Αφηρημένο

Η θεραπεία ακτινοβολίας είναι μια σημαντική θεραπευτική επιλογή για ανεγχείρητο προηγμένη ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, και μια κρίσιμη επικουρική θεραπεία για τη χειρουργική επέμβαση. Ωστόσο, ακτινοβολία ως θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει καθόλου ικανοποιητική λόγω προβλημάτων που συνδέονται με την αντίσταση ακτινοβολίας σε καρκινικά κύτταρα και σοβαρή κυτταροτοξικότητα σε μη-καρκινικά κύτταρα, τα οποία προκύπτουν σε δόσεις συνήθως χορηγούνται σε ασθενείς. Έχουμε εντοπίσει πρόσφατα μία υποσχόμενη νέα αναστολέας της β-κατενίνης /αλληλεπίδραση TCF4, που ονομάζεται BC-23 (C

21Η

14ClN

3Ο

4S), το οποίο δρα ως ένας ενισχυτής θάνατος ισχυρός κύτταρο όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ακτινοβολία. Διαδοχική έκθεση ανθρώπινων ρ53-ηυΙΙ μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) Η1299 κύτταρα σε χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας ακτίνων Χ, που ακολουθείται 1 ώρα αργότερα με χορήγηση ελάχιστα κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις του BC-23, είχε ως αποτέλεσμα μια ιδιαίτερα συνεργική επαγωγή των κλωνογόνων κυτταρικό θάνατο (συνδυασμός δείκτη , p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου 6 Gy + siRNA + BC-23

Η

Συζήτηση

Έχουμε καθορίσει τις άμεσες ανασταλτικές επιδράσεις των επιλεγμένων ενώσεων από NCI για την αλληλεπίδραση μεταξύ. β-κατενίνης και TCF4 χρησιμοποιώντας πρόσφατα αναπτύχθηκε ελεύθερα κυττάρων δοκιμασία ανταγωνιστικής πρόσδεσης μας βασίζεται στην FP [31]. Μεταξύ των ενώσεων που δοκιμάστηκαν, BC-23 εμφάνισε ισχυρή δραστηριότητα (ένα IC

50 τιμή 1,7 μΜ) έναντι της αλληλεπίδρασης μεταξύ β-κατενίνης και ένα επισημασμένο με FITC TCF4

(8-30) ανιχνευτή (Εικόνα 1). Χρησιμοποιήσαμε επίσης μια κορυφαία με βάση τα κύτταρα (που φέρουν το θέση πρόσδεσης Tef /Lef) δοκιμασία λουσιφεράσης για να δοκιμαστεί η επίδραση του BC-23 για μεταγραφική δραστηριότητα της διαδρομής /β-κατενίνης Wnt. BC-23 εξαρτώμενο από την δόση ανέστειλαν TOP ενεργοποίηση σε Η1299 κύτταρα, με μια IC

50 τιμή 2,3 μΜ (Σχήμα 2). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αλληλεπίδραση /TCF4 π.Χ.-23 στόχους της β-κατενίνης. Ανάλυση της δέσμευσης διαμόρφωση του BC-23 με μοριακή βάση σύνδεσης αποκάλυψε ότι BC-23 που καταλαμβάνει μια θέση στο Asp16 και Glu17 του TCF4, σχηματίζοντας δύο δεσμούς υδρογόνου με Asn430 και Lys508 και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με Pro505 της β-κατενίνης (Σχήμα 3Β). Αυτό έδειξε ότι η BC-23 αναστέλλει την αλληλεπίδραση μεταξύ TCF4 και β-κατενίνης σε Asp16 και Glu17 του TCF4. (Σχήμα 3Α & amp? 3Β)

Δοκιμάσαμε το δυναμικό της BC-23 να δρα ως ένας ενισχυτής ακτινοβολία για κύτταρα NSCLC Η1299. Υψηλά επίπεδα πυρηνικής β-κατενίνης βρέθηκαν σε πολλά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [16]. Η παρουσία του καρκίνου του πνεύμονα βλαστικά κύτταρα (LCSCs) που είναι ικανές να αυτο-ανανέωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση μπορεί να προσδίδουν αντίσταση όγκου στην ακτινοβολία [4-6]. Υποθέσαμε ότι η χορήγηση του BC-23 θα μπορούσε να βελτιώσει τη δράση της ακτινοθεραπείας στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα μέσω της αναστολής της β-κατενίνης /TCF4 αλληλεπίδραση και σηματοδότηση. Έχουμε καθορίζεται για πρώτη φορά την κυτταροτοξικότητα της BC-23 μόνη της σε Η1299 κύτταρα από το CellTiter-Μπλε Δοκιμασία. BC-23 μόνο του εμφάνισε μέτρια κυτοτοξικότητα έναντι Η1299 κυττάρων, με IC

50 τιμές των 7,6 και 4,5 μΜ για 1 ημέρα και 3 ήμερες θεραπείες, αντίστοιχα, όπως φαίνεται στο Σχ 4Α. Θεραπεία της H1975 κυττάρων (α ρ53 άγριου τύπου NSCLC) με BC-23 για 1 και 3 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα IC

50 τιμές για BC-23 7.9 και 5.2 μΜ, αντίστοιχα, οι οποίες ήταν οι τιμές συγκρίσιμες με αυτές που ελήφθησαν για Η1299 κύτταρα . Αυτό υποδηλώνει ότι η κυτταροτοξική δράση του BC-23 είναι ανεξάρτητη της ρ53. Διαδοχική επεξεργασία των κυττάρων με 2 έως 10 Gy ακτινοβολία, που ακολουθείται 1 ώρα αργότερα με χορήγηση 3μΜ BC-23, σημαντικά ενισχυμένη την ακτινοβολία διαμεσολαβείται κλωνογόνων θανάτωση επίδραση κυττάρου σε Η1299 κύτταρα (Εικόνα 4Β). BC-23, σε συνδυασμό με 10 Gy ακτινοβολία, προκάλεσε αύξηση κατά 2-log στην κλωνογόνο θάνατο των Η1299 κυττάρων σε σύγκριση με μόνη 10 Gy ακτινοβολία.

Οι δυνητικοί μηχανισμοί με τους οποίους BC-23 ενισχύει το θάνατο του κύτταρα NSCLC που εκτίθενται σε ακτινοβολία περαιτέρω διερευνηθεί με την ανάλυση της παραγωγής ROS κυτταρικού κύκλου και σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με BC-23 και την ακτινοβολία, μόνο του ή σε συνδυασμό. Προηγούμενη μελέτη δείχνει ότι η οδός σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και του πυρήνα εντοπισμένο σύμπλεγμα β-κατενίνης Tcf αυξάνει κατά τη διάρκεια του S-G

2 [34, 35]. Η ενεργοποίηση β-κατενίνης συσχετίζεται με την επιβίωση των κυττάρων με κατεστραμμένα DNA (που προκαλείται από ROS) και με τα λάθη επιδιόρθωση του DNA [36]. BC-23, μόνη ή σε συνδυασμό με ακτινοβολία, συνελήφθη Η1299 κύτταρα στη φάση S (Σχήμα 6), σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος και την ακτινοβολία μόνο. Η συνδυασμένη θεραπεία BC23 και την ακτινοβολία που παράγεται σύλληψη φάσης S και ταυτόχρονη ακτινοβολία που προκαλείται από G2 /M του κυτταρικού κύκλου μπλοκ. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η καθυστέρηση παρουσιάζεται κατά τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου ή /και στο DNA επεξεργασίας διάλειμμα διπλό σκέλος στα κύτταρα Η1299 μετά την συν-θεραπεία με BC-23 και την ακτινοβολία. Η καθυστέρηση στη σύνθεση του DNA που προκαλείται από BC-23 μπορεί να επιδεινώσει την επιβίωση των κυττάρων που υφίστανται G

2 /M σύλληψης (Σχήμα 6) που προκαλείται από την έκθεση σε ακτινοβολία και η προκύπτουσα ROS (Σχήμα 5). BC-23 επάγεται σημαντικά την παραγωγή ROS σε Η1299 κύτταρα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Α). Ο πιθανός ρόλος των ROS σε BC-23 με τη μεσολάβηση θανάτωσης κυττάρων και κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη χρήση του αντιοξειδωτικό NAC για την εξουδετέρωση του ROS στα κύτταρα. θεραπεία NAC κατάργησε σημαντικά την κυτταροτοξική δράση του BC-23 σε αμφότερες τις δοκιμασίες κυτοτοξικότητας και αποικιών (Σχήμα 5Β-5D). Η αυξημένη ROS προκαλείται από BC-23 μπορεί περαιτέρω να αναστέλλουν την β-κατενίνης /TCF4 μονοπάτι επειδή ROS ρυθμίζουν αρνητικά την σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της β-κατενίνης [37].

Έχουμε λάβει περαιτέρω επιβεβαίωση της ειδικής επίδρασης του BC-23 σχετικά με Wnt /β-κατενίνης /TCF4 σηματοδότηση με την εξέταση της έκφρασης του mRNA του c-myc και κυκλίνη D1, δύο κρίσιμα κατάντη γονίδια της οδού /β-κατενίνης Wnt. Σημαντική αναστολή της έκφρασης τόσο c-Myc και κυκλίνη D1 σε Η1299 κυττάρων παρατηρήθηκε μετά από αγωγή 16 ώρες με 20 και 40 μΜ BC-23 (Σχήμα 7). Περαιτέρω στοιχεία που παρέχονται από την παρατήρηση ότι CTNNB1 siRNA μείωσε την έκφραση β-κατενίνης και σημαντικά μπλοκάρει την ραδιοευαισθητοποίησης επίδραση του BC-23 σε Η1299 κύτταρα (Σχήμα 8). Στο σύνολό τους, οι ειδικοί της και μονοπάτι ειδικής δοκιμασίες ελεύθερο κυττάρων και κυτταρικών σειρών, καθώς και

in silico

αποτελέσματα μοριακής σύνδεσης, έδειξαν ότι BC-23 είναι ένα νέο αναστολέα του β-κατενίνης /TCF4 ότι ειδικότερα στοχεύει την αλληλεπίδραση β-κατενίνης /TCF4 και αναστέλλει μεταγραφική δραστηριότητα τους [38].

Συμπέρασμα

Έχουμε εντοπίσει και να χαρακτηρίζεται ένα νέο μικρό μόριο π.Χ.-23 που στοχεύει την αλληλεπίδραση του β- κατενίνης /TCF4 και αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα τους. BC-23 ρυθμίζει προς τα κάτω δύο σημαντικών γονιδίων /β-κατενίνης μονοπάτι Wnt: c-Myc και κυκλίνη D1.