Αφηρημένο

Ιστός εντοπισμό της γονιδιακής έκφρασης είναι ολοένα και πιο σημαντικό για την ακριβή ερμηνεία του μεγάλα σύνολα δεδομένων κλίμακας από την έκφραση και αναλύσεις μεταλλάξεων . Για το σκοπό αυτό, έχουμε (1) ανέπτυξε μια ισχυρή και επεκτάσιμη διαδικασία για την παραγωγή των ανιχνευτών υβριδισμού mRNA, παρέχοντας & gt? 95% ποσοστό επιτυχίας πρώτης διόδου στην παραγωγή καθετήρα σε οποιοδήποτε ανθρώπινο γονίδιο στόχο και (2) ενέκρινε μια αυτοματοποιημένη διαδικασία χρώσης για αναλύσεις ιστούς παραφίνης σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και μικροσυστοιχίες ιστού. Η

in situ

μοτίβα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης για τα γονίδια με γνωστή καθώς και άγνωστα πρότυπα έκφρασης ιστού αναλύθηκαν σε φυσιολογικούς και κακοήθεις ιστούς για την αξιολόγηση διαδικασία ειδικότητα και αν

in situ υβριδισμού

μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επικύρωση νέων αντισωμάτων. Έχουμε αποδείξει αντιστοιχία μεταξύ

in situ

πρότυπα μεταγραφή και πρωτεϊνική έκφραση των γνωστών βιοδεικτών παθολογία

KRT17

,

CHGA

,

MKI67

,

PECAM1

και

VIL1

, και να παρέχει ανεξάρτητη επικύρωση για νέα αντισώματα για να τα βιοδείκτες

BRD1

,

ΕΖΗ2

,

JUP

και

SATB2

. Η παρούσα μελέτη παρέχει μια βάση για την ολοκληρωμένη

in situ

γονίδιο που ή μεταγραφικό αναλύσεις των ανθρώπινων φυσιολογικών και καρκινικών ιστών

Παράθεση:. Kiflemariam S, Andersson S, Asplund Α, Pontén F, Sjöblom Τ (2012) Scalable

In Situ

υβριδοποίηση σε συστοιχίες ιστών για την επικύρωση του Καρκίνου Μυθιστόρημα και ιστο-ειδική βιοδείκτες. PLoS ONE 7 (3): e32927. doi: 10.1371 /journal.pone.0032927

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Σεπτεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 5 Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2012 |

Copyright: © 2012 Kiflemariam et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το σουηδικό Ίδρυμα Καρκίνου [11 0186] και το Ίδρυμα Beijer σε TS, και από το Ίδρυμα Wallenberg Knut και Alice [2002,0087] για να FP. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ακριβείς και συγκεκριμένες εντοπισμό των ιστών της γονιδιακής έκφρασης είναι καθοριστικής σημασίας για την ορθή ερμηνεία των δεδομένων μεταγραφικό από σύνθετα ιστούς, όπως οι όγκοι του ασθενούς. Η ταχεία συσσώρευση δεδομένων μετάλλαξης exome από όγκους αποδίδει επίσης νέες υποθετικές θεραπευτικούς στόχους, και επομένως είναι πολύτιμες για τη διερεύνηση της έκφρασης του γονιδίου του ιστού για την πρόβλεψη αποτελέσματα και παρενέργειες των νέων θεραπειών του καρκίνου. επικύρωση Ιδιαιτερότητα της διαγνωστικής και θεραπευτικής αντισωμάτων είναι μια άλλη εφαρμογή όπου

in situ

γονιδιακή έκφραση αναλύσεις θα μπορούσαν να συμβάλουν απαραίτητες γνώσεις. Να κάνουν βέλτιστη χρήση των εν λόγω

in situ

αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης στη βιολογία του καρκίνου, ένα ανάγκες (1) μεθόδους για την εύκολη και αποτελεσματική γενιά ανιχνευτών για κάθε γονιδίου στόχου, και (2) αυτοματοποιημένη και αποτελεσματικές διαδικασίες για την χρώση των σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) σε ιστούς και ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs).

in situ υβριδισμός (ISH) τεχνικές απασχολούν σημασμένους ανιχνευτές RNA για να αναλυθεί η έκφραση και ο εντοπισμός των συγκεκριμένων μεταγραφών mRNA σε ιστούς σε ανάλυση τύπο κυττάρου . Τέτοιοι ανιχνευτές συνήθως δημιουργούνται από

in vitro μεταγραφή

από το πλασμίδιο ή τα προϊόντα RT-PCR παρουσία ενός απτενίου συζευγμένου βάσης όπως διγοξιγενίνη-υΤΡ. Μετά την υβριδοποίηση, οι ανιχνευτές δεσμευμένα ανιχνεύονται με χρωμογόνο αντι-απτενίου ανοσοϊστοχημεία. Ενώ οι κατεψυγμένες τομές ιστού που χρησιμοποιείται πιο συχνά σε mRNA ISH, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν αρχειακό ιστούς FFPE και μικροσυστοιχίες ιστό [1]. Όπως mRNA ISH είναι τεχνικά δύσκολη και περιλαμβάνει πολλά πειραματικά στάδια, έχουν αναπτυχθεί πολλές διαφορετικές μορφές αυτοματισμού. Το σύστημα Tecan GenePaint είναι ένα ανοικτό ρομποτικό σύστημα που έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για τη χαρτογράφηση της μεταγραφικό ποντίκι σε κατεψυγμένα ιστούς [2], [3]. Εν συντομία, οι αντιδράσεις προϋβριδισμό, υβριδισμό και την ανίχνευση σήματος που εκτελείται σε ένα θάλαμο ροής, όπου ένα αυτοματοποιημένο σύστημα διαλύτη προσθέτει διαφορετικές λύσεις παράλληλα. Αυτό το σύστημα μαζί με την τεχνολογία ανίχνευσης επιτρέπει μία ημερήσια απόδοση έως διακόσια διαφάνειες [4]. προσπάθειες Proteome κλίμακα έχουν ήδη αποδείξει τη σκοπιμότητα της μεγάλης κλίμακας FFPE ανοσοχρώση [5], [6]. Συσχετίζοντας την έκφραση της πρωτεΐνης και του mRNA θα παρέχει μια ανεξάρτητη εργαλείο επικύρωσης τόσο για ανοσοϊστοχημεία (IHC) και ISH, και θα επιτρέψει την ανακάλυψη των ψευδώς θετικών οποιασδήποτε από τις μεθόδους.

Για να αποκτήσετε έναν ευέλικτο τρόπο για να αναλύσει την έκφραση ιστού των μεγάλων συνόλων γονιδίων σε μικροσυστοιχίες ιστό FFPE, δημιουργήσαμε μια απλή και κλιμακούμενη διαδικασία με βάση την PCR για την παραγωγή ανιχνευτών mRNA σε οποιοδήποτε γονίδιο στόχο στο ίδιο βιβλιοθήκη cDNA και να αναπτυχθούν περαιτέρω ένα αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης, όπου 48 γονίδια μπορεί να υποβάλλονται σε επεξεργασία σε 48 ιστούς ή TMAs σε ένα μόνο τρέξιμο. Στη συνέχεια επικύρωσε την ιδιαιτερότητα και την επεκτασιμότητα αυτής της προσέγγισης με παράλληλη ISH και IHC στόχευση γνωστό βιοδείκτες στην παθολογία. Τέλος, έχουμε αποδείξει την ειδικότητα των αντισωμάτων σε νέα βιοδείκτες ιστο-ειδικών ή καρκίνου χρησιμοποιώντας το

in situ υβριδισμού

.

Αποτελέσματα

βελτιστοποίηση Τεχνολογία

Δεκαεπτά γονίδια επιλέχθηκαν να αντιπροσωπεύουν καθιερωμένες βιοδείκτες παθολογία ή νέων βιολογικών δεικτών ιστο-ειδικών ή καρκίνο ανακαλυφθεί εντός της ανθρώπινης πρωτεΐνης σχέδιο Atlas [5]. Αυτά περιλαμβάνονται bromodomain περιέχει 1 (

BRD1

), χρωμογρανίνη-Α (

CHGA

), ιστονών-λυσίνη Ν-μεθυλοτρανσφεράσης (

ΕΖΗ2

), οικογένεια με ομοιότητα ακολουθίας 174 του μέλους Β (

FAM174B

), γλουταμινικό αποκαρβοξυλάση 1 (

GAD1

), Janus κινάση 3 (

JAK3

), διασταύρωση πλακοσφαιρίνης (

JUP

), κερατίνη 17 (

KRT17

), ν-ναι-1 Yamaguchi σάρκωμα ιογενή σχετικές ογκογονίδιο ομόλογο (

LYN

), ΜΙΧ1 ομοιοκυτίου-όπως 1 (

MIXL1

), το αντιγόνο Ki- 67 (

MKI67

), 6Α φωσφοδιεστεράσης (

PDE6A

), αιμοπεταλίων μόριο ενδοθηλιακών κυττάρων 1 (

PECAM1

), πρωτεΐνη τυροσίνης τύπου φωσφατάση C (

PTPRC

), ειδικά ΑΤ-πλούσια αλληλουχία δέσμευσης της πρωτεΐνης 2 (

SATB2

), villin1 (

VIL1

) και το δάχτυλο του ψευδαργύρου πρωτεΐνη 473 (

ZNF473

). Επιθυμητή προϊόντα PCR και RNA ανιχνευτές λήφθηκαν για όλα τα γονίδια (Σχήμα S1).

επόμενο καθοριστεί αν το μήκος του ανιχνευτή RNA επηρεάζει την ευαισθησία ή την ειδικότητα των σημάτων ISH χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές προσεγγίσεις. Στην πρώτη προσέγγιση, RNA ανιχνευτές για

CHGA

και

KRT17

ήταν κατακερματισμένη εις διπλούν χρησιμοποιώντας αλκαλικές και μέταλλο μεθόδους ιόντων καταλύεται να διερευνηθεί αν αυτή είναι μικρότερη το μήκος του ανιχνευτή θα έδινε ένα υψηλότερο σήμα λόγω της καλύτερης διείσδυση ιστού. Αμφότερα τα πρωτόκολλα προσαρμόστηκαν για χρήση με DIG-UTP-σημασμένο RNA ανιχνευτές. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο σήμα θα μπορούσε να θεωρηθεί μεταξύ κατακερματισμένη και μη θραυσματοποιημένου ανιχνευτές κατά την αξιολόγηση χρώση σε φυσιολογικό κόλον, νεφρό, ήπαρ, σπλήνα και αμυγδαλών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η δεύτερη προσέγγιση ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο οι μεγαλύτεροι ανιχνευτές θα έχουν αντίκτυπο στο σήμα ISH. Τρεις διαφορετικοί ανιχνευτές στόχευση

PDGFRB

(που προέρχεται από αιμοπετάλια βήτα υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα) με μήκη των 500 bp, 1000 bp και 1500 bp δημιουργήθηκαν. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο σήμα μεταξύ των μηκών καθετήρας θα μπορούσε να θεωρηθεί κατά την αξιολόγηση χρώση σε νεφρό σπειράματα, ωστόσο, το φόντο ήταν αυξημένη για 1000 bp και 1500 bp ανιχνευτές όταν συγκρίνονται με νόημα και αντινόημα RNA ανιχνευτές (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) [7].

Υιοθέτηση του συστήματος GenePaint για συστοιχίες ανθρώπινο ιστό

για να διευκολυνθεί η προσέγγιση μεγάλης κλίμακας, τη βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνάσης Κ εκτελέστηκε. Τρία γονίδια με διάφορα επίπεδα έκφρασης,

PDGFRB, KRT17

και βήτα ακτίνης (

ActB

), επιλέχθηκαν και αξιολογήθηκαν σε μια μικροσυστοιχία ιστού με φυσιολογικό κόλον, νεφρό, ήπαρ, σπλήνα και αμυγδαλών. Συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν ήταν 2,5, 5, 10, 20, 40, 60, 80 και 100 μg /ml. Για

ActB

μια συγκέντρωση 40 μg /ml ήταν επαρκής για να παρέχει σαφείς και διακριτές σήματα χωρίς να επηρεάζει τη μορφολογία ιστού. Για

KRT17

και

PDGFRB

, μία πρωτεϊνάση Κ συγκέντρωση 60 μg /ml ήταν η βέλτιστη κατά τη σύγκριση όλων των διαφορετικών ιστών στη συστοιχία και επομένως επιλέχθηκε για περαιτέρω πειράματα. Για να απεικονίσει τα γονίδια που εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα, διπλή κύκλους ενίσχυσης σήματος τυραμιδίου με βάση εισήχθη. Επιπλέον, η σπουδαιότητα των φρέσκων τομών ιστού έχει εξακριβωθεί από το ασθενές ή καθόλου σήμα παρατηρήθηκε για τομές ιστών μεγαλύτερα από 3 εβδομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επικύρωση της χρώσης ISH σε συστοιχίες ιστών

Διαδοχική τομές ιστού χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αίσθηση ISH ανιχνευτή, αντιπληροφοριακό ISH ανιχνευτή και ανοσοϊστοχημεία για να συγκριθεί η έκφραση του γονιδίου στο mRNA και το επίπεδο της πρωτεΐνης. Για ένα υποσύνολο των γονιδίων που αναλύθηκαν (

CHGA

,

KRT17

,

LYN

,

MKI67

,

PDE6A

,

PECAM1

,

PTPRC

και

VIL1

), πρότυπα έκφρασης πρωτεΐνης ανοσοϊστοχημείας που βασίζεται είναι γνωστές και καθιερωμένες. Οι στόχοι αυτοί χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν την έκφραση της πρωτεΐνης και των αντίστοιχων μεταγραφές για την επικύρωση της κλιμακούμενη διαδικασία ISH. Η ενδιάμεση πρωτεΐνη νήματος KRT17 ήταν, όπως αναμενόταν, εντόνως εκφρασμένο σε μια ευρεία επιλογή των διαφοροποιημένων επιθηλιακών κυττάρων, όπως καταδεικνύεται από χρώση του αμυγδαλών (Σχήμα 1, A-C και στο Σχήμα S3) και σε βρόγχο (Εικόνα S3). CHGA, ένας δείκτης για νευροενδοκρινικών διαφοροποίησης, έδειξαν ισχυρή χρώση στα νευροενδοκρινή κύτταρα του εντέρου (Σχήμα 1, D-F), σε παγκρεατικά νησίδια και ενδοκρινή όργανα, όπως το παραθυρεοειδούς (Σχήμα S3). Η καλά χαρακτηρισμένο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki-67 εκφράζεται σε G1, S, G2 και Μ φάσεις του κυτταρικού κύκλου και χρησιμοποιούνται συχνά για την αξιολόγηση πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα εντός όγκων. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα στη βάση των κανονικών εντερικών κρυπτών (Σχήμα 1, G-I), στο πρωκτικό αιδοίο και αμυγδαλές (Σχήμα S3) δείχνονται. Το σήμα ISH για Ki-67 ήταν εντοπισμένη σε συγκεκριμένες περιοχές του πυρήνα, σε συμφωνία με τα δεδομένα από το ποντίκι [8]. PECAM1 εκφράστηκε σε ενδοθηλιακά κύτταρα στα περισσότερα όργανα, παραδειγματικά με την πλούσια αγγειοποιημένου πλακούντα (Σχήμα 1, J-L), του ενδομητρίου (προ εμμηνόπαυση) και λεμφαδένα (Εικόνα S3). VIL1 είναι μία πρωτεΐνη που εκφράζεται σε σύνορα βούρτσα του επιθήλια και ως τέτοιες εντόνως εκφρασμένο σε νεφρικά σωληνάρια και αδενικά κύτταρα της γαστρεντερικής οδού, όπως το κόλον (Σχήμα 1, Μ-Ο), προσάρτημα και το δωδεκαδάκτυλο (Σχήμα S3). Επιπλέον, για

CHGA

,

PECAM1

και

VIL1

, δύο ανεξάρτητα ζεύγη ανιχνευτή RNA (Πίνακας S1) χρησιμοποιήθηκαν για την πολλαπλή επικύρωση της ειδικότητας καθετήρα. Ο ιστός και η κυτταρική πρότυπο κατανομής της έκφρασης και για τους δύο mRNA και της πρωτεΐνης ήταν παρόμοια για τα πέντε αυτά τα γονίδια, επιβεβαιώνοντας την ευαισθησία και ειδικότητα της αυτοματοποιημένης in situ υβριδισμού σε FFPE TMAs. Για PDE6A, IHC έδειξαν χρώση σε κυψελίδες, σκελετικό μυ, των βρόγχων και των κυττάρων στα νεφρικά σπειράματα. mRNA και πρωτεΐνη συσχέτιση παρατηρήθηκε μόνο σε δύο περιπτώσεις σκελετικών μυών. Ιδρύθηκε αντισωμάτων για LYN και PTPRC έδειξε διακριτή μεμβρανώδη και κυτταροπλασματική χρώση σε λεμφοειδείς ιστούς και αδενικά κύτταρα του γαστρεντερικού σωλήνα, και επιλεκτική κυτταροπλασματική χρώση στο λεμφικό ιστό, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της πρωτεΐνης και της έκφρασης του mRNA (Σχήμα S5). Για

PTPRC

, η έλλειψη χρώση ISH ήταν σταυρό επικυρωθεί με δύο ανεξάρτητα ζεύγη ανιχνευτή RNA (Πίνακας S1).

Τα σήματα ISH θεωρηθεί ως μπλε /μωβ χρώση με πυρήνες αντιχρώσθηκαν σε μεθυλ πράσινο, λαμβάνοντας υπόψη ότι η IHC σήματα είναι σε καφέ με αιματοξυλίνης.

Α-Γ

: κερατίνη 17 (

KRT17

) στην αμυγδαλή,

D-F

: Χρωμογρανίνης Α (

CHGA

) στο παχύ έντερο,

G-I

: Ki-67 (

MKI67

) στο παχύ έντερο,

J-L

: αιμοπεταλίων μόριο ενδοθηλιακών κυττάρων 1 (

PECAM1

) στον πλακούντα ,

Μ-Ο

: βιλλίνη-1 (

VIL1

) στο παχύ έντερο. συστοιχίες ιστών υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτές ελέγχου αίσθηση (Α, D, G, J, Μ), αντινοηματικοί ανιχνευτές (Β, Ε, Η, Κ, Ν), ή ανοσοχρώση με αντισώματα (C, F, I, L, Ο) στόχευσης το αντίστοιχο μεταγραφές ή τα προϊόντα πρωτεΐνης. Όλες οι εικόνες προέρχονται από διαφάνειες σαρωθεί με 40 × στόχος.

Η

Εκκαθάριση των νέων βιοδεικτών αντισώματος από ISH σε συστοιχίες ιστών

Η έκφραση του αντισώματος που προέρχονται από το έργο Ανθρώπινη Πρωτεΐνη Atlas προτεινόμενες είτε μια ιστο-ειδική έκφραση ή την κλινική χρησιμότητα στη διαγνωστική του καρκίνου ή θεραπεία για τις νέες υποθετικές βιοδείκτες

BRD1

,

ΕΖΗ2

,

FAM174B

,

GAD1

,

JAK3

,

JUP

,

MIXL1

,

SATB2

και

ZNF473

. Ως εκ τούτου, η ανάλυση των

in situ

έκφραση τους mRNA και πρωτεΐνης σε κανονικούς ιστούς θα μπορούσε να παρέχει την επικύρωση της ειδικότητας του αντισώματος. BRD1 είναι γνωστό με ανοσοϊστοχημεία να εκφράζονται σε Purkinje και νευρωνικά κύτταρα στο ΚΝΣ, κύτταρα σε seminiferus αγωγούς σε όρχεις, αδενικά κύτταρα στον προστάτη, στα επινεφρίδια και το προσάρτημα, και μακροφάγα στον πνεύμονα, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με ISH (Εικόνα 2, A-C και το Σχήμα S4). ΕΖΗ2 είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης του καρκίνου ως υπερέκφραση της πυρηνικής πρωτεΐνης φαίνεται σε μία ποικιλία επιθετικών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ο καρκίνος του προστάτη και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα [9]. Η γονιδιακή έκφραση βρέθηκε τόσο μεταγραφής (κυτταροπλασματική χρώση) και πρωτεΐνης (πυρηνική χρώση) σε αδενικά κύτταρα στο προσάρτημα (Σχήμα 2, D-F), του δωδεκαδάκτυλου και σάλπιγγα (σχήμα S4), κύτταρα σε seminiferus αγωγούς σε όρχεις και μυοκύτταρα στην καρδιά μυς. JUP προτάθηκε από την IHC να είναι μια ιστο-ειδική βιοδείκτη εκφράζονται σε εξαρτηματικές και επιδερμικά κύτταρα του δέρματος, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με ISH (Σχήμα 2, G-I) και σε πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα του αμυγδαλών (Σχήμα S4). SATB2 είναι μία νέα βιοδείκτης για καρκίνο του παχέος εντέρου [10], όπου προφίλ γονιδιακής έκφρασης έδειξε σύνδεση της μεταγραφικής αρνητική ρύθμιση με μετάσταση και φτωχή πρόγνωση [11]. Αντισώματα προς SATB2 έδειξε πυρηνική χρώση σε αδενικά κύτταρα του κατώτερου γαστρεντερικού σωλήνα, συμπεριλαμβανομένης της κολονικής κρύπτης κύτταρα (Σχήμα 2, L). Ταυτόχρονη συστοιχία ISH επιβεβαίωσε SATB2 έκφραση μεταγράφου σε κυτόπλασμα περιορίζεται στο επιθήλιο του προσαρτήματος, κόλον (Εικόνα 2, J-Κ) και του ορθού (Σχήμα S4), αλλά όχι σε άλλα όργανα. Για την επικύρωση των τεσσάρων αυτών νέων βιολογικών δεικτών, δύο ζεύγη ανιχνευτών ανεξάρτητες RNA χρησιμοποιήθηκαν για κάθε γονίδιο (Πίνακας S1). GAD1 έδειξαν παρόμοια ISH και χρώση IHC σε κύτταρα Purkinje και τα κύτταρα στη μοριακή στιβάδα της παρεγκεφαλίδας, αλλά δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση σε άλλους ιστούς. Η εξειδίκευση των νέων αντισωμάτων σε

FAM174B

,

JAK3

,

MIXL1

και

ZNF473

δεν ήταν δυνατό να επαληθευτεί από ISH (Σχήμα S5). Για

JAK3

, η έλλειψη χρώση ISH ήταν σταυρό επικυρωθεί με δύο ανεξάρτητα ζεύγη ανιχνευτή RNA, αλλά για

FAM174B

,

MIXL1

και

ZNF473

, μόνο ένα ζευγάρι ανιχνευτής θα μπορούσε να σχεδιαστεί οφείλονται είτε σε πάρα πολύ σύντομο κωδικές περιοχές της πρωτεΐνης ή πολύ υψηλή ομολογία με άλλα γονίδια (Πίνακας S1).

τα σήματα ISH θεωρηθεί ως μπλε /χρώση μωβ με πυρήνες αντιχρώσθηκαν σε μεθυλ πράσινο, ενώ IHC σήματα είναι σε καφέ με αιματοξυλίνης.

Α-Γ

: Bromodomain περιέχει 1 (

BRD1

) σε επινεφρίδια,

D-F

: ιστόνης-λυσίνη Ν-μεθυλοτρανσφεράσης (

ΕΖΗ2

) στο προσάρτημα (πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση για την πρωτεΐνη και mRNA, αντιστοίχως),

G-I

: Junction πλακοσφαιρίνης (

JUP

) στο δέρμα,

J-L

: Ειδικές πλούσια σε ΑΤ αλληλουχία δέσμευσης της πρωτεΐνης 2 (

SATB2

) στο παχύ έντερο (πυρηνικά και κυτταροπλασματική χρώση για πρωτεΐνη και mRNA, αντιστοίχως). συστοιχίες ιστών υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτές ελέγχου αίσθηση (Α, D, G, J), αντινοηματικοί ανιχνευτές (Β, Ε, Η, Κ), ή ανοσοχρώση με αντισώματα (C, F, I, L) με στόχο τις αντίστοιχες μεταγραφές ή τα προϊόντα πρωτεΐνης . Όλες οι εικόνες προέρχονται από διαφάνειες σαρωθεί με 40 × στόχος.

Η

Παράλληλες αναλύσεις της πρωτεΐνης SATB2 και της έκφρασης μεταγραφή για FFPE συστοιχίες καρκίνο του παχέος εντέρου

Η πρωτεΐνη και η έκφραση του mRNA της SATB2 αξιολογήθηκε σε του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας μια συστοιχία που περιλαμβάνει 60 πρωτογενείς όγκους εις διπλούν. Σχολιασμός έγινε με βάση μια κλίμακα τριών ποιότητας. Ένα ζευγάρι δεν περιείχε ιστό όγκου, και των υπολοίπων 59 δείγματα, 44 έδειξε πλήρη συμφωνία μεταξύ IHC και έκφραση ISH σε αδενικά κύτταρα (Σχήμα 3). Δώδεκα έδειξε ημι συμφωνία όπως παρατηρήθηκε χρώση, αλλά με διαφορετικές εντάσεις, ενώ 3 δείγματα εμφανίζεται καμία συσχέτιση. Συμφωνία μεταξύ της πρωτεΐνης και του τρόπου έκφρασης του mRNA παρατηρήθηκε σε ένα σύνολο 56 δειγμάτων (τεστ kappa του Cohen, κ = 0,68).

σήματα ISH θεωρούνται μπλε /χρώση μωβ με πυρήνες αντιχρώσθηκαν στο πράσινο μεθύλιο, ενώ τα σήματα IHC είναι σε καφέ με αιματοξυλίνης. συστοιχίες ιστών υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτή ελέγχου αίσθηση (Α, D, G, J), αντιπληροφοριακό ανιχνευτή (Β, Ε, Η, Κ) ή ανοσοχρώση με το αντίσωμα (C, F, I, L). Όλες οι εικόνες προέρχονται από διαφάνειες σαρωθεί με 40 × στόχος.

Η

Συζήτηση

Κλιμάκωση ISH προσεγγίσεις για τον καθορισμό γονίδιο ή αναλύσεις exome κλίμακα απαιτεί αγωγών για τη σύνθεση ανιχνευτή, υβριδισμός, ανάλυση και σχόλιο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η πολλή δουλειά έδαφος έχει πραγματοποιηθεί στο πλαίσιο των μεγάλων μελετών μεταγραφικό ποντικιού σε κατεψυγμένα ιστούς, τροποποιήσεις είναι απαραίτητες για την επιτυχή και επαναλήψιμη ISH στα υλικά FFPE. Για τη σύνθεση εύκολη ανιχνευτή, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η προσεκτική πληροφορικής σε συνδυασμό με τη χρήση ενός συγκεντρωτική βιβλιοθήκη cDNA ανθρώπινου (MegaMan) συνεπάγεται ένα υψηλό ποσοστό επιτυχίας πρώτης διόδου στην παραγωγή πρότυπο ανιχνευτή. Αυτή η βιβλιοθήκη cDNA περιλαμβάνει mRNA από 32 ανθρώπινους ιστούς και 34 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές εξασφαλίζει μια καλή αναπαράσταση της μετεγγραφής με ποικίλα επίπεδα έκφρασης και παραλλαγές ματίσματος. Παράλληλα έργα, η προσέγγιση αυτή έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για να δημιουργήσει ένα σύνολο 700 ανιχνευτών με ένα ποσοστό επιτυχίας πρώτης διόδου του & gt? 95% (τα δεδομένα δεν φαίνονται) .Essential παράγοντες για την επιτυχή χρώση που διαφέρουν από τα προηγούμενα δημοσιευμένα διαδικασίες που χρησιμοποιούν τα κατεψυγμένα ιστοί ήταν η χρήση προσφάτως τομή ιστού, αφού ασθενή ή καθόλου χρώση παρατηρήθηκε για τα μεγαλύτερα τμήματα ιστών FFPE πιθανόν λόγω της οξείδωσης του RNA στην εκτεθειμένη επιφάνεια ή μη ικανοποιητικές συνθήκες στερέωσης που επηρεάζουν την ποιότητα του RNA, μία υψηλότερη συγκέντρωση πρωτεϊνάσης Κ, και δύο κύκλους τυραμιδίου βιοτίνης με έδρα την ενίσχυση του σήματος. Παρά το γεγονός ότι ο τελευταίος μπορεί να οδηγήσει σε ελαφρώς υψηλότερα επίπεδα υποβάθρου, είναι σύμφωνα με την εμπειρία μας, ένας βολικός τρόπος για να αυξηθεί η ένταση του σήματος.

Η ειδικότητα και η ευαισθησία των ISH αξιολογήθηκε διεξοδικά με χρώση των διαδοχικών τμημάτων από το ίδιο TMAs περιλαμβάνει ~ 40 φυσιολογικό τύπους ιστού στο ανθρώπινο σώμα. Τα σχέδια χρώση ISH και IHC του

KRT17

,

CHGA

,

MKI67

,

PECAM1

και

VIL1

ήταν πανομοιότυποι σε ολόκληρη ιστού τύπων, μια επιλογή από αντιπροσωπευτικά δείγματα δείχνονται στο Σχήμα 1 και Σχήμα S3, παρέχοντας έτσι ισχυρή επικύρωση της προσέγγισης ISH. Αυτός ο υψηλός βαθμός αντιστοιχίας είναι σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις από τα έργα μεταγραφικό ποντίκι. Ωστόσο, μια τόσο αναγκαία βελτίωση επιτρέπουν την αποδοτική εξόρυξη δεδομένων της ISH και IHC είναι μια τυποποιημένη οντολογία για σχολιασμό των ανθρώπινων ιστών, σε αναλογία με την ανατομία EMAP ποντίκι οντολογία [3].

Το αντίσωμα ευαισθησία και ειδικότητα είναι ένα σημαντικό ανησυχία στην ανοσοϊστοχημεία, ειδικά σε έργα μεγάλης κλίμακας, όπου πολλά αντισώματα που παράγονται στην επίτευξη των στόχων με άγνωστα πρότυπα έκφρασης. επικύρωση εξειδίκευση των αντισωμάτων για διαγνωστικούς βαθμού μπορεί να πραγματοποιηθεί με λήψη πολύ παρόμοια μορφή χρώσης με ένα αντίσωμα που δημιουργείται σε ένα διαφορετικό επίτοπο του ιδίου αντιγόνου [6], η απώλεια του σήματος σε ποντίκια knock-out ή άλλο μοντέλο οργανισμός, ή πολύ παρόμοιες πρότυπο χρώσης με

in situ υβριδισμού

. Εμείς εδώ αποδεικνύουν τη σκοπιμότητα της τελευταίας προσέγγισης σε κλίμακα οργανισμού στον άνθρωπο, όπως TMAs περιλαμβάνει σχεδόν όλους τους φυσιολογικούς ιστούς μπορεί να αναλυθεί σε ένα μόνο πείραμα. Ήμασταν σε θέση να επαληθεύσει την εξειδίκευση των νέων αντισωμάτων να

BRD1

,

ΕΖΗ2

,

JUP

και

SATB2

, με δύο ανεξάρτητα ζεύγη ανιχνευτή RNA, επιβεβαιώνοντας ότι ISH μπορεί να παρέχει ανεξάρτητη επικύρωση ειδικότητα. Μια επιλογή από αντιπροσωπευτικά δείγματα φαίνεται στο Σχήμα 2 και Σχήμα S4. Παράλληλα πειράματα, ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει την εξειδίκευση των νέων αντισωμάτων σε

FAM174B

,

JAK3

,

MIXL1

και

ZNF473

(Σχήμα S5) . Το ημι-συσχέτιση μεταξύ mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης για

GAD1

και

PDE6A

μπορεί να οφείλεται είτε ειδικότητας ή διαφορές στα μεταγραφικά και μεταφραστικά διεργασίες αντισώματος. Η έλλειψη συσχετισμού μεταξύ του mRNA και της έκφρασης της πρωτεΐνης για

LYN

και

PTPRC

μπορεί να οφείλεται σε βιολογικούς και τεχνικούς λόγους. Τα αντισώματα για

LYN

και

PTPRC

στοχεύετε όλες τις γνωστές ισομορφές των πρωτεϊνών και τα ζεύγη ανιχνευτή RNA που βρίσκονται σε περιοχές οι οποίες είναι παρούσες σε όλες τις γνωστές μεταγραφές. Επίσης, για PTPRC, χρησιμοποιήθηκαν δύο ζεύγη ανιχνευτών ανεξάρτητες RNA, επιδεικνύοντας έλλειψη χρώσης ISH μεταξύ μεταξύ TMA αντιγράφεται. Επομένως, πιστεύουμε ότι η έλλειψη συσχετισμού μεταξύ mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης οφείλεται πιθανότατα σε βιολογικούς λόγους, όπως μετα-μεταγραφική, μεταφραστική και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που επηρεάζουν τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης. Επίσης, mRNA φθορά και την ημιζωή της πρωτεΐνης θα μπορούσε να έχει επιπτώσεις στην mRNA και της πρωτεΐνης συσχέτιση. Άλλες πηγές ασυμφωνίας μεταξύ IHC και ISH θα μπορούσε να είναι η έλλειψη ευαισθησίας ή ειδικότητας σε οποιαδήποτε μία από τις προσεγγίσεις? αυτό επιτρέπει την ερμηνεία των συγκλίνουσες χρώσης ως υποστηρικτικά της ειδικότητας του αντισώματος και ασύμφωνα μοτίβα όπως η έλλειψη εξειδίκευσης. Σε μεγάλες προσπάθειες κλίμακα, αντισώματα με τα πρότυπα χρώσης σύμφωνη ISH πρέπει να δοθεί προτεραιότητα για περαιτέρω αναλύσεις, σε αντίθεση με τα αντισώματα με ασύμφωνα ή λείπει ISH χρώση.

SATB2

, ένας παράγοντας μεταγραφής πυρηνικής μήτρας που σχετίζονται και ένα μέλος της οικογένειας των ειδικών πλούσια σε ΑΤ δεσμευτικές πρωτεΐνες, έχει πρόσφατα δειχθεί ότι εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα του κατώτερου γαστρεντερικού σωλήνα και σε καρκινικά κύτταρα του παχέος προέλευσης. Λόγω της εξαιρετικά συγκεκριμένο μοτίβο πυρηνική έκφραση σε κανονικά και κακοήθη κύτταρα του γαστρεντερικού σωλήνα, η έκφραση της πρωτεΐνης SATB2 προτάθηκε ως κλινικά χρήσιμο διαγνωστικό βιοδείκτη για παχέος εντέρου, η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στον κόσμο [10]. δοκιμή Κάππα του Cohen έγινε για να καθοριστεί η συμφωνία μεταξύ IHC και χρώση ISH, επιδεικνύοντας καλή αξιοπιστία μεταξύ των αξιολογητών. Η κλιμακούμενη τεχνολογία παρουσιάζονται εδώ επιτρέπει επίσης αναλύσεις σύνολο έκφραση γονιδίων σε συστοιχίες ανθρώπινο ιστό. Οραματιζόμαστε ότι η kinome τυροσίνη, phosphatome τυροσίνη, άλλα γονίδια σε μονοπάτια του καρκίνου, μαζί με ένα πλήθος νέων γονιδίων υποψηφίου του καρκίνου που προέρχεται από exome και της αλληλουχίας του γονιδιώματος αποτελούν πρωταρχικούς στόχους για μεγάλης κλίμακας

in situ υβριδισμού

με βάση το χαρακτηρισμό. Προτείνουμε ότι η ολοκληρωμένη και συστηματική χαρτογράφηση της έκφρασης

in situ

σε φυσιολογικά και κακοήθεις ανθρώπινους ιστούς σε ανάλυση τύπο κυττάρου θα προσφέρει πολύτιμες γνώσεις, ιδίως όσον αφορά την ανάπτυξη του καρκίνου των ναρκωτικών και τα αποτελέσματα μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη αποτελεσμάτων, οδηγός επανατοποθέτηση διαθέσιμες στοχευμένα φάρμακα, και να βοηθήσει στην πρόβλεψη ανταπόκρισης στα φάρμακα που αναστέλλουν πολλούς διαφορετικούς μοριακούς στόχους. Παρέχει επίσης την τεχνική βάση για τη χαρτογράφηση έκφραση απομαγνητοφώνηση των ανθρώπινων γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, και ενδεχομένως και άλλα είδη RNA, σε συστηματικές προσεγγίσεις ολόκληρου του γονιδιώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η χρήση των συστοιχιών ιστού ΗΡΑ σε αυτή τη μελέτη αυτή καλύπτεται από το ΗΡΑ ηθική άδεια (EPN Ουψάλα 2002/577, 2005/338) και ηθικές άδεια για τους ερευνητές (EPN Ουψάλα 2007/116). Οι ταυτότητες των δειγμάτων είναι παραταγμένοι ιστού δεν είναι γνωστά στους ερευνητές, ούτε και πρόκειται να κυκλοφορήσει μέσα στο δημόσιο τομέα.

γενιάς Probe

Η διαδικασία δημιουργίας ανιχνευτής περιγράφεται στο σχήμα S2. Έχουμε αναπτύξει ένα λογισμικό in-house που επιλέγει περιοχές μεταγραφή κατάλληλο για το σχεδιασμό ανιχνευτή υβριδισμού στα γονίδια που ενδιαφέρουν με την ελαχιστοποίηση ομολογίας με μεταγραφές των άλλων γονιδίων στο ανθρώπινο μεταγραφικό REFSEQ, διασφαλίζοντας ότι οι αλληλουχίες ανιχνευτών είναι παρόντες σε μεταγραφές REFSEQ του γονιδίου ενδιαφέροντος και συμπεριλαμβανομένων των περιφερειών να καλύπτουν τα όρια εξόνιο. Δύο ανεξάρτητες ομάδες εκκινητών PCR για την ενίσχυση του 500-600 προϊόντων nt δημιουργήθηκαν για κάθε γονίδιο χρησιμοποιώντας Primer3 [12]. Μία αλληλουχία υποκινητή Τ7 (5′-GCGTAATACGACTCACTATAGGG-3 ‘) ενσωματώθηκε στο 5’-άκρο του προς τα εμπρός ή αντίστροφο εκκινητή, αντίστοιχα, για να δημιουργηθεί το νόημα ή αντινόημα πρότυπο ριβοανιχνευτής. Όλα τα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή ανιχνευτής συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

MegaMan ανθρώπινη βιβλιοθήκη μεταγραφικό Stratagene, μια συλλογή cDNA που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας mRNA από 32 ανθρώπινους ιστούς και 34 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιήθηκε για PCR (www. genomics.agilent.com). Κάθε αντίδραση περιείχε 2 μΐ 10 Χ ρυθμιστικό διάλυμα PCR (166 mM (ΝΗ

4)

2SO

4, 670 mM Tris ρΗ 8,8, 100 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 67 mM MgCl

2), 2 μl dNTPs (10 mM, GE Healthcare, Uppsala, Sweden), 1,2 μΙ DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA), 0.4 μΙ πρόσθιου εκκινητή (50 μΜ, Sigma-Aldrich), 0,4 μΙ αντίστροφου εκκινητή (50 μΜ, Sigma-Aldrich), 0,2 μΙ Taq πολυμεράση (5 υ /μΙ, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 μΐ βιβλιοθήκη MegaMan ανθρώπινη μεταγραφικό (160 ng /μl, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)) και MilliQ νερό σε ένα όγκο 20 μΐ. Οι συνθήκες PCR touchdown περιλαμβάνονται θερμοκρασίες ανόπτησης κυμαίνονται από 64 ° C έως 57 ° C? 96 ° C για 2 λεπτά? 3 κύκλους 96 ° C για 10 s, 64 ° C για 10 s και 70 ° C για 30 s? 3 κύκλους 96 ° C για 10 s, 61 ° C για 10 s και 70 ° C για 30 s? 3 κύκλους 96 ° C για 10 s, 58 ° C για 10 s και 70 ° C για 30 s? 41 κύκλοι των 96 ° C για 10 s, 57 ° C για 10 s και 70 ° C για 30 s, και μια τελική επέκταση επί 5 λεπτά στους 70 ° C. Τα προϊόντα PCR έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,25% για την επιβεβαίωση του μεγέθους του προϊόντος. Και αντιπληροφοριακοί ριβοανιχνευτές επισημάνθηκε με διγοξιγενίνη παρήχθησαν με

in vitro μεταγραφή

των προϊόντων PCR με DIG RNA μείγμα σήμανσης (Roche, Rotkreuz, Ελβετία) σε ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 5 μΙ. Ένα μg κάθε ανιχνευτή RNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 6% ΤΒΕ-ουρίας γέλης (Invitrogen) για επιβεβαίωση του μεγέθους. Αποθέματα έγιναν με αραίωση RNA ανιχνευτές με MilliQ νερό έως 200 ng /μl και αποθηκεύονται σε -80 ° C. Probe διαλύματα εργασίας του 20 ng /μl έγιναν από μητρικά διαλύματα και αποθηκεύονται σε -20 ° C.

RNA ανιχνευτές κατακερματισμένη χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές προσεγγίσεις. Για αλκαλική καταλυόμενη κατακερματισμό, δίνοντας τα θραύσματα που κυμαίνονται από 50-150 bp, RNA ανιχνευτές υποβλήθηκαν σε πέψη με 0.2 Μ ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού νατρίου (ρΗ 10,2) στους 60 ° C. Ο χρόνος επώασης υπολογίζεται από t = L

0-L

f /

k

L

0L

f, όπου t είναι ο χρόνος επώασης μέσα σε λίγα λεπτά, L

0 και εάν L

f είναι το αρχικό και τελικό μήκος του καθετήρα σε kb, και

k

είναι η σταθερά ταχύτητας υδρόλυσης (περίπου 0,11 kb

-1min

-1). Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με την προσθήκη οξικού νατρίου (ρΗ 4.7) και τα δείγματα κατακρημνίστηκαν με αιθανόλη [13]. Ένα μg κάθε ανιχνευτή RNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 6% γέλη ΤΒΕ-ουρίας για την επιβεβαίωση του μεγέθους. Για μέταλλο κατακερματισμός ιόντων καταλύεται, δίνοντας τα θραύσματα μεταξύ 60-200 bp, RNA ανιχνευτές επωάστηκαν με 100 mM χλωριούχο ψευδάργυρο σε 100 mM Tris-HCl (ρΗ 7) στους 70 ° C για 15 λεπτά. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με 0.5 Μ EDTA (ρΗ 8) [14]. Ένα μg κάθε ανιχνευτή RNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 6% γέλη ΤΒΕ-ουρίας για την επιβεβαίωση του μεγέθους.

Παρασκευή ιστού

Οι συστοιχίες ιστών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι τυποποιημένες διατάξεις που χρησιμοποιούνται για ανοσοϊστοχημεία σε ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas του έργου (www.proteinatlas.org). Αυτές οι σειρές περιλαμβάνουν τριπλούν πυρήνες 1-mm 48 διαφορετικών τύπων μη κακοήθων ανθρώπινων ιστών [15] και εις διπλούν πυρήνες 1-mm του πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου [10]. μικροσυστοιχίες ιστών με FFPE όγκων και των φυσιολογικών ιστών κόπηκαν σε 6 μm και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια μικροσκοπίου Superfrost Plus.

Σε situ υβριδισμού

Τομές ιστού αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο, που ακολουθείται από ενυδάτωση σε διαβαθμισμένη αιθανόλη σειρά (100%, 95% και 80%, 3 λεπτά σε καθένα). Ο υβριδισμός ήταν αυτοματοποιημένη χρησιμοποιώντας Tecan GenePaint (Tecan Ag, Männedorf, Switzerland) ουσιαστικά όπως περιγράφεται [2], [4], [16]. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Εν συντομία, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε σε 0,7% Η

2O

2 σε μεθανόλη, που ακολουθείται από αποπρωτεΐνωση σε 0.2 Μ HCl και πέψη με 60 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ (Roche). Οι τομές ιστού προ-υβριδοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό υβριδισμού (Ambion, Foster City, CA, USA) χωρίς ιχνηλάτη επί 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με 200 ng /ml σημασμένο με διγοξιγενίνη ριβοανιχνευτή για 4 ώρες στους 64 ° C. Μετά την υβριδοποίηση, τα τμήματα του ιστού πλύθηκαν σε 5 × κιτρικό αλατούχο-νάτριο (SSC), 50% φορμαμίδιο και 0,1 χ SSC. Για την ανίχνευση συνδεδεμένου ανιχνευτή, προστέθηκε ένα αντίσωμα αντι-διγοξιγενίνης (150 U /ml, Roche) συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Μετά από πέντε πλύσεις σε ρυθμιστικό αποκλεισμού, ένα στάδιο ενίσχυσης τυραμιδίου βιοτίνη διεξήχθη για την αύξηση της in situ ευαισθησία ανίχνευσης (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA). Το αποτεθέν βιοτίνη ανιχνεύθηκε με συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση neutravidin (2 mg /ml, ThermoScientific, Waltham, ΜΑ, USA), η οποία διασπά το χρωμογονικό nitroblue υπόστρωμα τετραζολίου (ΝΒΤ) 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολύλιο (ΒΟΙΡ ) για να παραχθεί ένα μπλε /πορφυρό ίζημα στη θέση υβριδισμού. Μετά από 30 λεπτά χρόνο ανάπτυξης, το χρωμογόνο αντίδραση σταμάτησε με επώαση των τομών ιστού σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει EDTA, ακολουθούμενη από σταθεροποίηση σε 4% PFA. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 2% πράσινου μεθυλίου και τα πλακίδια αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένες αλκοόλες και τοποθετήθηκαν σε ένα μέσο με βάση ρητίνη.

Ανοσοϊστοχημεία

Εν συντομία, πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, ενυδατώνονται σε διαβαθμισμένες αλκοόλες και αποκλείστηκαν για ενδογενούς υπεροξειδάσης σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% αραιωμένο σε 95% αιθανόλη. Για την ανάκτηση του αντιγόνου, ένας θάλαμος decloaking (Biocare Ιατρική, Walnut Creek, Καλιφόρνια? USA) χρησιμοποιήθηκε. Τα πλακίδια βυθίστηκαν και βράζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού, ρΗ 6 (Lab Vision, Värmdö, Σουηδία) για 4 λεπτά στους 125 ° C και στη συνέχεια αφέθηκε να ψυχθεί στους 90 ° C. Αυτοματοποιημένη IHC διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφεται [17], με τη χρήση ενός οργάνου Autostainer 480 (Lab Vision). Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Πίνακας S2) και ένα σύστημα δεξτράνης πολυμερές οπτικοποίησης (UltraVision LP HRP πολυμερές, Lab Vision) για 30 λεπτά καθένα σε θερμοκρασία δωματίου και πλάκες αναπτύχθηκαν για 10 min με τη χρήση διαμινοβενζιδίνης (Lab Vision) ως χρωμογόνο. Όλες οι επωάσεις που ακολουθείται από ένα ξέπλυμα σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Lab Vision). Διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη Μάγιερ (Histolab, Γκέτεμποργκ, Σουηδία) και το κάλυμμα γλίστρησε χρησιμοποιώντας PERTEX (Histolab) ως μέσο στήριξης.