Αφηρημένο

Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι διάφοροι τύποι καρκινικών κυττάρων είναι ικανά να παράγουν IgG. Η ακριβής λειτουργία του καρκίνου που προέρχεται από IgG, ωστόσο, δεν έχουν διευκρινιστεί. Εδώ δείξαμε την έκφραση γονιδίων IgG με V (D) J ανασυνδυασμό σε 80 περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου, κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου 4 και ενός όγκου που φέρουν το ανοσοποιητικό ανεπαρκές μοντέλο ποντικού. έκφραση IgG συσχετίστηκε με τη διαφοροποίηση του όγκου, το στάδιο pTNM, εμπλοκή των λεμφαδένων και φλεγμονώδης διήθηση και συσχετίζεται θετικά με τις εκφράσεις Κυκλίνης D1, NF-κΒ και PCNA. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση του καρκίνου που προέρχεται από IgG στις κακοήθεις συμπεριφορές του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων και έδειξε ότι μπλοκάρισμα της IgG οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση και αρνητικά επηρέασε την δυνατότητα σχηματισμού αποικίας άγκυρα-ανεξάρτητη και καρκινικών κυττάρων εισβολής. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η IgG που συντίθεται από καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την αύξηση του καρκίνου του παχέος εντέρου και απόφραξη του IgG μπορεί να είναι μια πιθανή θεραπεία στην αντιμετώπιση αυτής του καρκίνου

Παράθεση:. Niu Ν, Zhang J, Huang Τ , Sun Υ, Chen Ζ, Yi W, et al. (2012) Έκφραση IgG στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου και τη σχέση του με συμπεριφορές Cancer Cell. PLoS ONE 7 (11): e47362. doi: 10.1371 /journal.pone.0047362

Επιμέλεια: Τζωρτζίνα Λ Κρατήστε, Πανεπιστήμιο του Αμπερντίν, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: ένατης Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 11 Σεπτέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 1 Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Niu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Young και μεσήλικες επιστήμονες Έρευνα Βραβεία Fundation της επαρχίας Shandong (Αρ BS2011SW051), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας στην ΝΝ (Νο 81100885). Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν επίσης Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας να JG (Νο 30971150). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

Πρόσφατα αρκετές αναφορές έχουν δημοσιευτεί που περιγράφουν την έκφραση των ανοσοσφαιρινών σε μη λεμφοειδή κύτταρα συμπεριλαμβανομένων αρκετών σαρκωμάτων και καρκινωμάτων [1] – [4]. Πριν από αυτές τις εκθέσεις, οι ανοσοσφαιρίνες ήταν ανέκαθεν γνωστό ότι παράγεται αποκλειστικά από τα Β λεμφοκύτταρα. IgG έχει ανιχνευθεί σε ιστό καρκίνου του κόλου του μερικές περιπτώσεις και το θραύσμα της σταθερής περιοχής IgG έχει παρατηρηθεί σε μερικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Με ένα αντίσωμα κατά CA215, το οποίο ήταν ένα μέρος των ανοσοσφαιρινών που εκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, Lee et al ανιχνεύεται IgG βαριάς αλυσίδας σταθερές περιοχές σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου με μια θετική αναλογία 44% [1], [5]. Το 2003, Qiu et al έδειξε έκφραση της IgG σε ιστούς από 6 περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου (CRC) και σε μία κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου (ΗΤ29) [3]. Με RT-PCR, Kimoto κ.ά. ανιχνεύεται σταθερή περιοχή βαριάς αλυσίδας IgG από καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή SW116 [2].

In vitro

μελέτη με ΗΤ 29 παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή καρκινώματος που επάγεται με ASODN πρότεινε ότι ο καρκίνος που προέρχονται από IgG κατέστειλε απόπτωση [6], η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα των Lee et al [1] και Qiu et al [3] ο οποίος έδειξε αναστολή ανάπτυξης όγκου με μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος σε ζώα και in vitro πειράματα. Αυτές οι παρατηρήσεις οδηγούν στην υπόθεση ότι ο καρκίνος που προέρχονται από IgG προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και αυτό είναι το επίκεντρο της παρούσας μελέτης

Μέχρι στιγμής, η σχέση μεταξύ IgG έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά και βιολογικών δεικτών [7]. – [9] που σχετίζεται με την πρόγνωση και την ανταπόκριση στη θεραπεία σε CRC δεν έχει διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε πρώτα την έκφραση της IgG σε ιστό 150 περιπτώσεις CRC και ανέλυσε την συσχέτιση της έκφρασης IgG και διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές και βιολογικά χαρακτηριστικά. Στη συνέχεια, IgG παραγωγή επιβεβαιώθηκε σε τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA. Αρκετές περιοχές της IgG βαριών και ελαφριών αλυσίδων και των βασικών ενζύμων για τη σύνθεση IgG ανιχνεύθηκαν στα δείγματα. Τα αποτελέσματα της IgG σε κακοήθη βιολογικές συμπεριφορές, όπως ο πολλαπλασιασμός, ο σχηματισμός κλώνος, εισβολή και την απόπτωση ερευνήθηκαν με πειράματα εξουδετέρωσης αντισώματος και την αναστολή siRNA. Τα αποτελέσματα παρέχουν γνώσεις σε νέες κλινικο-παθολογικές ρόλους του καρκίνου που προέρχονται από IgG στο CRC και να ενισχύσει το σκεπτικό για την ανάπτυξη θεραπειών που στοχεύουν καρκίνου που προέρχονται από IgG.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς από 150 περιπτώσεις που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία /αναλύθηκαν για CRC και τα συμφωνημένα δείγματα φυσιολογικού παχέος βλεννογόνου (χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι) και είκοσι φρέσκο ​​δείγματα βιοψίας από ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα συλλέχθηκαν από το Νοσοκομείο Ενταγμένο της Weifang Ιατρικό Πανεπιστήμιο. στάδιο pTNM έγινε σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης TNM της AJCC /UICC [10]. Διαφοροποιήσεις των καρκίνων βαθμολογήθηκαν καθώς και /μέτρια ή κακή. Φλεγμονώδης διήθηση αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια για τη χρόνια φλεγμονή (διήθησης μονοπύρηνων κυττάρων) που περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Weifang Ιατρικό Πανεπιστήμιο και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς

Οι κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου CRC διαφορετικού διαφοροποίησης (μετρίως διαφοροποιημένων, ΗΤ29 και SW480.? πτωχά διαφοροποιημένα, LOVO και HCT116) [12] και Raji (Β λεμφοκυτταρική λευχαιμία κυτταρική γραμμή ως θετικός έλεγχος), Jurkat (Τ λεμφοκυτταρική λευχαιμία κυτταρική γραμμή ως αρνητικός έλεγχος) αγοράστηκαν από την ATCC (12 Ιουνίου, 2008). κυτταρικές γραμμές CRC καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με ultralow-IgG βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco, Carlsbad, CA, USA) και σε ϋΜΕΜ μόνο 12-24 ώρες πριν από το πείραμα.

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημεία ( IHC) πραγματοποιήθηκε σε CRC και συμφωνημένα περιθωριακό ιστούς με κατάλληλους ελέγχους, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], [14]. Λεπτομέρειες των πρωτογενών αντισωμάτων σε ανοσοσφαιρίνης γ αλυσίδας (Igγ), ανοσοσφαιρίνης κ αλυσίδας (Ιακ), CEA (καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο), CD16 (ΡογΚ III), CD32 (ΡογΚ II), CD64 (ΡογΚ Ι), Ρ53, PCNA, Bcl-2 , ΜΜΡ-2, NF-κΒ, και Κυκλίνη D1 παρατίθενται στον πίνακα S1. Φυσιολογικό ορό κατσίκας υποκατασταθεί πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικοί έλεγχοι. Διπλή σήμανση των IgG και NF-κΒ ή Κυκλίνη D1 ή PCNA σε καρκινικά κύτταρα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

Scoring ανοσοαντιδραστικότητα

Οι χρωματισμένες τομές εξετάσθηκαν και βαθμολογήθηκαν ανεξαρτήτως από 2 οι συγγραφείς (ΝΝ και WY) χωρίς ενημέρωση των κλινικοπαθολογοανατομικών δεδομένων. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε πέντε τυχαία επιλεγμένες περιοχές με καρκίνο σε μία 400 χ μεγέθυνση. Τα επίπεδα της IgG έκφραση σε καρκινικά κύτταρα με βάση το άθροισμα της βαθμολογίας του ποσοστού των θετικών κυττάρων (βαθμολογήθηκε ως: 0 = & lt? 5%, 1 = 5-25%, 2 = 25-50%, 3 = & gt? 50%) και ότι του ένταση χρώσης (βαθμολογήθηκε ως: 0, απουσία σήματος? 1, ανοικτό κόκκινο ή ροζ? 2, κόκκινο? 3, σκούρο κόκκινο). Οι περιπτώσεις με τα αποτελέσματα της 0-3 ήταν χαρακτηρισμένα ως «ασθενώς χρωματισμένο» και τις περιπτώσεις με 4-6 ως «έντονα χρωματισμένο». Πυρηνικά βρίσκεται πρωτεΐνες μόνο σκόραρε σύμφωνα με θετικό ποσοστό τους σε καρκινικά κύτταρα [16]:. & Lt? 25% ήταν ομαδοποιούνται ως «αρνητικές», ≥25% ήταν ομαδοποιούνται ως «θετική»

προετοιμασία

καθετήρα cRNA και in situ υβριδισμού

Το κατάλληλο μήκος του ανιχνευτή για ISH ήταν 300-500 bp, και οι σταθερές περιοχές των κ και λ αλυσίδα ήταν πολύ μικρή για να είναι αποτελεσματική ανιχνευτές. Ως εκ τούτου, δύο συγκεκριμένα αντινόημα διερευνητές cRNA που κατευθύνονται έναντι ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης G1 βαριά αλυσίδα (IGHG1) παρασκευάστηκαν και in situ υβριδισμού (ISH) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [17]. Αμυγδαλής ιστό και τους ιστούς του λεμφικού οζίδια στον ορθοκολικό τοίχωμα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος, και διαφάνειες αμυγδαλής ιστός επωάζεται με ανιχνευτές αίσθηση ή CRC ιστού επωάζεται με ένα άσχετο ανιχνευτή χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Σύντομη διαδοχική επανάληψη ανάλυση

ανάλυση

Σύντομη διαδοχική επανάληψη (STR) από τις κυτταρικές σειρές CRC έγινε από την ξηρά · HUAGENE BIOSCIENCES CO., LTD (Guangzhou, Κίνα) χρησιμοποιώντας PowerPlex 16 Σύστημα HS (Promega).

κυτταρομετρία ροής

Για την ανίχνευση των IgG, κυτταρομετρία ροής με ΗΤ29, SW480, HCT116, κυτταρικές γραμμές LOVO διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3]. Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου Igγ (1:500, Sigma) και ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντι-ποντικού κατσίκας IgG (1:100, Jackson, West Grove, ΡΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα. κυτταρική γραμμή Raji χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. FITC-CD19 (Sigma) χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει για πιθανή μόλυνση από Β λεμφοκύτταρα.

ανοσοφθορισμού διπλή χρώση

ανοσοφθορισμού (IF) διπλή χρώση με Igγ και Ιακ πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές σειρές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [13]. Κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-TRITC (1:100, Jackson) ή κατσίκας αντι-ποντικού IgG-FITC (1:100, Jackson) χρησιμοποιήθηκε σαν το δευτερογενές αντίσωμα. Κανονική IgG ποντικού και την κανονική IgG κουνελιού (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκαν αντί των πρωτογενών αντισωμάτων. DAPI (μπλε σήμα) (1:500? Sigma) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των πυρήνων

RT-PCR

Το ολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad,. CA, USA). RQ1 RNase-free DNase (Promega, Madison, WI, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία RNA δείγματα για τον αποκλεισμό της μόλυνσης από γενωμικό DNA. Πέντε μg ολικού RNA που εκχυλίζεται μεταγράφηκε ανάστροφα με ολίγο (dT)

18 εκκινητή (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) χρησιμοποιώντας SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

PCR ήταν πραγματοποιείται με LA Taq πολυμεράσης (Takara, Dalian, Κίνα). Ειδικοί εκκινητές για IGHG1, η τρίτη περιοχή που προσδιορίζει συμπληρωματικότητα (CDR3) του γονιδίου βαριάς αλυσίδας (που περιλαμβάνει την αλληλουχία VDJ), σταθερά (Ιακ) και μεταβλητές (νκ) περιοχή του Ιακ, σταθερής περιοχής Igλ (Igλ), ΙΓ-Ογ στείρο μεταγραφές βλαστικής γραμμής (ΙΓ-Ογ), που προκαλείται από ενεργοποίηση απαμινάσης κυτιδίνης (AID), ανασυνδυασμό γονίδιο ενεργοποιώντας -1 και 2 (RAG1 και RAG2) ήταν τα ίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3], [4]. CD19 ενισχύθηκε για τον αποκλεισμό της μόλυνσης από τα λεμφοκύτταρα και β-ακτίνη ενισχύθηκε ως εσωτερική αναφορά [3]. Λεπτομέρειες σχετικά με τις εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S2. Ταυτοποίηση του προϊόντος PCR επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA και ανατινάξεις.

σύλληψης Laser μικροδιατομής (LCM) επικουρείται RT-PCR

LCM βοήθεια RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε 20 περιπτώσεις από φρέσκα κατεψυγμένα χειρουργική CRC δείγματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. IGHG1, Ιακ, CDR3 τμήμα ανασυνδυασμό, CD19 και β-ακτίνη ενισχύθηκαν με τους ίδιους εκκινητές όπως για RT-PCRs. Τα λεμφοκύτταρα του λεμφικού οζιδίων στο κολονικό τοίχωμα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος, και νερό αντί για το πρότυπο cDNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Δείγματα με ανιχνεύσιμα CD19, αποκλείστηκαν από τα επόμενα πειράματα.

κηλίδας Western και siRNA κάτω ρύθμιση

Οι κυτταρόπλασμα πρωτεΐνες των τεσσάρων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC (40 μg /λωρίδα) αναλύθηκαν με 10% SDS -PAGE (Igγ υπό μη αναγωγικές συνθήκες και Ιακ κάτω από αναγωγικές συνθήκες). Πρότυπη ανθρώπινη IgG ορού (0,02 μg /λωρίδα, Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Κατσίκας αντι-ανθρώπινης Igγ (1:2500? Sigma) ή το αντι-ανθρώπινο Ιακ ποντικού (1:2000, ABCom) χρησιμοποιήθηκαν ως τα πρωτεύοντα αντισώματα

siRNA (5′-CCAAGGACACCCUCAUDAUTT-3 ‘, 5. «-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3 ‘) σχεδιάστηκε σύμφωνα με τη σταθερή περιοχή που λαμβάνεται από καρκίνο IgG και επιμολύνθηκε σε LOVO κυττάρου με το αντιδραστήριο Χ-tremeGene siRNA Επιμόλυνσης (Roche, Mannheim, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μια τυχαία αλληλουχία χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Αποτελεσματικότητα των IgG κάτω-ρύθμισης επαληθεύτηκε με κηλίδα Western.

Μελέτες σε ζώα

Τα καλλιεργημένα κύτταρα LOVO (5 × 10

6) είχαν SC εμβολιάζονται στα αριστερά μπροστά μασχάλες των σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ποντικούς. Πενήντα μΐ αίματος ελήφθη από τον οφθαλμό φλέβα χρησιμοποιώντας τριχοειδείς σωλήνες στην 0κή, 7η, 14η και 21η ημέρα μετά τον εμβολιασμό. 1 μl ορός αναλύθηκε με 10% SDS-PAGE υπό μη αναγωγικές συνθήκες με τα ίδια αντισώματα όπως περιγράφεται ανωτέρω. Την ημέρα 21, οι όγκοι συλλέχθηκαν και Η &?. Ε χρώση, IHC και ISH διεξήχθησαν σε τομές ιστών

πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση ανάλυση

Μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS (CellTiter 96 AQ One Λύση Κυττάρου Πολλαπλασιασμού Assay Kit, Promega) διεξήχθη σε πλάκα 96 φρεατίων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Mouse αντί-ανθρώπινο αντίσωμα Igγ (10-1000 ηΜ, Sigma) προστέθηκε σε μέσο καλλιέργειας άνευ ορού και επωάστηκαν για 48 ώρες και αναλύθηκε OD490 [18]. Mouse αντι-ανθρώπινο IgM αντίσωμα (μ αλυσίδα ειδικών, 10-1000 ηΜ, Sigma) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Εξουδετέρωση του IgG αντισώματος με αντι-ποντικού IgG κουνελιού διεξήχθη με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0-1000 ηΜ) IgG αντι-ποντικού κουνελιού προστέθηκε στο υπερκείμενο αμέσως μετά την προσθήκη 100 ηΜ ποντικού αντι-ανθρώπου Igγ.

για αποπτωτικών ανάλυση, τα κύτταρα CRC επωάστηκαν για 48 ώρες σε μέσο καλλιέργειας ελεύθερο ορού με 100 ηΜ IgG και αναλύθηκαν με το κιτ Annexin V-ΡΙ (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Human Disease Genomics Research Center, Beijing, Κίνα) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3]. IgM αντίσωμα (100 ηΜ, Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. κύτταρα LOVO επιμολυσμένα με siRNA ερευνήθηκε επίσης για πολλαπλασιαστικές και αποπτωτικά ιδιότητα, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Soft δοκιμασία άγαρ επί του σχηματισμού κλώνου

Soft δοκιμασία άγαρ διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Ποντικού αντι-ανθρώπινης Igγ (100 ηΜ, Sigma) χρησιμοποιήθηκε και αντι-ανθρώπινο IgM αντίσωμα (100 ηΜ, Sigma) ή PBS στη θέση του Igγ αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

δοκιμασία κυττάρων εισβολή

τροποποιημένη δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων εκτελέστηκε με κύτταρα LOVO και το αντίσωμα 100 ηΜ ποντικού αντι-ανθρώπινη IgG (Sigma) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Η μεμβράνη βάφτηκε με Η &? Ε. Πέντε τυχαία πεδία ανά μεμβράνη φωτογραφήθηκαν με το μικροσκόπιο BX51 (Όλυμπος) σε × 400 μεγεθύνσεις. Τα εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν και το μέσο αριθμό υπολογίστηκαν για κάθε μεμβράνη. Εξετάστηκε επίσης κύτταρα LOVO επιμολυσμένα με siRNA.

Η στατιστική ανάλυση

Διαφορά IgG έκφραση μεταξύ κανονικών δειγμάτων βλεννογόνου και πρωτογενείς όγκους, διαφορά στην IgG έκφραση μεταξύ των διαφόρων κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, και η συσχέτιση μεταξύ IgG έκφραση και τα διάφορα σχετικά με τον καρκίνο βιολογικών μεταβλητών ελέγχθηκαν με τη χρήση της χ

2 δοκιμή. Δύο όψεων τιμές ρ μικρότερες του 5% θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι περισσότεροι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS 12.0.

Αποτελέσματα

Έκφραση και κατανομή των πρωτεϊνών IgG και του mRNA της στην ανθρώπινη CRC ιστό

Σε όλες τις περιπτώσεις που διερευνήθηκαν, τόσο Igγ και Ιακ ανιχνεύθηκαν κυρίως στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων και Β λεμφοκύτταρα στο στρώμα (Σχήμα 1Α-Ε), καθώς επίσης και στην μεσεγχυματικά συνδετικού ιστού (αλλά όχι ο λείου μυός) ιστών καρκίνου (Σχήμα 1Α, E). Συν-έκφραση του CEA με IgG και του mRNA του ανιχνεύθηκε σε διαδοχικές τομές ιστών (Σχήμα 1Α). Στα συμφωνημένα δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου, IgG δεν ήταν ανιχνεύσιμη στο αδενικό επιθήλιο (Εικόνα 1Β). Igγ ήταν ασθενώς εκφράζεται σε 83 (55,3%) και εκφράζεται έντονα σε 67 (44.7%) από τα 150 αδενοκαρκινωμάτων. υποδοχείς IgG ανιχνεύθηκαν μόνο στα φλεγμονώδη στρωματικά κύτταρα, αλλά όχι στα καρκινικά κύτταρα

Α:. Συν-έκφραση του CEA, πρωτεΐνη IgG και IGHG1 mRNA σε κύτταρα CRC. B-D: Έκφραση του IgG (κόκκινο σήματα) σε φυσιολογικό ιστό κόλου (Β), και διαφοροποιημένα (C) και ελάχιστα διαφοροποιημένα (D) CRC. Ε: Έκφραση του IgG σε κύτταρα του καρκίνου του φωλιές (βέλη) που διεισδύουν σε βαθύ στρώμα των μυών του τοιχώματος του παχέος εντέρου. Το επίπεδο έκφρασης του IgG είναι υψηλότερη σε διηθητικά καρκινικά κύτταρα (Ε) από ό, τι στα καρκινικά κύτταρα του «πρωτογενούς» όγκου φαίνεται στο Δ F: CRC φωλιές (CRC) και λεμφαδένα (LN) πριν και μετά LCM. G: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των ΡΤ-ΡΟΡ ενίσχυση των μικροδιατομή κυττάρων CRC και λεμφαδένες. Η: συν-εντοπισμό της πρωτεΐνης IgG που εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα (κόκκινο σήμα) και Κυκλίνη D1 (αριστερό πάνελ), ΝΡ-κΒ (μεσαίο πλαίσιο) και PCNA με πυρηνικό εντοπισμό (δεξί πάνελ) (μοβ-μπλε σήματα). ML: Μύες στρώμα. Γραμμές = 50 μm (Α-Ε, G), 20 μm (F).

Η

Για αδενοκαρκινώματος, η έκφραση του IgG διέφερε μεταξύ των τάξεων διαφοροποίηση. Σε γενικές γραμμές, μόνο μερικά απομονωμένα καρκινικά κύτταρα (& lt? 25%) βρέθηκαν θετικά σε καλά διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα (Σχήμα 1 C), ενώ περισσότερο ενιαία καρκινικά κύτταρα ή σε σύμπλεγμα αυτά ήταν θετικά σε μετρίως διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα, και τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα (& gt? 50% ) ήταν θετικά σε φτωχά διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα (Σχήμα 1D). Στις φωλιές καρκίνο διεισδύοντας στο βαθύτερο μυϊκό στρώμα, η θετική αναλογία ήταν υψηλότερη και η ένταση χρώσης ισχυρότερη από ό, τι στα μη διηθητικά καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στο βλεννογόνο (Σχήμα 1 Ε και D).

mRNA IgG (IGHG1 ) ήταν ανιχνεύσιμη στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων με in situ υβριδισμού (Σχήμα 1Α, δεξιά πάνελ? Σχήμα S1 Α). Η εξειδίκευση των ανιχνευτών και η αυστηρότητα για ISH ήταν καθιερωμένη με 2 ζευγών ιχνηθετών (αντινόημα και με νόημα) για διαφορετικές περιοχές της σταθερής περιοχής IgG και μία τυχαία άσχετες ανιχνευτή. Όλα τα 2 αντιπληροφοριακό ανιχνευτές έδωσε εντελώς identitical στη διανομή και την ένταση των θετικών σημάτων. Στο θετικό μάρτυρα, το λεμφικό οζίδια του παχέος τοιχώματος (Σχήμα S1 Β), IGHG1 βρισκόταν στο κυτταρόπλασμα των Β λεμφοκυττάρων. Στα αρνητικά δείγματα αναφοράς (τυχαία ανιχνευτής εφαρμόζεται σε ιστούς CRC και αίσθηση ανιχνευτές εφαρμόζονται σε αμυγδαλής ιστό), κανένα θετικό σήμα ανιχνεύθηκε (Σχήμα S1 Γ και Δ). Όλες οι περιπτώσεις ήταν θετικοί για IgG ανοσοχρώση ήταν επίσης θετικά για IGHG1 mRNA in situ υβριδισμού. Η παρουσία του mRNA IgG επιβεβαιώθηκε με LCM υποβοηθούμενης RT-PCR (Σχήμα 1 F και G). IGHG1 και Ιακ ήταν και οι δύο ενισχύθηκαν επιτυχώς μετά από απομόνωση των καρκινικών κυττάρων από τα κατεψυγμένα δείγματα CRC. Όλα τα είκοσι δείγματα που ελέγχθηκαν θετικά. Επιπλέον, CDR3, συμπεριλαμβανομένης της ακολουθίας V-D-J, ενισχύθηκε επίσης με επιτυχία από αυτά τα δείγματα. Δεν μεταγραφές CD19 ήταν ανιχνεύσιμα, έτσι, εκτός από μόλυνση Β λεμφοκυττάρων. CD19, IGHG1, Ιακ και CDR3 ήταν όλοι ενισχύθηκαν από τα δείγματα θετικός έλεγχος. Δεν μπάντα ήταν ανιχνεύσιμη όταν χρησιμοποιήθηκε ο αρνητικός μάρτυρας.

Συσχέτιση της έκφρασης IgG με κλινικοπαθολογοανατομικών και βιολογικά χαρακτηριστικά του CRC

Ο Πίνακας 1 δείχνει τη συσχέτιση της έκφρασης IgG σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα με διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές. Υπήρχε μια μεγαλύτερη συχνότητα ισχυρών IgG έκφρασης σε φτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (67,3%) από ό, τι στην καλύτερη διαφοροποιημένες αυτές (καθώς και μετρίως διαφοροποιημένων, 33,7%, P = 0,035). έκφραση IgG δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ των επιμέρους σταδίων pTNM (P = 0,091). Ωστόσο, όταν συγκρίναμε την έκφραση IgG στο στάδιο Ι-ΙΙ νεόπλασμα σε εκείνα του σταδίου III-IV, ο τελευταίος είχε υψηλότερη συχνότητα ισχυρή χρώση από ό, τι την προηγούμενη (59,7 έναντι 32,5%, Ρ = 0,027). Όταν οι καρκίνοι με ασθενή φλεγμονώδης διήθηση σε σύγκριση με εκείνους με ισχυρά φλεγμονώδη διήθηση, υπήρχε μια τάση για την πρώην να έχει υψηλότερη συχνότητα ισχυρή χρώση από το δεύτερο (49,5 έναντι 33,3%, Ρ = 0,041). Στην διάρκεια των λεμφαδένων στάσης, CRC του σταδίου Ν

1 και Ν

2 κατέλαβαν ένα σημαντικά υψηλότερο IgG-θετική αναλογία (54,8, 63,9 vs 32,5%, P = 0,042). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση της έκφρασης IgG με την ηλικία, το φύλο, την τοποθεσία του καρκίνου ή πρότυπο ανάπτυξης (όλα τα P & gt? 0,05)

Η

Ο Πίνακας 2 παρουσιάζει τη σχέση μεταξύ IgG έκφρασης και τις εκφράσεις των διαφόρων βιολογικών δεικτών.. έκφραση IgG έδειξαν θετική συσχέτιση με τις εκφράσεις του Κυκλίνη D1 (Ρ = 0,046), ΝΡ-κΒ (Ρ = 0,019), και PCNA (Ρ = 0.037), και αρνητική συσχέτιση με την έκφραση του Bcl-2 (Ρ = 0,041), και όχι σημαντική συσχέτιση με τις εκφράσεις του ΜΜΡ-2 και ρ53 (τόσο Ρ & gt? 0,05). Συν-εντοπισμό Κυκλίνης D1, NF-κΒ ή PCNA (πυρηνική χρώση) και IgG (κυτταροπλασματική χρώση) αποδεικνύεται σαφώς με διπλό ανοσοχρώση (Σχήμα 1).

Η

Η έκφραση της πρωτεΐνης IgG και του mRNA του σε κυτταρικές γραμμές CRC

οι ταυτότητες των κυτταρικών γραμμών που χρησιμοποιούνται CRC επαληθεύθηκαν με δοκιμή STR και τα προφίλ έδειξαν 100% επιβεβαίωση με εκείνες που παρέχονται από ATCC (Σχήμα S2 Α και Β). Συγκέντρωση της IgG σε Ultralow-IgG FBS για κυτταρική καλλιέργεια επιβεβαιώθηκε να είναι 2,3 ± 0,9 μg /ml, επαρκώς χαμηλή για το πείραμα. έκφραση πρωτεΐνης IgG απεδείχθη σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC με IF. Συν-έκφραση του Igγ και Ιακ Επιβεβαιώθηκε επίσης (Σχήμα 2Α). Igγ και Ιακ εντοπίστηκαν κυρίως στο κυτταρόπλασμα, και εν μέρει στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων. Δεν IgG ανιχνεύθηκε σήμα σε κύτταρα Jurkat

Α: Igγ και Ιακ ανιχνεύονται σε όλες τις τέσσερις γραμμές CRC με διπλή χρώση ανοσοφθορισμού. (Igγ, TRITC? Ιακ, FITC? Συγχώνευση, κίτρινο.). Γραμμές = 50 μm. Β: Ποσοστό IgG θετικά κύτταρα σε Raji, ΗΤ29, SW480, και LOVO. C: ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης των προϊόντων ενίσχυσης RT-PCR. R, ϋΝάση αντιμετωπίζονται RNA ως εκμαγείο? C, cDNA ως εκμαγείο. D: IgG ανίχνευση με στύπωμα Western σε τέσσερις κυτταρικές σειρές. Ε: IgG πρωτεΐνης και mRNA ανιχνεύονται με IHC και ISH σε όγκους που συγκομίζονται σε 21 ημέρες από κύτταρα LOVO σε SCID ποντίκια. IgG είναι ανιχνεύσιμο στον ορό την ημέρα 7, 14, και 21.

Η

Η μόλυνση των Β λεμφοκυττάρων αποκλείστηκε χρησιμοποιώντας FITC επισημασμένο ανοσοχρώση του CD19 (Σχήμα S2 C). Το ποσοστό των IgG θετικών κυττάρων προσδιορίστηκε με FACS με Igγ αντίσωμα. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων IgG ήταν 75,2%, 20,04%, 24,4%, 39,54% και 30,91% σε Raji, ΗΤ29, SW480, LOVO και κυτταρικές σειρές HCT116 αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Το μέσο ποσοστό IgG-θετικού κυττάρου από μετρίως διαφοροποιημένων ΗΤ29 και κυτταρικές σειρές SW480 (22,22%) ήταν χαμηλότερη από εκείνη των πτωχά διαφοροποιημένο κύτταρο γραμμές LOVO και HCT116 (35.23%, Ρ = 0,043).

RT-PCR , ευαισθησία και ειδικότητα ήταν καλά εγκατεστημένες σε πολλά πειράματα. Πρώτον, RNase-free DNase χρησιμοποιήθηκε για να εξαλειφθεί η πιθανή επίδραση του γενωμικού DNA. CD19 ενισχύθηκε για να αποκλείσει την πιθανή μόλυνση των Β λεμφοκυττάρων. Δεύτερον, διερευνήθηκαν διάφορες περιοχές της IgG βαριών και ελαφριών αλυσίδων και των βασικών ενζύμων για τη σύνθεση IgG. Τρίτον, η εκτεταμένη θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν για την ίδια ενίσχυση. Forth, όλα τα ενισχυμένα προϊόντα αλληλουχήθηκαν και η identitied των ενισχυμένων προϊόντων επιβεβαιώθηκε. Χρησιμοποιώντας RT-PCR, IGHG1, Ιακ, νκ, Igλ και ΙΓ-Ογ μεταγραφές ανιχνεύτηκαν σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές, με τις εντάσεις των θετικών ζωνών είναι ασθενέστερη από εκείνες των κυττάρων Raji. Επιπλέον, CDR3, συμπεριλαμβανομένης της V (D) J ανασυνδυασμό αλληλουχία και RAG1 και RAG2 ανιχνεύθηκαν επίσης, ενώ AID ανιχνεύθηκε μόνο σε LOVO και κυτταρικές σειρές HCT116 (Σχήμα 2C και στο Σχήμα S1E).

Σαράντα (40) μg ολικής πρωτεΐνης εξήχθη από κάθε κυτταρική γραμμή. Η ολική πρωτεΐνη έτρεξε σε ένα πήκτωμα κηλίδος Western και αντέδρασε με αντίσωμα κατά IgG. Μία ζώνη στο ίδιο μοριακό βάρος, αλλά με λιγότερη ένταση από ό, τι η ταινία που λαμβάνεται με 0,02 μg ανθρώπινης IgG ανιχνεύθηκε (Σχήμα 2D). Όσο καλύτερα οι κυτταρικές σειρές διαφοροποιούνται, τόσο λιγότερο IgG εκφράστηκε. Υπό μειωμένη κατάσταση, Ιακ ζώνες ανιχνεύτηκαν σε 25 KD σε κυτταρικές σειρές HCT116 ΗΤ29, SW480, LOVO και. Παρόμοια με τις παρατηρήσεις από τον Huang et al [21], εντοπίστηκε επίσης μια πρόσθετη ζώνη στα 23 KD σε ΗΤ29, κυτταρικές σειρές SW480 και LOVO. Οι ποσότητες του Ιακ ήταν μικρότερες από εκείνες του προτύπου IgG ορού.

Έκφραση και έκκριση IgG σε ποντικούς που φέρουν όγκο SCID

Την ημέρα 21 μετά τον εμβολιασμό καλλιεργημένων κυττάρων LOVO στα SCID ποντίκια, ο όγκοι συλλέχθηκαν. Ο όγκος αποτελείτο από συμπλέγματος καρκινικά κύτταρα με ακαθόριστα κυττάρων σύνορα χωρίς στρώμα. Όλα τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά IgG, με κοκκώδη θετικά σήματα στο κυτταρόπλασμα. Η κατανομή των IGHG1 mRNA ανιχνεύεται με in situ υβριδοποίηση ήταν παρόμοια με εκείνη των πρωτεϊνών IgG ανιχνεύονται με IHC (Σχήμα 2Ε).

SDS-PAGE έδειξε ότι καθώς ο καρκίνος έγινε μεγαλύτερη, ανιχνεύθηκαν σημαντικά ισχυρότερη ζώνες της ανθρώπινης IgG στους ορούς των ποντικών SCID (Σχήμα 2Ε).

Ο αποκλεισμός του καρκίνου που προέρχεται από IgG επηρεάζει τις βιολογικές συμπεριφορές των κυττάρων CRC

σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες (ορός ποντικού και αντι-ανθρώπινου IgM) , αντι-ανθρώπινη IgG έδειξαν αυξημένη σημαντικά αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LOVO, ειδικά στις συγκεντρώσεις 100 και 1000 ηΜ (Σχήμα 3Α). Για την επακόλουθη πείραμα, επιλέξαμε 100 ηΜ ως η πιο αποτελεσματική συγκέντρωση. Όπως κουνελιού αντι-ποντικού IgG μπορεί να εμποδίσει την πρόσδεση του ποντικού αντι-ανθρώπινης IgG για την ανθρώπινη IgG μόρια, ως αποτέλεσμα της στείρα παρεμπόδιση [22], ήταν να χρησιμοποιηθεί για να ανταγωνίζονται τα αποτελέσματα του αντι-ανθρώπινης IgG. Η θεραπεία με αντι-ποντικού IgG κουνελιού κοπάσει αποτελεσματικά την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων από ποντικού αντι-ανθρώπινης IgG (Σχήμα 3Β)

Α:. MTS με μία σειρά συγκεντρώσεων αντι-ανθρώπινης IgG (10-1000 ηΜ ) αντίσωμα. Β: Η θεραπεία με κουνελιού αντι-ποντικού IgG αυξάνει τα ποσοστά απόπτωσης σε κύτταρα LOVO. C: Τα αποπτωτικά ποσοστό των κυττάρων LOVO είναι υψηλότερο μετά την επώαση με αντίσωμα IgG από ότι με IgM αντίσωμα ή ορό ποντικού. D: Απόφραξη του καρκίνου που προέρχεται από τα αποτελέσματα IgG σε μορφολογικές αλλαγές. Ε: IgG αντίσωμα μειώνει κακοήθη άγκυρα-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων CRC. ΣΤ: Ο αποκλεισμός του καρκίνου που προέρχεται από IgG καταστέλλει το δυναμικό εισβολής των κυττάρων CRC. Μπαρ = 50 μm.

Η

Η ανάλυση απόπτωση (Σχήμα 3C) έδειξε ότι η θεραπεία με αντίσωμα IgG οδήγησε σε υψηλότερο ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων LOVO (40.16%) σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με αντίσωμα IgM (13,7% , P = 0,0364) ή ορού ποντικού (10,9%, P = 0.0417).

Μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων LOVO επηρεάστηκαν επίσης από τη θεραπεία με αντίσωμα IgG (Σχήμα 3D). Όταν επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-IgM (100 ναυτικών μιλίων), κύτταρα LOVO μεγάλωσε χαλαρά ενώ οι αναπτυσσόμενες αρκετές κυτταρικές διεργασίες. Σε αντίθεση, επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-IgG (100 ναυτικών μιλίων), κύτταρα LOVO έγινε γύρο με πολύ λιγότερο αριθμό των διεργασιών των κυττάρων και έδειξε μια περιορισμένη δέσμη προσανατολισμένη πρότυπο ανάπτυξης.

Soft ανάλυση άγαρ έδειξε ότι LOVO καρκινικά κύτταρα συν -cultured με αντίσωμα αντι-ανθρώπινης IgG αυξήθηκαν πιο αργά και δημιουργούνται σημαντικά μικρότερες αποικίες, που δεν ήταν διαφανής και είχε θολή κελιών, από εκείνες των ίδιων καρκινικών κυττάρων LOVO θεραπεία με αντι-ανθρώπινο IgM αντίσωμα (Σχήμα 3Ε). Η θεραπεία με PBS αντί του IgG αντισώματος έδωσε παρόμοια αποτελέσματα με εκείνη που έλαβαν θεραπεία με αντι-ανθρώπινο αντίσωμα IgM. Ο μέσος αριθμός του σχηματισμού αποικιών σε κύτταρα LOVO θεραπεία με αντι-ανθρώπινη IgG (23,7 ± 5,2 /35 mm αεροπλάνο) ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη των κυττάρων LOVO αγωγή με αντίσωμα IgM (46.1 ± 3.2 /35 αεροπλάνο mm, Ρ = 0,0374).

η δοκιμασία κύτταρο εισβολή έδειξαν ότι ο μέσος αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα LOVO επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ανθρώπινης IgG (32.3 ± 3.9) από ότι σε εκείνες που επωάστηκαν με αντίσωμα IgM (116,5 ± 5,2, P = 0,0293) (Σχήμα 3F).

Επίδραση των παρεμβολών IgG για τη βιολογική συμπεριφορά των κυττάρων CRC

για να διερευνήσουν πιθανούς ρόλους των IgG σε βιολογικές συμπεριφορές περαιτέρω, προς τα κάτω ρύθμιση της IgG έκφρασης με παρέμβαση siRNA ήταν εκτελείται. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S3 Α, πάνω από το 50% της σύνθεσης IgG πρωτεΐνη μειώθηκε αποτελεσματικά με siRNA. Σε MTS, IgG ρύθμιση προς τα κάτω κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LOVO (Σχήμα S3 Β). Αννεξίνη V-PI διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η πρώιμη (αννεξίνη V +) και αργά (ΡΙ +) αποπτωτικά κύτταρα αυξήθηκαν με IgG νοκ ντάουν από siRNA σε σύγκριση με το SI-ελέγχου (Σχήμα S3 Γ). Εν τω μεταξύ, IgG νοκ ντάουν μειώθηκε επίσης transwell κύτταρα (Σχήμα S3 D).

Συζήτηση

Τα αυξημένα επίπεδα IgG και IgA στον ορό συχνά ανιχνεύονται σε ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνους [23], [24], συμπεριλαμβανομένων εκείνοι με CRC [25], [26]. Επιπλέον, IgG και IgA έχουν βρεθεί να εκφράζονται σε κυτταρικές σειρές και ιστούς διαφόρων επιθηλιακών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων CRC [3], [4], [6], [27], [28]. Αν και το φαινόμενο της έκφρασης Ig σε καρκίνους έχει καθιερωθεί, η λειτουργία του καρκίνου που προέρχεται από Ig παραμένει ασαφής. Επιπλέον, λίγα είναι γνωστά για τις σχέσεις μεταξύ του καρκίνου που προέρχεται από IgG και τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και βιολογική συμπεριφορά των καρκινωμάτων. Chen et al. πρόσφατα ανέφεραν ότι η έκφραση του IgG σε sacomas μαλακών ιστών συσχετίστηκε με το βαθμό του όγκου και έκφραση του PCNA, Ki-67 και Κυκλίνη D1 [29]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει την παρουσία της έκφρασης IgG σε ορθοκολικό κύτταρα τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA. Η έλλειψη έκφρασης του υποδοχέα ανοσοσφαιρίνης και την ανίχνευση του mRNA IgG σε κύτταρα CRC απέκλεισε την πιθανότητα ότι κυκλοφορούν IgG παρελήφθη από αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Δείξαμε μια θετική συσχέτιση μεταξύ IgG έκφραση, όγκος βαθμού διαφοροποίησης, το στάδιο pTNM και τη συμμετοχή των λεμφαδένων. Έκφραση των IgG ήταν ισχυρότερη στους ιστούς CRC με κακή διαφοροποίηση ή με pTNM σταδίου III-IV, από ό, τι σε εκείνες με το καλύτερο διαφοροποίηση ή pTNM Ι-ΙΙ. έκφραση IgG μπορεί να σχετίζεται αρνητικά με φλεγμονώδη διήθηση, όπως οι καρκίνοι με ελαφρύτερα φλεγμονώδη διήθηση έδειξε ισχυρότερη IgG έκφραση. Τα ευρήματά μας σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς είναι συνεπείς με τις παρατηρήσεις μας σε ορθοκολικό κυτταρικές σειρές, που δείχνει μια μικρότερη ποσότητα της IgG σε καρκινικά κύτταρα μέτριας διαφοροποίησης (ΗΤ29 και SW480) όταν συγκρίνονται με εκείνες των φτωχών διαφοροποίησης (LOVO και HCT116). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι ο καρκίνος που προέρχονται από IgG μπορεί να εμπλέκονται στη διαδικασία της απο-διαφοροποίησης, η διήθηση και μετάσταση του ΚΕΣ, και ότι θα μπορούσε να παίξει ένα αυτο-προστατευτική ρόλο κατά την ανάπτυξη του καρκίνου. Στην πραγματικότητα, κάτω από ορισμένες συνθήκες ανοσοσφαιρίνες έχουν βρεθεί να προάγουν την ανάπτυξη του καρκίνου [30], [31], και το φαινόμενο αυτό έχει κυρίως αποδοθεί στη θωράκιση των επιτόπων στόχων στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων με αντισώματα «αντι-όγκου» [32 ], [33]. Μια μελέτη των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών προταθεί ότι τέτοια αντισώματα αποκλεισμού μπορεί να γλυκοζυλιωθεί με παρεκκλίνοντα μόρια IgG, τα οποία είναι ανίκανα να προκαλέσουν ανοσολογικές αποκρίσεις [24]. Εκτός από βαριές αλυσίδες ανοσοσφαιρίνης, υποδοχείς Τ-κυττάρων (όπως TCR-α και ΤΟΡ-β), ανοσοσφαιρίνη -όπως μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (όπως CD47, CD54, CD58) βρέθηκαν επίσης να εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα [34]. TCR και IgG αντισώματα οδήγησε σε εξαρτώμενη από συμπλήρωμα κυτταροτοξικότητα και απόπτωση των καρκινικών κυτταρικών σειρών. Έτσι, αυτά τα «ανοσοσφαιρίνη υπεροικογένεια πρωτεϊνών» ήταν υπέθεσε να είναι αυτο-προστασίας και εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [34]. Μια εναλλακτική, έμμεσο ρόλο για IgG στην τόνωση της ανάπτυξης του όγκου θα μπορούσε να περιλαμβάνει αυξητικό παράγοντα εξαλλαγής βήτα (ΤΟΡ-β), η οποία φέρεται από ανοσοσφαιρίνες και έχει αποδειχθεί ότι εμποδίζει κυτταρολυτικών αποκρίσεων Τ κυττάρου [35].