Αφηρημένο

Forkhead κουτί πρωτεΐνης O1 (FOXO1), ένα βασικό μέλος της οικογένειας FOXO των μεταγραφικών παραγόντων, δρα ως καταστολέας όγκων και έχει συσχετιστεί με διάφορες βασικές κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, της απόπτωσης και της αγγειογένεσης. Ως εκ τούτου, είναι αινιγματικός γιατί έκφραση πρωτεΐνης FOXO ρυθμίζεται μειωτικά σε καρκινικά κύτταρα. Τα microRNAs, μη-κωδικοποιητική 20~22 νουκλεοτίδιο μονής έλικας RNAs, να οδηγήσει σε μεταγραφική καταστολή ή αποικοδόμηση και γονιδιακή σίγηση γονιδίων στόχων τους, και συμβάλλουν σημαντικά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η έκφραση miR-370 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πέντε προστάτη, σε σύγκριση με κύτταρα φυσιολογικού προστάτη επιθηλιακά (PrEC). Η έκτοπη έκφραση του miR-370 επαγόμενο πολλαπλασιασμό και αύξησε την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και σχηματισμό αποικίας ικανότητα των DU145 και LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη, ενώ η αναστολή της miR-370 μειώνεται πολλαπλασιασμού, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και αποικία ικανότητα σχηματισμού. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση του miR-370 προώθησε την είσοδο των DU145 και LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη στην μετάβαση G1 /S του κυτταρικού κύκλου, το οποίο συνδέθηκε με προς τα κάτω ρύθμιση της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (CDK) αναστολείς,

ρ27

Kip1

και

p21

Cip1

, και προς τα πάνω ρύθμιση του ρυθμιστή κυκλίνης κυτταρικού κύκλου D1 mRNA. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι το miR-370 μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση των FOXO1 με την άμεση στόχευση του

FOXO1

3′-αμετάφραστη περιοχή. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-370 παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη, με την άμεση καταστολή της ογκοκατασταλτικό FOXO1

Παράθεση:. Wu Ζ, Ηλιόλουστη Η Zeng W, Ο J , ο Μάο X (2012) Προς τα πάνω ρύθμιση MircoRNA-370 επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη με προς τα κάτω ρύθμιση του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1. PLoS ONE 7 (9): e45825. doi: 10.1371 /journal.pone.0045825

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 24, 2012? Αποδεκτές: 24 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Σεπ, 2012

Copyright: © Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Weixia Zeng απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία Laura Biotech Co, Ltd Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι άλλοι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κοινή κακοήθεια στους άνδρες, με περισσότερους από 0.780.000 νέα κρούσματα συμβαίνουν σε παγκόσμιο επίπεδο κάθε χρόνο [1]. Περίπου 190.000 άνδρες διαγνώστηκαν με καρκίνο του προστάτη και περισσότερες από 27.360 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη πεθαίνουν κάθε χρόνο στις ΗΠΑ [2]. Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί μείζον ζήτημα δημόσιας υγείας και σχετίζεται με σημαντικό κόστος της υγειονομικής περίθαλψης. Ορός προστατικό ειδικό αντιγόνο (PSA) διαλογής είναι χρήσιμες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, η εξέταση PSA έχει πολλές ελλείψεις, για παράδειγμα, τα επίπεδα του PSA είναι συχνά αυξημένα σε άνδρες που πάσχουν καλοήθη φλεγμονή του προστάτη. Οι στρατηγικές θεραπείας που διατίθενται σήμερα για τον καρκίνο του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων χειρουργικό ευνουχισμό και τη χημειοθεραπεία, είναι γενικά ανεπιτυχής [3]. Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος του προστάτη αλλοιώσεις είναι ετερογενείς και συχνά ανταποκρίνονται καλά στην αρχική θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) [4]. Επί του παρόντος, οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη επέλεξε μια γοναδοτροπίνη που απελευθερώνει ορμόνη (GnRH) αγωνιστής /ανταγωνιστής αντί χειρουργικό ευνουχισμό, και ADT εφαρμόζεται κυρίως ως συστηματική θεραπεία σε ασθενείς με μεταστάσεις. Ωστόσο, πολλοί ασθενείς με καρκίνο του προστάτη βιώνουν τελικά υποτροπή και ανδρογόνων ανεξαρτησία, η οποία οδηγεί σε επιταχυνόμενη εξέλιξη της νόσου και θανάτου [4], [5]. Ως εκ τούτου, νέους στόχους για αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας του καρκίνου του προστάτη πρέπει επειγόντως να προσδιοριστεί.

Παρά το γεγονός ότι και οι δύο γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες που θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες, οι μοριακοί μηχανισμοί της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη και της εξέλιξης παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Οι κακοήθεις όγκοι χαρακτηρίζονται από απορυθμισμένη δραστηριότητα στις ρυθμιστικές οδούς που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό και /ή την απόπτωση. Η ικανότητα να αναστέλλουν μία ή περισσότερες βασικούς στόχους μέσα σε αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να παρέχει νέες ανακαλύψεις στη θεραπεία του καρκίνου. Αρκετές ρυθμιστικές οδούς, όπως τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μονοπάτι σηματοδότησης και Akt /κινάση Β πρωτεΐνης (ΡΚΒ) μονοπατιού σηματοδότησης διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης και πολλαπλασιασμού σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη 6-10. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε αυτά τα μονοπάτια, όπως η ανακάλυψη από τους βασικούς ρυθμιστές δεν μπορεί να δημιουργήσει μόνο ακριβείς προγνωστικές πληροφορίες, αλλά μπορεί επίσης να παρέχει νέες στρατηγικές θεραπείας για τον καρκίνο του προστάτη.

Η Akt /οδός ΡΚΒ προάγει την κυτταρική επιβίωση ρυθμίζοντας μια σειρά από παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα μεταγραφής forkhead υπεροικογένεια [11], όπως η πρωτεΐνη Forkhead κουτί O1 (FoxO1, επίσης γνωστή ως κεφαλή πιρουνιού σε ραβδομυοσαρκώματα [FKHR]), FOXO3a (FKHRL1), FoxO4 (AFX) και FoxO6 . Από την απομόνωση του γονιδίου forkhead σε

Drosophila melanogaster

, περισσότερα από 100 δομικά σχετίζονται forkhead παράγοντες μεταγραφής έχουν ταυτοποιηθεί [12]. Τα μέλη της υποοικογένειας FOXO είναι εξελικτικά συντηρημένες μεταγραφικοί ενεργοποιητές, που χαρακτηρίζεται από μία άκρως συντηρημένη forkhead τομέα περιέχοντα μία δέσμευσης DNA μοτίβο [13]. FOXO1 εντοπίστηκε κατά τη διάρκεια της μελέτης του t (2,13) ​​(q35? Q14) και t (1,13) (p36? Q14) χρωμοσωμικών μετατοπίσεων, που βρίσκονται συνήθως σε κυψελιδικό ραβδομυοσάρκωμα, ένα σκελετικών μυών όγκου διαδεδομένη στα παιδιά [ ,,,0],14]. πρωτεΐνες FOXO παίζουν κεντρικό ρόλο σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, αποκρίσεις στρες, την επισκευή βλάβης του DNA και του μεταβολισμού της γλυκόζης [15]. Η ενεργοποίηση των μελών της υποοικογένειας FOXO μπορεί upregulate το αναστολείς του κυτταρικού κύκλου p21

Cip1 και ρ27

Kip1, και ρυθμίζουν προς τα κάτω το ρυθμιστή κυτταρικού κύκλου κυκλίνη D1 /2, κατά συνέπεια οδηγεί σε G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου [16] – [ ,,,0],18]. Ως εκ τούτου, οι παράγοντες μεταγραφής FOXO είναι το κλειδί καταστολείς των όγκων. Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των FOXO1 διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [18] – [23]. Brunet et al. έδειξαν ότι, με αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες 14-3-3 συνοδού, φωσφορυλίωση μπορεί να προκαλέσει πυρηνική μετατόπιση των παραγόντων μεταγραφής FOXO [13]. Ωστόσο, οι λόγοι για τους οποίους FOXO ρυθμίζεται μειωτικά σε καρκινικά κύτταρα είναι ελάχιστα χαρακτηρισθεί. Έτσι, υποθέσαμε ότι ένας εναλλακτικός μηχανισμός μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση της πρωτεΐνης FOXO σε καρκινικά κύτταρα.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μία κατηγορία μικρών, μη-κωδικοποίησης, μονόκλωνο RNAs τα οποία μπορούν να ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου στο ταχυδρομείο -transcriptional επίπεδο, κυρίως μέσω σύνδεσης με μη μεταφραζόμενη περιοχή 3 ‘(UTR) του mRNA που στόχο τους [24] – [26]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι παρεκκλίνουσα έκφραση των miRNAs συνδέεται στενά με τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετάσταση και την πρόγνωση των διαφόρων μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, του καρκίνου του μαστού, το γλοίωμα και καρκίνο του πνεύμονα [27] – [30]. Ανώμαλη έκφραση των miRNAs αποτελέσματα σε αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης, επιγενετικές τροποποιήσεις και αλλαγμένη αφθονία του ενζύμου miRNA-επεξεργασίας Dicer. εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη συνδέεται με αλλοιωμένη έκφραση πολλαπλών ογκογονιδίων και καταστολείς όγκων, και miRNAs μπορεί δυνητικά να ρυθμίζουν αυτά τα γονίδια? Ωστόσο, η σχέση μεταξύ miRNAs και καρκίνου του προστάτη έχει αρχίσει μόνο να διευκρινιστεί κατά τα τελευταία έτη [31]. Περισσότερα από 50 miRNAs αναφερθεί ότι εμπλέκεται στον καρκίνο του προστάτη? Ωστόσο, τα περισσότερα από τα τρέχοντα δεδομένα δείχνουν ότι μόνο ένας μικρός αριθμός από αυτά σχετίζονται με την παθογένεση του καρκίνου του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι, από τα miRNAs που είναι γνωστό ότι μεταβάλλουν το φαινότυπο των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, ορισμένες από αυτές θεωρούνται ογκογόνο (π.χ., miR-221 /-222, miR-21 και miR-125b), ενώ άλλα θεωρούνται καταστολείς όγκων (π.χ. , miR-101, miR-126 *, miR-146a, miR-330, το σύμπλεγμα του miR-34 και την οικογένειά του miR-200). Με βάση αυτά τα ευρήματα, τα miRNAs πιστεύεται ότι έχουν μια σειρά από πιθανές κλινικές εφαρμογές στον καρκίνο του προστάτη ως βιοδείκτες και θεραπευτικών στόχων [27], [30], [32] – [38].

Στην παρούσα μελέτη , διαθέσιμο στο κοινό αλγόριθμους (TargetScan, Pictar, Μιράντα) έδειξε ότι το miR-370 μπορούν να στοχεύουν άμεσα την 3`-UTR του

FOXO1

. Έχουμε αποδείξει ότι miR-370 προωθείται πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη με την άμεση στόχευση του 3′-UTR του

FOXO1

mRNA, το οποίο στη συνέχεια μειωμένη έκφραση της εξαρτώμενης από κυκλίνη αναστολείς κινάσης (CDK),

ρ27

Kip1

και

p21

Cip1

, και ρυθμίζεται προς τα πάνω το ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου

κυκλίνης D1

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-370 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (PrEC ) ελήφθησαν από την Clonetics-Biowhittaker (Walkersville, MD, USA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο PrEMB (Clonetics-Biowhittaker). Προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές Tsu-Pr1, PC3, DU145, 22Rv1 και LNCaP κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA, USA). PC3 διατηρήθηκε σε F-12K μέσο (Invitrogen), DU145 καλλιεργήθηκε σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle (Invitrogen), και Tsu-Pr1,22Rv1 και LNCaP καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (HyClone, Logan, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen).

πλασμίδια και επιμόλυνση

Ο κλώνος ακολουθία

FOXO1

3’UTR είναι ως εξής: CTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAACTGAGAGAAGCAGTCCAAAGATGTCTTTCACCAACTCCCTTTTAGTTTTCTTGGTTAAAAAAAAAAACAAAAAAAAAAACCCTCCTTTTTTCCTTTCGTCAGACTTGGCAGCAAAGACATTTTTCCTGTACAGGATGTTTGCCCAATGTGTGCAGGTTATGTGCTGCTGTAGATAAGGACTGTGCCAT.

This αλληλουχία ενισχύθηκε με PCR από PREC RNA και κλωνοποιήθηκε στο

Sac

I /

Xma

sites Ι του pGL3-ελέγχου πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (τροποποιημένο με την προσθήκη

Sac

μου /

Xma

μου τοποθεσίες για να πλασμίδια από την Promega, Madison, WI, USA) και το

Sac

I /

Xma

sites Ι του pGFP-C3 (τροποποιημένο με την προσθήκη

Sac

I /

Xma

μου τοποθεσίες για να πλασμίδια από Clontech, Mountain View, CA, USA). Έχουμε τροποποιήσει το αρχικό διάνυσμα pGL3-ελέγχου με πέψη του ιστοσελίδα της Xbal 1934 και την καταστροφή των τόπων πολλαπλασιάζονται κλωνοποίησης (MCS), το οποίο βρίσκεται στο ανάντη του SV40 υποκινητή, έτσι ώστε οι αρχικές θέσεις των

Sac

I /

Xma

μου χάνονται. Και τότε έχουμε συντίθεται ένα τμήμα της ακολουθίας συμπεριλαμβανομένων των

Sac

I /

Xma

Ι θέσεις. Αργότερα προσθέσαμε αυτήν την ακολουθία στην περιοχή της Xbal 1934. Ο pGL3-ελέγχου τροποποιημένη ακολουθία έχει ως εξής:

ΤΟΤΑΟΑ AA GAGCTC AACCAATGCATTGGTCC CCCGGG GGAGCTCTAGA

Μετά από όλα αυτά, FOXO1 3’UTR έχει κλωνοποιηθεί στην 3’UTR της luc + όχι ο ανάντη του SV40 προαγωγού.

pGFP-C3 πλασμίδιο, MCS βρίσκεται στο 3’UTR της GFP, συμπεριλαμβανομένων των εξής sequence:

TACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCA.

The εκκινητές ήταν:

FOXO1

-3’UTR-wt-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAAC-3 ‘?

FOXO1

-3’UTR-wt-dn: 5′-GCCCTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3 ‘?

FOXO1

-3’UTR-mu-up: 5′-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCACCAAC-3 »και

FOXO1

-3’UTR-mu-dn: 5′-GCC CTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3 ‘. Η Ρ3Χ IRS-MLP-Luc πλασμίδιο κατασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Οι miR-370 μιμείται, αρνητικός έλεγχος και ο αναστολέας αντι-miR-370 αγοράστηκαν από RiboBio (Guangzhou, Guangdong, Κίνα). Η επιμόλυνση του αναστολέα microRNA και microRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κηλίδωση Western

ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε σύμφωνα με τυποποιημένες μεθόδους χρησιμοποιώντας αντι-FOXO1, αντι -p21, αντι-ρ27, αντι-κυκλίνης D1, αντι-Ki-67 αντισώματα (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), αντι-Rb και αντι- φωσφορυλιωμένο αντισώματα Rb (Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και επανα-στυπώθηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-τουμπουλίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) ως έλεγχος φόρτωσης.

εκχύλιση RNA και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Σύνολο miRNAs εκχυλίστηκαν από καλλιεργημένα κύτταρα με τη χρήση της mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, στη συνέχεια, το cDNA συνετέθη από 5 ng ολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ αντίστροφης μεταγραφής Taqman miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Τα επίπεδα έκφρασης του miR-370 ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας miRNA-ειδικό κιτ TaqMan Mirna Δοκιμασία (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ορίστηκαν με βάση τον κύκλο κατωφλίου (C

t), και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν ως 2

– [(Ct του miR-370) – (Ct του U6)].

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του 7500 σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας Applied Biosystems χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές για

ρ21

Cip1

, (προς τα εμπρός, 5′-CGATGCCAACCTCCTCAACGA-3 ‘και αντίστροφος, 5’ TCGCAGACCTCCAGCATCCA-3 ‘)?

p27

Kip1

(προς τα εμπρός, 5′-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3′) και κυκλίνης D1 mRNA (προς τα εμπρός, 5’-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 ‘και να αντιστραφεί, 5 «-CCACTTGAG CTTGTTCACCA-3 ‘). Τα δεδομένα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν με τη μέση γεωμετρική επίπεδο έκφρασης του γονιδίου housekeeping

GAPDH

(προς τα εμπρός, 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3 ‘? Αντίστροφη, 3′-AGAGGCAGGGATG ATGTTCTG -5’) και υπολογίζεται με τη χρήση 2

– [(Ct του

p21, p27, ή κυκλίνη D1

) – (Ct

του

GAPDH

)], όπου C

t αντιπροσωπεύει τον κύκλο όριο για κάθε μεταγραφή .

3- (4, 5-διμεθυλ-2-θειαζολυλ) -2, 5-διφαινυλ-2Η-τετραζολίου (ΜΤΤ)

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΐ στείρου ΜΤΤ (0,5 mg /ml, Sigma) για 4 ώρες στους 37 ° C, στη συνέχεια το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με 150 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm, με 655 nm ως μήκος κύματος αναφοράς. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Anchorage-ανεξάρτητη ικανότητα ανάπτυξης δοκιμασία

Πεντακόσια κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε 2 ml πλήρους μέσου που περιέχει 0.3% άγαρ (Sigma). Το μίγμα άγαρ-κυττάρων εμβολιάσθηκε σε πλήρες μέσο που περιέχει 1% άγαρ. Μετά από 10 ημέρες, οι βιώσιμες αποικίες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικρόμετρο και αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 50 κύτταρα και οι αποικίες μεγαλύτερες από 0,1 mm σε διάμετρο μετρήθηκαν. Το πείραμα διεξήχθη τρεις ανεξάρτητες φορές για κάθε κυτταρική γραμμή.

δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων (0.5 χ 10

3 κύτταρα ανά πλάκα), καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες, στερεώθηκαν με 10% φορμαλδεΰδη για 5 λεπτά, χρωματίστηκαν με 1.0% κρυσταλλικό ιώδες για 30 s και μετρήθηκαν.

επισήμανση βρωμοδεοξυουριδίνης και ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες (Fisher, Pittsburgh, ΡΑ , USA) επωάστηκαν με βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) για 1 ώρα και στη συνέχεια βάφτηκαν με αντι-BrdU αντίσωμα (Upstate, Temecula, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. εικόνες γκρι επίπεδο αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Axioskop 2 συν, Carl Zeiss & ΣΙΑ ΕΠΕ, Jena, Germany).

δοκιμασίες λουσιφεράσης

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (3.5 × 10

4) σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 24 φρεατίων, αφήνεται να κατακαθίσει επί 24 ώρες και στη συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng Ρ3Χ IRS-MLP πλασμιδίου λουσιφεράσης DNA, 100 ng pGL3-FOXO1-3’UTR (wt /μι) πλασμιδίου DNA ή 100 ng pGL3 ελέγχου-λουσιφεράση πλασμίδιο και 1 ng του ελέγχου Renilla πλασμίδιο pRL-ΤΚ (Promega) με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Λουσιφεράσης και η δραστικότητα της Renilla μετρήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας την διπλής Luciferase Reporter Assay Kit (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τρία ανεξάρτητα πειράματα και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. τιμές δραστηριότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκαν με τη δραστηριότητα της Renilla.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν σε ψυχρό PBS, σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 80% αιθανόλη σε PBS, φυγοκεντρήθηκαν στους 4 ° C και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS. Βόεια παγκρεατική ΚΝΑάση (Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 2 μg /ml, επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά, στη συνέχεια 20 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich) προστέθηκε και επωάστηκε για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Σε κάθε ομάδα, 50.000 κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (FACSCalibur? BD Biosciences, San Jose, CA, USA)

Η στατιστική ανάλυση

Οι δύο ουρά του Student

t

-test χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημασία των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων?

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

MiR-370 υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη

Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR αποκάλυψε. ότι η έκφραση miR-370 ήταν σημαντικά αυξημένη σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές πέντε προστάτη που δοκιμάστηκαν (Tsu-Pr1, PC3, DU145, 22Rv1 και LNCaP), σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά προστάτη (PrEC) κύτταρα (Σχήμα 1Α), υποδεικνύοντας ότι miR-370 είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη

Α, σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του miR-370 έκφραση σε φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα. (PRECs? δείχνονται ως Ν1 και Ν2) και καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές συμπεριλαμβανομένων των PC3, DU145, 22Rv1 και τα κύτταρα LNCaP Β, προσδιορισμοί ΜΤΤ υποδεικνύοντας ότι ο πολλαπλασιασμός των miR-370-μορφομετατραπέντα κύτταρα αυξήθηκαν, σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο (NC) επιμολυσμένα κύτταρα. C, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας του miR-370 κύτταρα που υπερεκφράζουν? Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα (αριστερά) και ποσοτικοποίησης (δεξιά) του κρυσταλλικού ιώδους χρωματισμένες αποικίες κυττάρων. Α, Ποσοτικοποίηση του Ki-67 θετικών κυττάρων PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο (NC) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ε, Η αναβάθμιση του miR-370 προωθείται προστάτη ογκογενετικότητας καρκινικών κυττάρων? Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα (αριστερά) και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αποικιών που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα (μέση) ή αποικίες μεγαλύτερες από 0,1 mm (δεξιά) στην δοκιμασία ανάπτυξης αγκύρωση-ανεξάρτητη. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? *

P

& lt? 0,05

Η

Η υπερέκφραση του miR-370 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και ενισχύει ογκογενετικότητας

Για να διερευνηθεί η λειτουργία του miR-370 στον καρκίνο του προστάτη. , επιμολύναμε ένα HSA-miR-370 μιμούνται σε PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετρήθηκε. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ και σχηματισμού αποικίας, παρατηρήσαμε ότι ο ρυθμός αύξησης του miR-370 κύτταρα που υπερεκφράζουν αυξήθηκε δραματικά, σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο (NC) -επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 1Β και 1Γ). Επιπλέον, το ποσοστό των Ki-67 θετικών κυττάρων, ένας γνωστός δείκτης των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα που εκφράζουν εκτοπικά miR-370, σε σύγκριση με NC-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 1 D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-370 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

Επιπλέον, έκτοπη έκφραση του miR-370 σε PC3 και καρκίνου του προστάτη DU145 κύτταρα ενισχύεται σημαντικά την ανεξάρτητη από προσκόλληση ικανότητα ανάπτυξης και να οδηγήσει σε αυξημένη αριθμοί αποικιών και το μέγεθος στην δοκιμασία μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας (Σχήμα 1 F), γεγονός που υποδηλώνει ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-370 αυξήθηκε καρκίνου του προστάτη κυτταρικών ογκογονικότητα

in vitro

. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα πειράματα κατέδειξαν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-370 προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό και μεταμόρφωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

Η υπερέκφραση του miR-370 προάγει την G1 /S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση του miR-370 για πολλαπλασιασμό χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. MiR-370 που υπερεκφράζουν PC3 και DU145 κύτταρα είχαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό κυττάρων στην /φάση G0 G1 και αυξημένο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S, σε σύγκριση με NC-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, αύξηση του αριθμού των κυττάρων BrdU-ενσωματώνουν παρατηρήθηκαν σε miR-370-μορφομετατραπέντα κύτταρα, σε σύγκριση με NC-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η υπερέκφραση του miR-370 μπορεί να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με την προώθηση της G1 /S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου.

, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 μιμητικό ή αρνητικό έλεγχο (NC) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Β, Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα (αριστερά) και ποσοτικοποίησης (δεξιά) του προσδιορισμού ενσωμάτωσης BrdU σε PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 ή NC 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. C, κηλίδωση Western ανάλυση δείχνει μειωμένη έκφραση του ρ21

Cip1, ρ27

Kip1 και αυξημένη έκφραση της κυκλίνης D1 και φωσφορυλιωμένο Rb (ρ-Rb) σε PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 ή NC 48 ώρες μετά την επιμόλυνση . α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. D, Real Time PCR ανάλυση του

p21

Cip1, p27

Kip1

και κυκλίνης D1 mRNA σε PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 ή NC 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? *

P

& lt?. 0.05

Η

MiR-370 μειώνει την έκφραση των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου

p21

Cip1

και

p27

Kip1

και αυξάνει την έκφραση του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστή κυκλίνη D1

Όπως miR-370 προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ερευνήσαμε την επίδραση του miR-370 στην έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν την G1 /S μετάβαση [4 ] – [6], συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων της CDK ρ21

Cip1 και p27

Kip1 και της κυκλίνης D1 ρυθμιστή CDK. Χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR, παρατηρήσαμε ότι το p21

Cip1 και p27

Kip1 πρωτεΐνης και του mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω και η πρωτεΐνη κυκλίνης D1 και του mRNA υπερεκφράζεται σε miR-370-επιμολυσμένα κύτταρα, σε σύγκριση με το NC-επιμολυσμένα κυττάρων (Σχήμα 2C και 2D). Συμπίπτει με αλλαγμένη έκφραση ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου, το επίπεδο φωσφορυλίωσης του Rb, κατάντη πρωτεΐνη στόχο της CDK, ήταν σημαντικά αυξημένη σε miR-370-μορφομετατραπέντα κύτταρα (Σχήμα 2C), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω ότι miR-370 μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό του προστάτη τα καρκινικά κύτταρα.

Αναστολή της miR-370 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Όπως περιγράφεται παραπάνω, miR-370 παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, παρέμεινε άγνωστο αν αναστέλλοντας miR-370 θα μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Όπως αναμενόταν, η αναστολή της miR-370 αύξησε την μεταγραφή του

ρ21

Cip1

και

ρ27

Kip1

και μείωσε την έκφραση του mRNA κυκλίνης D1 (Σχήμα 3Α). Επιπροσθέτως, η αναστολή της miR-370 αύξησε σημαντικά το ποσοστό κυττάρων στην φάση Ο0 /Ο1 και μείωσε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ, ανακαλύψαμε ότι η έκτοπη έκφραση του αναστολέα HSA-miR-370 μείωσε την ανάπτυξη των PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη, σε σύγκριση με NC-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 3C). Επιπροσθέτως, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, η αναστολή της miR-370 μείωσε τον αριθμό και αποικία αποικία μεγέθη των PC3 και DU145 κύτταρα στη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, και επίσης μείωσε σημαντικά το αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ικανότητα ανάπτυξης και των δύο κυτταρικών σειρών.

σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του

ρ21

Cip1, ρ27

Kip1

και κυκλίνης D1 mRNA σε PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 αναστολέα ή αρνητικό έλεγχο (NC) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση .

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. Β, Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-370 αναστολέα ή NC 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. C, προσδιορισμοί ΜΤΤ έδειξε ότι η αναστολή της miR-370 μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων. D, Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα (αριστερά) και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αποικιών που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα (μέση) ή αποικίες μεγαλύτερες από 0,1 mm (δεξιά) στις δοκιμασίες ανάπτυξης αγκύρωση-ανεξάρτητη. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? *

P

& lt?. 0.05

Η

MiR-370 στοχεύει άμεσα το μεταγραφικό παράγοντα

FOXO1

στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι FOXO1 μπορεί να ρυθμίσει μια σειρά γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο σε μεταγραφικό επίπεδο, συμπεριλαμβανομένων των

p21

Cip1

,

p27

Kip1

και κυκλίνης D1 mRNA. Παράλληλα, η ανάλυση μας χρησιμοποιώντας τρεις διαθέσιμες στο κοινό αλγόριθμους (TargetScan, Pictar, Μιράντα) απέδειξαν ότι το miR-370 μπορούν να στοχεύουν άμεσα την 3′-UTR του

FOXO1

(Εικόνα 4Α). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το miR-370 μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση της p27

Kip1, p21

Cip1 και κυκλίνης D1 με τη ρύθμιση

FOXO1

. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, το Σχήμα S2A και Εικόνα 4C, έκτοπη έκφραση του miR-370 μείωσε τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης και του mRNA του FOXO1 σε PC3 και DU145 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι

FOXO1

είναι ένας δυνητικός στόχος γονίδιο miR-370 . FOXO1 ρυθμίζεται μειωτικά σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα S1A και Σχήμα 1Α)? η οποία είναι πιθανό να συνδέεται με αυξητική ρύθμιση του miR-370 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη (Σχήμα 1), η οποία θα μειώσει την έκφραση του γονιδίου-στόχου miR-370

FOXO1

.

Α, Ακολουθία η

FOXO1

3’UTR miR-370 περιοχή πρόσδεσης των σπόρων και η μετάλλαξη του

FOXO1 περιοχή σπόρων

3′-UTR να δημιουργήσει FOXO1-mu. Β, κηλίδωση Western ανάλυση της έκφρασης FOXO1 σε miR-370 ή αρνητικό έλεγχο (NC) επιμολυσμένα PC3 και DU145 κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. C, σχετική δραστηριότητες FOXO1 ρεπόρτερ σε miR-370 ή NC-επιμολυσμένα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. D, κηλίδωση Western ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς GFP στα miR-370 ή NC-επιμολυσμένα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ε, σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των PC3 ή DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες miR-370 μιμούνται ολιγονουκλεοτίδια (20, 50 ηΜ), και τον ρεπόρτερ ελέγχου pGL3, pGL3-FOXO1-3’UTR ρεπόρτερ, ή pGL3-FOXO1 -3’UTR-mu ρεπόρτερ, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? *

P

& lt?. 0.05

Η

Για να επιβεβαιώσετε τη λειτουργία της υποθετικής θέσης δέσμευσης miR-370 στο

FOXO1

3′-UTR, θα κλωνοποιηθεί η

FOXO1

3′-UTR στα πλασμίδια αναφοράς pEGFP-C3 και pGL3. έκφραση πρωτεΐνης GFP ανεστάλη δραματικά με έκτοπη έκφραση του miR-370 σε PC3 και DU145 κύτταρα, σε σύγκριση με το πλασμίδιο ελέγχου GFP-γ-τουμπουλίνης, υποδηλώνοντας ότι miR-370 στοχεύει συγκεκριμένα το

FOXO1

3 ‘UTR. Η επιμόλυνση του miR-370 με συνέπεια και μειωμένη δοσοεξαρτώμενο τη δραστικότητα της λουσιφεράσης του

FOXO1

3′-UTR λουσιφεράσης πλασμίδιο ανταποκριτή σε PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 4Ε). Επιπλέον, η κατασταλτική δράση του miR-370 για το

FOXO1

3′-UTR καταργήθηκε από σημειακές μεταλλάξεις στο miR-370-δεσμευτική περιοχή σπόρο του

FOXO1

3′-UTR ( Εικόνα 4Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

FOXO1

είναι

καλόπιστους

στόχος του miR-370.

Η επιμόλυνση ενός αναστολέα miR-370 αποκατέστησε τη δραστηριότητα λουσιφεράσης του pGL3-FOXO1- πλασμίδιο ανταποκριτή 3’UTR σε PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 5Α), και ρυθμίζεται προς τα πάνω έκφραση πρωτεΐνης FOXO1 (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, η αναστολή της miR-370 με συνέπεια και την αύξηση της δοσοεξαρτώμενο την δραστικότητα λουσιφεράσης του pGL3-FOXO1-3’UTR σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του miR-370 αυξητικά FOXO1.

Σχετική δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης των PC3 και DU145 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pGL3-FOXO1-3’UTR και αυξανόμενες ποσότητες (20, 50 ηΜ) miR-370 mimic- ή miR-370 αναστολέα-ολιγονουκλεοτίδια, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα. Β, κηλίδωση Western ανάλυση της έκφρασης FOXO1 σε miR-370 ή αρνητικό έλεγχο (NC) επιμολυσμένα PC3 και DU145 κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. C, λουσιφεράσης δοκιμασία δραστικότητας των PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με το pGL3-FOXO1-3’UTR πλασμιδίου και αυξανόμενες ποσότητες (20, 50 ηΜ) miR-370 αναστολέα-ολιγονουκλεοτίδια 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τιμές τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? *

P

& lt?. 0.05

Η

Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα του miR-370 υπερέκφραση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη (Σχήμα 1), έχουμε ποσοτικά την έκφραση της FOXO1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Παρατηρήσαμε ότι FOXO1 ρυθμίζεται μειωτικά σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα S1A και Σχήμα 1Α)? επιβεβαιώνοντας ότι η υπερέκφραση του miR-370 ελαττώνουν την έκφραση του γονιδίου στόχου miR-370

FOXO1

στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

MiR-370-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκίνου του προστάτη διαμορφώνεται από FOXO1

Για να διερευνηθεί αν FOXO1 θα μπορούσε να καταστείλει miR-370-επαγόμενο πολλαπλασιασμό,

FOXO1

(χωρίς την 3′-UTR) και

FOXO1

3′-UTR (με 3′-UTR) επιμολύνθηκαν σε miR-370 που υπερεκφράζουν καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Όπως ήταν αναμενόμενο, έκτοπη έκφραση της FOXO1 να οδηγήσει σε σημαντικά μεγαλύτερες αλλαγές στην έκφραση του

p27

Kip1

,

p21

Cip1

και κυκλίνης D1 mRNA από FOXO1-3’UTR (Σχήμα 6Α). Ειδικότερα, μετά την επιμόλυνση ενός γονιδίου ανταποκριτή FOXO1 και miR-370 σε PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου προστάτη, η δραστικότητα της λουσιφεράσης θα μπορούσε να αποκατασταθεί από υπερέκφραση του FOXO1 και μερικώς διασωθεί από επιμόλυνση της FOXO1-3′-UTR (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, ο ρυθμός αύξησης των δύο PC3 και DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη αναστάλθηκε σε σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό από συν-επιμόλυνση του miR-370 και FOXO1 από συν-επιμόλυνση του FOXO1-3′-UTR και miR-370 (Σχήμα 6C). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το miR-370-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκίνου του προστάτη συνδέεται άμεσα με τη μεσολάβηση από την καταστολή της

FOXO1

.

Σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του

p21

Cip1 , p27

Kip1

και κυκλίνης D1 έκφραση mRNA στα υποδεικνύεται κύτταρα.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Β, λουσιφεράσης δοκιμασία δραστικότητας των υποδεικνυόμενων κυττάρων επιμολυσμένων με ένα ρεπόρτερ FOXO1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. C, ΜΤΤ δοκιμασία των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη επιμολυσμένα με miR-370 μιμούνται, συν-επιμολυσμένα με miR-370 και FOXO1, ή συν-επιμολυσμένα με miR-370 και FOXO1-3′-UTR.

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι miR-370 ρυθμίζεται αυξητικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα πρωτογενή επιθηλιακά προστάτη. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-370 προώθησε την G1 /S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η οποία συσχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (CDK) αναστολείς ρ27

Kip1 και ρ21

Cip1. Αντιστρόφως, η αναστολή του miR-370 τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μειώνεται προστάτη, ρυθμίζεται προς τα πάνω p27

Kip1 και p21

Cip1, και καθυστέρησε την G1 /S μετάβαση. MiR-370 υπερεκφράζεται το κυτταρικό κύκλο ρυθμιστική κυκλίνη D1 με απευθείας στόχευση του

FOXO1

3′-UTR, αποδεικνύοντας ότι FOXO1 ρυθμίζεται από miR-370 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του miR-370 μπορεί να προωθήσει την έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση FOXO1 ρυθμίζεται από διάφορους microRNAs, όπως miR-223, miR-182, miR-27a, miR-139 και miR-96 [39] – [43]. Από αυτούς, ορισμένοι microRNAs μπορεί να απορυθμίζεται σε καρκίνο του προστάτη, όπως miR-27a, miR-182 [41], [44].