Abstract

Λειτουργική γενετικές παραλλαγές παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της φαινοτυπική διαφορές μεταξύ των ατόμων μέσω επηρεάζουν την έκφραση του γονιδίου, και ως εκ τούτου, πολύ πιθανό να επηρεάσουν την ευαισθησία της νόσου, όπως ο καρκίνος ευαισθησία. Ένα κρίσιμο ερώτημα σε αυτή την εποχή των μελετών συσχέτισης μεγάλη μετα-γονιδίωμα (GWAS) είναι το πώς θα αξιολογηθεί η λειτουργική σημασία των γενετικών παραλλαγών που προσδιορίζονται από GWAS. Στην παρούσα μελέτη, με λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs) από 74 μη συνδεδεμένα γυναίκες με οικογενή καρκίνο των ωοθηκών και 47 άσχετα ελέγχους συμφωνημένα στην φύλο και τη φυλή, διερευνήσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ επτά παραλλαγές των ωοθηκών κίνδυνος καρκίνου που έχουν αναγνωριστεί από GWAS (

rs3814113

για 9p22.2,

rs2072590

στο 2q31,

rs2665390

στο 3q25,

rs10088218

,

rs1516982

,

rs10098821

σχετικά με 8q24.21, και

rs2363956

σε θέση 19p13) και τα προφίλ έκφρασης του mRNA ολόκληρο το γονιδίωμα. Παρατηρήσαμε 95 σημαντικές trans-ενώσεις σε επίπεδο μετάθεση των 0.001. Σε σύγκριση με τις άλλες παραλλαγές κινδύνου,

rs10088218

,

rs1516982

, και

rs10098821

για 8q24.21 είχε το μεγαλύτερο αριθμό σημαντικών ενώσεων (25, 16, και 38, αντίστοιχα). Δύο πιθανές cis-συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ

rs10098821

και

c-Myc

, και

rs2072590

και

HS.565379

(παραλλαγμένο P = 0.0198 και 0,0399, αντίστοιχα). Ανάλυση εμπλουτισμό οδός έδειξε ότι αρκετές βασικές βιολογικές οδούς, όπως του κυτταρικού κύκλου (P = 2,59 × 10

-06), κλπ, ήταν σημαντικά υπερεκπροσωπούνται. Περαιτέρω χαρακτηρισμός σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των mRNAs και αλληλόμορφα κινδύνου θα μπορούσε να διευκολύνει την κατανόηση των λειτουργιών των GWAS ανακάλυψε αλληλόμορφα κινδύνου στη γενετική αιτιολογία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Zhao H, Shen J, Wang D, Gregory S, Medico L , Χου Q, et al. (2012) Σύλλογοι μεταξύ Παραλλαγές γονιδιακής έκφρασης και του καρκίνου των ωοθηκών αλληλόμορφα κινδύνου που προσδιορίζονται από Genome Wide Μελέτες σύνδεσης. PLoS ONE 7 (11): e47962. doi: 10.1371 /journal.pone.0047962

Επιμέλεια: Yi Xing, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Μαΐου 2012? Αποδεκτές: 19 Σεπτεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 2 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (5R01CA136483 σε Hz και Ρ30 CA016056 στο Roswell Park Cancer Institute)? Ralph Ιατρικό Ίδρυμα Wilson (με ΗΖ)? Υπουργείο Άμυνας Πρόγραμμα Καρκίνου των Ωοθηκών (OC073116 να ΗΖ), και Roswell Ίδρυμα Πάρκο Συμμαχία (σε Hz). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πρόσφατα, μελέτες ευρεία ένωση γονιδιώματος (GWAS) εντόπισαν με επιτυχία μια σειρά από γενετικές παραλλαγές που προσδίδουν κίνδυνο για καρκίνο στον άνθρωπο [1] – [3]. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις παραλλαγές του κινδύνου που προσδιορίζονται από GWAS κατοικούν στην διαγονιδιακή, ιντρονικές, και άλλα μη-κωδικεύουσες περιοχές του γονιδιώματος [4]. Ως εκ τούτου, οι παρατηρούμενες συσχετίσεις έχουν ακόμη να μεταφραστεί σε μια πλήρη κατανόηση των γονιδίων και γενετικών στοιχείων που μεσολαβούν ευαισθησία της νόσου. Πώς να μελετήσει τη λειτουργική σημασία αυτών των GWAS χτυπά αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση σε αυτήν την εποχή μετα-GWAS. Μία από τις επιλογές που θα μπορούσε να είναι η έρευνα της γενετικής της γονιδιακής έκφρασης. Αρκετές μελέτες έχουν ορόσημο κατηγορηματικά δείξει ότι πολλές μεταγραφές στο ανθρώπινο γονιδίωμα επηρεαστεί από κληρονομήσει παραλλαγή [5] – [9]. Λειτουργική γενετική παραλλαγή, η οποία οδηγεί σε αλλαγές γονιδιακή έκφραση, μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στον προσδιορισμό φαινοτυπικών διαφορών μεταξύ των ατόμων, και ως εκ τούτου, είναι πολύ πιθανό να επηρεάσουν την ευαισθησία της ασθένειας. Ως εκ τούτου, μελετώντας τις συσχετίσεις μεταξύ γενετική παραλλαγή και την έκφραση του γονιδίου θα μπορούσε ενδεχομένως να βοηθήσει την ιεράρχηση των προσπαθειών εξομάλυνσης χαρτογράφηση και να παρέχει μια συντόμευση για τη βιολογία της νόσου.

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι μια από τις πιο κοινές γυναικολογικές κακοήθειες στις γυναίκες [ ,,,0],10]. Οικογενειακό ιστορικό είναι ο ισχυρότερος παράγοντας κινδύνου για καρκίνο των ωοθηκών. Σε σύγκριση με ένα ισόβιο κίνδυνο 1,6% να αναπτύξουν καρκίνο των ωοθηκών στο γενικό πληθυσμό, οι γυναίκες με έναν συγγενή πρώτου βαθμού με καρκίνο των ωοθηκών έχουν κίνδυνο 5%. Η οικογενής ομαδοποίηση με αυτοσωματικό κυρίαρχο μοτίβο κληρονομικότητας (κληρονομικό καρκίνο των ωοθηκών) προκύπτει από μεταλλάξεις βλαστικής σειράς στο υποθετικό ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΕΠΠΕ), όπως το

BRCA1 /2

και

MLH1 /MSH2

γονίδια [11] – [14]. Ωστόσο, γνωστές μεταλλάξεις στο

BRCA1 /2

και επισκευή ασυμφωνία (

MMR

) γονίδια μπορούν να εξηγήσουν μόνο ένα μικρό μέρος της οικογενούς συνυπολογισμού του καρκίνου των ωοθηκών (5-13%). Αυτό υποδηλώνει ότι άλλα γενετικά γεγονότα μπορούν να συμβάλουν στην οικογενή καρκίνους των ωοθηκών. Αρκετές GWAS έχουν γίνει στον καρκίνο των ωοθηκών και αρκετές παραλλαγές κινδύνου έχουν εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένων των

rs3814113

στις 9p22,

rs2072590

στο 2q31,

rs2665390

στο 3q25,

rs10088218

,

rs1516982

,

rs10098821

στο 8q24, και

rs2363956

σε θέση 19p13 [1] – [3]. Ωστόσο, η λειτουργική σημασία αυτών των παραλλαγών κινδύνου είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Έτσι, μελετώντας τις συσχετίσεις μεταξύ γονιδιακής έκφρασης και αλληλόμορφα των ωοθηκών κίνδυνος καρκίνου που έχουν αναγνωριστεί από GWAS μπορεί να βοηθήσει τη σύνδεση παραλλαγές του κινδύνου για την υποτιθέμενη γονιδίων-στόχων /μεταγραφές τους και βιολογικών οδών.

Για να μελετήσουμε τις συσχετίσεις μεταξύ γονιδιακής έκφρασης και αλληλόμορφα κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών , λάβαμε το σύνολο των προφίλ έκφρασης mRNA του γονιδιώματος σε 121 μη-περιττές λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs) που προέρχονται από 74 ασθενείς που δεν σχετίζονται με οικογενή καρκίνο των ωοθηκών ο οποίος είναι μη-φορείς των γνωστών

BRCA1 /2

και

MMR

γονιδιακές μεταλλάξεις, καθώς και 47 μη καρκινικά άσχετη οικογένεια ελέγχων. Εμείς γονότυπος επτά παραλλαγές των ωοθηκών κίνδυνος καρκίνου που ανακαλύφθηκε από GWAS σε αυτές τις 121 κυτταρικές σειρές και μελέτησε τις ενώσεις τους με μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης. Για τις γνώσεις μας, αυτό είναι το πρώτο γονιδίωμα-ευρεία μελέτη για την αξιολόγηση των συσχετίσεων μεταξύ διακυμάνσεις της έκφρασης mRNA σε LCLs της οικογενείς περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών και GWAS ανακάλυψε αλληλόμορφα κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών [1] – [3].

Αποτελέσματα

κυτταρικές γραμμές Λεμφοβλαστοειδή προήλθαν από τα δείγματα αίματος από 74 μη σχετικές γυναίκες με οικογενή καρκίνο των ωοθηκών και 47 un-σχετίζονται με τον καρκίνο χωρίς ελέγχους που προσλαμβάνονται για την GRFOCR (βλέπε Μέθοδοι). προφίλ γονιδιακής έκφρασης παράχθηκαν με τη χρήση των BeadChips ΗΤ-12 V3 Έκφραση Illumina άνθρωπο. Εμείς φιλτραρισμένα τα επεξεργασμένα δεδομένα να περιλαμβάνουν γονίδια με έκφραση πάνω από το υπόβαθρο σε τουλάχιστον 25% των δειγμάτων (n = 121). Συνολικά 10.435 γονιδίων mRNA κρατήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Για κάθε δείγμα, οι επτά παραλλαγές που προσδιορίζονται από τρεις καρκίνο των ωοθηκών GWAS γονότυπος χρησιμοποιώντας το σύστημα StepOnePlus ™ Real Time PCR και Αναλύσεις-on-Demand προϊόντων SNP Γονοτυποποίηση (βλέπε Μέθοδοι). Έχουμε αξιολογήσει τις πιθανές συνέπειες αυτών των GWAS-ανακάλυψε παραλλαγές στον καρκίνο των ωοθηκών, εκτελώντας ανάλυση σύνδεσης να αναλύσει τις συσχετίσεις μεταξύ των μεταβολών της έκφρασης mRNA και παραλλαγή γονότυπους. Σημαντικές ενώσεις ταυτοποιήθηκαν με την αξιολόγηση των σχέσεων μεταξύ των μεταβολών των επιπέδων έκφρασης του mRNA (με την ιδιότητα του ηλικία και την περίπτωση-ελέγχου ρυθμίζεται) και παραλλαγή γονότυπους μέσα από 10.000 παραλλαγές. Ο αριθμός των σημαντικών ενώσεων σε μετάθεση όριο επίπεδο των 0,05, 0,01 και 0,001 συνοψίζεται στον Πίνακα 1. Ο κατάλογος των επιλεγμένων κορυφαία σημαντικές συσχετίσεις (παραλλαγμένο P ≤ 0,001 και r

2≥0.095) παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. μία από τις πιο σημαντικές συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν μεταξύ των

rs10098821

και

IER3

γονίδιο (παραλλαγμένο P & lt? 0,0001).

IER3

, είναι μια άμεση γονίδιο πρώιμη αντίδραση στο στρες επαγόμενο, των οποίων οι λειτουργίες περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη ρύθμιση της απόπτωσης. Έχει βρεθεί ότι αυτό το γονίδιο είναι προ-αποπτωτική στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών [15].

rs10098821

εξηγεί περίπου το 13% της διακύμανσης στο

επίπεδο έκφρασης IER3

‘s, όπως μετράται με προσαρμόζεται r

2.

Η

Είναι ενδιαφέρον, οι τρεις παραλλαγές από την 8q24 τόπο, δηλαδή

rs10098821

,

rs10088218

και

rs1516982

, είχαν τις μεγαλύτερες σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ όλων των επτά παραλλαγές. Στο κατώφλι 0,05 μετάθεση, ο αριθμός σημαντικών ενώσεων με αυτές τις τρεις παραλλαγές ήταν 959, 821 και 618. Ο αριθμός ήταν 251, 194 και 139 σε πιο αυστηρές κατώφλι μετάθεση του 0,01, και 38, 25 και 16 στο κατώφλι του 0.001 . Αυτές οι τρεις παραλλαγές μοιράζονται μια σειρά από συλλόγους γονιδιακής έκφρασης σημαντική mRNA. Στο κατώφλι 0,05 μετάθεση, τριακόσιες δώδεκα mRNA, που αντιπροσωπεύουν το 33% του mRNA συσχετίζονται με

rs10098821

, το 38% του mRNA συσχετίζονται με

rs10088218

, και το 50% του mRNA συσχετιζόμενων με

rs1516982

, συσχετίζονται με όλες τις τρεις παραλλαγές (Σχήμα S1). Για παράδειγμα, τα επίπεδα του

fance

(αναιμία Fanconi, ομάδα συμπληρωματικότητας Ε) έκφραση συνδέεται σημαντικά με το

rs1516982

(παραλλαγμένο P = 8.0 × 10

-4, ρυθμίζεται r

2 = 10,3%),

rs10098821

(παραλλαγμένο P = 0,0037, ρυθμίζεται r

2 = 7,0%) και

rs10088218

(παραλλαγμένο P = 0,0312, ρυθμίζεται r

2 = 3,4%), αλλά κανένα από τα άλλα τέσσερα SNPs (Εικόνα S2).

Παρατηρήσαμε δύο πιθανές

cis

-associations στην οποία η παραλλαγή γονιδιωματική τοποθεσία είναι μέσα σε 1 Mb γύρω από το γονίδιο καθετήρα στόχευσης . Ένα

cis

-association είναι μεταξύ

rs10098821

και

c-Myc

γονίδιο, το οποίο είναι 806 kb μακριά από την παραλλαγή (παραλλαγμένα Ρ = 0,0198, Σχήμα 1), και το άλλο είναι μεταξύ

rs2072590

και

HS.565379

, η οποία είναι 697 kb μακριά από την παραλλαγή (παραλλαγμένα Ρ = 0.0399, που δεν φαίνεται).

rs10098821

εξήγησε περίπου 4,0% της διακύμανσης στο

c-Myc

έκφρασης όπως μετριέται με προσαρμόζεται r

2. Τα άτομα με παραλλαγή αλληλόμορφα T έχουν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη έκφραση του

c-Myc

σε σύγκριση με αυτά χωρίς παραλλαγή αλληλόμορφα Τ.

rs2072590

εξήγησε περίπου 4,4% της διακύμανσης στο

HS.565379

έκφρασης.

HS.565379

γονιδιακής έκφρασης έχει βρεθεί ότι παρουσιάζουν ιστο-ειδική έκφραση σε μήτρα και της μήτρας του όγκου βασίζονται σε EST-based προφίλ [16].

Η boxplot δείχνει τη σχέση μεταξύ log

2 υπολείμματα του

c-Myc

επίπεδα έκφρασης (προσαρμοσμένο για την ηλικία και την περίπτωση-ελέγχου κατάστασης) και γονότυπο του

rs10098821

.

rs10098821

εξήγησε περίπου 4,0% της διακύμανσης στο

c-Myc

έκφρασης όπως μετριέται με προσαρμόζεται r

2.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν υπάρχουν είναι οποιεσδήποτε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ αυτών των επτά παραλλαγές και γνωστά γονίδια κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων των

BRCA1 /2

,

MMR

γονίδια,

p53

,

κλπ

δεν παρατηρήσαμε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ αυτών των παραλλαγών και των

BRCA1 /2

γονίδια. Ωστόσο, βρήκαμε αρκετές σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των παραλλαγών και της

MMR

γονίδια και το

p53

γονιδίου (Σχήμα S3). Για παράδειγμα, βρήκαμε το επίπεδο έκφρασης του

MLH1

γονίδιο συνδέεται σημαντικά με το

rs2072590,

μια παραλλαγή στο 2q31 τόπους (παραλλαγμένο Ρ = 0,0049, Σχήμα 2).

rs2072590

εξήγησε περίπου 8,3% της διακύμανσης στο

MLHL1

‘s επίπεδο έκφρασης. Η έκφραση του

p53

γονίδιο συνδέεται σημαντικά με το

rs2665390

(παραλλαγμένο P = 0,018, ρυθμίζεται r

2 = 0.036),

rs1516982

(παραλλαγμένο P = 0,028, προσαρμοσμένο r

2 = 0.035), και

rs10088218

(παραλλαγμένο P = 0.049, ρυθμίζεται r

2 = 0.025). Επιπλέον, η έκφραση του

MSH5

γονίδιο συνδέεται σημαντικά με το

rs2363956

(παραλλαγμένο P = 0.0056, ρυθμίζεται r

2 = 0.075).

Οι boxplot παραστάσεις η σχέση μεταξύ της καταγραφής

2 υπολείμματα

MLH1

επίπεδα έκφρασης (προσαρμοσμένο για την ηλικία και την περίπτωση-ελέγχου κατάστασης) και γονότυπο του

rs2072590

.

η

Τέλος, για να βιολογικώς χαρακτηρίζουν αυτά τα γονίδια mRNA σημαντική συσχέτιση με GWAS ανακάλυψε αλληλόμορφα ωοθηκών κίνδυνο καρκίνου διερευνήθηκαν εδώ, εκτελέσαμε Gene Ontology (GO) εμπλουτισμός ανάλυση χρησιμοποιώντας το εργαλείο NCBI DAVID [17] Όπως φαίνεται στον πίνακα 3, ο κατάλογος των σημαντικά εμπλουτισμένη GO βιολογική διεργασίες περιλαμβάνουν «κυτταρικού κύκλου» (P = 2,59 × 10

-6), «ρύθμιση της απόπτωσης» (P = 4,37 × 10

-5), και «προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος» (P = 6,93 × 10

-5). Σε επίπεδο μοριακής λειτουργίας, τα σημαντικά εμπλουτισμένη όρους GO περιλαμβάνουν «δεσμευτική νουκλεοτιδίων» (P = 7,43 × 10

-9), «δεσμευτική ΑΤΡ» (P = 3,94 × 10

-7), «δεσμευτικό παράγοντα μεταγραφής «(P = 1,19 × 10

-5) και» δραστηριότητα ελικάση DNA «(P = 3,41 × 10

-4).

Η

Συζήτηση

Η γενετική αιτιολογία του οικογενούς καρκίνου των ωοθηκών είναι ακόμα ένα μυστήριο. Γνωστές μεταλλάξεις στο

BRCA1 /2

και

MMR

γονίδια μπορούν να εξηγήσουν μόνο ένα μικρό μέρος της οικογενούς συνυπολογισμού του καρκίνου των ωοθηκών. Τα αποτελέσματα από πρόσφατες μελέτες GWAS έχουν εντοπιστεί αρκετές κοινές γενετικές παραλλαγές που παρέχουν κίνδυνο για καρκίνο των ωοθηκών [1] – [3]. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις παραλλαγές δεν βρίσκονται σε περιοχές κωδικοποίησης πρωτεΐνης, έτσι ώστε η λειτουργική σημασία αυτών των παραλλαγών είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Η τρέχουσα μελέτη παρουσιάζει μια προσπάθεια να τεμαχίσει τη γενετική επιδεκτικότητα του οικογενή καρκίνο των ωοθηκών, καθώς επίσης και τη διαλεύκανση του δυναμικού λειτουργική σημασία των ταυτοποιημένων παραλλαγών κίνδυνο από GWAS. Συγκεκριμένα, μελετήσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ επτά σημαντικές παραλλαγές που προσδιορίζονται από τον καρκίνο των ωοθηκών GWAS και την έκφραση της παγκόσμιας mRNA

Όπως ήταν αναμενόμενο, έχουμε παρατηρήσει έναν μεγαλύτερο αριθμό μακρινό (

trans

-). Από την τοπική (

cis

-) ενώσεις. Μεταξύ των δύο προσδιορίζονται

cis

-associations, η συσχέτιση μεταξύ των

rs10098821

στο 8q24 και

c-Myc

είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα. Κοινό παραλλαγές στο 8q24 έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι προσδίδουν ευαισθησία σε πολλαπλές φαινοτύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, του παχέος εντέρου, του μαστού και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [18] – [23], και τα προηγούμενα λειτουργικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι κοινές παραλλαγές στην περιοχή αυτή μπορεί να σχετίζεται με μεταγραφικές ρύθμιση του

c-Myc

[24] – [25]. Οι περισσότερες ενώσεις του κινδύνου σε 8q24 βρίσκεται 5 ‘του

c-Myc

, αλλά οι τρεις πιο σημαντικές SNPs για το ψέμα του καρκίνου των ωοθηκών σε μια προφανή γονίδιο έρημο η οποία είναι & gt? 700 kb 3′ του

c-Myc

, γεγονός που υποδηλώνει είτε ότι

c-Myc

μπορεί να μην είναι το γονίδιο ευαισθησίας στόχος για τον καρκίνο των ωοθηκών ή ότι παραλλαγές σε αυτήν την περιοχή είναι επίσης σε θέση μακρινή ρύθμιση του

c-Myc

. Σε μια προηγούμενη μελέτη [2], Goode et al σύγκριση

c-Myc

έκφρασης σε 48 φυσιολογικά ωοθηκών επιθηλιακών κυττάρων γραμμές μεταξύ των ατόμων, χωρίς να

παραλλαγή rs10098821

αλληλόμορφα και αυτά με τουλάχιστον ένα

παραλλαγή rs10098821

αλληλόμορφα. Χρησιμοποιώντας

GAPDH

ως mRNA αναφοράς, διαπίστωσαν ότι εκείνοι, χωρίς να

παραλλαγή rs10098821

αλληλόμορφα είχαν υψηλότερα

c-Myc

έκφρασης από ό, τι αυτοί με τουλάχιστον ένα

rs10098821

παραλλαγή αλληλόμορφα (διάμεσος της σχετικής έκφρασης: 0.97 vs 0.62). Ωστόσο, η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (P = 0,43). Παρόμοια με τα ευρήματά τους, έχουμε παρατηρήσει ότι τα άτομα χωρίς

παραλλαγή rs10098821

αλληλόμορφα είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα

c-Myc

έκφρασης σε σύγκριση με αυτά με τουλάχιστον ένα

rs10098821

παραλλαγή αλληλόμορφα (παραλλαγμένο P = 0,0198). Όπως έχουμε αναφερθεί παραπάνω,

rs10098821

είναι 3 ‘του

MYC

και βρίσκεται περίπου 0.8 Mb μακριά. Πώς αυτό το SNP μπορεί να επηρεάσει

MYC

έκφραση είναι ακόμα ασαφής.

Χρησιμοποιώντας αυτές εντοπίζονται σημαντικές συσχετίσεις στην ανάλυση μονοπάτι, έχουμε βρει ότι τα γονίδια που σχετίζονταν σημαντικά με GWAS ανακάλυψε τα αλληλόμορφα τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου των ωοθηκών εμπλουτισμένη σε αρκετές βασικές βιολογικές οδούς, όπως κυτταρικού κύκλου, κυτταρική απόκριση στο στρες /ζημιές, το μεταβολισμό της ενέργειας, μεταγραφικού παράγοντα δεσμευτική,

κλπ

. Είναι ενδιαφέρον, πιο γνωστό οικογενή γονίδια του καρκίνου των ωοθηκών (

δηλ.

,

BRCA1 /2

και

MMR

) αποτελούν βασικούς παράγοντες σε αυτές τις βασικές οδούς. Για παράδειγμα, έχει αποδειχθεί ότι

BRCA1

είναι το κλειδί ρυθμιστής σε ανίχνευση στρες DNA /βλάβη και στη συνέχεια προωθώντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου [26]. Παρά το γεγονός ότι η ανάλυση του συλλόγου μας δεν μπορεί να εντοπίσει την ακριβή λειτουργίες αυτών των GWAS ανακάλυψε παραλλαγές, παρέχει μια λίστα των πιθανών βιολογικών μονοπατιών, για τα οποία θα μπορούσε κανείς να επικεντρωθεί στην ανάλυση και στο μέλλον.

Υπάρχουν διάφοροι περιορισμοί σε αυτήν την μελέτη. Πρώτον, πολλές mRNAs εκφράζεται με τρόπο ιστού-περιορισμένο. Τα αποτελέσματα από LCLs σε αυτή τη μελέτη είναι πιθανόν να αντιπροσωπεύουν ένα μικρό υποσύνολο των παραλλαγών έκφρασης mRNA. Επίσης, η ικανότητά μας να μελετήσουμε τη γενετική της έκφρασης mRNA περιορίζεται από το γεγονός ότι ερευνήσαμε μόνο επτά παραλλαγές στην ανάλυση, μολονότι αυτά τα επτά παραλλαγές έχουν συσχετιστεί με τον κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών σε πρόσφατες GWASs. Δεύτερον, οι συνέπειες για την μεταγραφή αφθονία μπορεί να είναι λεπτή και ως εκ τούτου κάτω από το όριο ευαισθησίας της πλατφόρμας μικροσυστοιχιών, και το μέγεθος του δείγματος στη μελέτη μας είναι σχετικά μικρή. Τρίτον, υπάρχει μια ανησυχία για το τι τα αποτελέσματα πραγματικά σημαίνει κατά τη μέτρηση της έκφρασης σε μη καρκινικό ιστό σε ένα μόνο σημείο στο χρόνο. Ο τελικός στόχος της μελέτης μας είναι ο προσδιορισμός των κληρονομικών γενετικών καθοριστικών παραγόντων της έκφρασης mRNA σε φυσιολογικούς ιστούς και όχι σωματικά μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης mRNA σε ιστούς όγκων. Μελέτες έχουν δείξει ότι τουλάχιστον μέρος της γονιδιακής έκφρασης mRNA καθορίζεται γενετικά. Ως εκ τούτου, ακόμη και σε ένα μόνο χρονικό σημείο σε μη καρκινικό ιστό, τι έχουμε παρατηρήσει από τη μελέτη αυτή εξακολουθεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με το πώς η έκφραση του mRNA είναι γενετικά ρυθμίζεται. Forth, ορισμένες επιδράσεις μπορούν να αποκαλυφθούν μόνο σε ορισμένα πλαίσια, όπως διατάραξη συγκεκριμένη οδό, και μπορεί να συμβεί μέσω των αλλαγών στη γονιδιακή μεταγραφές που προκαλούνται από μεταβολές στη microRNAs ή μη-κωδικοποίησης RNAs και όχι μέσω άμεσες επιπτώσεις στην γονίδια. Σε αυτές τις περιπτώσεις, εναλλακτικές δοκιμασίες θα πρέπει να εμπλέξει αυτά τα γονίδια. Τέλος, οι σημαντικές συσχετίσεις δεν είναι περαιτέρω λειτουργικά χαρακτηρίζεται από το σύνολο των κορυφαίων συλλόγων είναι trans-ενώσεις. Μέχρι στιγμής, υπάρχει ακόμα έλλειψη ιδρύθηκε πειραματικών μεθόδων για την αξιολόγηση trans-ρύθμισης μεταξύ SNPs και γονιδιακής έκφρασης.

Για το καλύτερο της γνώσης μας, η μελέτη αυτή παρέχει την πρώτη αξιολόγηση της διακύμανσης επίπεδο έκφρασης του ώριμου ανθρώπινου mRNAs σε LCLs από ασθενείς οικογενή καρκίνο των ωοθηκών και υγιή άσχετες ελέγχους. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να εντοπιστούν οι γενετικές αιτίες και τις βιολογικές συνέπειες που σχετίζονται με τις εντοπισμένες σημαντικές ενώσεις. Σημαντικές συσχετίσεις που εντοπίζονται στην παρούσα μελέτη μπορεί ενδεχομένως να διευκολύνει την καλύτερη κατανόηση της γενετικής αιτιολογίας της οικογενούς καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης

Αυτή η μελέτη έχει εγκριθεί από το Διοικητικό θεσμικό Ερευνών (IRB) του Roswell Park Cancer Institute. Γραπτές ενημέρωσε συναινέσεις έχουν ληφθεί από όλα τα άτομα της μελέτης. Δεδομένων και δειγμάτων από γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών και τους συγγενείς τους οι οποίοι ήταν ελεύθεροι καρκίνου ελήφθησαν από την Τζίλντα Radner οικογενή καρκίνο των ωοθηκών Μητρώου (GRFOCR). Εβδομήντα τέσσερα μη συνδεδεμένα γυναίκες με οικογενή καρκίνο των ωοθηκών συμπεριελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη ως περιπτώσεις. Είχαν ταυτοποιήθηκαν από οικογένειες με καρκίνο των ωοθηκών κληρονομείται στην οποία τουλάχιστον δύο πρώτου ή δεύτερου βαθμού συγγενείς είχαν επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών διαγιγνώσκονται σε οποιαδήποτε ηλικία. Όλες οι γυναίκες ήταν μη-φορείς του

BRCA1 /2

ή

MLH1 /MSH2

μεταλλάξεις. Την πάροδο του χρόνου, έχουν διαφορετικές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της κατάστασης μετάλλαξης του

BRCA1 /2

σε δείγματα GRFOCR. Για δείγματα που συλλέχθηκαν πριν από το 2002, η κατάσταση μετάλλαξης προσδιορίστηκε με διαλογή όλα τα εξώνια και κόμβους ιντρονίου /εξονίου συναρμογής του

BRCA 1/2

από ένα συνδυασμό SSCP και ανάλυση HD. Επιπρόσθετα, το εξόνιο 11 του

BRCA1

δοκιμάστηκε με τη δοκιμασία πρωτεΐνης κολόβωση για κωδικόνιο λήξης δημιουργία μεταλλάξεων. Εάν βρέθηκαν αλλοιώσεις, το τροποποιημένο θραύσμα αλληλουχήθηκε. Από το 2002, χρησιμοποιήθηκε αλληλουχίας των εξώνια και κόμβους σύνδεσης. Κατά τα τελευταία 5 χρόνια, όλα τα δείγματα (παλαιών και νέων) που δεν παρουσιάζουν μετάλλαξη αναλύθηκαν για

BRCA1

αναδιατάξεις μεγάλης κλίμακας. Τα καρκινικά χωρίς ελέγχους των GRFOCR ήταν οικογένειας συγγενείς των περιπτώσεων, συμπεριλαμβανομένων μητέρες, αδελφές, ανηψιές,

κλπ.

Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσετε άσχετες ελέγχους. Μη συνδεδεμένοι έλεγχοι είναι γυναίκες που δεν είναι συγγενείς τυχόν περιπτώσεις που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. συμπεριλήφθηκαν σαράντα επτά άσχετα ελέγχους. Οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι ήταν συμφωνημένα για το φύλο και τη φυλή. Όλες οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι ήταν λευκές γυναίκες. Η διάμεση ηλικία κατά τη διάγνωση του καρκίνου για τις 74 περιπτώσεις ήταν 47 (που κυμαίνονται 21-85), ενώ η μέση ηλικία για τους 47 ελέγχους κατά την εγγραφή στο GRFOCR ήταν 58 (που κυμαίνονται 26 έως 89). Όλα τα άτομα της μελέτης δωρεά δείγματα αίματος όταν ήταν εγγεγραμμένοι στο GRFOCR. LCLs καθορίστηκαν με μετασχηματισμό με ΕΒν χρησιμοποιώντας τα απομονωμένα λεμφοκύτταρα από τα δείγματα αίματος. Η μελέτη εγκρίθηκε από το θεσμικό συμβούλιο IRB.

λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs) Πολιτισμός και RNA Extraction

LCLs διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO BRL) συμπληρωμένο με 15% ορό εμβρύου μόσχου και αντιβιοτικά στους 37 ° C, 5% CO

2 ατμοσφαιρικές συνθήκες και 95% υγρασία. Το ολικό κυτταρικό RNA που απομονώθηκαν από LCLs χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται από τον κατασκευαστή (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Καθαρισμένο RNA που υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία για να αφαιρέσετε τυχόν μολυσματικές DNA (free-DNA κιτ, Ambion, Inc., Austin, TX, USA). Η ποιότητα και η ποσότητα του RNA αξιολογήθηκε με 260/280 αναλογία χρησιμοποιώντας NanoDrop φασματοφωτομετρία (NanoDrop ND-1000 Technologies Inc.) και Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Γονοτυπικές Ανάλυση για ωοθηκών αλληλόμορφα κίνδυνο καρκίνου

Επτά SNPs, τα οποία προσδιορίζονται από 3 καρκίνου των ωοθηκών GWAS, συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση του γονότυπου. Είναι

rs3814113

για 9p22.2,

rs2072590

στο 2q31,

rs2665390

στο 3q25 στο ιντρόνιο του TCDD επαγόμενου πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (

TIPARP

) γονίδιο,

rs2363956

σε θέση 19p13 στην επανάληψη ανκυρίνης και τον τομέα LEM που περιέχει 1 (

ANKLE1

) γονίδιο,

και rs10088218

,

rs1516982

, και

rs10098821

για 8q24.21.

rs2363956

είναι ένα nonsynomous SNP που οδηγεί σε αλλαγή αμινοξέος Leu σε Trp. ανάλυση γονοτυπικός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα StepOnePlus ™ Real Time PCR και προσδιορισμούς-on-Demand προϊόντα Γονοτυποποίηση SNP για φθορισμογόνα διάκριση αλληλόμορφων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Applied Biosystems). Κάθε πλάκα αντίδραση PCR περιλαμβάνεται αρνητικούς μάρτυρες, θετικούς μάρτυρες, και τα άγνωστα δείγματα. Τα ανήλικα συχνότητες αλληλόμορφο για κάθε SNP στις περιπτώσεις και άσχετες έλεγχοι ήταν 0.346 /0.298 (P = 0,65) για

rs3814113

, 0,3 /0,368 (P = 0,84) για

rs2072590

, 0,081 /0.060 (P = 0,60) για

rs2665390

, 0.149 /0.107 (P = 0,13) για

rs10088218

, 0,167 /0,119 (P = 0,06) για

rs1516982

, 0.127 /0.071 (P = 0,07) για

rs10098821

, και 0,432 /0,488 (P = 0,20) για

rs2363956

. Τα στοιχεία προσδιορισμού του γονότυπου έχουν κατατεθεί στο Gene Expression NCBI του Omnibus (GEO) με αριθμό πρόσβασης GSE37582.

γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών

Διακόσια νανογραμμάρια ολικού RNA από κάθε δείγμα σημάνθηκαν και υβριδοποιήθηκε επί Illumina ανθρώπινη BeadChips HT-12 v3 έκφρασης σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Illumina Ολόκληρο-Γονιδιώματος Gene Expression Guide). Τα προφίλ έκφρασης έχουν κατατεθεί στο Gene Expression NCBI του Omnibus (GEO) με αριθμό ένταξης GSE37582.

Στατιστική Ανάλυση

Η πρώτη ένταση της HT-12 συστοιχία v3expression Illumina ανθρώπινη σαρώθηκε και εξάγεται χρησιμοποιώντας BeadScan, με τα δεδομένα διορθώνονται με αφαίρεση του υποβάθρου στη μονάδα GenomeStudio. Το πακέτο lumi στο R-based Bioconductor Πακέτο χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει το αρχείο καταγραφής

2 μετασχηματισμένων δεδομένων έντασης χρησιμοποιώντας ποσοστημόριο αλγόριθμο κανονικοποίησης. Για τον έλεγχο της ποιότητας των δεδομένων, αποκλείσαμε τους ιχνηλάτες με ανίχνευση τιμή Ρ & gt? 0.05 (οι τιμές Ρ παρήχθησαν σε λογισμικό BeadStudio) σε τουλάχιστον 25% (n = 121) των δειγμάτων. Συνολικά 10.435 γονιδίων mRNA περάσει το στάδιο ελέγχου της ποιότητας και χρησιμοποιήθηκαν για τους μεταγενέστερους ανάλυση. Η ένωση του SNP γονότυπου με υπολείμματα του επιπέδου έκφρασης προσαρμοσμένο για την κατάσταση την ηλικία και την περίπτωση-ελέγχου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως (27). Δέκα χιλιάδες παραλλαγές των φαινοτύπων έκφρασης σε σχέση με το SNP γονοτύπων πραγματοποιήθηκαν (28-29). Να αντλήσει P-τιμές προσαρμόζονται για πολλαπλές δοκιμές, θα καθορίζεται το ποσοστό των φορές από 10.000 παραλλαγές που ξεπεράστηκε η παρατηρούμενη P-τιμή στην Μετατεθειμένο ανάλυση των δεδομένων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Venn διάγραμμα που δείχνει τις επικαλύψεις των γονιδίων mRNA σημαντικά (παραλλαγμένο P & lt? 0,05) που σχετίζονται με τα τρία GWAS ανακάλυψε SNPs από 8q24 τόπο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0047962.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των γονότυπων των τριών παραλλαγών για 8q24 τόπου και

fance

φαινοτύπων έκφρασης. Η boxplot δείχνει τη σχέση μεταξύ της καταγραφής

2 υπολείμματα

fance

επίπεδα έκφρασης (προσαρμοσμένο για την ηλικία και την περίπτωση-ελέγχου κατάστασης) και γονότυπο του

rs1516982

(επάνω, παραλλαγμένα P = 8,0 × 10

-4, ρυθμίζεται r

2 = 10,3%),

rs10098821

(μέση, παραλλαγμένα P = 0,0037, ρυθμίζεται r

2 = 7,0%) και

rs10088218

(κάτω, παραλλαγμένα P = 0,0312, ρυθμίζεται r

2 = 3,4%)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0047962.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των γονότυπων παραλλαγές και

p53

φαινοτύπων έκφρασης. Η boxplot δείχνει τη σχέση μεταξύ της καταγραφής

2 υπολείμματα

p53

επίπεδα έκφρασης (προσαρμοσμένο για την ηλικία και την περίπτωση-ελέγχου κατάστασης) και γονότυπο του

rs2665390

(επάνω, παραλλαγμένα P = 0,0181 , προσαρμοσμένο r

2 = 3,6%),

rs1516982

(μέση, παραλλαγμένα P = 0.0279, ρυθμίζεται r

2 = 3,5%) και

rs10088218

(κάτω, παραλλαγμένα P = 0,0494, ρυθμίζεται r

2 = 2,5%)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0047962.s003

(ΔΕΘ)