Αφηρημένο

Ιστορικό

Ezrin είναι μέλος του ezrin, ραδιξίνης και μοεσίνη οικογένεια που παρέχει μια λειτουργική σύνδεσμος μεταξύ της μεμβράνης πλάσματος και του φλοιώδους κυτταροσκελετού ακτίνης. Μια συσχέτιση μεταξύ εζρίνη υπερέκφραση και επιθετική συμπεριφορά καρκίνου έχει πρόσφατα αναφερθεί σε διάφορους τύπους όγκων. Ωστόσο, οι ρόλοι του στους μηχανισμούς που διέπουν την εξέλιξη του καρκινώματος της γλώσσας πλακωδών κυττάρων (SCC) είναι ασαφείς.

Μέθοδος

Εμείς που χρησιμοποιούνται ανθρώπινα SCC γλώσσα και noncancerous μικροσυστοιχίες ιστού για να αναλύσει ανοσοϊστοχημικά το επίπεδο έκφρασης ezrin και η σχέση της με πολλαπλασιαστική δραστικότητα. Η γλώσσα SCC ανθρώπινη κυτταρική σειρά HSC-3 χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του εζρίνης παρεμβολή RNA (RNAi) σε καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της ΜΤΤ? επούλωση τραυμάτων και εισβολή δοκιμασίες? ανοσοφθορισμού του κυτταροσκελετού ακτίνης? και κηλίδωση Western της Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, β-κατενίνης, καθώς και την ενεργό και συνολικό RhoA /Rac1 /cdc42.

Αποτελέσματα

Ezrin υπερεκφράστηκε σε 46,4% των όγκων που εξετάστηκαν σε μικροσυστοιχίες ιστό ανθρώπινη γλώσσα SCC. έκφραση Ezrin συσχετίστηκε με το δείκτη Ki-67. εξάντληση Ezrin με RNAi στα κύτταρα HSC-3 μείωσε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, και διεισδυτικότητα και διαταραχθεί αναδιοργάνωση ακτίνης κατά τη διάρκεια του σχηματισμού βάθρα. επιπτώσεις της στην RhoA /Rac1 έκφραση /cdc42 δεν ήταν σημαντικές, ενώ ενισχυμένη E-cadherin και β-κατενίνης έκφρασης και μειωμένη έκφραση Ν-cadherin.

Συμπεράσματα

Ezrin συχνά υπερεκφράζεται στην πρωτοβάθμια γλώσσας κλώνοι ενός κυττάρου και μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξή τους, τη μετανάστευση, και εισβολής ενδεχομένως μέσω της σχέσης του με την E-cadherin /συγκρότημα της β-κατενίνης και το διακόπτη cadherin. Έτσι, εζρίνη μπορούσε να είναι ένας θεραπευτικός στόχος σε SCC γλώσσα

Παράθεση:. Saito S, Yamamoto Η, Mukaisho Κ-i, Sato S, Higo Τ, Hattori Τ, et al. (2013) Μηχανισμοί υποκείμενου καρκίνου Εξέλιξη Προκαλείται από Ezrin υπερέκφραση σε Tongue πλακώδες καρκίνωμα. PLoS ONE 8 (1): e54881. doi: 10.1371 /journal.pone.0054881

Επιμέλεια: DunFa Peng, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Σεπ του 2012? Αποδεκτές: 17 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 24η του Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κεφαλής και τραχήλου από πλακώδες επιθήλιο καρκίνωμα (HNSCC) είναι σήμερα η έβδομη πιο κοινή μορφή καρκίνου, με 260.000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο και περίπου 128.000 ετήσιους θανάτους σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Η γλώσσα είναι ένα από τα πιο κοινά θέσεις προέλευσης των HNSCC στην Ιαπωνία [3]. Neck λεμφαδένα μετάσταση είναι ένα από τα πιο κρίσιμα καθοριστικούς παράγοντες της επιβίωσης και παρέχει έναν καλό οδηγό για στρατηγικές θεραπείας [4] – [8]. Ωστόσο, η ποιότητα της ζωής και το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι χαμηλά σε προχωρημένους καρκίνους της γλώσσας, ακόμη και με την τρέχουσα πολυτροπικών θεραπεία και χειρουργική εκτομή συνοδεύεται από τη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία. Για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων των προχωρημένων καρκίνων γλώσσας, πρέπει να αναπτύξουμε νέες στοχευμένες θεραπείες που βασίζονται στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την επιθετική συμπεριφορά των καρκίνων γλώσσας.

Ezrin αρχικά απομονώθηκε ως κυτταροσκελετού συστατικό της εντερικής μικρολάχνες, και είναι γνωστό ότι είναι ένα υπόστρωμα της κινάσης τυροσίνης [9]. Εζρίνη είναι ένα μέλος της οικογένειας εζρίνης, ραδιξίνη, μοεσίνη και πρωτεΐνη που συνδέει F-ακτίνης σε κυτταρικές πρωτεΐνες της μεμβράνης μετά την φωσφορυλίωση [10] – [13]. Αυτή η λειτουργία συνδέτη υποδηλώνει ότι εζρίνη είναι απαραίτητη για πολλούς βασικές κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου του καθορισμού του σχήματος του κυττάρου, την πολικότητα, επιφανειακή δομή, κυτταρική προσκόλληση, την κινητικότητα, την κυτοκίνηση, φαγοκυττάρωση, και ολοκλήρωση των μεταφορών μεμβράνης μέσω μονοπατιών σηματοδότησης [14] – [17] . Αυτές οι λειτουργικές πτυχές της εζρίνης αναμένεται να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι εζρίνη μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση, ανάπτυξη, εισβολή, και μετάσταση, πιθανώς μέσω της ρύθμισης των μορίων προσκόλλησης, η συμμετοχή στην μεταγωγή σήματος κύτταρο, και τη σηματοδότηση σε άλλα κανάλια της κυτταρικής μεμβράνης εντός του όγκου [18] – [22]. Ezrin είναι ένα απαραίτητο παράγοντα για κύτταρο όγκου μετάσταση σε οστεοσαρκώματα [23], του καρκίνου του μαστού [24], ρινοφαρυγγικά καρκινώματα [25], και του καρκίνου του προστάτη [26]. έκφραση Ezrin έχει επίσης συνδεθεί με κακή επιβίωση σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των καρκινωμάτων του μαστού [21], [27], του ενδομητρίου [28], και των ωοθηκών [29]? δερματική και uveal μελανώματα [30]? και σαρκώματα μαλακών ιστών [31], [32]. Ωστόσο, οι ρόλοι του στον καρκίνο του στόματος είναι ασαφείς. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να αποσαφηνίσει τους ρόλους της εζρίνης σε εξέλιξη SCC γλώσσα με παρεμβολή ezrin RNA (RNAi) σε μια κυτταρική γραμμή που προέρχεται από την SCC γλώσσα. Χρησιμοποιήσαμε πρωτογενή κλώνοι ενός κυττάρου γλώσσα για να προσδιοριστεί η συχνότητα των εζρίνης υπερέκφραση και τους συσχετισμούς της έκφρασης εζρίνης με το δείκτη Ki-67 και το αποπτωτικό δείκτη, τα οποία αντικατοπτρίζουν τις συνεισφορές του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απώλεια κυττάρων, αντίστοιχα, για την ανάπτυξη των όγκων και την επιθετικότητα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ezrin μπορεί να είναι κατάλληλο για στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία σε ΤΣΡ γλώσσα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανοσοϊστοχημική χρώση των εζρίνη και ιστολογική εξέταση

Η φυσιολογικών και καρκινικών ιστών της γλώσσας μικροσυστοιχίες του ανθρώπου που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την US Biomax Company (MD, USA). Από τα 79 δείγματα, 10 ήταν φυσιολογικούς ιστούς της γλώσσας και 69 ήταν γλώσσας ιστούς SCC. ΗΠΑ Biomax Εταιρεία απέκτησε τους πόρους ιστού από τράπεζες ιστών που εγγυάται ότι όλες οι συλλογές ανθρώπινο ιστό πραγματοποιήθηκαν σε πιστοποιημένα νοσοκομεία, σύμφωνα με τα υψηλότερα ηθικά πρότυπα. Όλες οι ανθρώπινοι ιστοί και εισπράττεται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που συμμορφώθηκε με την Υγεία Φορητότητα Ασφαλίσεων και Πράξη Ευθύνης (HIPPA). Έχουν πιστοποιηθεί ότι όλες οι τράπεζες ιστών που παρέχονται ανθρώπινου δυναμικού ιστού πληρούν τις ακόλουθες προϋποθέσεις της συμφωνίας μεταβίβασης του Ανθρώπου Υλικό: η ταυτότητα του δότη ήταν ανώνυμες και όλοι οι ιστοί και τα δεδομένα σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αναγνωριστικό κωδικό για την προστασία της ταυτότητας των δωρητών ιστών. Ενημερωμένη συγκατάθεση κρατήθηκε σε τράπεζες ιστών και όχι που μας Biomax Εταιρείας, προστατεύοντας έτσι την ιδιωτική ζωή του δωρητή

Ανοσοϊστοχημική χρώση των μικροσυστοιχίες ιστών ανθρώπινης γλώσσας SCC πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα κουνελιού αντι-ezrin (# 3145?. Κυττάρων Σηματοδοσίας, MA, USA) και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-Ki-67 αντίσωμα (κλώνος: ΜΙΒ-1? Dako, Glostrup, Δανία). Χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός Discovery XT Αυτοματοποιημένη IHC Stainer με Ventana DABMap Detection Kit (Νο 760-124? Ventana Medical System, AZ, USA). Κάθε βήμα της διαδικασίας Ventana DABMap Detection Kit έχει βελτιστοποιηθεί για το μέσο Discovery XT, και είχαν προκαθοριστεί οι προϋποθέσεις. ανάκτησης αντιγόνου από τα τμήματα του ιστού διεξήχθη χρησιμοποιώντας θερμότητα

Η ένταση χρώσης ανθρώπινης γλώσσας SCC ιστός βαθμολογήθηκε ως εξής: α. 0, αρνητικά? 1+, αδύναμη? 2+, μέτρια? και 3+, έντονη. Αυτή η βαθμολογία που χρησιμοποιούνται τα ακόλουθα κριτήρια: 1+ έδειξε μια ένταση παρόμοια με αυτή που βρέθηκε στο φυσιολογικό ιστό γλώσσα? 3+ υποδεικνύεται έντονη χρώση της μεμβράνης και κυτταροπλάσματος? 2+ έδειξε μια ένταση μεταξύ 1+ και 3+. Εμείς διχοτομήθηκε τις κατηγορίες κατά τη διάρκεια της στατιστικής ανάλυσης. Έτσι, ένας ασθενής-μέτρια ένταση χρώσης υποδεικνύεται χαμηλή έκφραση εζρίνης, ενώ μια έντονη ένταση χρώσης υποδεικνύεται υψηλή έκφραση εζρίνης.

Ki-67 εκφράζεται συνήθως στον πυρήνα του κυττάρου. Ο δείκτης Ki-67 (δηλαδή, ο αριθμός των Ki-67-θετικά κύτταρα όγκου διαιρεμένο με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων του όγκου × 100%) καθορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος (× 400 ).

Το αποπτωτικό δείκτη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια In situ Apoptosis Detection Kit (Takara Bio, Οτσού, Ιαπωνία). Οι διαδικασίες που ακολουθούνται χρώσης τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά ρουτίνα αποπαραφίνωση, ο ιστός υπέστη πέψη με proteinaseK (20 μg /mL σε PBS) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν με PBS. Τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 5 λεπτά και πλύθηκαν με PBS. ενζύμου και υποστρώματος TdT μεταφέρθηκε με πιπέττα σε τμήματα, τα οποία στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά. Μετά το πλύσιμο, συζυγές HRP anti-FITC προστέθηκε στα πλακίδια επί 30 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν, χρωματίστηκαν με diaminobenzine (Nichirei, Tokyo, Japan), και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Το αποπτωτικό δείκτη (ο αριθμός των θετικών κυττάρων όγκου διαιρεμένο με τον συνολικό αριθμό των καρκινικών κυττάρων χ 100%) καθορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος (Χ 400). Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης ezrin, Ki-67, και το αποπτωτικό δείκτη αξιολογήθηκαν επίσης σε ανθρώπινους ιστούς γλώσσα SCC.

καλλιέργειας κυττάρων

Το SCC κυτταρική γραμμή γλώσσας HSC-3 αγοράστηκε από την JCRB Τράπεζα κυττάρων και διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ? Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% διάλυμα αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό (Invitrogen, CA, USA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα συμπληρωμένο με 5% CO

2.

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Ezrin siRNA (5′-GAUUUCCUACCUGGCUGAAGCUGGA-3 ‘) και nonsilencing ελέγχου (NSC) siRNA αγοράστηκαν από την Invitrogen . Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εζρίνη siRNA επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα (εζρίνη-siRNA) και NSC-επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα (NSC) χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα

in vitro

πειράματα.

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή -πολυμεράσης αλυσιδωτή αντίδραση (qRT-PCR)

στην qRT-PCR, το συνολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας RNeasy (Qiagen, Tokyo, Japan) και cDNA συντέθηκε από 2 μg του ολικού RNA. cDNA υποβλήθηκε σε PCR (LightCycler480, Roche, Tokyo, Japan) χρησιμοποιώντας εκκινητές και SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). Όλες οι PCR εκκινητές αγοράστηκαν από την Takara Bio και οι αλληλουχίες τους παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους PCR στους 95 ° C για 5 s, ανόπτηση στους 60 ° C για 20 s, και επιμήκυνση στους 72 ° C για 10 s. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA κανονικοποιήθηκαν έναντι των επιπέδων έκφρασης του mRNA του εσωτερικού προτύπου γονίδιο αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH).

Η

κηλίδωση Western

Τα συρρέοντα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM χλωριούχο νάτριο, 0,5 mM EDTA, 0,09 μονάδες /ml απροτινίνης, 1 μg /mL πεπστατίνη, 10 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 1 μg /mL λευπεπτίνη). Πρωτεϊνικά λύματα (20 μα ανά διαδρομή) ανιχνεύθηκαν στη δοκιμασία πρωτεΐνης BCA διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα 4% -12% πηκτή βαθμίδωσης SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Invitrogen). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 4% άπαχο ξηρό γάλα σε ΤΒδ-Τ (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 8 g /L χλωριούχο νάτριο, και 0.1% Tween 20) πριν από την επώαση με πρωτογενή αντισώματα.

Anti- αντίσωμα κουνελιού εζρίνη (# 3145) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology. Αντι-β-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (SC-47778) και αντίσωμα ποντικού αντι-N-cadherin (sc-7939) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης ποντικού (κλώνος 36) και αντίσωμα ποντικού αντι-β-κατενίνης (κλώνος 14) αγοράστηκαν από την Becton Dickinson and Company (BD? NJ, USA). Goat συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-κουνελιού IgG (# L3012? Signalway Antibody, ΤΧ, USA) και γίδινο συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού IgG (# AP124P? Millipore, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός θετικός έλεγχος. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας υπόστρωμα HRP (Millipore) και σαρώνεται με ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Las 4000? Fuji Film, Tokyo, Japan). Οι εντάσεις μπάντα κανονικοποιήθηκαν σε β-ακτίνη.

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης δοκιμασία

Κύτταρα (1 χ 10

5) σπάρθηκαν σε 75-cm

2 φιάλες και επιμολύνονται με ezrin ή αρνητικού ελέγχου siRNA. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση και προετοιμάστηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 30 λεπτά σε 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. Μετρήσεις του κυτταρικού περιεχομένου DNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας FACSCalibur (BD).

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

Μία δοκιμασία ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει την κυτταρική ανάπτυξη. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο), και το διάλυμα ΜΤΤ (0.25 mg /mL) προστέθηκε στο μέσο μετά από επώαση για 24, 48, 72, ή 96 h. Κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε DMSO, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας έναν άπειρο 200 αναγνώστη μικροπλάκας (TECAN, Kawasaki, Ιαπωνία).

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η μετανάστευση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την επούλωση των πληγών χημική δοκιμή. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων σε μια σχεδόν συρρέουσες επίπεδο σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Διέσχισε ραβδώσεις έγιναν σχετικά με την καλλιέργεια μονοστοιβάδας χρησιμοποιώντας 200 μλ ρύγχη πιπέτας. Τα κύτταρα πλύθηκαν αμέσως με ΟΜΕΜ που περιέχει 10% FBS για την απομάκρυνση των αποσπασμένων κυττάρων. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιέχει μιτομυκίνη (3 μg /mL? Nacalai Tesque) για 1 ώρα για την αναστολή του πολλαπλασιασμού. Έτσι, η παρατηρούμενη αύξηση του αριθμού των κυττάρων δεν οφείλεται στην αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η μετανάστευση των κυττάρων παρακολουθήθηκε για 0, 12, 24, και 48 ώρες, και οι εικόνες συλλήφθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Nikon, Tokyo, Japan) που συνδέεται με ένα μικροσκόπιο αντίθεσης ανεστραμμένης φάσης (Nikon).

εισβολή δοκιμασία

Οι δοκιμασίες εισβολής που χρησιμοποιούνται 24 και BD BIOCOAT Matrigel θαλάμους εισβολή με ένθετα 8-μm πόρων (BD). Κύτταρα (5 × 10

4) αιωρούνται σε DMEM χωρίς ορό σπάρθηκαν στα ανώτερα ένθετα, ενώ ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στους κάτω θαλάμους ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια του φίλτρου με απόξεση με ένα βαμβάκι μετά από 22 ώρες σε καλλιέργεια. Τα κύτταρα που διείσδυσαν διαμέσου του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η /Ε). Οι μέσες τιμές των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με τους τρεις θαλάμους χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση.

ανοσοφθορισμού

κύτταρα που αναπτύσσονται σε πλάκες καλλιέργειας οκτώ φρεατίων σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη σε PBS για 30 λεπτά, διαπερατά με 0,25% Triton Χ-100 (Merck Calbiochem, Darmstadt, Γερμανία), και αποκλείστηκαν με 1% FBS σε PBS. Η ακτίνη χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας ροδαμίνη-φαλλοειδίνη (Invitrogen). εικόνες ανοσοφθορισμού έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα Olympus ΒΧ-61 μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan), και οι εικόνες συλλήφθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή CoolSNAP-HQ (NIPPON ROPER, Tokyo, Japan).

προσδιορισμού της δραστικότητας της οικογένειας Rho

Rho οικογένεια ενεργοποίηση δοκιμασία εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα κιτ RhoA /Rac1 /Cdc42 ενεργοποίηση Combo (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν, λύθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας, και φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 χ

g

για 1 λεπτό για την αφαίρεση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Για τον προσδιορισμό των συνολικών επιπέδων έκφρασης RhoA /Rac1 /Cdc42 με κηλίδωση Western, 20 μL από κάθε δείγμα αποθηκεύτηκε στους -80 ° C για χωριστή ανάλυση. Ένα προϊόν λύσης κυττάρου που περιέχει 500 μg της συνολικής πρωτεΐνης επωάστηκε για 1 ώρα στους 4 ° C με περιστροφή με 40 μι των σφαιριδίων αγαρόζης, τα οποία συνδέονται ενεργοποιημένα RhoA, Rac1, και Cdc42. Σφαιρίδια αγαρόζης δεσμεύεται στην ενεργή RhoA /Rac1 /Cdc42 πλύθηκαν τρεις φορές χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό δοκιμασίας, επαναιωρήθηκαν σε 40 μι 2 χ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος LDS, και βράζεται στους 70 ° C για 10 λεπτά. Η δραστική επίπεδα ολικής πρωτεΐνης RhoA /Rac1 /Cdc42 (GTP-δεσμευμένη) και σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western.

Στατιστικές αναλύσεις

Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Excel (Microsoft, WA, USA). Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με τη χρήση του μαθητή

t-test

. Η συσχέτιση των εζρίνης επίπεδα έκφρασης με SCC γλώσσα και λεμφαδένα μετάσταση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher, ενώ τα στάδια και τη διαφοροποίηση των τάξεων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

έκφραση Ezrin στον καρκίνο της γλώσσας και noncancerous ιστούς

Ezrin ανοσοδραστικότητα παρατηρήθηκε στο κυτταρικές μεμβράνες, ενώ ήταν ασθενώς θετικό στο κυτταρόπλασμα του φυσιολογικού βλεννογόνου της γλώσσας (Σχ. 1Α). Σε αντίθεση, τα δείγματα SCC γλώσσα αποδειχθεί μεμβρανώδη και κυτταροπλασματική χρώση εζρίνη, και η κυτταροπλασματική χρώση ήταν μεγαλύτερη στα δείγματα αυτά σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα γλώσσα βλεννογόνο (Εικ. 1Β). Ο Πίνακας 2 παρουσιάζει τα αποτελέσματα της χρώσης εζρίνης. Σε noncancerous ιστούς ανθρώπινης γλώσσας, οι 10 δείγματα εξέφρασαν εζρίνης σε χαμηλά επίπεδα. Σε ανθρώπινους ιστούς γλώσσα SCC, ωστόσο, υψηλά εζρίνη έκφραση ανιχνεύθηκε σε 32/69 (46,4%) των όγκων, ενώ χαμηλή έκφραση ανιχνεύθηκε σε 37/69 (53,6%) όγκων. Υψηλή έκφραση ezrin ήταν σημαντικά πιο συχνή στους ανθρώπινους ιστούς γλώσσα SCC από ό, τι στο noncancerous ιστούς (

P

= 0.0046). Υψηλή εζρίνη έκφραση έτειναν να ανιχνεύονται πιο συχνά στις περιπτώσεις με λεμφαδένα μετάσταση (62,5%) από ό, τι με τα άτομα χωρίς μετάσταση λεμφαδένα (44,3%), αλλά δεν υπήρξε καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης εζρίνη και το βαθμό στάδιο, περιφερειακό λεμφαδένα μετάσταση, και ο βαθμός διαφοροποίησης (

P

& gt? 0,05)

(Α) έκφραση Ezrin ήταν χαμηλή σε noncancerous ιστούς (μεγέθυνση 40 × και 200 ​​×.). (Β) Ezrin ήταν εντόνως εκφρασμένο σε γλώσσα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (μεγέθυνση 40 φορές και 200 ​​×). Ezrin ανοσοαντιδραστικότητα ήταν εμφανής στη μεμβράνη του φυσιολογικού επιθηλίου γλώσσας, ενώ θετική χρώση για εζρίνης ήταν κυρίως στο κυτταρόπλασμα ή στη μεμβράνη και κυτόπλασμα των κυττάρων γλώσσας πλακώδες καρκίνωμα.

Η

συσχετίσεις μεταξύ εζρίνης έκφρασης και οι δείκτες του Ki-67 και απόπτωσης σε ιστούς SCC ανθρώπινη γλώσσα

Είμαστε αξιολόγησε τις συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης ezrin και το Ki-67 και αποπτωτικών δεικτών σε ανθρώπινους ιστούς γλώσσα SCC. Ο δείκτης Ki-67 ήταν 33,0 ± 19,3% σε ιστούς με χαμηλά επίπεδα έκφρασης εζρίνη και 48,1 ± 15,0% σε ιστούς με υψηλά επίπεδα έκφρασης εζρίνη (Εικ. 2Α). Υπήρξε θετική συσχέτιση μεταξύ ezrin επίπεδα έκφρασης και του δείκτη Ki-67 (

P

= 0,0003). Η αποπτωτική δείκτης ήταν 0,60 ± 0,74% σε ιστούς με χαμηλά επίπεδα έκφρασης εζρίνη και 0,70 ± 0,78% σε ιστούς με υψηλά επίπεδα έκφρασης εζρίνη (Σχ. 2Β). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των ezrin επίπεδα έκφρασης και το αποπτωτικό δείκτη (

P

= 0,5776).

(Α) Ο δείκτης Ki-67 ήταν 33,0 ± 19,3% σε ιστούς με χαμηλό ezrin έκφρασης και 48,1 ± 15,0% σε ιστούς με υψηλή έκφραση ezrin. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν σε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης εζρίνη και του δείκτη Ki-67 (

P

= 0,0003). (Β) Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ezrin και αποπτωτικών δεικτών (

P

= 0,5776).

Η

γονιδιακής έκφρασης Ezrin στην γλώσσα SCC ανθρώπινη κυτταρική σειρά HSC-3 μετά το RNAi

για να εξετασθούν οι επιδράσεις της θεραπείας εζρίνης siRNA στα κύτταρα HSC-3, χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR και κηλίδωση Western για τη μέτρηση του mRNA εζρίνη και τα επίπεδα πρωτεΐνης, αντίστοιχα, στα κύτταρα HSC-3 τα οποία είχαν επιμολυνθεί με siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η έκφραση mRNA εζρίνης σαφώς αναστέλλεται στα εζρίνη-siRNA κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα NSC (0,10 ± 0,03 έναντι 1,06 ± 0,21?

P

& lt? 0,05). Η ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι η RNAi μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης εζρίνη (Σχ. 3Β).

(Α) έκφραση mRNA Ezrin αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου μετά RNAi. Η αναστολή της έκφρασης mRNA εζρίνης παρατηρήθηκε σαφώς σε εζρίνη siRNA επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη σε HSC-3 κύτταρα ελέγχου (0.10 ± 0.03 έναντι 1.06 ± 0.21?

P

& lt? 0,05). έκφραση της πρωτεΐνης (Β) Ezrin ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western μετά RNAi. Η έκφραση της εζρίνης μειώθηκε δραματικά σε ezrin siRNA επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα.

Η

Επιδράσεις της εζρίνης RNAi για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

επιμολυσμένα τα 3-HSC κυττάρων με ezrin siRNA και να συλλέγονται μετά από τρεις ημέρες για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι το κλάσμα Ο0 /Ο1 αυξήθηκε από 37,7% ± 4,9% έως 54,1% ± 0,5% (

P

= 0,0046) στα κύτταρα HSC-3 μετά RNAi (Εικ. 4). Σε αντίθεση, το S και G2 κλάσματα /M μειώθηκαν στα κύτταρα HSC-3 μετά RNAi. Ειδικότερα, οι αναλογίες των κυττάρων φάσης S μειώθηκε από 50,8% ± 1,6% έως 36,6% ± 0,4% (

P

= 0,0018), ενώ το ποσοστό των G2 /M κυττάρων μειώθηκε από 11,5% ± 3,3% σε 9,3% ± 0,9% (

P

= 0,1155). Δεν κύτταρα preG0 /G1 ή αποπτωτικά σώματα παρατηρήθηκαν στον έλεγχο και τα κύτταρα siRNA επιμολυσμένα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι εζρίνη siRNA μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρεμβαίνοντας με την κυτταρική μίτωση και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Το ποσοστό των HSC-3 κύτταρα στην φάση S μειώθηκε από 50,8 ± 1,6% έως 36,6 ± 0,4% μετά RNAi (

P

= 0,0018). Η αναλογία των κυττάρων στη φάση G0 /G1 αυξήθηκε επίσης από 37,7 ± 4,9% έως 54,1 ± 0,5% μετά RNAi (

P

= 0,0018). Απόπτωση δεν εντοπίστηκε.

Η

Επιδράσεις της εζρίνης RNAi στην κυτταρική ανάπτυξη

Τα αποτελέσματα της έκφρασης πρωτεΐνης εζρίνης στην κυτταρική ανάπτυξη ελέγχθηκαν με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως ΜΤΤ. Ο ρυθμός ανάπτυξης των εζρίνης siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα μειώθηκαν σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5). Οι τιμές απορρόφησης της δοκιμασίας ΜΤΤ μετά από 72 ώρες ήταν 0,36 ± 0,02 και 0,30 ± 0,01 για την NSC- και εζρίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα HSC-3, αντίστοιχα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι υπήρχε σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων στα εζρίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.

Η ανάπτυξη της εζρίνης siRNA-επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα μειώθηκαν σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. (24 ώρες:

P

= 0,6727? 48 h:

P

= 0,5314? 72 h:

P

= 0,0122? 96 h:

P

= 0,0065).

η

Επιδράσεις της εζρίνης RNAi για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

δοκιμασίες πληγών επούλωσης διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η κυτταρική κινητικότητα του NSC- και εζρίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Μια πληγή δημιουργήθηκαν σε έναν κυτταρική μονοστιβάδα, και το κλείσιμο του τραύματος εκτιμήθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία. Ezrin σίγηση στα κύτταρα HSC-3 μειωμένη ικανότητα τους να θεραπεύσουν μια πληγή σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα ελέγχου που εξέφραζαν εζρίνη (Εικ. 6). δοκιμασίες Εισβολή διεξήχθησαν επίσης χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους καλλιέργειας Transwell, και τα εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν μετά από 22 ώρες. Οι εζρίνη siRNA επιμολυσμένα κύτταρα παρουσίασαν τέσσερις φορές χαμηλότερος ρυθμός κυτταρικής εισβολής από τα NSC-επιμολυσμένα κύτταρα που εκφράζουν εζρίνη (564,7 ± 111,8 έναντι 1969,8 ± 126,6?

P

& lt? 0,05? Εικ. 7).

τα κύτταρα τραυματίες από το ξύσιμο με ένα ρύγχος πιπέτας, και μιτομυκίνη (3 mg /mL) προστέθηκε στο μέσο για 1 ώρα για να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ϋΜΕΜ επί 48 ώρες. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. HSC-3 κυτταρική μετανάστευση μειώθηκε με κατεργασία εζρίνης siRNA.

Η

(Α) Matrigel επικαλυμμένα θάλαμοι Transwell εχρησιμοποιήθησαν για την ανάλυση των κυττάρων εισβολής. Τα κύτταρα που διείσδυσαν διαμέσου του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν και βάφτηκαν, και αντιπροσωπευτικά πεδία φωτογραφήθηκαν. (Β) Τα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν με απαρίθμηση κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου HSC-3, οι εζρίνη siRNA επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη εισβολής (1969,8 ± 126,6 έναντι 564,7 ± 111,8?

P

& lt? 0,05).

Η

επιδράσεις της εζρίνης RNAi για ακτίνη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού

Είμαστε ανέλυσε τις επιπτώσεις της εζρίνης αρνητική ρύθμιση σχετικά με την οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Αναλύσεις κυττάρων φαλλοϊδίνη χρώση έδειξαν ότι σχηματισμός βάθρα σαφώς αναστέλλεται στα εζρίνης siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Εικ. 8). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η απουσία εζρίνης προκάλεσε μορφολογικές μεταβολές στα κύτταρα του καρκίνου μέσω της ακτίνης του κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση.

NSC- και εζρίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα HSC-3 σημάνθηκαν με ένα αντίσωμα έναντι της ακτίνης. εξάντληση Ezrin των HSC-3 κύτταρα οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης ezrin. Αυτό μειορρύθμιση συσχετίστηκε με την απώλεια προεξοχές (βέλη).

Η

οικογένειας Rho πρωτεΐνες, Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, και η έκφραση β-κατενίνης στα εζρίνη-εξαντλημένο κύτταρα

Δεν υπήρχαν διαφορές στα επίπεδα ολικής πρωτεΐνης του RhoA, Rac1, και Cdc42 (Εικ. 9), και τα επίπεδα των δραστικών μορφών τους ήταν πολύ χαμηλή για να ανιχνευθούν στις NSC- και εζρίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα.

η έκφραση της Ε-καδερίνης και β-κατενίνης αυξήθηκε και η έκφραση του Ν-καδερίνης μειώθηκε σε εζρίνη siRNA επιμολυσμένα HSC-3 κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη στα NSC-επιμολυσμένα κύτταρα. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα ολικής πρωτεΐνης του RhoA, Rac1 και Cdc42.

Η

ελέγξαμε εάν τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, και β-κατενίνη επηρεάστηκαν από εξάντληση εζρίνης στα κύτταρα HSC-3 με την ποσοτικοποίηση της έκφρασης τους χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 9, Ε-καδερίνη και εκφράσεις β-κατενίνης αυξήθηκαν, ενώ η έκφραση Ν-καδερίνης μειώθηκε στα εζρίνης siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σχέση με τα NSC-επιμολυσμένα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η καταστολή της έκφρασης πρωτεΐνης εζρίνης προκάλεσε την προς τα πάνω ρύθμιση της Ε-καδερίνης και β-κατενίνης, αλλά η ρύθμιση προς τα κάτω του Ν-καντερίνης στα κύτταρα HSC-3.

αναλύει Συζήτηση

Tissue μικροσυστοιχιών έδειξε ότι η υψηλή έκφραση ezrin ήταν σημαντικά πιο συχνή στους ιστούς της γλώσσας SCC ανθρώπινα από τα μη καρκινικούς ιστούς (

P

= 0.0046). Υπήρξε επίσης μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης εζρίνη και του δείκτη Ki-67 σε αυτή τη μελέτη. Το αντιγόνο Ki-67 εκφράζεται από πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα κατά τη διάρκεια της G1, S, G2, και Μ φάσεις, αλλά όχι κατά τη φάση G0 (κύτταρα ηρεμίας) [33]. Ki-67 χρησιμοποιείται ως δείκτης του πολλαπλασιασμού των όγκων και την επιθετικότητα, και μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στην πρόγνωση των ασθενών με HNSCC [34]. Υψηλή εζρίνη έκφραση έτειναν να ανιχνεύονται πιο συχνά σε περιπτώσεις με λεμφαδένα μετάσταση (62,5%) σε σχέση με εκείνους που δεν έχουν λεμφαδένα μετάσταση (44,3%). Μας

in vitro

πειράματα με τη χρήση της γλώσσας SCC ανθρώπινη κυτταρική σειρά HSC-3 με και χωρίς θεραπεία RNAi ανιχνεύεται επίσης τη σύνδεση μεταξύ εζρίνη υπερέκφραση και πιο επιθετική συμπεριφορά, ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των προτύπων έκφρασης εζρίνη και ΤΝΜ στάσης σε ανθρώπινους ιστούς γλώσσα SCC. Nicolas et al. ανέφερε επίσης καμία σημαντική διαφορά στην ezrin έκφρασης σε προχωρημένη και κάτω όγκων στάδιο TNM, ενώ τα υψηλά επίπεδα της εζρίνη και μοεσίνη έκφρασης που συνδέονται με την κακή επιβίωση του καρκίνου [35], [36]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι ezrin υπερέκφραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης ανεξάρτητα από TNM στάσης.

Το

in vitro

ρόλους των εζρίνης στην κυτταρική συμπεριφορά δεν έχουν αξιολογηθεί σε ΤΣΡ γλώσσα. πειραμάτων RNAi μας ανιχνεύθηκε ισχυρή καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, την κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα των HSC-3 κύτταρα γλώσσα SCC. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι η εξάντληση εζρίνης αύξησε την G0 κλάσμα /G1 αλλά μειώθηκε το κλάσμα G2-M παρεμβαίνοντας με την κυτταρική μίτωση και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με εκείνα που αναφέρθηκαν από τους Zhang et al. σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [37]. Ανέφεραν επίσης ότι εζρίνη θα μπορούσαν να ενισχύσουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με την υποστήριξη της κυτταρικής διαίρεσης και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου από G0 /G1 στην S και G2 /M φάσεις. Αυτό συμφώνησε με τα αποτελέσματα της μικροσυστοιχίες ιστού δείκτη Ki-67. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η εξάντληση εζρίνης αύξηση ανέστειλε κύτταρο σε μία δοκιμασία ΜΤΤ.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή είναι ουσιώδεις διεργασίες στην μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Μεταναστευτικά καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε μια σειρά από μορφολογικές αλλαγές μέσω της αναδιοργάνωσης των μορίων προσκόλλησης και των ινών ακτίνης [38]. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι η διαδικασία της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων περιλαμβάνει τέσσερα βασικά βήματα σχηματισμό και την επέκταση των filopodia και ελασματοπόδια βρίσκονται στην αιχμή, δημιουργία νέων θέσεων πρόσφυση στο μπροστινό μέρος, συρρίκνωση του κυτταρικού σώματος, και αποκόλληση των συμφύσεων κατά τη πίσω [39]. Παρατηρήσαμε ότι η εξάντληση ezrin μειώθηκε καρκινικών κυττάρων κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα και το σχηματισμό ανέστειλε βάθρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή εζρίνης διαταραχθεί αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, η οποία μείωσε την κινητικότητα και διεισδυτικότητα των κυττάρων HSC-3. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενες εκθέσεις, οι οποίες έδειξαν ότι οι αλλαγές στην κυτταροσκελετού μπορεί να είναι ένας βασικός παράγοντας στη ρύθμιση της νεοπλασματικής πρόοδο και την ανάπτυξη του όγκου [24], [40] – [43]. Μια προηγούμενη μελέτη ανιχνεύθηκε επίσης μια δραματική μείωση του αριθμού των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων με ρόδακες podosomal μετά τη θεραπεία εζρίνη RNAi και ανέφερε ότι ο σχηματισμός podosomes και ροζέτες τους οδηγήθηκε από εζρίνη-cortactin αλληλεπίδραση, η οποία έχει ένα ρόλο σε παγκρεατικά εισβολή του καρκίνου [44 ]. Μια άλλη έκθεση έδειξε ότι σχηματισμός ψευδοποδίου σαφώς μειώθηκε με κατεργασία εζρίνης RNAi σε τέσσερα ηπατοκυτταρικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος [37].

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι εζρίνη παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του επεμβατική κλώνοι ενός κυττάρου γλώσσας. Εξετάσαμε, επίσης, την ακτίνη, την οικογένεια πρωτεϊνών Rho, E-cadherin, N-cadherin, και β-κατενίνης για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν αυτές τις παρατηρήσεις. Βρήκαμε ότι η καταστολή εζρίνης προκάλεσε την αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και β-κατενίνης στα κύτταρα HSC-3. Είναι γνωστό ότι Ε-καδερίνης παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε επιθηλιακά προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και τη διατήρηση της επιθηλιακής ακεραιότητας αποικίας κυττάρου [45]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η απώλεια ή αναστολή της λειτουργίας Ε-καδερίνης, ή συνδεδεμένες κατενίνες του, οδηγεί σε μειωμένη ενδοκυτταρική συγκόλληση και αυξημένη επιθετική πιθανότητα [46]. Επιπλέον, διάφορες μελέτες επιθηλιακών κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένης της στοματικής ΕΕΑΚ έχουν προτείνει ότι το σύμπλοκο E-cadherin /β-κατενίνης ρυθμίζει εισβολή καρκίνου και μετάσταση [47], [48]. σύμπλοκα προσκόλλησης καδερίνης αλληλεπιδρούν με το ακτίνης κυτταροσκελετό σε ένα πολύπλοκο τρόπο, ο οποίος είναι ελάχιστα κατανοητή. Η τρέχουσα άποψη είναι ότι Ε-καδερίνης συνδέεται με την ακτίνη κυτταροσκελετό μέσω της αλληλεπίδρασής της με β-κατενίνη, η οποία με τη σειρά της δεσμεύει την πρωτεΐνη δεσμεύσεως της ακτίνης α-κατενίνης [49]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι εζρίνη είναι σημαντική για τον εντοπισμό της Ε-καδερίνης με την μεμβράνη του πλάσματος [24]. Έτσι, υποθέσαμε ότι η Ε-καδερίνης και β-κατενίνης συνδέονται με προς τα κάτω ρύθμιση εζρίνης υπερέκφραση μπορεί να συσχετισθεί με την αναδιαμόρφωση ακτίνης και το σχηματισμό των επεκτάσεων βάθρα.

Είναι ευρέως γνωστό ότι η ακτίνη αναδιοργάνωση ρυθμίζεται από την Rho οικογένεια μικρό GTPases όπως Rho, Rac και Cdc42 [50], δηλαδή, Rho ρυθμίζει ινών στρες και συναρμολόγηση εστιακή πρόσφυση, Rac ρυθμίζει το σχηματισμό των προεξοχών ελασματοπόδια και βολάν μεμβράνη, και Cdc42 προκαλεί η ύπαρξη φιλοποδίων στην περιφέρεια του κυττάρου [51]. Εξετάσαμε την έκφραση και τη δραστηριότητα των RhoA, Rac1, και Cdc42 στην εζρίνη siRNA- και NSC-επιμολυσμένα κύτταρα HSC-3.