Αφηρημένο

Οι σημερινοί περιορισμοί της χημειοθεραπείας περιλαμβάνουν τοξικότητας σε υγιείς ιστούς και την αντίσταση σε πολλά φάρμακα των κακοηθών κυττάρων. Μια σειρά από πρόσφατες στρατηγικές κατά του καρκίνου στοχεύουν στη στόχευση του μιτοχονδριακού μηχανήματα αποπτωτικό να προκαλέσει θάνατο καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δημιουργήσει πρωτόκολλα για τον καθαρισμό λειτουργικά μιτοχόνδρια από διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές για να αναλύσει την επίδραση των πεπτιδικών και ξενοβιοτικών ενώσεων που περιγράφονται στο λιμάνι είτε Bcl-2 ιδιότητες αναστολής ή τοξικές επιδράσεις που σχετίζονται με μιτοχόνδρια. Μιτοχονδριακή εσωτερικό και εξωτερικό διαπερατοποίηση μεμβράνης συστηματικά διερευνήθηκε σε καρκινικό κύτταρο μιτοχόνδρια

έναντι

μη καρκινικά μιτοχόνδρια. Η κολοβωμένη (Τ-) πρωτεΐνη Bid, συνθετικά πεπτίδια από ΒΗ3 Bim και Bak, και το μικρό μόριο ΑΒΤ-737 προκάλεσε μια ογκο-ειδική και ΟΜΡ-περιορισμένα μιτοχόνδριο-τοξικότητα, ενώ ενώσεις όπως ΗΑ-14.1, YC-137, χηλερυθρίνη, κατακάθι, TW-37 ή EM20-25 δεν το έκανε. Βρήκαμε ότι ΑΒΤ-737 μπορεί να επάγει την Bax-εξαρτώμενη απελευθέρωση των αποπτωτικών πρωτεϊνών (κυτόχρωμα c, Smac /Diablo και Omi /HtrA2 αλλά όχι ΟΕΕ), από διάφορα, αλλά όχι όλα τα μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, ΑΒΤ-737 εκτός από απομονωμένα μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από ολιγομερισμό του Βαχ και /ή Bak μονομερή ήδη τοποθετημένη στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Τέλος immunoprecipatations έδειξε ότι ΑΒΤ-737 επάγει Bax, Bak και ΒΙΜ desequestration από Bcl-2 και Bcl-xL, αλλά όχι από Mcl-1L. Αυτή η μελέτη ερευνά για πρώτη φορά ο μηχανισμός δράσης της ΑΒΤ-737 ως μονοθεραπεία σε απομονωμένα μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ΜΟΜΡ (μιτοχονδριακή διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης) είναι ένα ενδιαφέρον εργαλείο ελέγχου, προσαρμοσμένα για τον εντοπισμό Bcl-2 ανταγωνιστές με επιλεκτική τοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια, αλλά στερείται τοξικότητας κατά υγιή μιτοχόνδρια

Αιτιολογική αναφορά.: Buron Ν, Porceddu Μ, Brabant Μ, Desgué D, Racoeur C, Λασάλ M, et al. (2010) Η χρήση των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών μιτοχόνδρια για να διερευνήσει τους μηχανισμούς της ΒΗ3 πεπτίδια και ΑΒΤ-737-Induced μιτοχονδριακή μεμβράνη διαπερατότητα. PLoS ONE 5 (3): e9924. doi: 10.1371 /journal.pone.0009924

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 15 Ιανουαρίου 2010? Δεκτές: 1, Μαρτίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 31 Μάρτη 2010

Copyright: © 2010 Buron et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Agence Nationale pour la Αξιοποίηση de la Recherche (https://www.agence-nationale-recherche.fr) να Theraptosis SA (https://www.theraptosis.com), από Theraptosis SA και Mitologics SAS (http: //www.mitologics.com). Η Agence Nationale pour la Αξιοποίηση de la Recherche δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συγγραφείς ABS, NB και βουλευτής δηλώνουν ανταγωνιστικά οικονομικά συμφέροντα λόγω δικαιώματα ιδιοκτησίας σε Mitologics SAS. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η απόπτωση απορρύθμισης έχει αποδειχθεί ότι οφείλεται η αρκετές παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [1], [2 ]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι ποικίλα γεγονότα σηματοδότησης εντός απόπτωση συγκλίνουν σε μιτοχόνδρια τα οποία υφίστανται διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΟΜΡ) προκαλώντας την απελευθέρωση διαλυτών apoptogenic παράγοντες από τον χώρο intermembrane όπως κυτόχρωμα c και επακόλουθη σειρά της ενεργοποίησης ενός συνόλου πρωτεολυτικά ένζυμα, η κασπάσες διεξαγωγή σε αποπτωτικό διάλυση της δομής των κυττάρων [3].

ΜΟΜΡ είναι υπό τον έλεγχο των μελών της οικογένειας Bcl-2 πρωτεΐνη η οποία περιλαμβάνει (1) αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 και Α1 /Bfl-1 που περιέχει και τα τέσσερα Bcl-2 πεδία ομολογίας (BH1-4), (2) προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως Βαχ, Bak, Bok έλλειψη του πεδίου ΒΗ4 και (3) προ- αποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, όπως προσφορά, Bim, Bad, BMF, Noxa και Puma [4] – [8]. Στο μοντέλο άμεσης ενεργοποίησης, επαγωγή Bim ή Bid απαιτείται για Bax ή Bak να ολιγομερισμό και σχηματίζουν πόρους στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (ΜΟΜ) [9], [10]. Οι αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών μπορεί να μπλοκάρει τη διαδικασία αυτή κατά τη ΜΟΜ με πρωτίστως απομόνωσης πρωτεϊνών Bax /Bak [11] – [13]. Στο μοντέλο έμμεσης ενεργοποίησης [14], [15], ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες μπορεί να ανταγωνιστεί αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα και να απελευθερώσουν τις πρωτεΐνες Bax /Bak. Είναι ακόμα ένα θέμα συζήτησης το αν Bax και Bak μπορεί να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες όπως VDAC (τάση εξαρτάται από το κανάλι ανιόντων) και /ή ΑΝΤ (νουκλεοτιδίου αδενίνης) για τη ρύθμιση της μετάβασης διαπερατότητα πόρων (PTP) [16]. Στο μιτοχονδριακό επίπεδο, ο κυτόχρωμα c διανέμεται σε δύο ξεχωριστές πισίνες: 15-20% στο χώρο intermembrane και το μεγαλύτερο κλάσμα (80%) στο χώρο intracristae [17]. Έτσι, ΒΗ3 μιμητικό πεπτίδιο χρειάζεται αναδιαμόρφωση μήτρας για να απελευθερώσει το δεύτερο πισίνα του κυτοχρώματος c [18]. Άλλες αποπτωτικών παραγόντων όπως η Omi /HtrA2 και Smac /DIABLO (κασπάσης-εξαρτώμενη τελεστές θανάτου) ή την απόπτωση-προκαλώντας παράγοντας ΟΕΕ και EndoG (κασπάσης-ανεξάρτητο τελεστές θανάτου) κυκλοφόρησε μετά ΜΟΜΡ.

Το διαπερατότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης ( διεργασία ΜΜΡ) είναι συχνά μεταβάλλεται σε καρκινικά κύτταρα πιθανώς ως αποτέλεσμα του συστατικού υπερέκφρασης PTP [19], προς τα πάνω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 και /ή προς τα κάτω ρύθμιση του Bax [20]. Αυτά υπόκεινται των πολυάριθμες στρατηγικές αντικαρκινική στόχευση συστατικά του πυρήνα μηχανήματα κυτταρικό θάνατο για την προώθηση των καρκινικών κυττάρων θάνατο [21], [22]. Οι στρατηγικές αυτές βασίζονται στη χρήση των πεπτιδίων BH3-μιμούνται [14], [23], αντιπληροφοριακό [24] ή παρεμβολή RNA [25] έναντι Bcl-2, και φυσικά ή συνθετικά μικρά μόρια τα οποία δεσμεύονται ειδικά σε οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών . Για παράδειγμα διαλογή προσεγγίσεις χρησιμοποιώντας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, η δομή που βασίζεται σε σχεδίαση και συνδυαστική χημική σύνθεση, οδήγησε στην ταυτοποίηση του ΑΒΤ-737, ένας αναστολέας μικρού μορίου των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, Bcl-xL και Bcl-w αλλά δεν Mcl-1 και Α1 /Bfl1 [26]. ΑΒΤ-737 θεωρείται ότι είναι ένα Bad-όπως ΒΗ3 μιμητικό διότι τόσο ΑΒΤ-737 και Bad ΒΗ3 πεπτίδιο δεσμεύει το ίδιο υποσύνολο των Bcl-2 πρωτεϊνών προ-επιβίωσης [27] και επάγουν κυτόχρωμα απελευθέρωσης C σε μιτοχόνδρια που λαμβάνονται από το «γεμάτοι για το θάνατο «κύτταρα όγκου [28]. Ωστόσο, η ασθενής συγγένεια των ΑΒΤ-737 για τις πρωτεΐνες προ-επιβίωσης Mcl-1 και Α1 /Bfl1 [26] θα μπορούσε να αποτελέσει βασικό παράγοντα της αντίστασης των καρκινικών κυττάρων σε αυτή την ένωση [29].

Έχουμε θέσει μέχρι μια πολυπαραμετρική οθόνη καθαρίζεται μιτοχόνδρια για την αναγνώριση ενώσεων που επάγουν ΟΜΡ των μιτοχονδρίων που απομονώνονται από κυτταρικές γραμμές καρκίνου, αλλά όχι των μιτοχονδρίων που απομονώνονται από μη καρκινικά κύτταρα. Μεταξύ των διαφόρων ενώσεων (από χημικές, πεπτιδικές ή πρωτεϊνικά προέλευση) που περιγράφονται για τη στόχευση μιτοχόνδρια, διαπιστώσαμε ότι μόνο ανασυνδυασμένου t-Bid, Bak ΒΗ3 και Bim ΒΗ3 πεπτίδια, και ΑΒΤ-737 παρουσιάζουν άμεσο όγκο-ειδικό μιτοχόνδριο-τοξικότητα και επάγουν σχετικά μεγάλη OMP λόγω Bax και Bak ολιγομερισμό. Με την περαιτέρω διερεύνηση της ΑΒΤ-737 που επάγεται OMP στο μιτοχονδριακό επίπεδο ελεύθερο κυττάρων, βρήκαμε ότι (1) καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια από διαφορετικές πηγές διέφεραν ως προς την ευαισθησία τους προς ΑΒΤ-737 που συσχετίζεται με διαφορετικά πρότυπα (εξωτερική) μεμβράνη που σχετίζεται με Bcl τα μέλη της οικογένειας -2 και τις αλληλεπιδράσεις τους, (2) ΑΒΤ-737 επάγει Βαχ, Bak, και ΒΙΜ desequestration από Bcl-xL και Bcl-2, αλλά όχι από Bcl-w ή Mcl-1.

Αποτελέσματα

Απομόνωση και λειτουργικό χαρακτηρισμό των υγιών και καρκινικών μιτοχόνδρια

τα μιτοχόνδρια τόσο από τους υγιείς ιστούς (ήπαρ ποντικού) και ανθρώπινα καρκινικά (PC-3, προστάτη) κυτταρική σειρά καθαρίστηκαν με ισοπυκνική φυγοκέντρισης σε βαθμίδες πυκνότητας Percoll. Τα απομονωμένα μιτοχόνδρια βρέθηκαν υψηλά ανέπαφη όπως καταδεικνύεται με τη δοκιμασία οξειδάσης κυτοχρώματος c προσβασιμότητα και κυτταρομετρία ροής FSC /SSC ανάλυση [30]. Υπερδομική συγκριτικές μελέτες των απομονωμένων μιτοχονδρίων από το ήπαρ ή PC-3 κυτταρική γραμμή όγκου αποκαλύπτουν μια σχετικά παρόμοια οργάνωση μήτρας /ακρολοφίες παρά την ελαφρά διαφορά πυκνότητας μεταξύ του όγκου (χαμηλής πυκνότητας) και ήπαρ (υψηλής πυκνότητας) μιτοχόνδρια (Σχ. 1Α). Ασβέστιο (50 μΜ) προκαλεί μια εκτεταμένη διάρρηξη της εξωτερικής μεμβράνης τόσο σε υγιή ιστό και κυτταρική γραμμή όγκου μιτοχόνδρια που ακολουθείται από ένα πρήξιμο το οποίο αναστέλλεται από κυκλοσπορίνη Α (CsA), υποδεικνύοντας ένα άθικτο και λειτουργικό πόρων μετάβαση διαπερατότητας στα δύο μιτοχονδριακή τύπους. Πολαρογραφικό έρευνες επόμενου διενεργούνται σε ήπαρ και PC-3 μιτοχόνδρια (Σχ. 1Β). οξείδωση Ηλεκτρική εξαρτιόταν ουσιαστικά από προσθήκη ADP και ένα δείκτη αναπνευστικής ελέγχου (RCI) 3 που συνδέεται με την οξείδωση ηλεκτρικού έδειξε την λειτουργική ακεραιότητα των μιτοχονδρίων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που απομονώθηκαν από καλλιεργημένα κύτταρα όγκου. Ομοίως, τα μιτοχόνδρια απομονώνονται από ΗΤ-29, κυτταρικές γραμμές καρκίνου Jurkat HCT-116 και και ΗΜΕ-1 μη-καρκινικές κυτταρική γραμμή παρουσίασε υψηλό επίπεδο ακεραιότητας και της λειτουργικότητας (δεν φαίνεται).

A. Λεπτήν ανάλυση των απομονωμένων μιτοχονδρίων και την ικανότητά τους να διογκώνονται. ηλεκτρονικές μικρογραφίες λήφθηκαν μετά από επώαση των μιτοχονδρίων που απομονώνονται από υγιείς ήπατος ποντικού, ή PC-3 κυτταρικές γραμμές όγκου χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή υπέστησαν αγωγή με Ca

2+ (50 μΜ) ή με ένα 5 min-προεπώαση με κυκλοσπορίνη Α (CsA ? 10 μΜ) ή κόκκινο ρουθηνίου (RR? 1 μΜ) πριν από την προσθήκη του ασβεστίου. Το ποσοστό των διογκωμένων μιτοχονδρίων ήταν & lt? 10% στον έλεγχο και & gt? 80% 30 λεπτά μετά Ca

2+ προσθήκης (n = 3). μπαρ κλίμακα 1 μm. B. Η οξειδωτική ιδιότητες του απομονωμένου ήπατος και PC-3 μιτοχόνδρια. Ίχνη αναπαριστούν την κατανάλωση οξυγόνου από απομονωμένα μιτοχόνδρια (100 μg) μετά την προσθήκη των υποδεικνυόμενων αντιδραστηρίων. Αριθμούς κατά μήκος του ίχνους είναι ητηοΐ O

2 καταναλώνονται ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης. Ο δείκτης του αναπνευστικού ελέγχου (RCI) υπολογίζεται για κάθε τύπο των μιτοχονδρίων, όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι. C. Για να αξιολογηθεί μιτοχονδριακή διόγκωση και ΔΨ

απώλεια m, μιτοχόνδρια απομονώθηκαν από υγιείς ποντικούς ήπαρ ή PC-3 κυτταρική γραμμή διανεμήθηκαν σε μικροπλάκες 96 αυλάκων και επωάστηκαν για 30 λεπτά είτε με Ca

2+ (100 μΜ) στην παρουσία (κίτρινο) ή απουσία (ροζ) της CsA (10 μΜ), με το

m

ClCCP (τυρκουάζ? 50 μΜ) ή με τ-Bid (μοβ? 1 nM). Για ποσοτικοποίηση της αποδέσμευσης κυτοχρώματος c, απομονωμένα μιτοχόνδρια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του t-προσφοράς ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη και μιτοχονδριακό υπερκείμενο υποβλήθηκε σε δοκιμασίες ELISA, που δίνονται σε ποσοστό απελευθέρωσης σε σύγκριση με 20 μg /ml αλαμεθικίνη (Ala? 100% του κυτοχρώματος c απελευθέρωση) (n = 3 ανεξάρτητα πειράματα).

η

μέθοδο πολλαπλών παραμέτρων ελέγχου σε απομονωμένες υγιή και καρκινικά μιτοχόνδρια

απομονωμένα μιτοχόνδρια αναλύθηκαν σε μια πλατφόρμα ελέγχου η οποία επέτρεψε την ποσοτικοποίηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης διαπερατότητας (πρήξιμο? Εικ. 1C? αριστερό πάνελ) συν μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό (ΔΨm? Εικ. 1C, μεσαίο πάνελ) με τη χρήση πραγματικού χρόνου φασματοφθορισμομετρία και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c με ELISA ως δείκτης για ΜΟΜΡ (Εικ 1C?. δεξί πάνελ). Σε πραγματικό χρόνο ανίχνευση ΔΨm αντανακλάται εσωτερική μεμβράνη και αναπνευστικής αλυσίδας μεταβολές αλλά δεν επιτρέπει να παρατηρήσουμε καθυστερημένη ΔΨm σε απόκριση προς προ-αποπτωτική ενώσεις. Όταν επωάζονται σε υποτονικό ρυθμιστικά διαλύματα, τόσο σε φυσιολογικά όσο και καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια έκανε φούσκωμα (απώλεια Ο.Π. στα 550 nm) παρουσία του ασβεστίου σε ένα CSA-εξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, η διόγκωση πλάτος μειώθηκε στην περίπτωση των μιτοχονδρίων όγκου σε συμφωνία με μικρότερη πυκνότητα τους σε σύγκριση με τα μιτοχόνδρια του ήπατος. Ασβέστιο και

m

ClCCP προκάλεσε μια γρήγορη απώλεια ΔΨm χαρακτηρίζεται από ένα αυξημένο φθορισμό που αντιστοιχεί σε Rhodamine-123 dequenching λόγω της μείωσης της συγκέντρωσης της χρωστικής ύλης σε αποπολωμένο μιτοχόνδρια. έτσι Παρατηρήσαμε ότι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη t-Bid είχε καμία επίδραση στην διόγκωση και ΔΨm αλλά επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c ειδικά σε PC-3 (Εικ. 1C), ΗΤ-29, ΗΟΤ-116 και Jurkat (δεν φαίνεται) μιτοχόνδρια των κυττάρων σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, όπως φαίνεται από την ανάλυση ELISA των υπερκειμένων.

Διαλογή υποθετικών αναστολέων οικογένειας Bcl-2

Αξιολογήσαμε επόμενο η επίδραση των αναστολέων Bcl-2 επί μιτοχόνδρια απομονώθηκαν από ήπαρ ποντικού, ανθρώπινο μη-καρκινικές (ΗΜΕ-1) και καρκινικά κύτταρα (PC-3) με τη χρήση 3 παραμέτρους: οίδημα, ΔΨm και κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωσης (σχήμα 2Α).. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που προκαλείται απελευθέρωση κυτοχρώματος c t-Bid (χωρίς πρήξιμο και απώλεια ΔΨm) από PC-3 μιτοχόνδρια αλλά δεν είχε καμία επίδραση στο ήπαρ και ΗΜΕ-1 μιτοχόνδρια στα 100 ηΜ. Μερικά πεπτίδια ΒΗ3 (που προέρχεται από Bak, Bim, Bax, Bad, Bid, Noxa και Puma) από τον άνθρωπο ή ποντίκι πηγές ελέγχθηκαν επίσης. Μεταξύ αυτών, μόνο την ανθρώπινη Bak ΒΗ3 και Bim ΒΗ3 (Εικ. 2Α) που προκαλείται μιτοχόνδριο-τοξικότητα σε καρκινικών κυττάρων (PC-3) μιτοχόνδρια, ενώ είναι ανενεργός στα 100 μΜ σε ήπαρ και HME-1 μιτοχόνδρια. Αξιοσημείωτα, ακόμη και το αντίστοιχο ποντίκι ΒΗ3 αλληλουχίες είναι αδρανείς επί ήπατος ποντικού μιτοχόνδρια, αποκλείοντας μια παρερμηνεία λόγω ειδικότητα είδους (δεν φαίνεται). Σε αντίθεση με άλλους αναστολείς μικρού μορίου αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη, μόνο ΑΒΤ-737 που εμφανίζεται ειδικότητα μιτοχόνδρια του όγκου, επαγωγή του κυτοχρώματος c απελευθέρωση από PC-3 μιτοχόνδρια αλλά όχι από το ήπαρ και ΗΜΕ-1 μιτοχόνδρια. Η απελευθέρωση κυτοχρώματος c από PC-3 μιτοχονδρίων σε επεξεργασία με t-Bid και ΑΒΤ-737 έλαβε χώρα χωρίς οποιαδήποτε διόγκωση (Σχ. 2Α και ηλεκτρονικές μικροσκοπίας, δεν φαίνεται) ή απώλεια ΔΨm (σχ. 2Α) κατά τη διάρκεια μιας min-θεραπεία 45, υποδεικνύοντας ότι αυτές τις συνθήκες εμφανίζεται μια συγκεκριμένη OMP. Στη συνέχεια επέκτεινε την μελέτη της ΑΒΤ-737 εφέ σε μιτοχόνδρια απομονώνονται από το HCT-116, ΗΤ-29 και κυτταρικές γραμμές καρκίνου Jurkat (Σχ. 2Β) και παρατηρήθηκε διαφορετική ευαισθησία στο ΑΒΤ-737. Πράγματι, ΗΤ-29 μιτοχόνδρια ήταν πολύ λιγότερο ευαίσθητα στην ΑΒΤ-737 από PC-3, HCT-116 και Jurkat, τα τρία αυτά μεταγενέστερους παρουσιάζει παρόμοιο επίπεδο ευαισθησίας σε ΑΒΤ-737. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΑΒΤ-737 επάγει το κυτόχρωμα απελευθέρωση γ από διάφορα, αλλά δεν είναι όλα τα μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από τα καρκινικά κύτταρα.

Α. Μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από ήπαρ ποντικού, μη καρκινικά ανθρώπινα κύτταρα (ΗΜΕ-1) και καρκινικών (PC-3) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του t-Bid, Bak ΒΗ3, ΗΑ-14.1, YC-137, χηλερυθρίνη, γκοσσυπόλης, TW- 37, EM20-25 και ΑΒΤ-737 πριν από την αξιολόγηση της μιτοχονδριακής διόγκωσης και ΔΨ

απώλεια m. Εναλλακτικά, μιτοχονδριακό υπερκείμενο υποβλήθηκε σε δοκιμασίες ELISA για την ποσοτικοποίηση της αποδέσμευσης κυτοχρώματος c. Αποτελεσματική συγκέντρωση που επάγει το 50% της μέγιστης επίδρασης (ΕΚ

50) δίνεται για το πρήξιμο (100% του αποτελέσματος με 50 μΜ Ca

2+), ΔΨ

απώλεια m (100% του αποτελέσματος με 50 μΜ

m

ClCCP) και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c (100% του αποτελέσματος με 20 μg /ml αλαμεθισίνη) (n = 3 ανεξάρτητα πειράματα). B. Μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από ήπαρ ποντικού ή ΗΜΕ-1, PC-3, HCT-116, ΗΤ-29 και κυτταρικές γραμμές Jurkat επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 30 ° C με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737 και τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε κυτόχρωμα γ ανοσοστύπωμα (ΝΤ: μη επεξεργασμένο? Ala: αλαμεθισίνη 20 μg /ml).

η

ΑΒΤ-737 που προκαλείται από ΜΟΜΡ σε καρκινικές κυτταρικές μιτοχόνδρια σχετίζεται με Bak και /ή Bak ολιγομερισμό

εμείς στη συνέχεια διερευνάται αν ΑΒΤ-737 που προκαλείται από OMP ήταν επιλεκτική, με το κυτόχρωμα c ή θα μπορούσε να επιτρέψει την απελευθέρωση άλλων apoptogenic μιτοχονδριακών παραγόντων (Εικ. 3). Απομονωμένα ήπατος ποντικού, PC-3 και Jurkat μιτοχόνδρια υποβλήθηκαν σε αγωγή με Bak ΒΗ3, ΑΒΤ-737 ή t-Bid και τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση. Smac /DIABLO (23 kDa) και Omi /HtrA2 (37 kDa) απελευθερώθηκαν από το PC-3 και Jurkat μιτοχόνδρια ενώ ΟΕΕ (56 kDa) δεν ήταν (Εικ. 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι ενώσεις επάγουν μία μιτοχόνδρια αναδιαμόρφωση δεν επαρκεί για ΟΕΕ ελευθέρωση. Χρησιμοποιήσαμε την επόμενη απομονωμένα μιτοχόνδρια από το knock-out κυτταρικές σειρές HCT-116 στο οποίο ελλείψει Bax και /ή Bak ελέγχθηκε με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 4Α) Bax ή /και Bak. Βρήκαμε ότι ΑΒΤ-737 επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c από Bax +/- και Bak – /- μιτοχονδρίων αλλά όχι από Ββχ – /- ή Βαχ /Bak διπλό knock-out μιτοχόνδρια (Εικόνα 4Β).. Αυτά τα δεδομένα επεσήμανε τον κρίσιμο ρόλο του Bax στο μηχανισμό δράσης της ΑΒΤ-737. Επιπλέον, το t-Bid και ΑΒΤ-737 που προκαλείται από ΜΟΜΡ ελέγχθηκε με μια περίσσεια των Bcl-xL (Εικ. 4C) ή Bcl-2 (δεν φαίνεται) ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, υποστηρίζοντας την υπόθεση ενός σχηματισμού ενός συγκεκριμένου καναλιού στο εξωτερικό μεμβράνη [31]

Απομονωμένα μιτοχόνδρια από ήπαρ ποντικού, κύτταρα Jurkat PC-3 και ήταν χωρίς θεραπεία (ΝΤ) ή επωάστηκαν είτε με αλαμεθικίνη (Ala? 20 μg /ml? θετικός έλεγχος)., το πεπτίδιο Bak ΒΗ3 (10 μΜ), ΑΒΤ-737 (1 μΜ) ή ανασυνδυασμένο t-Bid (1 ηΜ) για 45 λεπτά. Μιτοχονδριακή υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε ανοσοανίχνευση του κυτοχρώματος c, Smac /DIABLO, Omi /Htra2 και AIF (Western blots είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων). Σημειώστε ότι το κυτόχρωμα c (15 kDa), Smac /DIABLO (23 kDa), και Omi /Htra2 (37 kDa), αλλά όχι ΟΕΕ (56 kDa) απελευθερώνονται από τον καρκίνο του μιτοχόνδρια των κυττάρων.

Η

Α. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα από HCT-116 Bax +/-, Βαχ – /-, Bak – /- και Βαχ /Bak – /- (ϋΚΟ) κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε Βαχ και Bak ανοσοκηλίδος για τον έλεγχο Βαχ και Bak περιεχόμενό τους. B. Μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από HCT-116 Bax +/-, Βαχ – /-, Bak – /- και Βαχ /Bak – /- (ϋΚΟ) κυτταρικές σειρές επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737 και το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε ανοσοκηλίδος ανίχνευση του κυτοχρώματος c (ΝΤ: μη επεξεργασμένο? Ala: αλαμεθισίνη 20 μg /ml). C. Το κυτόχρωμα c απελευθέρωση που προκαλείται από Τ-Bid και ΑΒΤ-737 αναστέλλεται από μια περίσσεια ανασυνδυασμένης Bcl-XL. PC-3 μιτοχόνδρια επωάστηκαν με ΑΒΤ-737 (1 μΜ) ή τ-Bid (1 ηΜ) για 45 λεπτά μετά από μια 5 min-προκατεργασία με ανασυνδυασμένη Bcl-xL (100 έως 400 nm) και το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε αντι κυτόχρωμα c ανοσοστύπωμα (ΝΤ: μη επεξεργασμένο? Ala: αλαμεθισίνη 20 μg /ml). Σημειώστε ότι Bcl-xL μειώνει έντονα τόσο η T-Bid και ΑΒΤ-737-επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c (n = 2 ανεξάρτητα πειράματα).

Η

Αφού διαπίστωσε ότι Bax παρέμειναν δεσμευμένες στο μιτοχονδριακό OM ακόμη και μετά από ένα πλύνετε με αλκαλικό ρυθμιστικό ομογενοποίησης (ρΗ 11,6) (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας μια εισαγωγή του Βαχ εντός της μεμβράνης [32], μπορούμε περαιτέρω θέλαμε να εξετάσουμε εάν ΑΒΤ-737 θα μπορούσε να προκαλέσει ολιγομερισμό των πισίνες Βαχ και Bak ήδη συσχετιστεί στα μιτοχόνδρια των κυττάρων του όγκου . Παρόμοια με t-Bid και ΒΙΜ ή Bak ΒΗ3 πεπτίδια, ΑΒΤ-737, που προκαλείται από Bax ή /και Bak ολιγομερισμού σε PC-3 και τα μιτοχόνδρια Jurkat, όπως objectived χρησιμοποιώντας τον παράγοντα εγκάρσιας σύνδεσης 1,6-δισμαλεϊμιδοεξάνιο (ΒΜΗ? Σχ. 5 ). Μεταλλαγμένα [L78A? D83A] Bak ΒΗ3 πεπτιδίου ήταν αναποτελεσματική για την πρόκληση του κυτοχρώματος απελευθέρωση c και Bax /Bak ολιγομερισμού όταν προστίθεται σε PC-3 μιτοχόνδρια (Σχ. 5Α). Σε PC-3 μιτοχόνδρια τα οποία περιέχουν και Bax και Bak, μια αδύναμη Bak ολιγομερισμού συνέβη με ΒΗ3 πεπτίδια ή ΑΒΤ-737 υποδηλώνει ένα σημαντικό ρόλο για την Bax στην ενεργοποίηση σχηματισμό κανάλια σε αυτήν την κυτταρική σειρά (Εικόνα 5Α?. Μεσαίο πάνελ). Εμείς επόμενο χρησιμοποιείται (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-υλο) -3-πιπεραζιν-1-υλ-προπαν-2-όλης που προσδιορίζονται από Ο Bombrun και συνεργάτες [33] ως αναστολέας Βαχ καναλιού ( BCB) ικανή να αναστείλει t-Bid προκαλούμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c [33], [34] (εικ. 5Α). Προεπεξεργασία των καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια με την παρούσα BCB εμπόδισε την απελευθέρωση κυτοχρώματος πυροδοτείται από Bak ΒΗ3, Bim ΒΗ3, t-Bid ή θεραπεία ΑΒΤ-737 (Εικ. 5Α). Επιπλέον, βρήκαμε ότι BCB εμπόδισε Ββχ /Bak ολιγομερισμού σε απόκριση σε αγωγές με ΑΒΤ-737, καθώς και τ-Bid και Bak ή Bim ΒΗ3 πεπτίδια (Εικ. 5Α και 5Β).

Μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από PC-3 (Α) και Jurkat (Β) κυτταρικές γραμμές επωάστηκαν ή όχι με την BCB, ένα Βαχ Κανάλι Blocker (2 μΜ (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-υλο) -3-πιπεραζιν 1-υλ-προπαν-2-όλη) πριν από τη θεραπεία με 1 μΜ Bim ΒΗ3, 10 μΜ Bak ΒΗ3, 10 μΜ μεταλλαγμένο Bak ΒΗ3, 1 ηΜ t-Bid ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του ΑΒΤ-737. Τα υπερκείμενα αναλύθηκαν για απελευθέρωση κυτοχρώματος c (κάτω πάνελ? ΝΤ: μη επεξεργασμένο? Ala: αλαμεθισίνη 20 μg /ml) και μιτοχονδριακή σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το μη αναστρέψιμο μέσο διασύνδεσης ΒΜΗ (1 mM). Σαράντα μικρογραμμάρια πρωτείνης από κάθε αντίδραση τρέχει σε SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-Βαχ (Α) ή αντι-Bak (Α, Β) αντισώματα. Βαχ /Bak ολιγομερισμό συνοδεύει ΑΒΤ-737-επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c η οποία αναστέλλεται από BCB.

Η

Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΑΒΤ-737 προκάλεσε την απελευθέρωση των πρωτεϊνών από apoptogenic καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια με σχηματισμό πολυμερικές κανάλια Βαχ /Bak όπως φαίνεται με συσχέτιση μεταξύ Βαχ και Bak ολιγομερισμό και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c (Εικ. 5).

ΑΒΤ-737 που προκαλείται από ΜΟΜΡ σε καρκινικές κυτταρικές μιτοχόνδρια σχετίζεται με συγκεκριμένο σύμπλεγμα διαταραχών, ανάλογα με το μιτοχονδριακή τύπος

Όπως παρατηρήθηκαν διαφορές στην ευαισθησία μεταξύ των διαφόρων μιτοχονδριακής-τύποι που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την προ- και αντι-αποπτωτικά μέλη οικογένειας Bcl-2 που συνδέονται με τις μιτοχονδριακές μεμβράνες (Εικ. 6). Μεταξύ των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Bcl-2 ήταν παρούσα μόνο σε PC-3, Jurkat και HCT-116 μιτοχόνδρια, ενώ Bcl-w, Bcl-xL και Α1 ανιχνεύθηκαν σε όλους τους τύπους των μιτοχονδρίων (Σχ. 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, Bcl-xL ήταν ποσοτικά σημαντικότερο σε καρκινικές κυτταρικές μιτοχόνδρια από ό, τι σε υγιείς ομόλογό τους. Αντι-αποπτωτικά Mcl-1L ήταν παρούσα σε μεγάλες ποσότητες σε PC-3 και τα μιτοχόνδρια Jurkat και σε μικρότερη ποσότητα σε ΗΤ-29 μιτοχόνδρια. Όσον αφορά τις προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, ενώ Bak ήταν παρούσα σε όλα τα είδη των μιτοχονδρίων, Bax ήταν παρούσα σε PC-3, ΗΤ-29, ΗΟΤ-116 και ΗΜΕ-1 μιτοχόνδρια αλλά όχι σε Jurkat και τα μιτοχόνδρια του ήπατος. Μεταξύ των ΒΗ3-μόνο ενεργοποιητές, Bim βρέθηκε σε καρκινικές κυτταρικές μιτοχόνδρια αλλά όχι σε εκείνες από ΗΜΕ-1 και του ήπατος (Εικ. 6Β), ενώ προσφοράς δεν μπορεί να ανιχνευθεί σε οποιοδήποτε από αυτά τα είδη μιτοχονδριακής (δεν φαίνεται). Μεταξύ των ΒΗ3 μόνο ευαισθητοποιητές, Bad ανιχνεύθηκε στο PC-3, ΗΤ-29 και Jurkat μιτοχονδριακές μεμβράνες (Εικ. 6Β), ενώ Puma, Noxa, HRK, Bik, Bok και BMF δεν ήταν (δεν φαίνεται). Bcl-2, Bcl-xL και ΒΗ3 μόνο ευαισθητοποιητές (πρώην Bim) θα μπορούσε κάλλιστα να είναι βασικοί παράγοντες, ακόμη και αν αυτό είναι δύσκολο από τέτοιες πρωτεομική ανάλυση για να εξηγήσει τις διαφορές στην ευαισθησία στην ABT-737. Μάλιστα αξίζει να σημειωθεί ότι η HME-1 μιτοχόνδρια έχουν ούτε Bim, ούτε Bcl-2 και μόνο το χαμηλό επίπεδο των Bcl-XL, που θα μπορούσαν να τους διακρίνουν από τους ευαίσθητους μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων.

Συνολικά εκχυλίσματα κυττάρων (ΤΕ) και μιτοχονδριακή εκχυλίσματα (Μ) από HCT-116 κυτταρικές γραμμές καρκίνου PC-3, ΗΤ-29, Jurkat και ή από υγιείς ΗΜΕ-1 κυτταρική γραμμή και ποντικού ήπατος αναλύθηκαν με κηλίδα Western για την ανίχνευση του αντι-αποπτωτικό (Α) Bcl-2 , Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1L και Α1 πρωτεΐνες και το προ-αποπτωτικό (Β) Bak, Βαχ, Bim, κακός και Mcl-1S πρωτεϊνών.

η

Όπως ABT-737 είναι αποφασίζοντας με συγκρότημα διάσπαση μεταξύ προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε κάποιες συγκρότημα διαταραχών με συν-ανοσοκαταβύθιση σε PC-3, ΗΤ-29 και τα μιτοχόνδρια Jurkat υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΒΤ-737 (Εικ. 7). Ανεξάρτητα από την κυτταρική γραμμή που ανιχνεύεται παρόμοια δέστρες: Bcl-xL σε Βαχ και Bak, Bcl-2 για να Βαχ και ασθενώς προς Bak, Mcl-1 μόνο σε Bak (Εικ. 7) και Bcl-w προς Βαχ (δεν φαίνεται). Παρατηρήσαμε ότι ΑΒΤ-737-επαγόμενη απελευθέρωση κυτοχρώματος c συσχετίζεται με Βαχ, Bak (Εικ. 7) και ΒΙΜ (δεν φαίνεται) απελευθέρωση από Bcl-xL και Bcl-2. Ωστόσο, ΑΒΤ-737 δεν είχε καμία επίδραση επί Bak και ΒΙΜ παγίδευση με Mcl-1 (Εικ. 7), ή Bax παγίδευση με Bcl-w (δεν φαίνεται), αυτά τα σύμπλοκα που απομένουν μετά τη θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Bax, Bak και ΒΙΜ απελευθέρωση από Bcl-2 και Bcl-xL σε απόκριση ΑΒΤ-737 ήταν υπεύθυνη για το σχηματισμό καναλιών και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c σε PC-3 (Εικ. 8) και τα μιτοχόνδρια Jurkat. Σε αντίθεση, ΗΤ-29 μιτοχόνδρια περιέχουν λιγότερο Bim και να στερηθούν του Bcl-2 ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην ABT-737 θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει ένα σημαντικό ρόλο για την Bcl-2 και Bim στην ABT-737 ευαισθησία.

Τα μιτοχόνδρια απομονωμένες από PC-3 (Α), ΗΤ-29 (Β) και Jurkat κύτταρα (C) ήταν χωρίς αγωγή (ΝΤ) ή υπέστησαν αγωγή με ί-(προσφορά? 2 ηΜ) ή ΑΒΤ-737 (ΑΒΤ? 1 μΜ) πριν να είναι ανοσοκαταβυθίστηκαν από τα αντισώματα που κατευθύνονται έναντι του Bcl-2, Bcl-xL και Mcl-1 αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών. Μιτοχονδριακή ολικά εκχυλίσματα (ΤΕ? Θετικός έλεγχος του ανοσοστυπώματος? 25 μg) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος, ενώ μία μιτοχονδριακή λύμα υποβλήθηκε σε διαδικασία ανοσοκαθίζηση χωρίς αντίσωμα (C? Αρνητικός έλεγχος του ανοσοκαταβύθιση). Έτσι, η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για να προσδιοριστεί συνδέσεις μεταξύ των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Bak (εκπρόσωπος κηλίδες Western 3 ανεξάρτητα πειράματα).

Η

A. Βαχ, Bak και ΒΙΜ οι sequestred από Bcl-2, Bcl-xL και Mcl-1 στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. B. Σε απάντηση ΑΒΤ-737, οι πρωτεΐνες Bax, Bak και ΒΙΜ απελευθερώνεται από Bcl-2 και Bcl-xL, αλλά όχι από Mcl-1L. Έτσι Bim μπορεί να ενισχύσει άμεσα Bax και Bak ολιγομερισμό προκαλώντας το σχηματισμό ΜΟΜΡ (C) και την απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως το κυτόχρωμα c στο κυτταρόπλασμα.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε υψηλής ποιότητας ελέγχεται απομονωμένα μιτοχόνδρια για να συγκριθούν τα αποτελέσματα των θεωρούμενων αναστολέων Bcl-2 και να προσπαθήσει να διερευνήσει το μηχανισμό δράσης των ΑΒΤ-737. Χρησιμοποιήσαμε πέντε διαφορετικές παραμέτρους για την αξιολόγηση της ακεραιότητας και λειτουργικότητά τους: κυτοχρώματος c οξειδάσης της προσβασιμότητας σε εξωγενή κυτόχρωμα C (δεν φαίνεται), το αναπνευστικό τιμές ελέγχου, η ικανότητα για διόγκωση μήτρας, διαμεμβρανικό δυναμικό αξίες και την απελευθέρωση του apoptogenic παράγοντες όπως το κυτόχρωμα C (ΟΜΡ) (Εικ . 1). Σύγκριση των ενώσεων-αποτελέσματος σε κάθε μιτοχονδριακή τύπου απαιτεί παρομοίως υψηλά επίπεδα καθαρότητας και άθικτο των μιτοχονδριακών παρασκευασμάτων, ανεξαρτήτως των πηγών τους (καλλιεργημένα κύτταρα ή υγιή ιστό). Αυτό λύθηκε με καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας κυττάρων και καθαρισμό των μιτοχονδρίων με διαφορική φυγοκεντρήσεις συν κλίση Percoll πυκνότητας. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, και τα δύο απομονωμένα ήπαρ ποντικού και καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια παρουσιάζουν παρόμοια ποιότητα και απόκριση σε ασβέστιο (Εικ. 1).

Παραδόξως οι περισσότερες ενώσεις που προσδιορίζονται ως αναστολείς Bcl-2 βρέθηκαν να δρουν σε υγιή μιτοχόνδρια τουλάχιστον σε μία παράμετρο ακεραιότητα. Για παράδειγμα, παρατηρήσαμε ότι το ΗΑ-14.1, χηλερυθρίνη, γκοσσυπόλης και EM20-25 επάγεται MMP στο ήπαρ μιτοχόνδρια ποντικού, ενώ άλλοι αναστολείς οικογένειας Bcl-2 βρέθηκαν να είναι ανενεργές (YC-137 και TW-37). Appart από t-Bid, Bak ΒΗ3, Bim ΒΗ3 που είναι από πρωτεϊνική προέλευση, μόνο ΑΒΤ-737 αποδεικνύεται επιλεκτική όγκου μιτοχόνδριο-στόχευση υποδεικνύεται από OMP και την απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών παραγόντων (Εικ. 2). Προηγούμενες παρατηρήσεις έχουν αποδείξει ότι ΑΒΤ-737 μπορεί να επάγει OMP είτε όταν μιτοχόνδρια προέρχονται από κύτταρα «γεμάτοι» από τα σήματα θανάτου (για παράδειγμα σε IL-3-στερούνται λεμφοκύτταρα [28], ή σε TNF-παλμικά κύτταρα HeLa [35]), ή όταν απομονώνονται μιτοχόνδρια είναι συν-επεξεργασία με πεπτίδιο ΒΗ3 (για παράδειγμα με Noxa ΒΗ3 στο ΥΠΟΙΟ μιτοχόνδρια [13]). Για πρώτη φορά, αποδείξαμε ότι ΑΒΤ-737 μπορεί η ίδια να προκαλέσουν ΟΜΡ επί μιτοχόνδρια απομονώνονται από μη διεγερμένα καρκινικές κυτταρικές σειρές. Όσον αφορά τ-Bid, απομονωμένες συκώτι μας και ΗΜΕ-1 υγιή μιτοχόνδρια δεν ήταν ευαίσθητα στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη t-Bid. Αυτή η απουσία αποτελέσματος επί μιτοχόνδρια ήπατος θα μπορούσε να εξηγηθεί από την υψηλή καθαρότητα και σταθερότητα των μιτοχονδριακών παρασκευασμάτων μας. Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών ανιχνεύεται τόσο στα φυσιολογικά όσο και τα καρκινικά κύτταρα τα μιτοχόνδρια (Εικ. 6) υπενθυμίζουν παρούσα μετά πλύσεις αλκαλικής (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας ότι δεν συνδέονται με ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση με τους μιτοχονδριακές μεμβράνες και δεν προέρχονται από υπολειμματικό κυτοσόλιο ή ενδοπλασματικό δίκτυο .

Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη t-Bid, Bak ΒΗ3, Bim ΒΗ3 και ΑΒΤ-737 πυροδότησε την απελευθέρωση των apoptogenic πρωτεϊνών από το PC-3 και τα μιτοχόνδρια Jurkat από το σχηματισμό των καναλιών αρκετά μεγάλο για να απελευθερώσουν τις πρωτεΐνες, όπως η Omi /HtrA2 (37 kDa) (Σχ. 3). OMP εμφανίζεται ανεξάρτητη από PTP, δεδομένου ότι δεν αναστέλλεται από γνωστούς αναστολείς ΡΤΡ όπως ADP, η κυκλοσπορίνη Α και bongkrekic οξύ (δεν φαίνεται). Η απουσία μιτοχονδριακής μεταβολές μεμβράνης (δεν παρατηρήθηκε διόγκωση και απώλεια ΔΨm) (Σχ. 2Α) και η απελευθέρωση των μικρότερων αποπτωτικών παραγόντων υπό θεραπεία (Εικ. 3) πρότειναν ότι ΑΒΤ-737 που επάγεται ο σχηματισμός ενός συγκεκριμένου καναλιού και όχι μια μιτοχονδριακή μεμβράνη ρήξη, παρόμοια με την Bax [53-86] ΒΗ3 πεπτιδίου σε Polster

et al.

[36]. Κατά συνέπεια, διακριτική απελευθέρωση apoptogenic παραγόντων έχει ήδη δειχθεί σε απομονωμένα μιτοχόνδρια HeLa σε επεξεργασία με t-Bid [37]. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με την προηγούμενη περιγραφή ενός αποπτωσώματος-εξαρτώμενη βρόχου, όπου θα πρέπει να ενεργοποιηθεί για να προκαλέσει μιτοχονδριακή απελευθέρωση του ΟΕΕ και EndoG, δευτεροβάθμια στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, Omi /HtrA2 και Smac /DIABLO [37] κατάντη κασπασών. Σε κυτταρικό μοντέλο, η απώλεια ΔΨm και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c ταυτοχρόνως ανιχνεύθηκαν σε απόκριση ΑΒΤ-737 [38], [39] σε αντίθεση με ό, τι παρατηρήθηκε με συνθήκες μας στο ελεύθερο κυττάρων σύστημα. μέθοδος διαλογής μας φαίνεται να είναι ένα πραγματικό διαδικασία φορά που επιτρέπει την ανίχνευση των άμεσων και πρόωρης επιδράσεις των ενώσεων επί μιτοχόνδρια, χωρίς παρεμβολές που προκαλούνται από κυτοσολικό διαμέρισμα.

Έχουμε επίσης δείξει ότι (1) HCT-116 Bak- /-, αλλά όχι Βαχ – /-, τα μιτοχόνδρια είναι ευαίσθητα σε ΑΒΤ-737, (2) ΑΒΤ-737 που προκαλείται από το κυτόχρωμα απελευθέρωσης C επί PC-3 μιτοχόνδρια ελέγχονται από μία περίσσεια των Bcl-xL (Σχήμα (Σχήμα 4Α).. 4C) και (3) αναστολή της Βαχ και Bak ολιγομερισμού με BCB είναι επαρκής για να εμποδίσει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c (Εικ. 5Α και Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ισορροπία μεταξύ προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 παίζει έναν ουσιαστικό ρόλο στο μηχανισμό δράσης ΑΒΤ-737.

Έχουμε έτσι απέδειξαν ότι Βαχ και Bak ολιγομερισμό κατά τη PC-3 μιτοχονδριακής μεμβράνης επάγεται από Bak και Bim ΒΗ3 πεπτίδια, t-Bid ή ΑΒΤ-737 θεραπείες (Εικ. 5Α), Βαχ και Bak τόσο εισάγεται ως μια μονομερή μορφή σε ακατέργαστα φυσιολογικά (ΗΜΕ-1) και των όγκων (PC -3) μιτοχόνδρια των κυττάρων. Ωστόσο, πολυάριθμες μελέτες έχουν διεξαχθεί δείχνουν Bax ολιγομερισμό και εισαγωγή μετέπειτα μεμβράνη χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο Βαχ και απομονωμένα μιτοχόνδρια ή λιποσώματα [40] – [42]. Αυτές οι μελέτες έχουν οδηγήσει σε αντίθετα συμπεράσματα σχετικά με την κινητική του Bax πόρους ενεργοποίησης. Ωστόσο, πιο πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι ολιγομερισμός του Βαχ λαμβάνει χώρα στο μιτοχονδριακό επίπεδο και όχι στο κυτταρόπλασμα [43] – [45]. Έτσι, χρησιμοποιώντας null κύτταρα c-myc, Άννης και συνεργάτες έδειξαν ότι Bax επαγόμενη μιτοχονδριακής διαπερατότητας αποτελέσματα από ολιγομερισμό διαμεμβρανικών μονομερών και όχι εισαγωγή ως προσχηματισμένα ολιγομερή [43].

Ορισμένες οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών, όπως το ΒΗ3 μόνο ενεργοποιητή Bim ή αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Mcl-1L είναι ιδιαίτερα παρούσα σε καρκινικό κύτταρο μιτοχόνδρια. Σε αντίθεση με προηγούμενες παρατηρήσεις [28], [29], [46], η έκφραση Mcl-1L στο μιτοχόνδρια δεν ήταν επαρκής στα χέρια μας για την πρόληψη σχηματισμού ΜΟΜΡ σε απόκριση ΑΒΤ-737. Για παράδειγμα, PC-3 και Jurkat μιτοχόνδρια είναι ευαίσθητες σε χαμηλές συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737, παρά την υψηλή περιεκτικότητα σε Mcl-1L (Σχήματα 2 και 6), ενώ ΗΤ-29 μιτοχόνδρια με χαμηλό επίπεδο Mcl-1L είναι σχετικά ανθεκτικά στην ABT- 737. Δείχνουμε εδώ ότι σε μοριακό επίπεδο, ΑΒΤ-737 επιτρέπει προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL, αλλά ούτε Mcl-1L ούτε Bcl-w για την απελευθέρωση Βαχ, Bak και ΒΙΜ (Σχήματα 7 και 8).