Αφηρημένο

Το επίκεντρο αυτής της μελέτης είναι οι αντικαρκινικές επιδράσεις των

Cudrania tricuspidata

στέλεχος ( CTS) εξάγει σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Η επίδραση της CTS στη βιωσιμότητα των κυττάρων διερευνήθηκε σε HPV-θετικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κυττάρων και HaCaT ανθρώπινα φυσιολογικά κερατινοκύτταρα. CTS έδειξαν σημαντική δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία κυτταροτοξική δράση του CTS επί HaCaT κερατινοκύτταρα σε συγκεντρώσεις 0,125 έως 0,5 mg /mL. Με βάση αυτή την κυτταροτοξική δράση, αποδείξαμε ότι CTS απόπτωση που επάγεται από τα κάτω ρύθμιση των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με χρώση ϋΑΡΙ, αννεξίνη V-FITC χρώση /ΡΙ, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, κηλίδωση Western, RT-PCR, και χρώση JC-1 σε καρκίνο του τραχήλου SiHa κύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της εξωγενούς οδού μορίων όπως Fas, υποδοχέας θανάτου 5 (DR5), και TNF που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) αυξήθηκαν κατά CTS. Επιπλέον, η θεραπεία CTS ενεργοποιημένη κασπάση-3 /κασπάσης-8 και διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP). Ωστόσο, οι μιτοχονδριακές δυναμικό της μεμβράνης και την έκφραση των επιπέδων των ενδογενών μορίων οδού όπως Bcl-2, Bcl-xL, Bax, και κυτόχρωμα C δεν διαμορφώνονται από CTS. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι CTS απόπτωση που επάγεται από την ενεργοποίηση της εξωγενούς οδού, αλλά όχι την ενδογενή οδό, σε καρκίνο του τραχήλου SiHa κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CTS μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ρυθμιστικός παράγοντας για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Kwon S-Β, Kim M-J, Yang JM, Lee H-P, το Χονγκ JT, Jeong H-S, et al. (2016)

Cudrania tricuspidata

Stem Απόσπασμα επάγει την απόπτωση μέσω της εξωγενούς οδού σε κύτταρα SiHa καρκίνο του τραχήλου. PLoS ONE 11 (3): e0150235. doi: 10.1371 /journal.pone.0150235

Επιμέλεια: Yi-Hsien Hsieh, Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, ΤΑΪΒΑΝ

Ελήφθη: 24 του Νοεμβρίου 2015? Αποδεκτές: 10 του Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 9 Μαρτίου 2016

Copyright: © 2016 Kwon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από το βασικό πρόγραμμα (2015R1A2A2A09001137) του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), https://www.nrf.re .kr /nrf_eng_cms. D.Y. Yoon υποστηρίχθηκε εν μέρει από την Προτεραιότητα Ερευνητικά Κέντρα Πρόγραμμα (2.012 – 0.006.686). Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς Pharma Teksol και Chungcheongbukdo Bio CS για την πνευματική και οικονομική τους υποστήριξη αυτού του έργου. Δεν υπήρξε καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συγγραφέας Eun Σουκ Κιμ απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία, Chungcheongbukdo Bio CS, και η εταιρεία παρέχει υποστήριξη με τη μορφή του μισθού για εκείνη. Ωστόσο, η εταιρεία δεν έχει καμία επιπλέον ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Ο ειδικός ρόλος του συγγραφέα αρθρώνεται στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Συντομογραφίες:. HPV, τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων? CTS,

Cudrania tricuspidata

βλαστικά? DR, υποδοχέας θανάτου? TRAIL, που επάγει απόπτωση TNF συνδετήρα που σχετίζονται με? PARP, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι μία από τις πιο κοινές ασθένειες που πλήττουν τις γυναίκες σε όλο τον κόσμο και παραμένει υψηλό αιτία θνησιμότητας μεταξύ των γυναικών στις αναπτυσσόμενες χώρες [1-2 ]. Επιδημιολογικά και κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μόλυνση με τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου τύπους (HPV), όπως οι τύποι 16 και 18, παίζει σημαντικό ρόλο στην πολυπαραγοντική αιτιολογία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [3]. HPV ογκοπρωτεΐνες υψηλού κινδύνου Ε6 και Ε7 παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 απενεργοποιούν ογκοκατασταλτικό ρ53 πρωτεΐνες και pRb, αντίστοιχα [4]. HPV υψηλού κινδύνου ογκοπρωτεϊνης Ε6 συνεργάτες με και υποβαθμίζει p53, ενώ HPV πρωτεΐνη Ε7 ανταγωνίζεται με E2F για την πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (pRb) θέσεις σύνδεσης [5].

Cudrania tricuspidata

είναι ανήκει ένα φυλλοβόλο δέντρο στην οικογένεια

Moraceae

που διανέμονται κυρίως στην Κορέα, την Κίνα και την Ιαπωνία. Το σύνολο του

C

.

tricuspidata

φυτό έχει αξιοποιηθεί ως σημαντική λαϊκή θεραπεία για τον καρκίνο στην Κορέα κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, ενώ έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ως παραδοσιακή ιατρική για τη θεραπεία νευρίτιδα και φλεγμονή σε άλλα μέρη της Ασίας [6]. Επιπλέον, διάφορα αποτελέσματα της

C

.

tricuspidata

εκχύλισμα έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένων αντιοξειδωτική δράση [7] και ανασταλτικές επιδράσεις επί συνθάσης νιτρικού οξειδίου [8]. Ωστόσο, οι αντικαρκινικές επιδράσεις του εκχυλίσματος του στελέχους του

C

.

tricuspidata

για τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα δεν έχουν διερευνηθεί.

Έτσι, οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η αντικαρκινική δράση του

Cudrania tricuspidata

στέλεχος (CTS) εκχύλισμα επί του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα HPV-θετικά και για τη διερεύνηση των αποπτωτικών μηχανισμών της CTS. Εδώ, αναφέρουμε ότι η αγωγή CTS προκαλεί απόπτωση μέσω της εξωγενούς οδού, καθώς επίσης και μέσω της καταστολής του HPV-16 ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 και τις μεταβολές των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 και ρ-pRb.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Reagent Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού [MTS, 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο] αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI, USA). Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) χρώση αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση αντιδραστήρια αγοράστηκαν από Pierce (Rockford, IL, USA). Αντισώματα ειδικά για PARP, κασπάσης-3, κασπάσης-8, ρ53, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bid, pRb, ρ-pRb, και κυτόχρωμα C αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Το αντι-κουνελιού IgG horseradish υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα και IgG συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού αγοράστηκαν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Αντισώματα ειδικά για ρ27, ρ21, και αφυδρογονάση αφυδρογονάση 3-φωσφορική (GAPDH) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-τετρααιθυλεστέρος χλωριούχο benzimidazolycarbocyanine) αγοράστηκε από Enzo (Farmingdale, ΝΥ, USA). Γενικά-κασπάσης αναστολέας Ζ-VAD-fmk και κασπάσης-8 αναστολέα Ζ-IETD-fmk αγοράστηκαν από την R &? Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ, USA). Το κιτ ΡΙΤΟαννεξίνης Ανίχνευση V απόπτωση που αγοράστηκε από την BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

Μέθοδοι εκχύλισης

Cudrania tricuspidata

στέλεχος (CTS) εκχύλισμα αγοράστηκε από την Κορέα Plant απόσπασμα τράπεζα (KPEB), Κορέα Ερευνητικό Ινστιτούτο Bioscience και Βιοτεχνολογίας (KRIBB) (Ochang, Chungbuk, Κορέα). Εν συντομία, το αποξηραμένο στέλεχος του

C

.

tricuspidata

πλύθηκε με αποστειρωμένο νερό και υποβλήθηκε σε εκχύλιση με μεθανόλη (MeOH) στους 30 ° C για 3 ημέρες. Ο διαλύτης εξατμίστηκε υπό μειωμένη πίεση για να δώσει ένα ακατέργαστο εκχύλισμα, όπως περιγράφεται σε προηγούμενη έκθεση [9].

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

Το εκχύλισμα διαλύθηκε σε μεθανόλη ( καθαρότητας HPLC) και διηθείται μέσω ηθμού σύριγγας 0,45-μm (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) πριν από την HPLC (ACME 9000 σύστημα, Younglin, Anyang, Κορέα) ανάλυση. Οι κινητές φάσεις ήταν 0.1% (ν /ν) οξικό οξύ σε νερό (Α) και 0,1% (ν /ν) ακετονιτρίλιο οξικό οξύ (Β). Το σύστημα βαθμιαίο διαλύτη είχε ως εξής: 92: 8 (%, ν /ν) Α: Β για 2 λεπτά, 90:10 (%, ν /ν) Α: Β για 27 λεπτά, 70:30 (%, v /ν) Α: Β για 50 λεπτά, μειώθηκε στο 10% Α σε 51 λεπτά, 0: 100 (%, ν /ν) Α: Β επί 60 λεπτά, και τέλος 92: 8 (%, ν /ν) Α: Β σε 70 λεπτά. Ο ρυθμός ροής ήταν 1 mL /min. Ο όγκος έγχυσης ήταν 20 μλ. Ο ανιχνευτής υν λειτούργησε σε 280 nm. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε μία στήλη ODS (5 μm, 4.6 χ 250 mm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Κυτταρική καλλιέργεια

HPV-16-θετικά SiHa και CaSki του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ? Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) που περιείχε 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα (FBS? Hyclone Laboratories). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε μία ατμόσφαιρα από 2/95% αέρα 5% CO

με κορεσμένο υγρασία.

προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με την αναγωγή βαφής MTS δοκιμασία, η οποία μετρά μιτοχονδριακή αναπνευστική λειτουργία. Ο καρκίνος του τραχήλου κύτταρα σπάρθηκαν (12 × 10

4 κύτταρα /mL) σε 100 μL μέσου /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CTS, όπως αναφέρεται στις λεζάντες σχήμα, για 24 ώρες . Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίζεται με εκτίμηση του μεταβολισμού MTS όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, τα δείγματα μέσων (100 μL) απομακρύνθηκαν και επωάστηκαν με 100 μL διαλύματος μίγματος MTS-PMS για 1 ώρα στους 37 ° C. Οπτική απορρόφηση μετρήθηκε στα 492 nm χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης ELISA (Απόλλων LB 9110, Berthold Technologies GmbH & amp? Co. KG, Bad Wilbad, Γερμανία).

DAPI χρώση

Τα αποπτωτικά πυρηνική μορφολογία παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση DAPI. κύτταρα SiHa σπάρθηκαν σε πλάκες 2-καλά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις CTS για 24 ώρες, μετά την οποία οι πλάκες 2-φρεατίων πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Στη συνέχεια, τα κύτταρα SiHa μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με διάλυμα χρώσης ϋΑΡΙ. Τα πλακίδια 2-φρεατίων πλύθηκαν με PBS και στερεώθηκαν σε πλάκες μικροσκοπίου με τοποθέτηση διάλυμα. Βιτρώ κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan).

αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο χρώση

Ο καρκίνος του τραχήλου κύτταρα (2.5 × 10

5 κύτταρα /mL) σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 60-mm και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CTS για 24 ώρες, συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη-ΕϋΤΑ και πλύθηκαν με PBS. Annexin V και χρώση ΡΙ διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το FITC-αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACSCalibur και το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

κυτταρικού κύκλου αναλύσεις με κυτταρομετρία ροής

Το κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με προπίδιο ιωδιούχο (PI) χρώση και κυτταρομετρία ροής. κύτταρα SiHa (2.5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 60-mm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CTS για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και σταθεροποιήθηκαν με 80% αιθανόλη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και φυγοκεντρείται, μετά την οποία τα προκύπτοντα υπερκείμενα απορρίφθηκαν. Το ίζημα επαναιωρήθηκε και χρωματίστηκαν με PBS που περιέχει 50 μg /mL ΡΙ και 100 μg /mL RNase Α για 20 λεπτά στο σκοτάδι. περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACSCalibur και το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Κύτταρα κατεργασμένα με CTS ήταν συγκομιδή. RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εύκολο BLUE

TM Ολικό RNA Extraction Kit (Intron Biotechnology, Sungnam, Κορέα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10]. προϊόντα cDNA αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Μ-ΜυΙ_ν αντίστροφης μεταγραφάσης (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ, USA). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR διεξήχθη με σχετική πρωτόκολλο ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας Roter-Gene λογισμικό 6000 series 1.7 (QIAGEN, Venlo, Ολλανδία) και η SensiFAST

TM SYBR NO-ROX Kit (BIOLINE, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων-στόχων κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του γονιδίου housekeeping GAPDH. Κάθε δείγμα τρέξει με τα ακόλουθα σύνολα εκκινητών: Ε6, 5′-GCA GCC CTT GAA ΤΤΑ CCC ΑΤ-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CAG AGG TTG GAC ΑΓΓ GAA GAA-3′ (αντίστροφο)? Ε7, 5’-TGA ΑΓΓ ACA ΤΟΟ CTT AGA AGT G-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGT GCA ΑΓΓ GTC ACA ΟΤΟ ΤΤ-3′ (αντίστροφο)? TRAIL, 5’-AAG ΤΤΤ GTC GTC GTC GGG GT-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-ΤΟΟ TGC ΑΓΓ GAC TTC TCT CT-3′ (αντίστροφο)? Fas, 5’-TGA ΑΓΓ ACA ΤΟΟ CTT AGA AGT- 3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGT GCA ΑΓΓ GTC ACA ΟΤΟ ΤΤ-3′ (αντίστροφο)? DR5, 5’-CAG AGG GAT GGT CAA GGT CG- 3 ‘, 5′-TGA TGA TGC CTG ΑΤΤ CTT TGT GG-3′? και GAPDH, 5’-ΤΟΟ GCT ACA CTG AGC ACC AG-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGG TGT CGT TGT TGA AGT CA-3’ (αντίστροφο).

ανάλυση Western blot

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις CTS για 24 ώρες, συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και επαναφυγοκεντρήθηκε (1890 ×

g

, 5 λεπτά, 4 ° C). Τα προκύπτοντα σφαιρίδια κυττάρου επανααιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 50 mM Tris (ρΗ 7.4), 1.5 Μ χλωριούχο νάτριο, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), και μια πρωτεάση αναστολέας κοκτέιλ. Τα κυτταρολύματα επωάστηκαν σε πάγο για 1 ώρα και διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 17.010 χ

g

για 30 λεπτά στους 4 ° C. Η περιεκτικότητα πρωτεΐνης ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και ένα φασματοφωτόμετρο UV. Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10-12% SDS (SDS-PAGE). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF? Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), τα οποία είχαν μπλοκαριστεί σε 5% σκόνη άπαχου γάλακτος διαλύονται σε Tris ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που περιέχει Tween-20 (2,7 Μ NaCl, 53.65 mM ΚΟΙ, 1 Μ Tris-HCI, ρΗ 7,4, 0,1% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ειδικά πρωτογενή αντισώματα. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα δευτερογενή αντισώματα (HRP συζευγμένο αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι κηλίδες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας West-Ζοΐ Plus και σύστημα ανίχνευσης κηλίδος western (Intron Βιοτεχνολογία, Sungnam, Νότια Κορέα).

Πυρηνικής Φυσικής και κυτταροπλασματική κλασματοποίηση

Οι CTS-επεξεργασμένα κύτταρα συλλέγονται και κλασματωμένο χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση Αντιδραστήρια (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ανάλυση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ)

ΜΜΡ (Δψ

m) αξιολογήθηκε με χρώση JC-1 και κυτταρομετρία ροής. κύτταρα SiHa σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 60-mm (2,5 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CTS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες 1,5 mL. JC-1 (5 μg /ml) προστέθηκε στα κύτταρα και αναμίχθηκε μέχρις ότου διαλύθηκε πλήρως, μετά την οποία τα κύτταρα επωάστηκαν στο σκοτάδι για 10 λεπτά στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν (300 χ

g

, 5 min, 4 ° C), πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 200 μL PBS. Τα διαλύματα διαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACSCalibur και αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Το σύνολο του πρωτοκόλλου έγινε σε ελάχιστο φως.

Αποσιώπηση του ενδογενούς έκφρασης HPV16 Ε6 και Ε7 από τα siRNA

Η siRNAs των Ε6 και Ε7 και ομελέτα siRNA αγοράστηκαν από Dharmacon (Dharmacon, Lafayette, CO ). Η αλληλουχία Ε6 siRNA και η αλληλουχία Ε7 siRNA χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο προηγουμένως αναφερθεί [11]. Για την καταστολή της μεταγραφής των ενδογενών γονιδίων HPV16 Ε6 και Ε7, τα κύτταρα SiHa ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με τα συνθετικά siRNAs για HPV16 Ε6 και Ε7 ή ένα nontargeting siRNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

η στατιστική ανάλυση

δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με t-test του Student. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt? 0.005 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των φαινολικών ενώσεων σε CTS

Εντοπίσαμε δυναμικό φαρμακευτικά συστατικά (Σχήμα 1, Πίνακας 1) και ένα μεγάλο αριθμό χλωρογενικό οξύ (Πίνακας 2) στο εκχύλισμα CTS χρησιμοποιώντας HPLC. Ο Πίνακας 2 παραθέτει τα συστατικά στο εκχύλισμα CTS, η οποία περιελάμβανε χλωρογενικό οξύ, (+) – κατεχίνη, καφεϊκό οξύ, phloretic οξύ, veratric οξύ, εσπεριδίνη, quercetin, και ναριγκενίνη. Το εκχύλισμα CTS περιείχε ποικίλες φαινολικά οξέα και ήταν πλούσια σε χλωρογενικό οξύ (64,42 mg /g). Χλωρογενικό οξύ έχει αναφερθεί ότι έχει αντικαρκινικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες [12-15]. Quercetin, εσπεριδίνη, και άλλα φαινολικά οξέα όπως καφεϊκό οξύ έχουν επίσης αναφερθεί ότι εμφανίζουν αντικαρκινικές επιδράσεις σε διάφορους τύπους καρκίνου [16-18]. Ωστόσο, αυτές οι ενώσεις ήταν παρούσες σε χαμηλές συγκεντρώσεις στο εκχύλισμα CTS.

Τα δεκαεπτά είδη της σύνθεσης φαινολικής οξύ του δείγματος αναλύθηκαν με σύγκριση του φάσματος των συστατικών του δείγματος και τα πρότυπα ταιριάζουν για να δημιουργήσουν μία πρότυπη καμπύλη από εμβαδόν κορυφής ανά συνιστώσα για να υπολογιστεί το ποσό της αλλαγής. (Α) Οι δεκαεπτά είδη των ενώσεων αναφοράς φαινολικές οξύ. (Β)

Cudrania tricuspidata

στέλεχος (CTS) απόσπασμα. Η ανάλυση HPLC έδειξε την παρουσία οκτώ ενώσεων που αντιστοιχούν σε 8 μεταξύ των 17 πρότυπες ενώσεις. Η 5, 7, 11 κορυφές εκπροσωπούνται χλωρογενικό οξύ, το καφεϊκό οξύ, και veratric οξύ, αντίστοιχα.

Η

Η

CTS επάγει κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά κερατινοκύτταρα

Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της CTS αξιολογήθηκαν σε αρκετές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS. Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρικές γραμμές και κανονικές HaCaT κερατινοκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις και τις χρονικές περιόδους (Σχήμα 2). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του τραχήλου μειώθηκε σε δόση και το χρόνο τρόπο εξαρτώμενο από εκχύλισμα CTS. Η βιωσιμότητα των CaSki HPV16-θετικών κυττάρων μειώθηκε σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με εκχύλισμα CTS, αλλά σε μικρότερο βαθμό από αυτή που παρατηρήθηκε στα SiHa HPV16-θετικά κύτταρα. Επιπλέον, CTS δεν είχε αποτέλεσμα σε κυτταροτοξική HaCaT κερατινοκύτταρα ανθρώπινη φυσιολογική συγκεντρώσεις 0,125 έως 0,5 mg /mL (Σχήμα 2Α). Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να εκτελέσει μια μελέτη σχετικά με το μηχανισμό που διέπουν την απόπτωση που επάγεται από το εκχύλισμα CTS σε SiHa του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων.

(Α) HaCaT, (Β) SiHa και CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24-48 ώρες με διάφορες Οι συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος CTS, μετά το οποίο η βιωσιμότητα των κυττάρων διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS. Αποτελέσματα * p & lt? 0.05 και ** ρ & lt? 0.005 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι CTS-επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Η

CTS επάγει μορφολογικές αλλαγές και απόπτωση σε κύτταρα SiHa

μικροσκοπία αντίθεσης φάσης έδειξε ότι CTS επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και μορφολογικές αλλαγές σε κύτταρα SiHa με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από μια θεραπεία 24 h (Σχήμα 3Α). χρώση DAPI χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσει πυρηνική συμπύκνωση, ένα δείκτη της απόπτωσης. Πυρηνική συμπύκνωση ήταν σημαντικά και με δοσοεξαρτώμενο αυξηθεί τα CTS-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ 3Β και 3C). Annexin V-FITC χρώση /ΡΙ γενικά χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της απόπτωσης και νέκρωσης. Η απόπτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αννεξίνη V-FITC και ΡΙ-χρώση μετά από θεραπεία 24 ώρες με CTS. Τα κύτταρα SiHa σε επεξεργασία με CTS σε συγκεντρώσεις 0,125 έως 0,5 mg /mL για 24 ώρες έδειξαν μια σημαντικά αυξημένη αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι CTS επαγόμενη απόπτωση. Ωστόσο, δεν υπήρξαν μεταβολές στην CTS κατεργασμένα κύτταρα HaCaT (Σχήμα 3D).

(Α) Μικροσκοπική εικόνες των κυττάρων SiHa σε επεξεργασία με CTS για 24 ώρες. Οι φωτογραφίες λήφθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης σε 100 × μεγέθυνση. (Β) Fluorescence μικροσκοπικές εικόνες των κυττάρων SiHa σε επεξεργασία με CTS για 24 ώρες. παρατηρήθηκαν πυρηνική συμπύκνωση και χρωματίνης συρρίκνωση. (Γ) Τα στοιχεία σχετικά με αποπτωτικών πυρήνων των ολόκληρων ϋΑΡΙ χρώση κύτταρα συνοψίζονται ως γραφήματα ράβδων. Αποτελέσματα *

σ

& lt? 0.05 και **

σ

& lt? 0.005 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. (Δ) Μετά την επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του CTS για 24 ώρες, SiHa και HaCaT κύτταρα βάφτηκαν με αννεξίνη V-FITC /ΡΙ.

Η

CTS αναστέλλει την έκφραση Ε6 /Ε7 και ρυθμίζει την έκφραση του Ε6 /Ε7-στόχευση παραγόντων κατά του όγκου

είναι

Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών γνωστό ότι προκαλεί αποικοδόμηση της ρ53 και pRb, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση των Ε6 και Ε7 ογκογονίδια θα αναμένεται να οδηγήσει σε αποκατάσταση της ρ53 και τα επίπεδα pRb [19-20]. επίπεδα έκφρασης HPV-16 Ε6 και Ε7 mRNA ερευνήθηκαν με ποσοτική RT-PCR. έκφραση Ε6 mRNA μειώθηκε σε CTS κατεργασμένα κύτταρα SiHa σε σύγκριση με εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων ελέγχου. Επιπλέον, η έκφραση Ε7 mRNA μειώθηκε επίσης (Σχήμα 4Α). Το επίπεδο έκφρασης του ρ-pRb ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω, αλλά η έκφραση pRb παρέμεινε αμετάβλητη σε CTS-κατεργασμένα κύτταρα SiHa (Σχήμα 4Β). CTS αυξημένη δοσοεξαρτώμενο το επίπεδο έκφρασης της ρ53, με αποτέλεσμα την διαμόρφωση του κατάντη παράγοντες ρ21 και ρ27. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Β, τα επίπεδα ρ21 και ρ27 έκφρασης αυξήθηκαν με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με επεξεργασία CTS, όπως αναμενόταν.

επίπεδα (Α) mRNA του ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7, όπως ανιχνεύεται από qRT-PCR. (Β) αναλύσεις Western blot pRb, ρ-pRb, ρ53, ρ21, και ρ27. κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση της CTS για 24 ώρες.

Η

CTS αναστέλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και ρυθμίζει τους παράγοντες συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της CTS για κυτταρικού κύκλου εξέλιξη, εξετάσαμε την κατάσταση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Στα προηγούμενα πειράματα, τα επίπεδα έκφρασης της ρ53 και κατάντη γονίδια ρ21 και ρ27 αυξήθηκαν μετά από αγωγή με CTS (Εικόνα 4Β). Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, CTS-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν σημαντική και εξαρτώμενη από τη δόση συσσώρευση στην υπο-G1 φάσης (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στους πληθυσμούς κυττάρων στην G0 /G1, S και G2 /M φάσεις μετά από αγωγή με CTS (Εικόνα 5Α).

(Α) προφίλ κυτταρικού κύκλου του CTS αγωγή SiHa κύτταρα. (Β) Η αναλογία των κυττάρων στη φάση υπο-G1. Αποτελέσματα **

σ

& lt? 0.005 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. CTS-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Τα αποτελέσματα της CTS είναι ανεξάρτητες της ενδογενούς οδού

μιτοχονδριακή δυσλειτουργία είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας στην ενδογενή οδό της απόπτωσης. Όταν τα μιτοχόνδρια δυναμικού μεμβράνης καταρρέει, κυτόχρωμα C απελευθερώνεται στο κυτοσόλιο, μετά το οποίο σχηματίζει το αποπτωσώματος με Apaf-1 και κασπάσης-9 [21]. Για τη μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης ενδεχόμενη κατάρρευση μετά από θεραπεία CTS, εκτελέσαμε JC-1 χρώσης και ανάλυση FACS. Όπως φαίνεται στο Σχ S1A, η κορυφή JC-1 δεν μετατοπίστηκε μετά τη θεραπεία CTS. Επιπλέον, οι αναλύσεις κηλίδος western έδειξε ότι η θεραπεία CTS δεν μετέβαλλε τα επίπεδα έκφρασης των προ-αποπτωτικών παράγοντας Bax ή εκείνες των αντι-αποπτωτικών παραγόντων Bcl-2 και Bcl-XL. Επιπλέον, κυτόχρωμα C δεν απελευθερώθηκε στο κυτοσόλιο (S1B Εικ). Έτσι, συμπεραίνουμε ότι η ενίσχυση της αποπτωτικής σήματος μετά την επεξεργασία CTS είναι ανεξάρτητη από τη σηματοδότηση μέσω του ενδογενούς μονοπατιού της απόπτωσης.

CTS-επαγόμενη απόπτωση διαμεσολαβείται μέσω υποδοχέων σηματοδότησης θανάτου

Επειδή αποδείξαμε ότι η ενδογενή οδό της απόπτωσης δεν ενεπλάκη στην CTS-επαγόμενη απόπτωση, εμείς δίπλα επικεντρώθηκε στην εξωγενή οδό της απόπτωσης. Η εξωγενής οδός της απόπτωσης λαμβάνει σήματα μέσω της δέσμευσης των εξωκυτταρικών πρωτεϊνών συνδέτη θάνατο σε προ-αποπτωτικών υποδοχείς θανάτου (ΑΔ) [22]. Η εξωγενής οδός μεταδίδει σήματα από εξωκυτταρικά προσδέματα μέσω προαποπτωτικών DRs με την αποπτωτική μηχανήματα κασπάσης [23]. Επιπλέον, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) εμπλέκεται στην απόπτωση, καθώς και μια σειρά άλλων κυτταρικών διαδικασιών. Ερευνήσαμε επίπεδα έκφρασης του εξωγενούς οδού που σχετίζονται με παράγοντες TRAIL, DR5, και Fas σε κύτταρα SiHa μετά από θεραπεία CTS (Εικόνα 6Α). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία CTS απορυθμίζει τα επίπεδα mRNA του TRAIL, DR5, και Fas. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης της κασπάσης-3, κασπάσης-8, PARP, και Bid, διασπάστηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με CTS (Εικόνα 6Β). Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει τις συγκεκριμένες κασπάσες εμπλέκονται στην προ-αποπτωτικό μηχανισμό του CTS. κύτταρα SiHa προκατεργάστηκαν με αναστολείς κασπάσες, συμπεριλαμβανομένης μιας γενικής αναστολέα κασπάσης και ενός αναστολέα κασπάσης-8. Όπως φαίνεται στο Σχ 6C, η προθεραπεία με αναστολέα κασπάσης γενική Z-VAD-FMK πριν την CTS θεραπεία μπλοκάρει σημαντικά CTS-επαγόμενη απόπτωση. Μια παρόμοια ανασταλτική επίδραση στην CTS-επαγόμενη απόπτωση παρήχθη με κασπάσης-8 αναστολέα Ζ-IETD-FMK. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι κασπάσης-3, κασπάσης-8, και PARP ενεργοποιούνται μέσω DR μεσολάβηση σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της CTS-επαγόμενη απόπτωση.

επίπεδα (Α) mRNA του TRAIL, DR5 και Fas όπως ανιχνεύεται με qRT-PCR . (Β) ανάλυση κηλίδας Western των εξωγενών παραγόντων οδού που σχετίζονται. κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του CTS για 24 ώρες. (C) Ανάλυση Western blot των επιπτώσεων CTS εξής προθεραπείας με αναστολέα κασπάσης γενική Z-VAD-FMK ή κασπάσης-8 αναστολέα Ζ-IETD-FMK σε κύτταρα SiHa.

Η

κάτω ρύθμιση του Ε6 και τα γονίδια Ε7 ενισχυμένη CTS απόπτωση που επάγεται

Για να διερευνηθεί κατά πόσο CTS-επαγόμενη απόπτωση θα επηρεάζονται από τα επίπεδα Ε6 /Ε7, Ε6 /Ε7 siRNA διαμολύνθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CTS. Η απόπτωση ενεργοποιητικών πρωτεϊνών όπως κασπάση-3, κασπάση-8, και PARP ήταν περισσότερο διασπάται υπό Ε6 /Ε7 siRNA επιμόλυνση και θεραπεία CTS (Σχήμα 7). επίπεδο έκφρασης ρ-pRb μειώθηκε σε Ε6 /Ε7 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα SiHa σύγκριση με τους μάρτυρες siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Ωστόσο, το επίπεδο έκφρασης p53 δεν μεταβλήθηκε (Σχήμα 7). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι θα μπορούσε να υποστηρίξει CTS επαγωγή απόπτωσης μέσω ρύθμισης προς τα κάτω των εκφράσεων Ε6 /Ε7 mRNA.

ανάλυση Western blot των παραγόντων που σχετίζονται με την απόπτωση μετά την επιμόλυνση του siRNA ελέγχου ή Ε6 /Ε7 στόχευση siRNA.

Συζήτηση

Ο κύριος στόχος της μελέτης μας ήταν να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου και των συναφών μηχανισμών του CTS σε ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. εκχύλισμα CTS ανέστειλε τραχήλου του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων σε HPV-θετικών SiHa και CaSki κύτταρα. Η κυτταροτοξική αποτελεσματικότητα του CTS σε HPV-16-θετικά κύτταρα SiHa ήταν ελαφρώς καλύτερη από την αποτελεσματικότητά του σε κύτταρα CaSki (σχήμα 2). Η επίδραση αυτή μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι ο αριθμός των αντιγράφων του γονιδιώματος HPV σε κύτταρα CaSki είναι υψηλότερο από αυτό των κυττάρων SiHa [24]. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι ο συνολικός αριθμός των HPV αντιγράφων στα κύτταρα μπορεί να επηρέασε την ευαισθησία τους στα προ-απόπτωσης της CTS [24]. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι CTS κάτω ρυθμισμένα επίπεδα έκφρασης των ογκογονιδίων Ε6 και Ε7 του HPV-16-θετικές κυτταρικές σειρές. Όπως αναμενόταν με βάση την μειωμένο επίπεδο έκφρασης του Ε6, επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση p53 ήταν αυξημένη σε δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μειωμένη έκφραση της Ε7 δεν συσχετίστηκε με αλλοιωμένη έκφραση pRb? Ωστόσο, ρ-pRb μειώθηκε κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο με CTS (Εικόνα 4Β). Το αποτέλεσμα αυτό υπενθύμισε παλαιότερες εκθέσεις που αποδεικνύουν ότι η αναστολή της Ε7 οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση της pRb, χωρίς να αλλάζει τη συνολική έκφραση της πρωτεΐνης pRb [20].

CTS εκχύλισμα περιέχει αρκετές φαινολικές ενώσεις (Σχήμα 1). Χλωρογενικό οξύ είναι παρόν στην υψηλότερη συγκέντρωση μεταξύ τους. Χλωρογενικό οξύ έχει αναφερθεί ότι έχει αντικαρκινικές, αντιοξειδωτικό, και αντιδιαβητική δράση [14, 25-26]. Επιπλέον, χλωρογενικό οξύ είναι το δεύτερο σημαντικό συστατικό βιοδραστικό στον καφέ μετά καφεΐνη [25]. Χλωρογενικό οξύ διεγείρει την μεταφορά της γλυκόζης στο L6 σκελετικό μυ μέσω ενεργοποίησης ΑΜΡΚ, η οποία συμβάλλει στις ευεργετικές συνέπειες για το διαβήτη [25]. Επιπλέον, χλωρογενικό οξύ είναι ένα αντιοξειδωτικό που μπορεί να επιβραδύνει την απελευθέρωση της γλυκόζης στην κυκλοφορία του αίματος μετά από ένα γεύμα [26]. Επιπλέον, χλωρογενικό οξύ μπορεί να προκαλέσει κυτταρική βλάβη του DNA και απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα χωρίς να επηρεάζει φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα [14]. Ωστόσο, οι αντικαρκινικές επιδράσεις του χλωρογενικό οξύ του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα δεν έχουν πλήρως διερευνηθεί. Οι καφεϊκό οξέα που βρίσκονται σε πολλά φυσικά φυτά [27] και έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου και την ενίσχυση της αντιοξειδωτική δράση [28]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το καφεϊκό οξύ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, την προσκόλληση και τη μετανάστευση από Α549 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και ΗΤ29-D4 καρκινικά κύτταρα κόλου [29]. Επιπλέον, εσπεριδίνη, ναριγκενίνη και κερκετίνη έχουν αναφερθεί ότι εμφανίζουν αντικαρκινικές επιδράσεις σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [16-17, 30-31].

Η απόπτωση που προκαλείται από τους ενδογενείς και εξωγενείς οδούς. Η ενδογενής οδός διαμεσολαβείται από μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ) και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα [32-33]. Στο κυτοσόλιο, κυτόχρωμα c επάγει τη συναρμολόγηση του αποπτωσώματος, το οποίο περιέχει την πρωτεΐνη προσαρμογέα Apaf-1 και απόπτωση έναρξη πρωτεάσης κασπάσης-9. Αποπτωσώματος σχηματισμός ενεργοποιεί κασπάση-9, το οποίο ενεργοποιεί κασπάσες ενέργειας [34]. Η εξωγενής οδός λαμβάνει σήματα μέσω της δέσμευσης της εξωκυτταρικής πρωτεΐνης προσδεμάτων προαποπτωτικά DRs που βρίσκεται στην κυτταρική επιφάνεια [23]. Αν και έχουν περιγραφεί διάφορες DRs, εστιάσαμε στην Fas (CD95) και DR5 και τους αντίστοιχους συνδέτες όπως συνδέτης Fas (Fas L) και TRAIL [35]. DRs έχουν μια ενδοκυτταρική περιοχή θανάτου που προσλαμβάνει πρωτεΐνες προσαρμογής και της κασπάσης-8 [36]. Η δέσμευση του συνδέτη θάνατο του DR οδηγεί σε σχηματισμό του θανάτου που επάγει σηματοδότηση σύμπλοκο (DISC), αποτελούμενο από τον υποδοχέα του θανάτου, και FADD κασπάσης-8 [37]. Ο δίσκος ενεργοποιεί ένα σηματοδοτικό μονοπάτι οδηγεί σε απόπτωση [38-40]. Ερευνήσαμε τα οποία οδών που εμπλέκονται στην απόπτωση που προκαλείται από CTS σε SiHa του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων. Αν και εγγενείς παράγοντες μονοπάτι που σχετίζονται δεν επηρεάστηκαν από αγωγή CTS (S1 Σχήμα), τα επίπεδα έκφρασης του εξωγενούς οδού που σχετίζονται με παράγοντες όπως Fas, DR5, TRAIL, και κασπάσης-8, επηρεάστηκαν από CTS κατεργασία (Σχήμα 6).

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η CTS έχει μια βαθιά επίδραση κατά του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έναντι καρκινικών κυττάρων. Αυτή είναι η πρώτη επίδειξη της ικανότητας του CTS να αναστείλουν την έκφραση του HPV-16 Ε6 και Ε7 ογκογονίδια, και να επάγει απόπτωση που διαμεσολαβείται από την εξωγενή οδό του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να προσδιορίσει τις συγκεκριμένες ενώσεις σε CTS υπεύθυνα για την αντικαρκινική τα αποτελέσματά της.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Επιδράσεις της CTS στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και την απελευθέρωση κυτοχρώματος C σε SiHa καρκίνο του τραχήλου κύτταρα.

(Α) Η διαφορά στην JC-1 χρώματα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. JC-1 συσσωματώματα (πορτοκαλί) είναι ένα χαρακτηριστικό των υγιών κυττάρων, ενώ JC-1 μονομερή (πράσινο) είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των αποπτωτικών κυττάρων. (Β) ανάλυση κηλίδας Western αντι-αποπτωτικών παραγόντων Bcl-2 και Bcl-xL, προ-αποπτωτικών παράγοντας Βαχ και κυτόχρωμα C σε SiHa καρκίνο του τραχήλου κύτταρα. κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση της CTS για 24 ώρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0150235.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Αυτή η έρευνα ήταν υποστηρίζονται από το βασικό πρόγραμμα (2015R1A2A2A09001137) του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF). (https://www.nrf.re.kr/nrf_eng_cms). D.Y. Yoon υποστηρίχθηκε εν μέρει από την Προτεραιότητα Ερευνητικά Κέντρα Πρόγραμμα (2.012 – 0.006.686).