Αφηρημένο

RASSF1C είναι μια σημαντική ισομορφή του γονιδίου RASSF1, και αναδύεται ως ένα ογκογονίδιο. Αυτό είναι σε αντίθεση με την ισομορφή RASSF1A, η οποία είναι μια καθιερωμένη ογκοκατασταλτικό. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι RASSF1C προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα και έχουν εντοπίσει γονίδια στόχους RASSF1C με λειτουργίες προώθηση της ανάπτυξης. Εδώ, αναφέρουμε ακόμη ότι RASSF1C προωθεί τη μετανάστευση καρκίνο του πνεύμονα και ενισχύει το σχηματισμό σφαίρα των καρκινικών κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα. Δείχνουμε επίσης ότι RASSF1C υπερ-έκφραση μειώνει τις ανασταλτικές επιδράσεις του αντικαρκινικού παράγοντα, betulinic οξύ (ΒΑ), επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα. Σε προηγούμενη εργασία, αποδείξαμε ότι RASSF1C ρυθμίζει ανοδικά

piwil1

γονίδιο έκφρασης, το οποίο είναι ένα βλαστοκύτταρο γονίδιο αυτο-ανανέωση, που υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Εδώ, θα υποβάλει έκθεση σχετικά με τις επιπτώσεις της ΒΑ στο

piwil1

γονιδιακής έκφρασης. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με BA δείχνουν μειωμένη

piwil1

έκφρασης. Επίσης, η αλληλεπίδραση της IGFBP-5 με RASSF1C φαίνεται να εμποδίζει RASSF1C από up-ρύθμιση των επιπέδων πρωτεΐνης PIWIL1. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η IGFBP-5 μπορεί να είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της RASSF1C /PIWIL1 δραστηριότητες που προάγουν την ανάπτυξη. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η αναστολή του μονοπατιού ATM-AMPK up-ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου RASSF1C

Παράθεση:. Reeves ME, Firek Μ, Chen ST, Amaar YG (2014) Αποδεικτικά στοιχεία ότι RASSF1C διέγερση του καρκίνου του πνεύμονα πολλαπλασιασμό Εξαρτάται από IGFBP-5 και PIWIL1 επίπεδα έκφρασης. PLoS ONE 9 (7): e101679. doi: 10.1371 /journal.pone.0101679

Επιμέλεια: Pierlorenzo Pallante, Ινστιτούτο Πειραματικής Ενδοκρινολογίας και Ογκολογίας «Γ Salvatore »(IEOS), Ιταλία

Ελήφθη: 10 Ιουνίου, 2013? Αποδεκτές: 11 Ιουνίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 9 του Ιουλίου 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτείται από το Loma Linda Κέντρο Καρκίνου. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το γονίδιο RASSF1 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη. Είναι κωδικοποιεί πολλαπλές ισομορφές, οι κυριότερες των οποίων είναι RASSF1A και RASSF1C. RASSF1A είναι η πιο συχνά αδρανοποιούνται ογκοκατασταλτικών σε ανθρώπινους καρκίνους, κυρίως με τη βοήθεια ειδικών μεθυλίωσης υποκινητή. Αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη και μετανάστευση, και προάγει την απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, η ισομορφή RASSF1C είναι καλά εκφράζεται στην πλειονότητα ανθρώπινων καρκίνων, και φαίνεται να λειτουργεί ως ογκογονίδιο. Σε αντίθεση με RASSF1A, προωθεί τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση, και εξασθενεί την απόπτωση [1] – [13]. Έτσι, το γονίδιο RASSF1 φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό διττό ρόλο στον καρκίνο, λειτουργούν εναλλακτικά ως καταστολέας όγκων και ως ογκογονίδιο [1] – [15]. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η έκφραση του RASSF1C είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ιστό καρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς, και συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου και φτωχή πρόγνωση [13]. Επιπλέον, RASSF1C υπερ-έκφραση (αλλά όχι RASSF1A υπερέκφραση) σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ενισχύει συσσώρευση του ογκογονιδίου β-κατενίνης, βασικός παράγοντας στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, που οδηγεί σε αυξημένη μεταγραφική ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [16].

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι η υπερ-έκφραση του RASSF1C ρυθμίζει ανοδικά (και σίγηση του RASSF1C ρυθμίζει προς τα κάτω) την έκφραση PIWIL1, ενός γονιδίου βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [12]. Η οικογένεια γονιδίων το Piwik είναι μια υποοικογένεια των πρωτεϊνών Argonaute που παίζει κεντρικό ρόλο στην βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση, γαμετογένεση, και μεταγραφική γονιδιακή σίγηση σε μια ευρεία ποικιλία ειδών. Οι πρωτεΐνες Argonaute δεσμεύουν μικρά RNA και χαρακτηρίζονται από αμινοτελικό (Ν), PAZ (το Piwik-Argonaute-Zwille), MID (μεσαία), και τους τομείς PIWI [17]. Στους ανθρώπους, τρία το Piwik (το Piwik 1 (ονομάζεται επίσης Hiwi), Piwil2, και Piwil3) γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί. προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης Piwi έχουν λάβει πρόσφατα μεγάλη προσοχή για τις πιθανές λειτουργικές εμπλοκή τους στην ογκογένεση σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων και Piwil1 και το Piwik 2 έχουν αποδειχθεί να είναι ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες σε γαστρικό καρκίνο [17] – [19]. Οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν το Piwik και μικρά RNAs τους (piRNAs) μπορεί να παίζουν ρόλο στην ογκογένεση μέσω της αύξησης της μεθυλίωσης των γονιδίων και σίγηση των εξαρτώμενων από κυκλίνη αναστολέων κινάσης και καταστολείς όγκων. Οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν το Piwik και μικρά RNAs τους (piRNAs) μπορεί να παίζουν ρόλο στην ογκογένεση μέσω της αύξησης της μεθυλίωσης των γονιδίων και σίγηση των εξαρτώμενων από κυκλίνη αναστολέων κινάσης και καταστολείς όγκων [17] – [19]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η υπερ-έκφραση του PIWIL1 προωθεί sarcomagenesis και ρυθμίζει προς τα κάτω μια σειρά καταστολείς όγκων, συμπεριλαμβανομένης της ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα δέσμευσης πρωτεΐνης 5 (IGFBP-5) [20]. IGFBP-5 είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών πρόσδεσης IGF εμπλέκεται στη ρύθμιση των μιτογόνων IGF Ι και II. IGFBP-5 είναι εξαιρετικά σημαντική σε ανθρώπινο καρκίνο εξέλιξης [21]? και έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι RASSF1C είναι ένας εταίρος δέσμευσης της IGFBP-5 [20].

Έτσι, θελήσαμε να καθορίσει εάν RASSF1C μεσολαβεί επιπτώσεις της στην καρκινικών κυττάρων μέσω αλληλεπιδράσεων με IGFBP-5 και PIWIL1. Για να γίνει αυτό, σχεδιάσαμε πειράματα για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της επί του σχηματισμού RASSF1C πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα, η μετανάστευση και σφαίρα όγκου. Επειδή το αντικαρκινικό παράγοντα, betulinic οξύ (ΒΑ), έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου PIWIL1 [22], μελετήσαμε τα αποτελέσματα της ΒΑ και αλληλεπίδραση RASSF1C /IGFBP-5 επί της έκφρασης γονιδίου PIWIL1 και επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης . Βρήκαμε ότι RASSF1C προάγει σχηματισμό μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και καρκινικών σφαίρα, και μειώνει την αναστολή του πολλαπλασιασμού από την ΒΑ. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση της IGFBP-5 με RASSF1C απέτρεψε RASSF1C μεσολάβηση πάνω ρύθμιση PIWIL1. Τέλος, σίγηση της γονιδιακής έκφρασης PIWIL1 μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης β-κατενίνης, υποδεικνύοντας ότι PIWIL1 μπορεί να συνεισφέρει στη σηματοδότηση Wnt. Έτσι, RASSF1C, IGFBP-5, PIWIL1, και το μονοπάτι Wnt μπορεί να λειτουργούν μαζί ως ένα νέο άξονα ότι η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου επιπτώσεις πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι ανθρώπινες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η1299 και Α549 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Α549 είναι RASSF1A αρνητική, p16 αρνητική, και p53 θετική, ενώ NCI-Η1299 είναι RASSF1A αρνητική, p16 αρνητική, και p53 αρνητική. Η κυτταρική καλλιέργεια διεξήχθη, όπως συνιστάται από την ATCC.

φορείς έκφρασης γονιδίων

RASSF1C, IGFBP-5, και RASSF1A ήταν υπερ-εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα χρησιμοποιώντας επαγώγιμο ιό λευχαιμίας ποντικού (MLV) με έδρα φορείς ρετροϊών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12].

Ο αριθμός των κυττάρων καταμέτρηση

κύτταρα NCI-Η1299 σταθερά μεταγωγή με MLV-σπονδυλική στήλη (ΒΒ) και MLV-HA-RASSF1C (1C) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μg δοξυκυκλίνη /ml για 72 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

ανάλυση Alamar Blue

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων /η βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη δοκιμασία Alamar Μπλε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11], [12]. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση t-test.

In vitro

κυτταρική εισβολή δοκιμασία

Το BD BIOCOAT Matrigel εισβολής Επιμελητηρίου (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής καρκίνου του πνεύμονα. NCI-Η1299-ΒΒ (έλεγχος) ή ΝΟΙ-H1299-1C (υπερεκφράζουν RASSF1C) κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 25.000 κυττάρων στους θαλάμους Matrigel και αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 άνευ ορού για 24 ώρες. Οι θάλαμοι που περιέχουν το NCI-Η1299-ΒΒ και τα κύτταρα NCI-H1299-1C μεταφέρθηκαν στη συνέχεια στο μέσο που περιέχει καλά συμπληρωμένο με 10% βόειο ορό μόσχου για 24 ώρες. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 1% κυανούν της τολουϊδίνης. Οι χρωματισμένες μεμβράνες φωτογραφήθηκαν μέσω του μικροσκοπίου και εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

σχηματισμό σφαίρα όγκου

Ένα CD133 Microbead Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) χρησιμοποιήθηκε για να απομονώσει την πλευρά Α549 πληθυσμού (SP, CD133

+, αρχέγονα καρκινικά κύτταρα) και μη-SP (CD133

– κύτταρα) με χρήση κυτταρομετρίας ροής με τη χρήση του πρωτοκόλλου από τον προμηθευτή. Τα κύτταρα SP απομονώθηκαν από Α549 σε μεταγωγή είτε με έλεγχο MLV-ραχοκοκαλιά (Α549-ΒΒ) ή MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). SP και μη SP κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένου με EFG (20 ng /ml) και FGF (10 ng /ml) για την προώθηση κύτταρα SP για το σχηματισμό σφαιρών όγκου για τρεις εβδομάδες. σφαίρες όγκων φωτογραφήθηκαν, συλλέγεται, και απλώθηκε σε μέσα συμπληρωμένα με 10% ορό μόσχου, και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western για να ελέγξει για έκφραση εξωγενούς ΗΑ-RASSF1C.

απομόνωση RNA και RT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα απομονώθηκε από καλλιέργειες και ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) -PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας PIWIL1 γονίδιο-ειδικούς εναρκτήρες, όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του κύριου HotStart μείγμα (Qiagen, Valencia, CA), και οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν με τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 15 λεπτά, 95 ° C για 1 λεπτό, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 sec για 35 κύκλους. Η ενίσχυση του cyclophyllin χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές PCR γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι RT-PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν και η πολλαπλή μεταβολή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο -ΔΔCT 2

[23]. Οι RT-PCR πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

betulinic οξύ (BA) θεραπεία

BA (Enzo Life Sciences, New York, NY) διαλύθηκε σε DMSO σε 5 mg /ml . Α549 και ΝΟΙ-Η1299 κύτταρα απλώθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μg /ml ΒΑ για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με τη χρήση της ανάλυση Alamar Blue. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Η σίγαση της έκφρασης Piwil1 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

πνεύμονα καρκινικά κύτταρα (NCI-Η1299) τοποθετήθηκαν σε 5000 /φρεάτιο σε τρυβλία 96 φρεατίων 24 ώρες . πριν από τη μόλυνση και τα κύτταρα μολύνθηκαν με αποστολή μη στόχους shRNA ελέγχου Μεταγωγή σωματίδια ή με πολλαπλές Mission λεντοϊών shRNA Μεταγωγή Σωματίδια (NMID: NM_004764) για φίμωση RASSF1C (Sigma, St. Louis, ΜΟ) όπως περιγράφεται προηγουμένως [14]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πολυβρένιο (Sigma, ST. Louis, ΜΟ) για δύο ώρες πριν από την προσθήκη λεντοϊών σωματίδιο σε μία πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 5. Knockdown επικύρωση του

piwil1

έκφραση αξιολογήθηκε με στύπωμα Western και qRT -PCR, χρησιμοποιώντας αντίσωμα RASSF1C και RASSF1C ειδικά αρχικά τεμάχια, αντιστοίχως. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

ανάλυση Western ανάλυση κηλίδος

Western στύπωμα διεξήχθη χρησιμοποιώντας την υπέρυθρη System Οδύσσεια (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ) και αντι-β- κατενίνης αντίσωμα # 9582 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), αντι-PIWIL1 αντίσωμα ab12337 (Abcam, Cambridge, ΜΑ), αντι-ΗΑ κλώνο αντίσωμα 16B12 (Covance, Berkeley, CA), μονοκλωνικό αντίσωμα βήτα ακτίνης AC-74 (Sigma, St. Louis, ΜΟ), και φθορισμό σημασμένο δευτερογενή αντισώματα IRDye 680RD Υπέρυθρο Dye (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές. τα επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα ακτίνης (ο έλεγχος φόρτωσης) με τυπικές αποκλίσεις.

μεταγραφικό PCR οθόνη Array

SureFind μεταγραφικό PCR Array λήφθηκε από Qiagen (Catalog Νο 336611. Αποτελούνταν από 90 δείγματα cDNA που προέρχονται από τον καρκίνο του μαστού MCF7 κυτταρική σειρά που έλαβαν θεραπεία με 90 διαφορετικές χημικές αναστολείς που ρυθμίζουν διάφορες οδούς σηματοδότησης. Η σειρά PCR προβλήθηκε με ειδικό γονίδιο RASSF1C εκκινητών. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με την εισαγωγή των τιμών Ct που λαμβάνονται στην παράταξη δεδομένων SureFind μεταγραφικό PCR ανάλυση λογισμικού https://www.sabiosciences.com/tpadataanalysis.php (Qiagen). Οι χημικές ουσίες που προσδιορίζονται ως ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης RASSF1C χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα για να επιβεβαιώσουν τις επιπτώσεις τους στην έκφραση των γονιδίων RASSF1C χρησιμοποιώντας RT-PCR.

Dorsomorphin και τριχοστατίνη Α θεραπεία

καρκινικά κύτταρα Η1299 πνεύμονα υποβλήθηκαν σε αγωγή με Dorsomorphin, επίσης γνωστή ως ένωση Γ, (10 μΜ) ή τριχοστατίνη Α (10 μΜ) σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες πριν από κύτταρα συλλέχθηκαν για την απομόνωση του RNA. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). RT-PCR ανάλυση χρησιμοποιώντας RASSF1C, PIWIL1, και γονίδιο cyclophyllin ειδικών εκκινητών διεξήχθη όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Dorsomorphin ελήφθη από Phoenix Pharmaceutical, Inc (Burlingame, CA) και τριχοστατίνη Α ελήφθη από Αντιδραστήρια Direct (Encinitas, CA). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Στατιστική Ανάλυση

Το t-test χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σημασία των δεδομένων.

Αποτελέσματα

RASSF1C υπερέκφραση ενισχύει τον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική μετανάστευση

Η κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-Η1299 μετήχθη με ρετροϊικό φορέα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], [13], για να δημιουργήσει μια σταθερή κυτταρική γραμμή ότι η υπερ-εκφράζει RASSF1C. Βρήκαμε ότι τα σταθερά RASSF1C υπερ-έκφραση όχι μόνο αυξημένο πολλαπλασιασμό του καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 1), η οποία είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα μας χρησιμοποιώντας παροδική υπερέκφραση RASSF1C [11], αλλά προωθείται επίσης μετανάστευση κυττάρων (Σχήμα 2).

κύτταρα ΝΟΙ-Η1299 σταθερώς μεταγωγή με MLV-σκελετό (ΒΒ) ή MLV-HA-RASSF1C (1C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /ml δοξυκυκλίνης για 72 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα μετρήθηκαν. RASSF1C υπερέκφραση (1C) αυξήθηκε κυτταρικού πολλαπλασιασμού κατά 2,5 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (ΒΒ). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM. * P & lt?. 0.05

Η

. RASSF1C προωθεί τη μετανάστευση των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων. (Α) Η BD Biocoat Matrigel εισβολής τμήμα χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των κυττάρων εισβολή /μετανάστευση των κυττάρων ΝΟΙ-Η1299 σταθερώς μεταγωγή με άδειο MLV-σκελετό (ΒΒ) ή MLV-HA-RASSF1C (1C). Κύτταρα κατεργασμένα με δοξυκυκλίνη σε 1 ug /ml συν-επωάστηκαν με μέσα που περιέχουν ορό. Μετά από 24 ώρες, οι κάτω πλευρές των φίλτρων μονιμοποιήθηκαν και βάφτηκαν, και τα κύτταρα σε τέσσερις μικροσκοπικά πεδία μετρήθηκαν. Ο μέσος αριθμός αριθμός κυττάρων παρίσταται γραφικώς. κύτταρα (Β) NCI-Η1299 υπερεκφράζουν RASSF1C έδειξε αύξηση του αριθμού των κυττάρων που εισβάλλουν στον θάλαμο Matrigel και μεταναστεύουν προς την άλλη πλευρά του φίλτρου σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου ΝΟΙ-Η1299-ΒΒ. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο αριθμό αποικιών των κυττάρων. * Ρ & lt?. 0,05, όπως προσδιορίζεται με t-test

Η

RASSF1C ενισχύει το σχηματισμό σφαίρα όγκου πνεύμονα

Έχει καταδειχθεί ότι CD133-θετικά κύτταρα από την κυτταρική γραμμή Α549 μπορούν να προκαλέσουν σφαίρες όγκου και μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογενή κύτταρα [24], [25]. Έτσι, θελήσαμε να εκτιμηθεί η επίδραση της RASSF1C υπερ-έκφραση επί του σχηματισμού σφαίρα όγκου καρκίνου του πνεύμονα. Εμείς απομονωθεί πλευρά Α549 πληθυσμού (SP, CD133

+ κύτταρα), τα οποία εμφανίζουν βλαστικά χαρακτηριστικά των κυττάρων-όπως, και μη-SP CD133

– κύτταρα χρησιμοποιώντας CD133 κυτταρομετρία ροής [24], [25]. Τα κύτταρα SP απομονώθηκαν από Α549 μεταγωγή με είτε MLV-σκελετό (Α549-ΒΒ) ή MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένου με EFG και FGF να κάνουν τα κύτταρα να σχηματίσουν SP σφαίρες όγκου (Σχήμα 3Α). RASSF1C-SP-CD133

+ κύτταρα σχηματίζονται σφαίρες περισσότερα και μεγαλύτερα όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο της ΒΒ-SP-CD133

+ κύτταρα (Σχήμα 3Α). Για να δειχθεί ότι οι απόγονοι σφαίρα όγκου ακόμη υπερ-εκφράζεται RASSF1C, σφαίρες όγκου απομονώθηκαν, αναπτύχθηκαν, και χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση στυπώματος Western. κύτταρα SP όντως υπερεκφράζουν RASSF1C (Σχήμα 3Β). Όλα αυτά δείχνουν ότι RASSF1C μπορεί να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα, και είναι πιθανό ότι αυτό συμβαίνει μέσω πάνω ρύθμιση του PIWIL1 γονίδιο, ένα γονίδιο βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [12].

(Α) Μη -δΡ-1C CD133

-, SP-ΒΒ CD133

+, και SP-1C CD133

+ κύτταρα απομονώνονται από το κυτταρική γραμμή καρκίνου πνεύμονα Α549 αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με 10 ng /ml EGF και 20 ng /ml FGF για την προαγωγή του σχηματισμού όγκων σφαίρα για τρεις εβδομάδες. (Β) Α549 κύτταρα ανασυσταθείσες από σφαίρες όγκων ελέγχθηκαν ως προς την έκφραση ΗΑ-RASSF1C χρησιμοποιώντας ΗΑ-αντισώματος. Όπως ήταν αναμενόμενο, SP-1C CD133- και CD133 + εξέφρασε HA-RASSF1C, ενώ τα κύτταρα SP-ΒΒ δεν το έκανε. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

RASSF1C μειώνει την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με το αντικαρκινικό παράγοντα betulinic οξύ

betulinic οξύ (ΒΑ) είναι ένα αντι-φλεγμονώδη και αντικαρκινικού παράγοντα που έχει δειχθεί ότι προάγει την απόπτωση και αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Αυτό επιτυγχάνεται, τουλάχιστον εν μέρει, από τα κάτω ρύθμιση PIWILI, κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, BCL2 και up-ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου Ββχ σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Α549 [22], [26], [27]. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι RASSF1C υπερέκφραση up-ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου PIWIL1 και έτσι θέλαμε να προσδιοριστεί εάν RASSF1C υπερ-έκφραση θα μείωνε τις αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της ΒΑ επί κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Τα πειράματά μας έδειξαν ότι Α549 και ΝΟΙ-Η1299 κύτταρα που υπερεκφράζουν RASSF1C ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε BA αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4), υποστηρίζοντας περαιτέρω ένα αυξητικών ρόλο για RASSF1C σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Α549 (Α) και ΝΟΙ-Η1299 (Β) κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα που υπερεκφράζουν RASSF1C υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με betulinic οξύ (ΒΑ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για κυτταρική βιωσιμότητα /πολλαπλασιασμό. RASSF1C υπερέκφραση μείωσε σημαντικά την ευαισθησία των κυττάρων στην ΒΑ. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM. * P & lt? 0.05: για 1C σε σύγκριση με BB

Η

Επιδράσεις της ΒΑ στην έκφραση PIWIL1 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία ΒΑ του ανθρώπινου γαστρικού αδενοκαρκινώματος AGS κύτταρα κάτω. γονιδιακή έκφραση -regulates PIWIL1 [26]. Ως εκ τούτου, θελήσαμε να εκτιμηθεί η επίδραση της ΒΑ επί της έκφρασης γονιδίου PIWIL1 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. δεδομένα RT-PCR (Σχήμα 5) δείχνουν ότι

piwil1

επίπεδα του mRNA μειώθηκαν σε Α549 και κύτταρα Η1299 κατά την κατεργασία ΒΑ. Η προς τα κάτω ρύθμιση επίδραση της ΒΑ στο

piwil1

mRNA επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα είναι σύμφωνο με αυτό που παρατηρήθηκε σε AGS κύτταρα αδενοκαρκινώματος στομάχου [26].

Piwil1

έκφραση του mRNA αξιολογήθηκε με την παρουσία και απουσία ορού και ΒΑ στο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549 (Α) και ΝΟΙ-Η1299 (Β). δεδομένα RT-PCR δείχνουν ότι

piwil1

έκφραση κάτω-ρυθμίζονται από την BA απουσία και παρουσία ορού. Οι αντιδράσεις PCR που εις τριπλούν και Cyclophillin χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτισης και να χρησιμοποιηθούν για την κανονικοποίηση των σχετικών επιπέδων έκφρασης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2

-ΔΔ (26). αντίδραση RT-PCR διεξήχθησαν σε τρεις ανεξάρτητες φορές.

Η

PIWIL1 knock-down οδηγεί σε μείωση της έκφρασης β-κατενίνης

RASSF1C έχει προηγουμένως συνδεθεί με την οδό σηματοδότησης Wnt, όπως RASSF1C υπερέκφραση αυξήσεις και σιγαστήρα ή RASSF1C μειώνει συσσώρευση β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα [16]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι knock-down των αποτελεσμάτων έκφρασης RASSF1C σε μειορύθμιση της έκφρασης του γονιδίου PIWIL1 [12]. Έτσι θελήσαμε να καθορίσει εάν PIWIL1 γονίδιο knock-down θα επηρεάσει την έκφραση της β-κατενίνης. Knock-κάτω της γονιδιακής έκφρασης PIWIL1 χρησιμοποιώντας έναν φορέα shRNA-βραδέος οδήγησε σε χαμηλότερα επίπεδα β-κατενίνης mRNA και η πρωτεΐνη (Σχήμα 6). Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι PIWIL1 μπορεί να ρυθμίζει τα επίπεδα της β-κατενίνης και ότι RASSF1C και PIWIL1 μπορεί να παίξει καθοριστικό ρόλο στην Wnt μονοπατιού σηματοδότησης για την προώθηση της ογκογένεσης.

Νοκ-κάτω της

piwil1

έκφρασης είχε ως αποτέλεσμα η μείωση των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης β-κατενίνης. (Α) ανάλυση Western blot των καρκινικών κυττάρων Η1299 πνεύμονα που έχουν μολυνθεί με σωματίδια αποστολή λεντοϊών-shRNA ελέγχου (shRNA-cont) και αποστολή λεντοϊών-shRNA-

piwil1

(shRNA-

piwil1

) για να σιωπή ενδογενούς

piwil1

έκφρασης. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας δείχνει αντι-PIWIL1 αντίσωμα μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε κύτταρα PIWIL1 shRNA-PIWIL1 σύγκριση με shRNA-cont κύτταρα. Αποσιώπηση του

piwil1

έκφραση γονιδίου ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης β-κατενίνης όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας αντίσωμα β-κατενίνης. Τα κανονικοποιημένα επίπεδα της πρωτεΐνης PIWIL1 με ακτίνη (έλεγχος φόρτωσης) φαίνεται επίσης, δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα κηλίδες. (Β)

Piwil1

και

β-κατενίνης

επίπεδα mRNA αξιολογήθηκαν επίσης σε shRNA-cont και shRNA-

piwil1

κύτταρα και τα δεδομένα RT-PCR δείχνουν προς τα κάτω ρύθμιση και των δύο

piwil1

και

β-κατενίνης

επίπεδα mRNA το οποίο είναι σύμφωνο με την ανάλυση κηλίδος Western. πειράματα RT-PCR διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 ανεξάρτητες φορές.

Η

Η ενδοκυτταρική IGFBP-5 φαίνεται να ρυθμίζουν τη λειτουργία RASSF1C στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Πρόσφατες εργασίες δείχνουν ότι PIWIL1 υπερ-έκφραση προς τα κάτω -regulates έναν αριθμό ογκοκατασταλτικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των IGFBP-5, σε ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα [18]. Προηγούμενη εργασία στο εργαστήριο μας απέδειξε ότι RASSF1C προσδένεται σε IGFBP-5 και μπορεί να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων οστεοσαρκώματος και την απόπτωση [20]. Έτσι, θελήσαμε να ερευνήσουμε την επίδραση του 5 IGFBP-αλληλεπίδραση RASSF1C /στη γονιδιακή έκφραση PIWIL1 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι συν-έκφραση RASSF1C και IGFBP-5 ελαττωμένη PIWIL1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, ενώ συν-έκφραση RASSF1A-RASSF1C δεν είχε σημαντική επίδραση στα επίπεδα PIWIL1 mRNA σύγκριση με τα κύτταρα που υπερεκφράζουν RASSF1C (Σχήμα 7). επίπεδα πρωτεΐνης PIWIL1 μειώθηκαν επίσης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα συν-εκφράζουν RASSF1C-IGFBP-5 σε σύγκριση με κύτταρα που υπερεκφράζουν RASSF1C (Σχήμα 8). Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα συν-εκφράζουν RASSF1C και IGFBP-5, αλλά όχι κύτταρα που συν-εκφράζουν RASSF1A και RASSF1C, ήταν ως ευαισθητοποιημένα στην αναστολή BA όπως τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 9). Θα πρέπει όχι ότι RASSF1A υπερ-έκφραση μόνο του δεν ενίσχυσε τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του ΒΑ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ενδοκυτταρική IGFBP-5, αλλά όχι RASSF1A, επιδρά αρνητικά τις λειτουργίες RASSF1C. Η σύνδεση RASSF1C /IGFBP-5 αλληλεπίδραση με την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης PIWIL1 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είναι ένα νέο εύρημα που απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Piwil1

έκφραση του mRNA εκτιμήθηκε σε Η1299 κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με MLV -HA-back των οστών (ΒΒ), MLV-HA-RASSF1C (1C), MLV-HA-RASSF1A και 1C (1Α-1C) και MLV-HA-1C και IGFBP-5 (1C-BP5). δείχνουν δεδομένα RT-PCR που

piwil1

έκφραση mRNA σε κύτταρα που συνεκφράζουν 1C και BP5 μειώθηκε σε σύγκριση με κύτταρα που υπερεκφράζουν 1C και 1Α and1C. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM. * Ρ & lt? 0.05: για 1C σύγκριση με ΒΒ

Η

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των ΝΟΙ-Η1299 και Α549 κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με MLV-σκελετό (ΒΒ), MLV-HA-RASSF1C (1C. ), MLV-HA-IGFBP-5 (BP5), και συν-μεταγωγή με τόσο MLV-HA-RASSF1C και -IGFBP-5 (1C-BP5) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μg /ml δοξυκυκλίνης για 48 ώρες. Το αντίσωμα ετικέτα αντι-ΗΑ ανιχνεύεται ένα ΗΑ-RASSF1C και ΗΑ-IGFBP-5 πρωτεΐνη σύντηξης σε κύτταρα που υπερ-εκφράζεται σε κάθε μόνο και εκείνων που τους δύο συν-εκφράζεται. Η πρωτεΐνη σύντηξης οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας σημασμένα με φθορισμό δευτερεύοντα αντισώματα. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των Α549 και Η1299 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα σταθερώς μεταγωγή με MLV-σκελετό (Α549-ΒΒ και Η1299-ΒΒ), MLV-HA-RASSF1C (A549-1C και H1299-1C), MLV-HA-IGFBP- 5 (Α549-BP5 και Η1299-BP5), και MLV-HA-RASSF1C /MLV-HA-IGFBP-5 A549-1C-BP5 και H1299-1C-BP5). Το αντίσωμα αντι-PIWIL1 χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την κηλίδα Western. PIWIL1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε Α549 και ΝΟΙ-Η1299 κύτταρα που υπερεκφράζουν RASSF1C, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν IGFBP-5 ή συν-εκφράζουν τόσο IGFBP-5 και RASSF1C. (C) δείχνει κανονικοποιημένα επίπεδα πρωτεΐνης PIWIL1 με ακτίνη (έλεγχος φόρτωσης) με τυπικές αποκλίσεις, τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα κηλίδες.

Η

. Η1299-ΒΒ, H1299-1C, H1299-1A-1C, και H1299-1C-BP5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με betulinic οξύ (ΒΑ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για κυτταρική βιωσιμότητα /πολλαπλασιασμό. Κύτταρα που συνεκφράζουν RASSF1C-IGFBP-5 ήταν πιο ευαίσθητα στην ΒΑ σύγκριση με τα κύτταρα που υπερεκφράζουν RASSF1C ή συν-εκφράζουν RASSF1A-RASSF1C. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM. * P & lt? 0.05: για 1C σε σύγκριση με BB

Η

Αναστολή των ATM-AMPK οδού επάγει την έκφραση του γονιδίου RASSF1C

Αυτή τη στιγμή τίποτα δεν είναι γνωστό για τις ανάντη καταρράκτες σηματοδότησης που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής RASSF1C. έκφραση. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε ένα μεταγραφικό μελέτη συστοιχία PCR για τον εντοπισμό χημικών αναστολέων και συνδέονται μονοπάτι σηματοδότησης (ες) που ρυθμίζουν την έκφραση RASSF1C. Η συστοιχία PCR αποτελούνταν από cDNA από το καρκίνο του μαστού MCF7 κυτταρική γραμμή κατεργάζεται με 90 διαφορετικές χημικές αναστολείς που ρυθμίζουν διάφορες οδούς σηματοδότησης. Η συστοιχία σαρώθηκε με ειδικό γονίδιο RASSF1C εκκινητές και διάφορες χημικές αναστολείς που φαίνεται να ρυθμίζουν και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση RASSF1C από ≥ 1,5 φορές ταυτοποιήθηκαν. Οι πιο αξιοσημείωτες αντιδραστήρια είναι Dorsopmorphin (αναστολέας ΑΜΡΚ) και KU60019 (αναστολέας ΑΤΜ), τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση RASSF1C κατά 2,8 και 2,4 φορές αντίστοιχα? και Τριχοστατίνη Α (αναστολέας HDAC και ΑΜΡΚ ενεργοποιητή) ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση RASSF1C κατά 2 φορές (Πίνακας 1). Εμείς στη συνέχεια επιβεβαιώνεται η επίδραση της Dorsomorphin και τριχοστατίνη στην έκφραση RASSF1C σε Η1299 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 10). Αυτά τα ευρήματα είναι νέα και δείχνουν ότι η οδός ΑΤΜ-ΑΜΡΚ μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση RASSF1C /λειτουργία σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Η1299 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dorsomorphin και Τριχοστατίνη Α σε συγκέντρωση 10 μΜ για την επικύρωση της PCR δεδομένων πίνακα. RT-PCR ανάλυση δείχνει ότι Dorsomorphin σημαντικά επάνω ρυθμισμένη έκφραση γονιδίου RASSF1C ενώ ελαφρώς up-ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου PIWIL1. Τριχοστατίνη Α θεραπείας σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται RASSF1C και τα επίπεδα PIWIL1 mRNA. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων RT-PCR γίνεται εις τριπλούν, * = P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

RASSF1 φαίνεται να είναι ένα γονίδιο με διπλή λειτουργικότητα, τόσο ως πρωτεΐνη καταστολέας όγκου (RASSF1A ισομορφή), και ως ογκοπρωτεϊνης (RASSF1C ισομορφή) [11] – [16]. Σε αυτό το άρθρο, αναφέρουμε ότι η υπερ-έκφραση του RASSF1C όχι μόνο ενισχύει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του πνεύμονα, αλλά επίσης προάγει την κυτταρική μετανάστευση. Αυτό είναι συνεπές με προηγούμενα ευρήματα μας σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [13]. Επιπλέον, RASSF1C υπερέκφραση μειώνει επίσης τις επιδράσεις του παράγοντα κατά του καρκίνου, betulinic οξύ, το οποίο είναι γνωστό ότι μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου πνεύμονος [22]. Αυτό υποστηρίζει την περαιτέρω προώθηση και την απόπτωση ελαφρυντικές ενέργειες της RASSF1C την ανάπτυξη.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι RASSF1C ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση PIWIL1, μια βλαστικών κυττάρων γονίδιο αυτο-ανανέωση. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι RASSF1C μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα και την εξέλιξη. Σε συμφωνία με αυτό, βρήκαμε ότι CD133

+ καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (τα οποία επιδεικνύουν κυτταρο-σαν χαρακτηριστικά καρκινικά βλαστικά [24], [25] που υπερεκφράζουν RASSF1C φαίνεται να σχηματίσουν μεγαλύτερα και πιο πολλές σφαίρες όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο της CD133

+ κύτταρα. PIWIL1 είναι αυξημένη σε πολλούς ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, και έχει προταθεί ότι PIWIL1 μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση [17], [18], [26]. Πρόσφατα, SH-RNA

piwil1

γονίδιο knock-down στον καρκίνο του πνεύμονα βλαστοκύτταρα (SSCloAldebr) έχει αποδειχθεί ότι μειώνει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνούς ποντικούς, περαιτέρω εμπλέκοντας το ρόλο της πρωτεΐνης PIWIL1 στη διατήρηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [28].

BA έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι μειώνει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών και ρυθμίζουν προς τα κάτω

piwil1

έκφραση mRNA σε γαστρικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος [22], [26]. Έχουμε αξιολογήσει τις επιδράσεις της ΒΑ στο

piwil1

γονίδιο έκφραση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα χρησιμοποιώντας RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Ενώ θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με ΒΑ ως αποτέλεσμα τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικόνα 4) και σε ρύθμιση προς τα κάτω του

piwil1

mRNA το οποίο είναι σύμφωνο με τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία. Η

piwil1

γονίδιο υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, και knock-down του

piwil1

μειώνεται (και υπερέκφραση του

piwil1

γονιδίου αυξάνει) την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

[18], [19], [28]. Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και την εξέλιξη. Εμείς γκρέμισε

piwil1

γονιδιακής έκφρασης σε περαιτέρω μάθετε για τις λειτουργίες του σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι

piwil1

γονίδιο knock-down οδήγησε σε μείωση σε επίπεδα ενδογενούς πρωτεΐνης β-κατενίνης. Έχουμε δείξει ότι RASSF1C up-ρυθμίζει την έκφραση PIWIL1 [12], και άλλοι έχουν δείξει ότι RASSF1C ενισχύει την συσσώρευση των επιπέδων της πρωτεΐνης β-κατενίνης σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα [15]. Τα ευρήματά μας δείχνουν μια πιθανή σύνδεση μεταξύ RASSF1C και PIWIL1 και την κανονική μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, ένα μονοπάτι που παίζει καθοριστικό ρόλο όχι μόνο τη διατήρηση βλαστικών κυττάρων σε ένα αυτο-ανανέωση και την αδιαφοροποίητη κατάσταση, αλλά και στην προώθηση ογκογένεση [19], [ ,,,0],28].

PIWIL1 έχει πρόσφατα δειχθεί ότι αναστέλλει τη διαφοροποίηση των προδρόμων σαρκώματος

in vitro

και να επάγουν σαρκώματα

in vivo

(19). PIWIL1 επάγει sarcomagenesis μέσω μειορύθμιση καταστολείς όγκων και αναστολείς κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη μέσω υπερμεθυλίωση [19]. Ένας από τους καταστολείς όγκων κάτω ρυθμίζονται από PIWIL1 είναι IGFBP-5, το οποίο έχουμε δείξει προηγουμένως ότι είναι ένας που αλληλεπιδρά εταίρος της RASSF1C [19]. Συνεπώς, θέλαμε να μελετήσουμε την επίδραση της 5-IGFBP αλληλεπίδραση RASSF1C /στη γονιδιακή έκφραση PIWIL1 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Περιέργως, η συν-έκφραση της RASSF1C και IGFBP-5 σημαντικά αναίρεσης RASSF1C πάνω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης PIWIL1 και επίσης ενίσχυσε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της ΒΑ σε σύγκριση με κύτταρα που είτε εκφράζουν RASSF1C ή συν-εκφράζουν RASSF1A και RASSF1C (Σχήμα 9). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η IGFBP-5 μπορεί να δεσμεύεται και διαχωρίζουν RASSF1C, εμποδίζοντας έτσι τα πάνω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης PIWIL1 με RASSF1C. Αυτή η σύνδεση της IGFBP-5 /RASSF1C αλληλεπίδραση με ρύθμιση της έκφρασης PIWIL1 είναι ένα νέο εύρημα και αξίζει περαιτέρω μελέτη και επικύρωση.

Αυτή τη στιγμή τίποτα δεν είναι γνωστό για το πώς ρυθμίζεται η έκφραση του γονιδίου RASSF1C, και ως εκ τούτου πραγματοποιήσαμε ένα μεταγραφικό PCR οθόνη του πίνακα και προσδιόρισε διάφορες χημικές αναστολείς που φαίνεται να διαμορφώνουν την έκφραση του γονιδίου RASSF1C. Μεταξύ αυτών των χημικών αναστολέων, βρήκαμε ότι ο χημικός αναστολέας Dorsomorphin (επίσης γνωστό ως ένωση C) και KU60019 πλειορύθμιση RASSF1C & gt? 2 φορές ενώ η χημική Τριχοστατίνη Α ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου RASSF1C κατά 2 φορές σε κύτταρα του μαστού και τον καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας 1). Dorsomorphin έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τις επιδράσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) για τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσα από την αδρανοποίηση των ATM-AMPK-p21

WAF /CIP μονοπατιού [29].