπνού σε καταναλωτές σε κίνδυνο για την ανάπτυξη της HNSCC, και /ή σε HNSCC ασθενείς που συνεχίζουν να καπνίζουν ή να χρησιμοποιούν τα προϊόντα ST. Από αυτή την άποψη, παρατηρήσαμε ότι η GS κατέστειλε την φωσφορυλίωση της Akt (Ser473 και Thr308), ΡϋΚ1 (Ser241) και ρ85 υπομονάδα ΡΙ3Κ, οδηγώντας σε μειωμένη φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β, pRaf, PS6, κατάντη στόχοι της Akt. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η μελέτη μας έδειξε ότι η GS ανέστειλε όχι μόνο την συστατική ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, αλλά προεπεξεργασία του καταργηθεί τόσο ST και επαγόμενη νικοτίνη ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. ST και νικοτίνη ακύρωσε τις προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του Βαχ /Bad με φωσφορυλίωση και απομόνωσης σε κυτταρόπλασμα, ωστόσο GS προεπεξεργασία ανέστειλε την επίδραση της ST και της νικοτίνης, στοχεύοντας Bax και Bad σε μιτοχόνδρια, επάγει απόπτωση. Ωστόσο, η επίδραση του GS δεν είναι ειδική και να περιορίζεται μόνο καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει τις αντικαρκινικές επιδράσεις του GS σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών τύπων δηλαδή, το κεφάλι και το λαιμό? λευχαιμία, πολλαπλό μυέλωμα, πνεύμονα, μελάνωμα, ωοθήκης, αδενοκαρκίνωμα που προέρχεται εντέρου, ορθοκολικό, του παχέος εντέρου, του δέρματος, του προστάτη, του οισοφάγου, του μαστού και [19], [21] – [24], [38] – [43]

.

Συμπερασματικά, η μελέτη μας έδειξε ότι αμφότερα ST και νικοτίνη προάγουν την επιβίωση των ανθρώπινων καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα SCC4, με την αδρανοποίηση των προ-αποπτωτική λειτουργίες του Βαχ και Bad μέσω φωσφορυλίωσης της και απομόνωσης αυτών των πρωτεϊνών σε κυτταρόπλασμα. GS όχι μόνο αναστέλλει ουσιαστικά δραστική ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, αλλά επίσης αναστέλλει ST και νικοτίνη επαγόμενη ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού και προωθεί σήματα απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 6c). Ως εκ τούτου, GS μπορεί να διερευνηθεί ως παράγοντας χημειοαποτρεπτικός για ST που προκαλείται από το κεφάλι και το λαιμό καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

z-Guggulsterone (GS), 3 – (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Ποντίκι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Bax (sc-7480)? πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι 14-3-3ζ (sc-1019), pPI3K ρ85 αντίσωμα (Tyr-508, SC-12929R) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι φωσφο-Akt (Ser 473, cat-9271), φωσφο-Akt (Thr 308, cat-9275), Akt (cat-9272), φωσφο-GSK-3β (Ser 9, cat-9336), φωσφο -Raf (Ser 259, cat-9421), φωσφο-ΡϋΚ1 (Ser 241, cat-3061), αναστολέα ΡΙ3-κινάσης LY294002 (cat-9901) ήταν όλα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Για μελέτες συν-εντοπισμό, γίδινο αντι-κουνελιού Alexa Fluor® 594 (Cat ηο Α-11012) αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Goat αντι-ποντικού FITC (Cat ηο. F2012) αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Πρωτεΐνη Α-Sepharose σφαιρίδια ελήφθησαν από την GE Healthcare Biosciences, (Uppsala, Sweden).

Κυτταροκαλλιέργεια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκινώματος, SCC4 ελήφθη από την American Type Culture Collection ( ATCC) και HSC2 (JCRB0622) ελήφθη από την Health Science Research Τράπεζα Πόρων (HSRRB), η Ιαπωνία [44], [45]. Και οι δύο αυτές καρκίνο κεφαλής και λαιμού κυτταρικές σειρές που είναι γνωστό ότι φιλοξενούν μεταλλαγμένο ρ53. κύτταρα SCC4 έχουν μια σημειακή μετάλλαξη στο κωδικόνιο 51 CCC TCC να και HSC2 κύτταρα έχουν μία μετάλλαξη στο ιντρόνιο 6 [44], [45]. κύτταρα HSC-2 περικλείουν μεταλλαγμένη PIK3CA (H1047R) [46]. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού (SCC4 και HSC2) αναπτύχθηκαν σε καλλιέργειες μονοστιβάδας σε τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco (DMEM) (Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Sigma), 1 mM L-γλουταμίνη, 1Χ πυροσταφυλικό νάτριο, βιταμίνες 1Χ, 1 mM ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 100 U /ml πενικιλίνη σε υγροποιημένο επωαστή (5% διοξείδιο του άνθρακα, 95% αέρας) στους 37 ° C όπως περιγράφεται παραπάνω [47].

Προετοιμασία του καπνού χωρίς καύση Απόσπασμα (ST)

Συνήθως χρησιμοποιείται μάρκα του αποξηραμένου καπνού (Khaini) αγοράστηκε από την τοπική αγορά. 25 γραμμάρια καπνού ήταν λεπτά κονιοποιημένου και ομογενοποιούνται σε 225 ml αποσταγμένου νερού. Το μίγμα αναδεύτηκε σε μαγνητικό αναδευτήρα για δύο ώρες και στη συνέχεια αφέθηκε να παραμείνει για 24 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση στα 5000 g για 20 λεπτά. Το εκχύλισμα αποστειρώθηκε με διαβίβαση αυτού μέσω ενός φίλτρου 0,22 μm και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι τη χρήση. Η τελική συγκέντρωση του καπνού σε υδατικό εκχύλισμα εκτιμάται ότι είναι 2,7 g% [48].

Η κυτταροτοξικότητα Δοκιμασία

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου κύτταρα (5 × 10

3 /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν εις τριπλούν με την παρουσία του μέσου που περιέχει ST /νικοτίνη ή 0,02% του DMSO η οποία χρησίμευσε ως έλεγχος οχήματος σε τελικό όγκο 100 μΐ για 24-96 ώρες στους 37 ° C. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε με προσθήκη 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) σε 37 ° C για 3-4 ώρες. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε σε μήκος κύματος 570 nm. Ο θάνατος ποσοστό κυττάρων υπολογίζεται ξεχωριστά για κάθε δόση ως εξής:. (OD

έλεγχος-OD

επεξεργασία /OD

έλεγχος) × 100, όπως περιγράφεται παραπάνω [49]

κηλίδωση Western και συνανοσοκαθίζησης (Co-IP) δοκιμασία

συνανοσοκαθίζησης (Co-IP) δοκιμασίες και WB πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται από εμάς στο παρελθόν [39]. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν από GS (50 μΜ) ή νικοτίνη (10 μΜ) κατεργασμένα κύτταρα SCC4 και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Bradford (Sigma) και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (50 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν επί 12% νάτριο δωδεκυλ θειικό άλας (SDS) -πολυακρυλαμιδίου γέλη. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν πάνω polyvinylidenedifluoride (PVDF). Μετά τον αποκλεισμό με 5% γάλα χωρίς λιπαρά σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (TBS, 0,1 Μ, ρΗ = 7,4), τα στυπώματα επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα, όπως ανά συνιστώμενη πρωτόκολλο του κατασκευαστή σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Πρωτεΐνη αφθονία του α-τουμπουλίνης (Santa Cruz Biotechnology, CA) χρησίμευσαν ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωση σε κάθε λωρίδα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με HRP, (ϋΑΚΟ Cytomation, Glostrup, Denmark), αραιωμένα σε κατάλληλη αραίωση σε 1% BSA, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από κάθε στάδιο, οι κηλίδες πλύθηκαν τρεις φορές με Tween (0,1%) – Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (TTBS). Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας (ECL, Santa Cruz Biotechnology, CA) σε φιλμ XO-MAT. δοκιμασίες συν-IP πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε νωρίτερα

Υπο-κυτταρική κλασματοποίηση:. Απομόνωση κυτταρόπλασμα και τα μιτοχόνδρια

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου κύτταρα (2 × 10

7) υποβλήθηκαν σε θεραπεία, συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά με ψυχρό 1Χ PBS και επαναιωρήθηκαν σε ισοτονικό ρυθμιστικό μιτοχονδριακή (210 mM μαννιτόλη, 70 mM σακχαρόζη, 1 mM EGTA, 10 mM Hepes, ρΗ 7,5, 0,1% BSA) που περιέχει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Τα επαναιωρημένα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν με ένα ομογενοποιητή Polytron λειτουργεί για τέσσερις ριπές των 10 s το καθένα σε ρύθμιση 5 και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 2000 g για 3 λεπτά για να κατακρημνιστούν οι πυρήνες και αδιάσπαστη κύτταρα. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g για 10 λεπτά για να σφαιροποιηθούν τα μιτοχόνδρια όπως περιγράφεται [50]. Το υπερκείμενο περαιτέρω φυγοκεντρήθηκε σε 15,000 g για να σφαιροποιηθούν φως μεμβράνες. Το προκύπτον υπερκείμενο περιείχε τα κυτοσολικά κλάσματα. Η μιτοχόνδρια πλύθηκε με μιτοχονδριακή ρυθμιστικό δύο φορές, επαναιωρήθηκαν με 1% Nonidet Ρ-40 ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, ανακινείται επί 60 λεπτά, και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο που περιέχει μιτοχονδριακών πρωτεϊνών συλλέχθηκε. Πρωτεΐνη (100 μg) από κάθε κλάσμα υποβλήθηκε σε 12% SDS-PAGE και αναλύθηκε με ανάλυση κηλίδος western χρησιμοποιώντας αντι-κυτοχρώματος c αντισώματος. Η καθαρότητα των κλασμάτων επιβεβαιώθηκε με αξιολόγηση εντοπισμός του κλάσματος-ειδικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων ηλεκτρική αφυδρογονάση για μιτοχόνδρια.

μελέτες συν-εντοπισμό των Akt και Bax σε καρκίνο του στόματος κύτταρα χρησιμοποιώντας μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ συνεστιακού

καρκίνος κεφαλής και τραχήλου κύτταρα, SCC4 και HSC2, αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS στους 37 ° C και υποβάλλονται σε επεξεργασία για συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ, όπως περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [51]. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν σε ΟυΙββοοο PBS (DPBS), στερεώθηκαν σε μεθανόλη για 5 λεπτά στους -20 ° C και επωάστηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα, μονοκλωνικά ποντικού αντι-Βαχ και μονοκλωνικά κουνελιού αντι-Ακί αντίσωμα, επωάστηκαν ως ένα κοκτέιλ στους 4 ° C όλη τη νύκτα . Μετά το ξέπλυμα σε φωσφορικό ρυθμιστικό saline- 0,1% Tween (PBST, 1Χ) οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με αντι-ποντικού FITC συζευγμένο /αντι-κουνελιού Alexa flour®594 συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα για 45 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν και αντίθετα με ϋΑΡΙ για 30 δευτερόλεπτα. Ένα αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης Βαχ, αντίσωμα κουνελιού κατά της ανθρώπινης Akt, και ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη-συζευγμένο αντι-ποντικού (πράσινο) ή ροδαμίνη-συζευγμένο αντι-κουνελιού (κόκκινο) δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν έτσι ώστε τα κύτταρα θα μπορούσαν να χρωματίζονται ταυτοχρόνως χωρίς διασταυρούμενη αντίδραση . Σε αρνητικούς ελέγχους, οι πρωτογενείς αντισώματα αντικαταστάθηκαν από μη-άνοση IgG ποντικού ίδιου ισότυπου να εξασφαλιστεί η ειδικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, οι πλάκες ξεπλύθηκαν και τοποθετήθηκαν σε μέσο στερέωσης φθορισμού και εξετάστηκαν με Lieca TCS SP2 συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (CLSM).