Αφηρημένο

Η caveolin-1 είναι γνωστό ότι προάγει την κυτταρική μετανάστευση, και την αύξηση της caveolin -1 έκφραση συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση. Σε ινοβλάστες, caveolin-1 πόλωση και φωσφορυλίωση τυροσίνης-14 είναι απαραίτητα για την προώθηση της μετανάστευσης. Ωστόσο, ο ρόλος του caveolin-1 σε μετανάστευση μεταστατικών κυττάρων παραμένει ακαθόριστα. Εδώ, η συμμετοχή caveolin-1 σε μεταστατικό κυτταρική μετανάστευση αξιολογήθηκε με shRNA στόχευση της ενδογενούς caveolin-1 σε MDA-MB-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού και έκτοπη έκφραση σε Β16-Ρ10 κύτταρα μελανώματος ποντικού. Η εξάντληση του caveolin-1 σε MDA-MB-231 κύτταρα μειώνεται, ενώ έκφραση σε κύτταρα Β16-Ρ10 προωθείται μετανάστευση, πόλωση και εστιακή κύκλο εργασιών προσκόλληση σε μια ακολουθία των γεγονότων που εμπλέκονται φωσφορυλίωση της τυροσίνης-14 και την ενεργοποίηση Rac-1. Σε κύτταρα Β16-Ρ10, έκφραση ενός μη-φωσφορυλιώσιμη τυροσίνης-14 σε φαινυλαλανίνη μεταλλαγμένο απέτυχε να ανακεφαλαίωση των αποτελεσμάτων που παρατηρούνται με άγριου τύπου caveolin-1. Εναλλακτικά, η επεξεργασία των κυττάρων MDA-MB-231 κυττάρων με τον αναστολέα Src ΡΡ2 οικογένειας κινάσης μειωμένη φωσφορυλίωση caveolin-1 σε τυροσίνη-14 και της μετανάστευσης των κυττάρων. Παραδόξως, σε αντίθεση για ινοβλάστες, caveolin-1 πόλωση και την εκ νέου εντοπισμό προς το χείλος εκφυγής δεν είχαν παρατηρηθεί σε μεταστατικά κύτταρα μεταναστεύουν. Έτσι, η έκφραση και η φωσφορυλίωση, αλλά όχι πόλωση caveolin-1 υπέρ το εξαιρετικά κινητό φαινότυπο των μεταστατικών κυττάρων

Παράθεση:. Urra Η, Τόρες VA, Ortiz RJ, Lobos L, Díaz MI, Díaz Ν, κ.ά. . (2012) Η caveolin-1-Enhanced Κινητικότητα και Focal κύκλος εργασιών πρόσφυσης Απαίτηση τυροσίνη-14, αλλά δεν Συσσώρευση προς τα πίσω σε κύτταρα μεταστατικού καρκίνου. PLoS ONE 7 (4): e33085. doi: 10.1371 /journal.pone.0033085

Επιμέλεια: Burton Β Yang, του Πανεπιστημίου του Τορόντο, Καναδά

Ελήφθη: 7, Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 9 Φλεβάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 του Απριλίου, 2012

Copyright: © 2012 Urra et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Fondo de Financiamiento de Centros de Excelencia en Investigación # 15010006 (με AQ), Εθνικό Ταμείο για την Επιστημονική και Τεχνολογική Ανάπτυξη (FONDECYT) # 1110149 (για να L. Leyton), FONDECYT # 1090071 (για να AQ), Βιοϊατρικών Neuroscience Institute P09 -015-F από Iniciativas Científicas Milenio (με το Ν Leyton και SH), Fogarty International Research Collaboration Βραβείο-Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας 5R03TW007810 (με το Ν Leyton), Εθνική Επιτροπή για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (CONICYT) # 79090021 «Εισαγωγή Νέων μεταδιδακτορικός Έρευνες στην Ακαδημία «(για να VT), FONDECYT Κίνηση # 11100287 (για VT) και CONICYT υποτροφίες διδακτορικό (σε HU, ΝΔ, RO, MID και L. Lobos). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κυτταρική μετανάστευση είναι απαραίτητη σε μια μεγάλη ποικιλία βιολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων εμβρυϊκή ανάπτυξη, την επισκευή των ιστών και την αναγέννηση, καθώς και εκδηλώσεις που σχετίζονται με ασθένειες όπως η αρθρίτιδα, η αθηροσκλήρωση και η μετάσταση του όγκου των κυττάρων [1]. Αρχικά, τα κύτταρα ανταποκρίνονται σε εξωτερικά ερεθίσματα (τραυματισμό, χημειοκίνες και αυξητικούς παράγοντες) με αναπροσανατολισμό του κέντρου οργάνωσης των μικροσωληνίσκων (MTOC) και Golgi προς το ηγούμενο άκρο (βήμα πόλωση κυττάρων) [2]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επεκτείνει ευρεία (

ελασματοπόδια

) και ακίδα-όπως προεξοχές (

τΊΙοροάίβ

) σε μια διαδικασία που ακολουθείται από εστιακή πρόσφυση (FA) σχηματισμό, τη συστολή των κυττάρων του σώματος και τελικά την οπισθοχώρηση της οπίσθιο άκρο αποκόπτοντας ΕΧΟ [3]. Πολλές από αυτές τις εκδηλώσεις που διοργανώνονται από την οικογένεια Rho των μικρών GTPases, η οποία περιλαμβάνει RhoA, Rac1 και Cdc42. Σήματα που ενεργοποιούν Rho ΘΤΡάσες οδηγήσει σε χωροχρονική ρύθμιση της FA συναρμολόγησης, της δυναμικής και του κύκλου εργασιών [4], [5].

Πολλές πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων των PI3K, PTEN [6], Rho-ΘΤΡάσες [4], [7] και caveolin-1 [8], [9], έχει αποδειχθεί ότι αναμεταδίδουν σε όλο το κύτταρο κατά τη διάρκεια πολωμένη μετανάστευση. Η caveolin-1 έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, αφού είναι γνωστό ότι προάγει την κυτταρική μετανάστευση [10], εισβολή [11], [12], [13] και προτείνεται ότι εμπλέκεται στην κυτταρική μετάσταση όγκου (που επισκοπείται στο [14], [ ,,,0],15]).

η caveolin-1 είναι μια μεμβρανική πρωτεΐνη που εμπλέκονται στην μικροσπηλαίων βιογένεση, ομοιόσταση της χοληστερόλης, ενδοκυτταρική διακίνηση και μεταγωγής σήματος, μεταξύ άλλων λειτουργιών (αναθεωρούνται στο [15]). Ο ακριβής ρόλος του caveolin-1 σε ογκογένεση παραμένει ένα θέμα έντονων συζητήσεων και αν η πρωτεΐνη δρα ως καταστολέας των όγκων ή ως υποκινητή της μετάστασης φαίνεται να είναι κυτταρικό τύπο και το περιεχόμενο που εξαρτώνται από [14], [15]. Έτσι, σε μοντέλα καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη, του μαστού και του παχέος εντέρου, caveolin-1 έκφραση είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται και τα επίπεδα πρωτεΐνης συσχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση [15]. Συνεπής με ένα ρόλο στη μετάσταση, caveolin-1 αναφέρθηκε να ενισχύσει την κυτταρική μετανάστευση και διεισδυτικότητα [11], [12], [16], [17]. Ωστόσο, ο ρόλος του caveolin-1 κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης των κυττάρων έχει ως επί το πλείστον χαρακτηρίζεται από το μη-μεταστατικά κύτταρα. Για παράδειγμα, σε ποντικό εμβρυϊκούς ινοβλάστες (ΠΜΑ), caveolin-1-προωθείται κυτταρική κινητικότητα εμπλέκονται κύτταρο πόλωση και αυξημένη ταχύτητα και επιμονή της κυτταρικής μετανάστευσης [18]. Επιπλέον, caveolin-1 μειώνει Rac1 και Cdc42, αλλά αυξάνει δραστικότητα RhoA με αναστολή της οδού Src /p190RhoGAP σηματοδότηση [10], [18]. Περιέργως, caveolin-1 η ίδια συσσωρεύεται στο πίσω μέρος του μεταναστεύουν ινοβλάστες, νευρώνες και ενδοθηλιακά κύτταρα σε 2D μοντέλα [19], [20], [21], αν και σε διαμετακινήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα και τους νευρώνες, caveolin-1 συσσωρεύεται κατά προτίμηση στο εμπρόσθιο κύτταρο [20], [22]. Η caveolin-1-εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση και συσσώρευση στο πίσω μέρος του ΠΜΑ απαιτούν την αμινοξική αλληλουχία 1-60, η οποία περιλαμβάνει μια υποθετική caveolin-1 Ν-τελική περιοχή πόλωση [21], [23].

Caveolin- 1 σταθεροποιεί το κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) σε ΕΧΟ μειώνοντας την παλινδρόμηση μεταξύ ΕΧΟ και κυτοσολικές πισίνες, όπως φαίνεται από την ανάκτηση φθορισμού μετά από φωτολεύκανση ανάλυση του κινητού κλάσματος. Από FAK, και πιο συγκεκριμένα φωσφο-Y397-ΡΑΚ, είναι γνωστό ότι ενισχύει τον κύκλο εργασιών FA, caveolin-1 προτάθηκε να συμμετέχει στη ρύθμιση της διαδικασίας αυτής [24]. Πράγματι, οι μελέτες που ακολούθησαν έδειξαν ότι caveolin-1-εξαρτώμενη σταθεροποίηση των FAK, μετανάστευση κυττάρων και εισβολή εμπλέκονται τον άξονα Src /Rho /ROCK καθώς και φωσφορυλίωση caveolin-1 επί τυροσίνης-14 [11]. Μάλλον περίεργο τρόπο, caveolin-1 επίσης δειχθεί ότι αυξάνει τη σταθερότητα των εν τω γεννάσθαι ΕΧΟ (ή εστιακές επαφές) και ενεργοποίηση RhoA [18].

Είναι ενδιαφέρον ότι, Src κινάση φωσφορυλίωση του caveolin-1 επί της τυροσίνης-14 φαίνεται να είναι απαραίτητη για caveolin-1 με γνώμονα την κυτταρική μετανάστευση. Σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού κύτταρα (MDA-MB-231), caveolin-1 εκφράζεται έντονα και φωσφορυλιωμένη στην τυροσίνη-14, σε σύγκριση με μη-μεταστατικών καρκινικών κυττάρων [11]. Αν και οι αρχικές μελέτες πρότειναν ένα υποθετικό ρόλο για caveolin-1 φωσφορυλίωση στην τυροσίνη-14, αμφιλεγόμενα ζητήματα παραμένουν όσον αφορά την ακριβή εμπλοκή των φωσφο-caveolin-1 σε σύμπλοκα προσκόλληση με την εξωκυτταρική μήτρα [25]. Το πιο σημαντικό, όμως, ο ρόλος του caveolin-1 στη μετανάστευση των μεταστατικών κυττάρων απαιτεί περαιτέρω έρευνα, προκειμένου να κατανοήσουμε πώς αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να συμβάλει σε διαδικασίες όπως η μετάσταση.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε συγκεκριμένα το ρόλο της caveolin -1 σε μεταστατική κυτταρική μετανάστευση με την χρησιμοποίηση δύο διαφορετικά μοντέλα: ΜϋΑ-ΜΒ-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού και του μελανώματος ποντικού κυτταρική γραμμή Β16-Ρ10. Και στις δύο κυτταρικές σειρές, caveolin-1 προωθείται μετανάστευση των κυττάρων, αυξάνοντας FA κύκλου εργασιών, την πόλωση, την ταχύτητα, την επιμονή και την κατευθυντικότητα. Αυτές οι λειτουργίες του caveolin-1 όλα μπλοκαριστεί παρεμβαίνοντας με φωσφορυλίωση στην τυροσίνη-14, όπως φαίνεται από φαρμακολογική αναστολή και ανάλυση μεταλλάξεων. Περιέργως, και στα δύο μοντέλα μεταστατικού κυττάρου, caveolin-1 εντοπισμού στο πίσω κυττάρων δεν απαιτείται για την προώθηση της μετανάστευσης.

Αποτελέσματα

Η caveolin-1 συσσωρεύεται το πίσω άκρο του Μεταναστεύουν ΥΠΟΙΟ-3Τ3 και DI-TNC1 κύτταρα, αλλά όχι Μεταστατικός MDA-MB-231 και Β16-Ρ10 κύτταρα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι caveolin-1 συσσωρεύεται στο πίσω μέρος του μεταναστευτικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων ΠΜΑ, HUVECs και νευρώνες [19], [ ,,,0],20], [21]. Επιδιώξαμε να επεκτείνουν αυτές τις παρατηρήσεις στις ταχέως μεταναστεύουν μεταστατικά κύτταρα, αξιολογώντας τον εντοπισμό των caveolin-1 σε μια δοκιμασία για επούλωση της πληγής που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοφθορισμού. Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 και δι-TNC1, καθώς και κύτταρα MEF-3Τ3, όλοι εξέφρασαν υψηλά ενδογενή επίπεδα caveolin-1 (Εικόνα 1Α). Απροσδόκητα, caveolin-1 απέτυχε να συσσωρεύεται στο πίσω μέρος του MDA-MB-231 κυττάρων κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης προς τους τραυματίες περιοχής (Εικόνα 1Β). Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [8], [9], πόλωση του caveolin-1 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ινοβλαστών MEF-3Τ3, καθώς επίσης και σε αστροκυτταρικές κύτταρα DI-TNC1 (Εικόνα 1Β). Για να εκτιμήσει την έκταση της caveolin-1 πόλωσης, εντάσεις φθορισμού στο πίσω και μπροστινό μέρος είχαν προσδιοριστεί ποσοτικά μέσα σε διακριτές ζώνες, χρησιμοποιώντας το

Εικόνα J

λογισμικό και τα πίσω /εμπρός αναλογίες υπολογίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία της μετανάστευσης, όπως και στο παρελθόν περιγράφεται [21], [23]. Και για τα δύο MEF-3Τ3 και DI-TNC1, αλλά όχι MDA-MB-231 κύτταρα, εξαρτώμενη από τον χρόνο αυξήσεις caveolin-1 πόλωση ανιχνεύθηκαν, οπότε η συσσώρευση στο πίσω μέρος ήταν σχεδόν πλήρης μετά από 360 λεπτά μετανάστευση (Σχήμα 1 C). Έλλειψη caveolin-1 πόλωση σε MDA-MB-231 κύτταρα δεν μπορούσαν να αποδοθούν σε υψηλά επίπεδα ενδογενούς έκφρασης σε αυτά τα κύτταρα, αφού, μετά shRNA μεσολάβηση κάτω ρύθμιση των caveolin-1, απομεινάρι caveolin-1 απέτυχε να πολώσει σε αυτά τα κύτταρα κατόπιν μετανάστευση (βλέπε παρακάτω κείμενο, τα σχήματα 2Α, 2Β και 2C).

(Α) Συνολική εκχυλίσματα πρωτεΐνης από DI-TNC1, MEF-3Τ3 και MDA-MB-231 κύτταρα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (35 μg ολικής πρωτεΐνης ανά λωρίδα) και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα εναντίον caveolin-1 και β-ακτίνης. (Β) Συρρέουσες μονοστιβάδες DI-TNC1, MEF-3Τ3 και MDA-MB-231 κύτταρα τραυματίστηκαν με ένα ρύγχος πιπέτας και καθορίζεται σε 0 (αριστερό πάνελ) και 60 λεπτά (δεξί πάνελ) μετά από τραυματισμό μονοστιβάδας. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-caveolin-1 αντίσωμα που ακολουθείται από ένα αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG (πράσινο) και οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με DAPI (μπλε). Το πρώτο στρώμα των κυττάρων που αντιμετωπίζει η πληγωμένη περιοχή διακρίνεται από το υπόλοιπο τμήμα της με λευκή γραμμή. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Γ) Η caveolin-1 διανομή αξιολογήθηκε με μέτρηση της έντασης φθορισμού σε τέσσερις τυχαία επιλεγμένα περιοχές ίσων διαστάσεων στο μπροστινό και το πίσω μέρος του κυττάρου με το

Εικόνα J

λογισμικό, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στα Υλικά και Μέθοδοι . Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν την αναλογία της έντασης φθορισμού «οπίσθια /εμπρόσθια» (μέση ± SEM? N = 3). Στατιστικώς σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με το χρόνο οι 0 λεπτά για κάθε κυτταρικό τύπο υποδεικνύονται (**, Ρ & lt? 0,01? *, Ρ & lt? 0,05). (D) Κύτταρα Β16-Ρ10 επιμολυσμένα με είτε pLacIOP (mock) ή pLacIOP-caveolin-1 (cav1) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με 1 mM IPTG για 24 ώρες και ολικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (35 μg ολικής πρωτεΐνης ανά λωρίδα) και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Ε) Συρρέουσες μονοστιβάδες pLacIOP-caveolin-1 επιμολυσμένων κυττάρων Β16-Ρ10 απουσία ή παρουσία 1 mM IPTG τραυματίστηκαν με το ρύγχος μιας πιπέτας και στερεώνεται είτε σε 0 ή 60 λεπτά μετά τον τραυματισμό. Δείγματα υπέστησαν χρώση με αντι-caveolin-1 πολυκλωνικό αντίσωμα (πράσινο) και DAPI (μπλε). Η άκρη του τραύματος σκιαγραφείται με λευκή γραμμή. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (F) Η caveolin-1 εντοπισμός αναλύθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία, όπως περιγράφεται στο C. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να επεκτείνει τα ευρήματα μας σε MDA-MB-231 , caveolin-1 πόλωση αξιολογήθηκε επίσης σε μελάνωμα ποντικού κύτταρα Β16-Ρ10. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν χαμηλά επίπεδα ενδογενούς και, ως εκ τούτου, caveolin-1 εισήχθη από σταθερώς επιμόλυνση κυττάρων με το πλασμίδιο placIOP που περιέχει ένα ένθετο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη πλήρους μήκους. Ένα πλεονέκτημα αυτού του πλασμιδίου είναι ότι επιτρέπει ΙΡΤΟ-διεγέρσιμη έκφραση [26]. Όπως φαίνεται, η επιμόλυνση με pLacIOP-caveolin-1 (

κατάσταση cav1

) οδήγησε σε μια 5-πλάσια αύξηση στην caveolin-1 επίπεδα σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα pLacIOP (

mock κατάσταση

, σχήμα 1Δ). Η έκφραση αυξήθηκε περαιτέρω με 1 mM IPTG κατά 5-φορές σε σύγκριση με μη επαγόμενα κύτταρα (Σχήμα 1 D). Έτσι, caveolin-1 εντοπισμός αξιολογήθηκε τόσο επαγόμενη (υψηλή έκφραση) και μη επαγόμενα κύτταρα (χαμηλή έκφραση) κατά της μετανάστευσης σε μία δοκιμασία επούλωση της πληγής. Όσο για MDA-MB-231 κύτταρα, caveolin-1 απέτυχε να αποκαταστήσει εντοπίζονται σε μεταναστευτικά κύτταρα Β16-Ρ10 (σχήμα 1 Ε) και συσσώρευση στο πίσω μέρος δεν παρατηρήθηκε ποτέ σε οποιαδήποτε στιγμή κατά τη μετανάστευση (Σχήμα 1 F).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι, σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις σε μη μεταστατικά κύτταρα αξιολογήθηκαν εδώ (MEF-3Τ3, DI-TNC1) και στη βιβλιογραφία [19], [20], [21], caveolin-1 δεν υφίστανται πόλωση κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης των μεταστατικών κυττάρων. Δεδομένου ότι οι συνέπειες αυτής της caveolin-1 συμπεριφορά για τη μετανάστευση των κυττάρων είναι άγνωστες, η συμβολή των caveolin-1 σε διάφορα μετανάστευση που σχετίζονται χαρακτηριστικά του MDA-MB-231 και Β16-Ρ10 κύτταρα αξιολογήθηκε στα ακόλουθα πειράματα.

κυττάρων πόλωση είναι το πρώτο βήμα που απαιτείται για την μετανάστευση των κυττάρων και κατεύθυνσης κίνησης. Re-εντοπισμό του εν όψει των πυρήνων MTOC και πίσω από το Golgi είναι σημαντική στον καθορισμό της κατεύθυνσης της μετανάστευσης [27]. Για να εξεταστεί ο ρόλος των caveolin-1 σε πόλωση κυττάρων MDA-MB-231, ενδογενή πρωτεΐνη κάτω-ρυθμίζονται από shRNA (shRNA-caveolin-1 # 5) (Σχήμα 2Α). Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα 1, η υπολειπόμενη ενδογενή caveolin-1 δεν συσσωρεύονται στο πίσω μέρος του μεταναστευτικά κύτταρα (Σχήματα 2Β, 2C). Ωστόσο, πόλωση του MDA-MB-231 κυττάρων με μειωμένη caveolin-1 έκφραση μειώθηκε σημαντικά, όπως φαίνεται από Golgi προσανατολισμό (Σχήματα 2Β, 2D? Σχήμα S1A, S1B). Ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι shRNA μεσολάβηση κάτω ρύθμιση των caveolin-1 καθυστερήσει πόλωση κυττάρων MDA-MB-231, δεδομένου ότι οι διαφορές δεν ήταν πλέον σημαντική μετά 360 λεπτά (Σχήμα 2D). Όπως θα μπορούσε να προβλεφθεί για ένα δοσοεξαρτώμενο caveolin-1 δράση, μερική απώλεια κυττάρου πόλωσης παρατηρήθηκε με ένα άλλο shRNA (shRNA-caveolin-1, αλληλουχία # 3), που στοχεύουν caveolin-1 με μικρότερη απόδοση (Σχήμα S1A, Εικόνα S1c) . Έτσι, caveolin-1 φαίνεται να παίζουν ένα νωρίς, αλλά παροδική ρόλο στην πόλωση των μεταστατικών κυττάρων MDA-MB-231. Ομοίως, Β16-Ρ10 πόλωση κυττάρων αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από μετανάστευση σε μια τραυματισμένη περιοχή και ο αριθμός των πολωμένα κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα που εκφράζουν caveolin-1 μετά IPTG επαγωγή (Σχήματα 2Ε, 2F? Εικόνα S2). Μικρότερη αύξηση σε κυτταρική πόλωση παρατηρήθηκε σε κύτταρα χαμηλής caveolin-1 που εκφράζουν (χωρίς επαγωγή IPTG) σε σύγκριση με την ψευδο ελέγχου (Σχήμα 2F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τόσο Β16-Ρ10 μελανώματος ποντικού και MDA-MB-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού, caveolin-1 προάγει κυτταρική πόλωση με τρόπο που δεν απαιτεί caveolin-1 συσσώρευσης στο πίσω κύτταρο.

(α) η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν τόσο από τη γονική MDA-MB-231 και τα κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με έναν έλεγχο shRNA στόχευσης λουσιφεράσης (sh-Ctrl) ή ένα shRNA στόχευσης caveolin-1 (shRNA-caveolin-1 # 5, SH-cav1 ). Εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (35 μg ολικής πρωτεΐνης ανά λωρίδα) και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα εναντίον caveolin-1 και β-ακτίνης. (Β) Μονοστοιβάδες της γονικής, shRNA ελέγχου (sh-ctrl) ή shRNA-caveolin-1 (sh-cav1) αντιμετωπίζονται MDA-MB-231 κύτταρα τραυματίες με το ρύγχος μιας πιπέτας και καθορίζεται σε 0 (αριστερό πάνελ) και 60 λεπτό (δεξί πάνελ) μετά από τραυματισμό μονοστιβάδας. Δείγματα υπέστησαν χρώση με αντι-caveolin-1 (πράσινη) και αντι-Golgin-97 (κόκκινο) αντισώματα, ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Το πρώτο στρώμα των κυττάρων που αντιμετωπίζει η πληγωμένη περιοχή διακρίνεται από το υπόλοιπο τμήμα της με λευκή γραμμή. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Γ) Η caveolin-1 εντοπισμός αναλύθηκε όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1 C, με μέτρηση της αναλογίας της έντασης φθορισμού «οπίσθια /εμπρόσθια». Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SEM, η = 3. (D) Πόλωση και των δύο γονικών (-) και shRNA κατεργάζεται MDA ΜΒ-231-κυττάρων με shRNA-λουσιφεράσης (sh-Ctrl) ή shRNA-caveolin-1 (sh-cav1) μετρήθηκε από (C) όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι, αναλύοντας το εξωτερικό στρώμα των κυττάρων που αντιμετωπίζει η πληγωμένη περιοχή (Β). Το ποσοστό των πολωμένα κύτταρα αξιολογήθηκε στις 0, 60 και 360 λεπτά μετά τον τραυματισμό. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο από τρία ανεξάρτητα πειράματα (μέση ± SEM). * Σύγκριση με έλεγχο shRNA P & lt? 0,05. κύτταρα (Ε) Β16-Ρ10 επιμολυσμένα με είτε pLacIOP (mock) ή pLacIOP-caveolin-1 (cav1) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με 1 mM IPTG για 24 ώρες, που καλλιεργούνται σε μονοστοιβάδες και τραυματίες με το ρύγχος μιας πιπέτας για να επιτρέψει τη μετανάστευση επί 1 ώρα. Δείγματα υπέστησαν χρώση με αντι Gigantin-1-πολυκλωνικό αντίσωμα (μπλε), φαλλοειδίνη-Alexa488® (πράσινο) και ιωδιούχο προπίδιο (ερυθρό). Το εξωτερικό στρώμα των κυττάρων που αντιμετωπίζει η πληγωμένη περιοχή σκιαγραφείται με λευκή γραμμή. (F) πόλωση των κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι, αναλύοντας το εξωτερικό στρώμα των κυττάρων που αντιμετωπίζει η πληγωμένη περιοχή. Το ποσοστό των πολωμένα κύτταρα αξιολογήθηκε 0-360 λεπτά μετά τον τραυματισμό την μονοστιβάδα. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο από τρία ανεξάρτητα πειράματα (μέση ± SEM). Στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με pLacIOP-επιμολυσμένα Β16-F10 είναι (mock) κύτταρα που αναφέρεται (**, Ρ & lt? 0,01 σε χρόνο 360 λεπτά? *, Ρ & lt? 0,05 σε χρόνο 60 min)

Η

Η caveolin. -1 Προωθεί μετανάστευση των μεταστατικών κυττάρων

Ο ρόλος των caveolin-1 σε μετανάστευση κυττάρων είναι αμφιλεγόμενη και φαίνεται να είναι κύτταρο-πλαίσιο που εξαρτάται, δεδομένου ότι έχει περιγραφεί τόσο ως θετικός [18], [19] και αρνητικός ρυθμιστής της μετανάστευσης [28], [29], [30]. Σε αυτές τις μελέτες χαρακτηρίστηκαν κυρίως ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα. Έτσι, αξιολογήσαμε την επίδραση της caveolin-1 σε μετανάστευση μεταστατικών MDA-MB-231 και τα κύτταρα Β16-Ρ10. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, caveolin-1 έκφραση ευνοούνται μετανάστευση, όπως παρατηρείται σε μία δοκιμασία Boyden τμήμα (Σχήματα 3Α, 4Α) και με ανάλυση με time-lapse βίντεο μικροσκοπία συνδυαστούν με ατομικές κυτταρικές παρακολούθησης (σχήματα 3Β, 4Β). Caveolin-1 κάτω ρύθμιση στο MDA-MB-231 κύτταρα με shRNA μειώθηκε το μήκος της τροχιάς και κατευθυντικότητα της μετανάστευσης σε σχέση με το γονικό έλεγχο και κυττάρων (Σχήμα 3Β). Τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι caveolin-1 παρουσία σε αυτά τα κύτταρα ευνοεί επιμονή της κυτταρικής μετανάστευσης. Πράγματι, caveolin-1 κάτω ρύθμιση μειώθηκε μετανάστευση κυττάρου που σχετίζεται παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένου του στιγμιαίου (Εικόνα 3C) και μέση ταχύτητα (Σχήμα 3D), εμμονής (που λαμβάνεται ως ο λόγος μεταξύ των καθαρών και συνολική απόσταση, Σχήμα 3Ε) και κατευθυντικότητα της μετανάστευσης (που εκφράζεται ως το ποσοστό των κυττάρων που κινούνται μέσα σε μια γωνία 60 ° από το σημείο εκκίνησης) (Σχήματα 3Β, 3F). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα Β16-Ρ10, όπου caveolin-1 έκφραση αυξήθηκε μετανάστευση σε προσδιορισμό θαλάμου Boyden (Σχήμα 4Α) και η μετανάστευση σε μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής (Σχήμα 4Β), καθώς και την στιγμιαία και μέση ταχύτητα, ανθεκτικότητας και κατευθυντικότητα της μετανάστευσης (Σχήμα 4C, το Σχήμα S3). Τα στοιχεία αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις σε κύτταρα ΥΠΟΙΟ-3Τ3 [10], [11], [18] και δείχνουν ότι caveolin-1 ρυθμίζει τη μετανάστευση των μεταστατικών MDA-MB-231 και τα κύτταρα Β16-F10, αλλά το κάνει ακόμα ελλείψει αλλαγές στην ενδοκυτταρική κατανομή.

(α) μετανάστευση του MDA ΜΒ-231 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με shRNA στοχεύουν είτε λουσιφεράσης (sh-ctrl) ή caveolin-1 (sh-cav1) αξιολογήθηκε σε μία Boyden δοκιμασία θαλάμου. Κύτταρα (5 × 10

4) σπάρθηκαν επί (2 μg /ml) πλακών transwell ινωδονεκτίνη επικαλυμμένες και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 2 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά ανιχνεύθηκαν με χρώση κρυσταλλικού ιώδους (μέση ± SEM, η = 3). ** P & lt? 0,01. (Β) Γονική και shRNA αντιμετωπίζονται MDA-MB-231 κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδες συρροής, τραυματίες με το ρύγχος μιας πιπέτας και τη μετανάστευση καταγράφηκε από μικροσκόπιο time-lapse βίντεο (σύνολο 15 ώρες, 12 λεπτά χρονικό πλαίσιο). κομμάτια των κυττάρων προσδιορίστηκαν με τη χρήση του

Εικόνα J

λογισμικού (

«Εγχειρίδιο Tracking»

plug-in). Τα κομμάτια του ενιαίου κυττάρων στο τραυματίες άκρη εμφανίζονται (άνω πάνελ). Η άκρη του τραύματος υποδεικνύεται με λευκή γραμμή. Τα κομμάτια Ενιαία κελί εμφανίζεται σε ένα καρτεσιανό σύστημα συντεταγμένων για κάθε τύπο κυττάρου (κάτω πλαίσιο). (Γ) Άμεση ταχύτητα αναλύθηκε για κάθε κυτταρικό τύπο στο (Β) και παρίσταται ως συνάρτηση του χρόνου (0-15 ώρες). τιμές (D) Μέση ταχύτητα ελήφθησαν από (C) και χαράσσονται για κάθε κυτταρικό τύπο. (Ε) Διατηρησιμότητα της μετανάστευσης υπολογίστηκε ως ο λόγος μεταξύ του καθαρού απόσταση και τη συνολική απόσταση της μετανάστευσης στο (Β). Μέσες τιμές ελήφθησαν για τη γονική, SH-ctrl και SH-cav1 κύτταρα (μέση τιμή ± SEM). (F) κατευθυντικότητα του μετανάστευση ελήφθη από την ανάλυση που φαίνεται στο (Β), κάτω πάνελ. Τα ίχνη που βρισκόταν μέσα σε μια γωνία 60 ° σε σχέση με την κατεύθυνση της κίνησης των κυττάρων θεωρήθηκαν ως προσανατολισμένη (σκιασμένη περιοχή). Το ποσοστό των κυττάρων με προσανατολισμένη κομμάτια υπολογίστηκε και χαράσσεται (μέση ± SEM, η = 3). * P & lt?. 0.05

Η

φωσφορυλίωσης τυροσίνης σε Η caveolin-1 απαιτείται για μετανάστευση των μεταστατικών κυττάρων

Η caveolin-1 υποβάλλεται μεσολαβεί η Src φωσφορυλίωση στην τυροσίνη-14, η οποία θεωρείται ότι είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των ινοβλαστών κυττάρου [18]. Η εμπλοκή της φωσφορυλίωσης του caveolin-1 επί τυροσίνης-14 για την προώθηση της κυτταρικής μετανάστευσης υποστηρίζεται περαιτέρω από παρατηρήσεις στον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των MDA-MB-231 κύτταρα [11]. Έτσι, αξιολογήσαμε το ρόλο της φωσφορυλίωσης τυροσίνης στο κυτταρική σειρά μελανώματος Β16-Ρ10. Περιέργως, η έκφραση της μη-φωσφορυλιώσιμη caveolin-1 (μεταλλαγμένο Y14F) απέτυχε να προωθήσει Β16-Ρ10 κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 4Α, 4Β). Παρά το γεγονός ότι η μεταλλαγμένη Y14F δεν εκφράστηκε στον ίδιο βαθμό όπως η άγριου τύπου πρωτεΐνη, είναι απίθανο ότι αντιπροσωπεύει τέτοια διαφορική έκφραση για ανικανότητα αυτής της πρωτεΐνης για την προώθηση της κυτταρικής μετανάστευσης (Σχήμα 4Α), δεδομένου ότι για ένα πληθυσμό B16F10 (caveolin-1) κύτταρα (κλώνος 3) με συγκρίσιμα επίπεδα caveolin-1 με εκείνες ανιχνεύτηκε σε 1 caveolin-κύτταρα (Y14F) (βλέπε Σχήμα S3), τα ποσοστά της μετανάστευσης ήταν παρόμοια με αυτά που ανιχνεύονται για τον αρχικό πληθυσμό των κυττάρων Β16Ρ10 (caveolin-1) (Εικόνα 4Α). ανάλυση βίντεο μικροσκοπία έδειξε ότι τα κομμάτια του mock ελέγχων και των κυττάρων caveolin-1 (Y14F) ήταν μικρότερες από εκείνες που λαμβάνονται από κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου caveolin-1 (Σχήμα 4Β). Επιπρόσθετα, η μετανάστευση ήταν πιο τυχαία σε κύτταρα που στερούνται caveolin-1 ή έκφραση caveolin-1 (Y14F) και τις παραμέτρους της μέσης ταχύτητας, εμμονής και κατευθυντικότητα της μετανάστευσης ήταν χαμηλότερες σε caveolin-1 (Y14F) κύτταρα, σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου caveolin -1 (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι caveolin-1 προάγει την κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα Β16-Ρ10 με την αύξηση των κυττάρων πόλωση, την ταχύτητα, επιμονή και κατευθυντικότητα της κίνησης των κυττάρων και ότι η ικανότητα να το πράξουν εξαρτάται από την παρουσία και πιθανώς φωσφορυλίωση τυροσίνης-14.

κύτταρα (Α) Β16-Ρ10 επιμολυσμένα με pLacIOP (mock), pLacIOP-caveolin-1 (WT) ή ο pLacIOP-caveolin-1 /Y14F μετάλλαγμα (Y14F) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM IPTG για 24 ώρες. Στη συνέχεια, η μετανάστευση των κυττάρων αξιολογήθηκε σε μία δοκιμασία θάλαμο Boyden με σπορά κυττάρων (5 × 10

4) στο (2 μg /ml) πλακών transwell ινωδονεκτίνη επικαλυμμένες και επιτρέποντας μετανάστευσης για 2 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά ανιχνεύθηκαν με χρώση κρυσταλλικού ιώδους (μέση ± SEM, η = 3). * P & lt? 0,05. Κάτω πάνελ δείχνουν ολικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (35 μg ολικής πρωτεΐνης ανά λωρίδα) και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Οι αριθμοί παρακάτω πίνακες δείχνουν τα σχετικά επίπεδα caveolin-1 (caveolin-1 /WT = 22.0 ± 1.8, caveolin-1 /Y14F = 16.6 ± 3.8? Αξιών σε σχέση με την πλαστή κατάσταση και λαμβάνεται ως η μέση τιμή από τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις ± SEM). (Β) Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων Β16-F10 επιμολυσμένα με pLacIOP (πλαστή), pLacIOP-caveolin-1 (WT) ή pLacIOP-caveolin-1 /Y14F (Y14F) τραυματίστηκαν με το ρύγχος μιας πιπέτας και καταγράφονται από time-lapse μικροσκοπία βίντεο για 10 ώρες (διάστημα πλαισίου 12 λεπτά). κομμάτια κυττάρων προσδιορίστηκαν όπως φαίνεται στο Σχήμα μύθο 3Β. Τα κομμάτια του ενιαίου κυττάρων στο τραυματίες άκρη εμφανίζονται (άνω πάνελ). Η άκρη του τραύματος σκιαγραφείται με λευκή γραμμή. Τα κομμάτια Ενιαία κελί εμφανίζεται σε ένα καρτεσιανό σύστημα συντεταγμένων για κάθε τύπο κυττάρου (κάτω πλαίσιο). (Γ) Η μέση ταχύτητα (μm /min) προήλθε από την στιγμιαία ταχύτητα (Σχήμα S3), όπως περιγράφεται στο (D). Ο επίμονος και κατευθυντικότητα της μετανάστευσης ελήφθησαν όπως περιγράφεται στα σχήματα 3Ε και 3F, αντίστοιχα. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι ο μέσος όρος ± SEM (n = 3). * P & lt?. 0.05

Η

Τα στοιχεία που λαμβάνονται στα κύτταρα Β16-F10 περαιτέρω επικυρωθεί από φαρμακολογική αναστολή των κινασών Src οικογένειας, η οποία φωσφορυλιώνει caveolin-1 σε τυροσίνη-14 [31]. Η μετανάστευση κυττάρων και φωσφορυλίωση caveolin-1 εκτιμήθηκαν με την παρουσία ή απουσία του επιλεκτικού αναστολέα κινάσης Src, ΡΡ2 (4-αμινο-5- (4-χλωροφαινυλ) -7- (διμεθυλαιθυλ) πυραζολο [3,4-d] πυριμιδίνη ), τόσο σε MDA-MB-231 και τα κύτταρα Β16-Ρ10. διέγερση ορού αυξήθηκε κλεισίματος τραύματος στα δύο MDA-MB-231 και τα κύτταρα Β16-Ρ10. Το κλείσιμο της πληγής που διαμορφώνονται από caveolin-1 έκφραση, όπως shRNA μεσολάβηση κάτω ρύθμιση σε MDA-MB-231 κυττάρων μειώθηκε (Σχήμα 5Α, ιστόγραμμα bars), ενώ έκτοπη έκφραση σε Β16-Ρ10 κυττάρων αυξήθηκε το κλείσιμο του τραύματος (Σχήμα 5Β, ιστόγραμμα bars) . Σημαντικά, η θεραπεία με ΡΡ2, αλλά όχι έλεγχο οχήματος (διμεθυλοσουλφοξείδιο, DMSO) εμπόδισαν το κλείσιμο του τραύματος caveolin-1-ενισχυμένη τόσο MDA-MB-231 (Σχήμα 5Α) και Β16-Ρ10 κύτταρα (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, τόσο ενδογενείς και εκτοπικά εκφραζόμενη caveolin-1 απέτυχε να υποστούν φωσφορυλίωση με την παρουσία αυτού του αναστολέα (Σχήματα 5Α, 5Β, κηλίδες Western). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι λίγο pY14-caveolin-1 ήταν ανιχνεύσιμη στα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα Β16-Ρ10, πιθανώς λόγω ενδογενών επιπέδων caveolin-1 ήταν πολύ χαμηλή. Σημαντικά, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στον πολλαπλασιασμό και για τις δύο κυτταρικές σειρές σε παρουσία του αναστολέα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την ιδέα ότι η ικανότητα του caveolin-1 για την ενίσχυση της μεταστατικής κυτταρικής μετανάστευσης εξαρτάται από τυροσίνης-14 φωσφορυλίωση από κινάσες της οικογένειας Src.

MDA ΜΒ 231-κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με shRNA είτε στόχευση λουσιφεράσης ( sh-ctrl) ή caveolin-1 (sh-cav1) προ-επωάστηκαν με DMSO (D) ή 10 μΜ ΡΡ2 για 30 λεπτά, τραυματίστηκαν με ένα άκρο σωληνίσκου, διεγερμένα (+) ή όχι (-) με 3% ορού και οι εικόνες καταγράφηκαν στις 0 και 16 ώρες μετά τον τραυματισμό. Οι τραυματίες περιοχή μετρήθηκε με το

Εικόνα J

λογισμικό και το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος ήταν απεικονίζονται (άνω πάνελ). Σύνολο πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα εναντίον caveolin-1, pY14-caveolin-1 και ακτίνης. (Β) Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων Β16-Ρ10 επιμολυσμένα με είτε pLacIOP ή pLacIOP-caveolin-1 προ-επωάστηκαν με 1 mM IPTG για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (D) ή ΡΡ2, τραυματίστηκαν με ένα άκρο σωληνίσκου, διεγείρονται με 3% ορού και αναλύθηκαν στις 0 και 7 ώρες μετά τον τραυματισμό, όπως περιγράφεται στο (Α). Σύνολο πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Οι τιμές στο (Α) και (Β) έχουν κατά μέσο όρο από 3 ανεξάρτητα πειράματα (μέση ± SEM). * P & lt?. 0.05

Η

Η caveolin-1 Προωθεί Focal κύκλος εργασιών Πρόσφυση σε μεταστατικά κύτταρα

Η caveolin-1 μειώνει την παλινδρόμηση των ΡΑΚ μεταξύ των εστιακών πρόσφυση και κυτοσολίων πισίνες, προτείνοντας ένα ρόλο για caveolin -1 στον κύκλο εργασιών του Fas [24]. Το πιο σημαντικό, η μετανάστευση των κυττάρων ρυθμίζεται αυστηρά στο επίπεδο του κύκλου εργασιών FA [32], [33]. Έτσι, αξιολόγησε την επίδραση της caveolin-1 επί του κύκλου εργασιών FA στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα με επιμόλυνση με GFP-βινκουλίνης που ακολουθείται από ανάλυση time-lapse βιντεομικροσκοπία. GFP-βινκουλίνης συνδέθηκε με ΕΧΟ τόσο mock και caveolin-1 κύτταρα που εκφράζουν Β16-Ρ10 (Σχήμα 6Α). Παρά το γεγονός ότι ένα μικρό ποσοστό του συνολικού κύκλου εργασιών ΕΧΟ υποβλήθηκε σε κύτταρα Β16-Ρ10 (5-10% του συνόλου των FAS), μια σημαντική αύξηση στην κινητική της FA αποσυναρμολόγησης παρατηρήθηκε σε κύτταρα caveolin-1 που εκφράζει σε σύγκριση με την ψευδο ελέγχου (Σχήμα 6Α , βέλη? Εικόνα 6Β, άνω γραφική παράσταση). Είναι σημαντικό ότι, η έκφραση του caveolin-1 αυξάνεται εστιακό επαφής (FC) ζωή (Σχήμα 6Α, αιχμές βελών? Σχήμα 6Β, γράφημα κάτω), σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις [18]

κυττάρων

(Α) Β16-F10 επιμολυσμένα. με pLacIOP (mock) ή pLacIOP-caveolin-1 (cav1) επιμολύνθηκαν με pEGFP-βινκουλίνης για 24 ώρες, εμβολιάζονται σε φιμπρονεκτίνη-επικαλυμμένες (2 μg /ml) και αναπτύχθηκαν σε παρουσία 1 mM IPTG για 24 ώρες (βλέπε Υλικά και μέθοδοι). Στη συνέχεια, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 4 ώρες, δονήθηκαν με 10% ορό και καταγράφονται από time-lapse μικροσκοπία βίντεο για 60 λεπτά (διάστημα πλαισίου 1-min). Οι μεγεθυνθεί περιοχές που εμφανίζονται σε επιλεγμένους χρόνους για πλαστή και cav1 κύτταρα. Εστιακό συμφύσεις (FA, βέλη) και το εστιακό επαφές (FC, αιχμές βελών) ορίστηκαν από το μέγεθος. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Κινητική ΕΧΟ και FCs μετρήθηκαν από πειράματα φαίνεται στο Α FA αποσυναρμολόγηση και FC διάρκεια ζωής μετρήθηκαν για τουλάχιστον 6 δομών ανά πείραμα (μέση ± SEM, η = 3). * P & lt? 0,05. (C) Β16-F10 mock ή cav1 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε φιμπρονεκτίνη-επικαλυμμένες (2 μg /ml), αναπτύχθηκαν σε παρουσία 1 mM IPTG για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ νοκοδαζόλη σε μέσο χωρίς ορό για 4 ώρες. Στη συνέχεια, νοκοδαζόλη απομακρύνθηκε με έκπλυση με μέσο και τα κύτταρα άνευ ορού επωάστηκαν με 0-20 λεπτά στους 37 ° C. Ακολούθως, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα (κόκκινο) και DAPI (μπλε) η επισήμανση ΕΧΟ και πυρήνες, αντίστοιχα. (D) ΕΧΟ ποσοτικοποιήθηκαν από πειράματα που περιγράφονται στο (C) με τη χρήση του

Εικόνα J

λογισμικού. Τουλάχιστον το 10 εικόνες ανά χρονικό σημείο αναλύθηκαν. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο από τρία ανεξάρτητα πειράματα (μέση ± SEM, η = 3). (Ε) Β16-F10 mock (-) κύτταρα, cav1 (WT) ή cav1 /Y14F (Y14F) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ νοκοδαζόλη, όπως περιγράφεται στην Εικόνα 6C. Νοκοδαζόλη στη συνέχεια πλύθηκε-out για 60 λεπτά και ΕΧΟ αναλύθηκαν με ένα αντι-αντίσωμα βινκουλίνης (κόκκινο) και οι πυρήνες με ϋΑΡΙ (μπλε). ΕΧΟ ποσοτικοποιήθηκαν όπως στο (D). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά από τρία ανεξάρτητα πειράματα (μέση τιμή ± SEM). * P & lt? 0,05. (F) MDA-MB-231 κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με shRNA είτε στόχευση λουσιφεράσης (sh-Ctrl) ή caveolin-1 (sh-cav1) επιμολύνθηκαν με pEGFP-βινκουλίνης για 24 ώρες, σε παντελή στέρηση ορού για 4 ώρες, δονήθηκαν με 10 % ορό και καταγράφονται από time-lapse μικροσκοπία βίντεο, όπως περιγράφεται στο (Α). FA αποσυναρμολόγηση και FC ζωής μετρήθηκαν για 5 δομών ανά πείραμα. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο από τρία ανεξάρτητα πειράματα (μέση ± SEM, η = 3). (G) αποσυναρμολόγηση Focal προσκόλληση μετρήθηκε μετά νοκοδαζόλη αφαίρεσης σε MDA-MB-231 κύτταρα κατεργασμένα με shRNA στόχευση της λουσιφεράσης (sh-Ctrl) ή caveolin-1 (sh-cav1), όπως περιγράφεται στο (Γ) και (Δ). Τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο από 12 μετρήσεις (μέση τιμή ± SD).