Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος 4 (PDCD4), ταυτοποιήθηκε αρχικά ως το νεοπλασματικό μετασχηματισμό αναστολέα, εξασθένησε σε διάφορους τύπους καρκίνου. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε μια συνεχή ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης PDCD4 στην αλληλουχία του φυσιολογικού οριακά-κακοήθη δείγματα ωοθηκικού ιστού και μια σημαντική συσχέτιση της έκφρασης PDCD4 με ελεύθερη νόσου επιβίωση. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει περαιτέρω την λειτουργία και διαμόρφωση των PDCD4 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Κύρια Ευρήματα

Έχουμε αποδείξει ότι έκτοπη έκφραση PDCD4 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο G

1 στάδιο και αυξητική ρύθμιση των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου των ρ27 και ρ21. μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή επίσης αναστέλλεται από PDCD4. PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη φωσφατάση και tensin ομόλογο (ΡΤΕΝ) και ανέστειλε την πρωτεϊνική κινάση Β (ρ-Akt). Επιπλέον, η έκφραση της PDCD4 ήταν επάνω ρυθμισμένη και εξήχθη στο κυτταρόπλασμα μετά από θεραπεία στέρησης ορού, αλλά ήταν γρήγορα εξαντληθεί μέσω της υποβάθμισης του πρωτεασώματος κατά ορό εκ νέου διοίκηση. Κατεργασία ενός (ΡΙ3Κ) φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης εμπόδισε την υποβάθμιση των PDCD4, υποδεικνύοντας την εμπλοκή της ΡΙ3Κ-Akt μονοπάτι στη ρύθμιση της PDCD4.

Συμπέρασμα

PDCD4 μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο λειτουργία στη σύλληψη της προόδου του κυτταρικού κύκλου στο σημείο ελέγχου κλειδί, αναστέλλοντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και την καταστολή της μετάστασης όγκου. Η ΡΙ3Κ-Ακί μονοπατιού υπονοήθηκε ότι εμπλέκεται στην ρύθμιση της αποδόμησης PDCD4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Σε απάντηση στην κατάσταση στρες, η ενδογενής PDCD4 ήταν σε θέση να λεωφορείο μεταξύ των κυττάρων διαμερίσματα για να εκτελέσει εκτρέπεται λειτουργίες του

Παράθεση:. Wei Ν, Liu SS, Chan KKL, Ngan HYS (2012) του όγκου Κατασταλτικός Λειτουργία και Διαμόρφωση προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (1): e30311. doi: 10.1371 /journal.pone.0030311

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 12, 2011? Αποδεκτές: 13, Δεκεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Wei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια εσωτερική επιχορήγηση από το Πανεπιστήμιο του προγράμματος χρηματοδότησης Χονγκ Κονγκ σπόρων για τη βασική έρευνα [να KKLC], και με μια δωρεά από τον Wong Ελέγξτε Εκείνη Φιλανθρωπικό Ίδρυμα [να HYSN]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

PDCD4 αρχικά προσδιορίζονται ως αναστολέας νεοπλασματικών μετασχηματισμό του μοντέλου επιδερμική κυτταρική σειρά JB6 ποντίκι [1]. PDCD4 διαγονιδιακά ποντίκια έδειξαν χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης όγκων και θηλωμάτων-to-καρκίνωμα συχνότητα μετατροπής [2]. Αργότερα αναφορές έχουν σιωπηρή ανασταλτικό ρόλο PDCD4 για την μετάφραση πρωτεΐνης μέσω της αναστολής των ευκαρυωτικών παράγοντα έναρξης 4Α (eIF4A) ελικάσης, καθώς και παρεμβαίνοντας με τη σύνδεση των eIF4A με eIF4G, με αποτέλεσμα την αποτυχία σχηματισμού συμπλόκου έναρξης μετάφρασης [3], [4 ], [5]. Από τότε, αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί για να διερευνηθεί ο ρόλος της PDCD4 κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. PDCD4 βρέθηκε να είναι σε θέση να ρυθμίζουν τη μεταγραφή. Υπερ-έκφραση του PDCD4 οδήγησε σε καταστολή πολλαπλασιασμού καρκινοειδούς κυττάρου μέσω καταστέλλοντας τη μεταγραφή του μίτωση προαγωγής παράγοντας εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) 1 /cdc2 μέσω επάνω ρύθμιση του p21

WAF1 /Cip1 [6], [7]. PDCD4 ανέστειλε κόλου εισβολή των καρκινικών κυττάρων μέσω της καταστολής που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση κινάση κινάση κινάση 1 (MAP4K1), οδηγώντας σε κατέστειλε ΑΡ-1 εξαρτώμενη μεταγραφή [8]. Ο ρόλος των PDCD4 σε κυτταρικής απόπτωσης έχει επίσης διερευνηθεί σε διαφορετικές μελέτες. PDCD4 προτάθηκε να είναι ένα μόριο προαποπτωτικά εμπλέκονται σε αυξητικό παράγοντα εξαλλαγής βήτα-1 (TGF βήτα-1) που προκαλείται από απόπτωση σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [9]. Μειωμένη έκφραση PDCD4 απορυθμισμένη την κανονική απόκριση βλάβη του DNA, εμποδίζοντας έτσι τα κύτταρα με DNA υποστεί βλάβη από το να υποστούν απόπτωση [10].

Παρά τις ιδιότητες καταστολής όγκου που αναφέρθηκαν παραπάνω, ο ρόλος της PDCD4 στην πρόοδο του όγκου έχει προταθεί να είναι κυτταρικού τύπου ειδική [11]. Υπερ-έκφραση του PDCD4 δεν είχε καμία επίδραση σε οποιαδήποτε πολλαπλασιασμό ή απόπτωση σε ΗΕΚ293 κύτταρα [12], καθώς και σε RKO κύτταρα καρκίνου κόλου [8]. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν την εξάντληση έκφραση PDCD4 σε καρκίνο σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς [13], [14], [15], και PDCD4 στοχεύτηκε για αποικοδόμηση κατά την διάρκεια προώθησης του όγκου [16], ωστόσο, οι μηχανισμοί για τη ρύθμιση της PDCD4 δεν ήταν σαφές ακόμα.

Οι έρευνες σχετικά με το ρόλο των PDCD4 στην καρκινογένεση του καρκίνου των ωοθηκών ήταν μάλλον περιορισμένη. Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα μας, η απώλεια της έκφρασης PDCD4 βρέθηκε στα οριακά και κακοήθη δείγματα ωοθηκικού ιστού, και συνδέεται με μια δυσμενή έκβαση της νόσου [17]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της PDCD4 στον καρκίνο των ωοθηκών, στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις πιθανές λειτουργίες ογκοκατασταλτικό της PDCD4 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, και ο πιθανός μηχανισμός που ρυθμίζει PDCD4.

Αποτελέσματα

PDCD4 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκίνου των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου εξέλιξη

Για να διερευνήσουν τη λειτουργία PDCD4 στον καρκίνο των ωοθηκών, δύο PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερά κλώνους 433-PDCD4c1 και 433-PDCD4c2, ιδρύθηκαν το καρκινικό κύτταρο OVCA433 των ωοθηκών. Ένα PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερός κλώνος SKOV3-PDCD4, ιδρύθηκε το καρκινικό κύτταρο ωοθηκών SKOV3 (Σχήμα 1Α). Η καθιέρωση PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερά κλώνους που υποδεικνύεται από το επιπλέον ταινία σε σύγκριση με γονικά κύτταρα. pEGFP υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων (433-EV και SKOV3-EV) επίσης καθιερωθεί ως τον κενό φορέα ελέγχου και χρησιμοποιούνται στα ακόλουθα πειράματα. Η ποσοτικοποίηση των δυτικών αποτύπωση ζώνες παρουσιάστηκε στο Data S1.

(Α) PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερά κλώνους 433-PDCD4c1, 433-pdcd4c2, και SKOV3-PDCD4, ιδρύθηκαν το ωοθηκών καρκινικά κύτταρα OVCA433 και SKOV3 . 433-EV και SKOV3-EV: GFP υπερεκφράζουν κενό φορέα σταθεροί κλώνοι για έλεγχο. (Β) 433 PDCD4c1 και 433 PDCD4c2 παρουσίασαν σημαντική βραδύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τον έλεγχο (* p & lt? 0,01 και ** p & lt? 0,05, αντίστοιχα), σύμφωνα με ΧΤΤ (αριστερό πάνελ) και κλωνογονική δοκιμασία (ρ & lt? 0,05) (δεξιά πλευρά). (C) PDCD4 που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα είναι από ένα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα ποσοστά των κυττάρων που ήταν σε στάδιο G1 για OVCA433 C1 και C2 ήταν 84,6% (± 2,1%) και 80,9% (± 2,2%), αντίστοιχα. Και οι δύο ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σύγκριση με τον έλεγχο (69,9% ± 3,1%) (ρ = 0,004 και Ρ = 0,01, αντίστοιχα). Το ποσοστό των κυττάρων που ήταν σε στάδιο G1 για SKOV3-PDCD4 ήταν 66,7% (± 1,8%), η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τον έλεγχο (37,5% ± 2%) (p = 0.008). (D) PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων, καθώς και κενό φορέα ελέγχου σταθεροί κλώνοι διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ με 10% FBS, και μετά συλλέχθηκαν για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Πρωτεΐνη εκφράσεις ενός πάνελ των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων p53, p21, p27, cdc25A, κυκλίνη και κυκλίνη αναλύθηκαν. Η ένταση της ζώνης προσδιορίστηκε με πυκνομετρική σάρωση. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών παρουσιάστηκε στο Data S1. GAPDH συμπεριλήφθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΧΤΤ και κλωνογονική δοκιμασία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα ΧΤΤ, και τα δύο από τα κύτταρα OVCA433-PDCD4 εμφάνισαν σημαντικά βραδύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού συγκριτικά με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,05 για OVCA433-PDCD4c1 και ρ & lt? 0,01 για OVCA433-PDCD4c2, αντίστοιχα, Σχήμα 1Β, αριστερό πάνελ). Κλωνογονική δοκιμασία έδειξε επίσης παρόμοια αποτελέσματα: οι αριθμοί των αποικιών που σχηματίστηκαν για OVCA433-PDCD4c1 και c2 ήταν 33% και 58% λιγότερο σε σύγκριση με τον μάρτυρα (GFP μόνο κενό φορέα ελέγχου), αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 1Β, δεξιό πλαίσιο).

για να διερευνήσουν τις υποκείμενων μηχανισμών για τις ανασταλτικές επιδράσεις της PDCD4 στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, εκτιμήσαμε την επίδραση της PDCD4 για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Κατά τον έλεγχο OVCA433, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 ήταν 69,9% (± 3,1%). Συγκριτικά, τα ποσοστά των κυττάρων σε φάση G1 ήταν 84,6% (± 2,1%) και 80,9% (± 2,2%) για OVCA433-PDCD4c1 και C2 αντίστοιχα, και οι δύο από τα οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από τον έλεγχο (ρ = 0,004 και Ρ = 0,01, αντίστοιχα). Υπήρχε μια αντίστοιχη μείωση του ποσοστού των κυττάρων στο στάδιο S στο OVCA433-PDCD4c1 (10,3% ± 2,4%) και C2 (15,7% ± 2%)) σε σύγκριση με τον έλεγχο (25,9% ± 2,1%, Σχήμα 1 C).

Η υπερέκφραση του PDCD4 σε SKOV3 επηρέασε και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου της. Στα κύτταρα SKOV3 ελέγχου, το ποσοστό των κυττάρων σε φάση G1 ήταν 37,5% (± 2%). Συγκριτικά, στα κύτταρα SKOV3-PDCD4, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 ήταν 66,7% (± 1,8%), η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη από τον έλεγχο (ρ = 0.008). Υπήρχε μια αντίστοιχη μείωση του ποσοστού των κυττάρων στο στάδιο S σε κύτταρα SKOV3-PDCD4 (20,9% ± 2,5%) σε σύγκριση με τον έλεγχο (46,2% ± 1,9%).

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι πάνω από -έκφραση PDCD4 που προκαλείται από τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, κυρίως στο στάδιο G1? 1.2 (p & lt? = 0.01) και 1.8 (ρ & lt? 0,01) φορές αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στο στάδιο G1 στην OVCA433-PDCD4 και SKOV3-PDCD4 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα, αντίστοιχα (p & lt? = 0,01).

για τον εντοπισμό πιθανών μορίων που εμπλέκονται στις παραπάνω ανασταλτικές επιδράσεις της PDCD4 στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αξιολογήσαμε τις εκφράσεις των διαφόρων ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων p21, p27, p53, κυκλίνη, κυκλίνη, cdc25A. Σε OVCA433-PDCD4c1 και c2, η έκφραση p53 είχε μόλις αλλάξει και p21 ήταν σημαντικά μέχρι ρυθμίζονται, ενώ στα κύτταρα SKOV3-pdcd4 p53-null, ρ21 δεν ανιχνεύτηκε. έκφραση P27 ήταν μέχρι ρυθμίζεται σε δύο κύτταρα OVCA433-PDCD4 και SKOV-PDCD4. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια αύξηση της έκφρασης cdc25A στα δύο 433 PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων, και την αύξηση της έκφρασης κυκλίνη το 433 PDCD4 c2 αλλά όχι σε c1 (Εικόνα 1D). Ωστόσο, μόνο ένα ελαφρώς μείωση cdc25A παρατηρήθηκε σε SKOV-PDCD4 κύτταρο, και το επίπεδο κυκλίνη είχε παρέμεινε η ίδια και στις δύο σταθερός κλώνος και φορέα μάρτυρα των κυττάρων SKOV3. Η ποσοτικοποίηση των δυτικών αποτύπωση ζώνες παρουσιάστηκε στο Data S1.

PDCD4 ανέστειλε τη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

Για να διερευνήσει τις πιθανές επιπτώσεις της PDCD4 για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, δύο διαφορετικές προσεγγίσεις ήταν εφαρμοσμένος. Πρώτον, τραύματος δοκιμασία επούλωσης χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση του χρόνου που απαιτείται για το κλείσιμο της πληγής σε έλεγχο και PDCD4 υπερεκφράζουν ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Πριν από την δοκιμασία, τα κύτταρα προ-αγωγή με μιτομυκίνη C, μια σύνθεση του DNA και του αναστολέα πυρηνικής διαίρεσης, για να εξασφαλιστεί το κλείσιμο της πληγής οφείλεται αποκλειστικά στη μετανάστευση των κυττάρων, αλλά όχι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα παρουσίασαν βραδύτερο ρυθμό μετανάστευσης. Η γδαρμένο πληγή στα δύο κύτταρα ελέγχου έκλεισε το 23 ώρες μετά την εισαγωγή του τραύματος, ενώ ένα κενό ακόμη παρατηρήθηκε στην PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα (Εικόνα 2Α).

(Α) Τόσο ελέγχου και PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μιτομυκίνη C (10 μg /ml) για τρεις ώρες πριν από την εισαγωγή της πληγής. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (0, 5, 8 και 23 ώρες). PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων επέδειξε πιο αργή διαδικασία επούλωσης του τραύματος σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω του μικροπορώδους μεμβράνης για 9 ώρες σε Transwell δοκιμασία μετανάστευσης. Οι αριθμοί των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω για PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων ήταν σημαντικά λιγότερες σε σύγκριση με τον έλεγχο (* ρ & lt? 0.01 και ** ρ & lt? 0,05, αντίστοιχα). (Γ) Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλλουν μέσω της ECMatrix για 72 ώρες σε Transwell δοκιμασία εισβολής. Οι αριθμοί των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω για PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων ήταν σημαντικά λιγότερες σε σύγκριση με τον έλεγχο (* ρ & lt? 0,05). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Για να εκτιμηθεί ποσοτικά ο ρυθμός μετανάστευσης των κυττάρων, εφαρμόστηκε transwell δοκιμασία μετανάστευσης. OVCA433-PDCD4c1 και c2 έδειξε 35% και 63% λιγότερο μετανάστευση, αντίστοιχα, από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (ρ & lt? 0.01 Σχήμα 2Β). κύτταρα SKOV3-PDCD4 έδειξε 22% λιγότερο μετανάστευση από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2Β)

PDCD4 έχει επίσης επίδραση στην εισβολή των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων αποδεικνύεται με Transwell δοκιμασία εισβολή.. OVCA433-PDCD4c1 και c2 έδειξε 27% και 30% λιγότερο εισβολή σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0.05 Σχήμα 2C). SKOV3-PDCD4 έδειξε 19% λιγότερο εισβολή σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2C).

Διαφοροποίηση των PDCD4

PDCD4 αναφέρθηκε ως αναστολέας μετάφρασης. Όπως μετάφραση πρωτεΐνης μπορεί να ενισχυθεί από ορό και αναστέλλονται όταν τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής απουσία αυξητικών παραγόντων, εξετάσαμε έτσι τις επιδράσεις του ορού για την αφθονία του PDCD4. Τόσο OVCA433 και SKOV3 στερήθηκαν τροφής εντός μέσου χωρίς ορό για 48 ώρες πριν από τον ορό εισήχθη ξανά σε υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, των οποίων 1 ώρα, 2 ώρες, 6 ώρες και 24 ώρες. Και στις δύο κύτταρα, PDCD4 ανυψώθηκε όταν πεινασμένο. Ωστόσο, μετά την εκ νέου χορήγηση του ορού, PDCD4 μειώθηκε σταδιακά σε μια περίοδο με τρόπο που εξαρτάται σε SKOV3 και γρήγορα εξαφανίστηκε μέσα σε 1 ώρα σε OVCA433 (Σχήμα 3Α). Η ποσοτικοποίηση των κηλίδωση Western ζώνες παρουσιάστηκε στο Data S2.

(Α) και OVCA433 SKOV3 στερήθηκαν από τον ορό (SD) για 48 ώρες πριν από την εκ νέου χορηγείται ορού για 1 ώρα, 2 ώρες, 6 ώρες και 24 ώρες. Υπήρχε μια δραματική αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης PDCD4 κατόπιν στέρηση θεραπεία ορού. PDCD4 εξαφανίστηκε γρήγορα μετά την εκ νέου χορήγηση ορού. P-Akt και p-ERK ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω όταν ορός αποσύρθηκε και σταδιακά να επαναληφθεί μετά από ορό προστέθηκε πίσω. Σύνολο Akt και ERK δεν επηρεάστηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας. (Β) PDCD4 ανυψώθηκε σε κύτταρα στερούνται ορού (SD) και απεμπλουτισμένο όταν ορός προστέθηκε πίσω (SA, προσθήκη ορού) επί 2 και 4 ώρες. Η χορήγηση είτε αναστολέα πρωτεασώματος MG132 (S + MG132), ή αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (S + LY294002) απέτρεψαν την εξάντληση του PDCD4. DMSO συμπεριλήφθηκε επίσης ως έλεγχος (S + DMSO). Αρνητικός μάρτυρας (-νε) ενδείκνυται για κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με μέσο που περιέχει ορό. (Γ) Η έκφραση του ΡΤΕΝ, ρ-Akt και ρ-ERK μεταβλήθηκαν σε όλες PDCD4 υπερέκφραση σταθερών κλώνων, ενώ οι εκφράσεις του συνολικού Akt και ERK παρέμειναν αμετάβλητες. Τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η ποσοτικοποίηση των δυτικών αποτύπωση ζώνες παρουσιάστηκε στο Data S2.

Η

Για να διερευνήσει τα πιθανά μονοπάτια που εμπλέκονται στη διαμόρφωση της PDCD4 στην παραπάνω επεξεργασία, οι εκφράσεις του PTEN, π-Akt και p-ERK ( εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη) εξετάστηκαν. ΡΤΕΝ ανυψώθηκε μετά απομακρύνθηκε ο ορός, και δεν υπήρχε περαιτέρω αλλαγή μετά την εκ νέου προσθήκη του ορού μέχρι έως και 24 ώρες. Υπήρξε μια σημαντική μείωση του ρ-Ακί όταν αφαιρείται ο ορός και στα δύο κύτταρα OVCA433 και SKOV3, που ακολουθείται από επανάληψη σε 6 ώρες μετά ορό εκ νέου προσθήκη στην OVCA433. Σε SKOV3, η ανάκτηση του ρ-Ακί ήταν τόσο γρήγορη όσο 1 ώρα. Μια μικρή μείωση του ρ-ERK παρατηρήθηκε και στα δύο κύτταρα απουσία ορού, καθώς και περαιτέρω μείωση παρατηρήθηκε επίσης και στα δύο κύτταρα όταν ορού εισήχθη ξανά για 1 ώρα. Η έκφραση του ρ-ΕΚΚ συνεχίστηκε μετά από 2 ώρες από τη χορήγηση ορού και σταδιακά έφθασε στο αρχικό επίπεδο στις 24 ώρες. Δεν παρατηρείται καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε είτε σε ολική Akt ή ERK (Εικόνα 3Α).

Για να επιβεβαιώσετε τη δυνατότητα συμμετοχής των PI3K-Akt και ΜΕΚ-ERK μονοπατιών στη ρύθμιση της PDCD4, ειδικός αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002, και αναστολέα ΜΕΚ U0126 εισήχθησαν στα πεινασμένα κύτταρα μαζί με ορό και επωάστηκαν για 2 ώρες και 4 ώρες μετά τη θεραπεία ασιτία 48 ωρών. Όταν το ρ-Ακί ήταν ειδικά κάτω ρυθμίζονται από την κατεργασία του LY294002, η εξάντληση των PDCD4 αποτράπηκε (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, η χορήγηση U0126 δεν επιδεικνύει καμία επίδραση στην πρόληψη της υποβάθμισης PDCD4 (Σχήμα S1). Επιπλέον, όταν αναστολέας πρωτεασώματος MG132 εισήχθη στα πεινασμένα κύτταρα, η εξάντληση των PDCD4 επίσης εμπόδισε (Σχήμα 3Β). Δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στα κύτταρα ελέγχου DMSO. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η εξάντληση των PDCD4 μετά την εκ νέου προσθήκη ορού σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών οφειλόταν στο πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση. Η ποσοτικοποίηση των δυτικών αποτύπωση ζώνες παρουσιάστηκε στο Data S2.

Στο PDCD4 υπερεκφράζουν κυττάρων των ωοθηκών, PTEN είχε μέχρι ρυθμίζεται, και p-Akt και p-ΕΚΚ ήταν σημαντικά κάτω ρύθμιση, ενώ το σύνολο των Akt και ERK δεν επηρεάστηκαν (Σχήμα 3C). Η ποσοτικοποίηση των δυτικών αποτύπωση ζώνες παρουσιάστηκε στο Data S2.

Η ενδοκυτταρική μετατόπιση των PDCD4

προηγούμενη μελέτη ανοσοϊστοχημείας μας έδειξε ένα μοτίβο διαφορική κυτταρική εντόπιση του PDCD4 μεταξύ φυσιολογικών και κακοήθων κυττάρων των ωοθηκών [17] , γεγονός που υποδηλώνει ότι ίσως PDCD4 μετατοπίζονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου των ωοθηκών. Άλλες μελέτη κατέδειξε επίσης την ενδοκυτταρική μετατόπιση PDCD4 υπό ορισμένες συνθήκες στρες [18]. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ενδογενή εντοπισμός PDCD4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών, Ον2008 και C13, έχουν υψηλό επίπεδο έκφρασης του ενδογενούς PDCD4, το οποίο βρέθηκε εντοπισμένη αποκλειστικά στον πυρήνα κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 4). Μετά τη θεραπεία ασιτία ορού για 48 ώρες, το ενδογενές PDCD4 βρέθηκε να μετατοπισθεί από πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 4).

Ενδογενής PDCD4 στα δύο καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα Ον2008 και C13 ήταν εντοπισμένη αποκλειστικά στον πυρήνα όταν καλλιεργούνται σε μέσο με ορό. Περισσότερα κυτταροπλασματική εντόπιση της PDCD4 παρατηρήθηκε σε θεραπεία στέρησης ορού. Η ενδογενής PDCD4 ανιχνεύθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας PDCD4 πρωτογενές αντίσωμα και δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού σημασμένο με FITC κατσίκας. χρώση DAPI αναφέρεται πυρηνικού εντοπισμού. Εκπρόσωπος μετατόπιση αυτή υποδεικνύεται από τα βέλη.

Η

Συζήτηση

Μια σειρά από μελέτες έχουν αναφέρει τις ανασταλτικές επιδράσεις της PDCD4 σε πρωτεΐνη μετάφραση [19], [20], και ΑΡ-1 εξαρτώμενη διενεργοποίηση [12], [21]. Μελέτες για τη λειτουργία PDCD4 για κυτταρικού κύκλου έχουν δημιουργήσει αντιφατικά αποτελέσματα. Στα καρκινικά κύτταρα του μαστού, PDCD4 προκάλεσε αυξημένη πληθυσμού G0 να φάση G1 χωρίς να επηρεάζει τις άλλες φάσεις του κυτταρικού κύκλου υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο στην απόπτωση [22]. Στα καρκινικά κύτταρα γλοιώματος, PDCD4 καθυστερημένη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από G1 στην S φάση [23]. Μια άλλη ομάδα ανέφερε ότι PDCD4 επαγόμενα κύτταρα τόσο υπο-G1 και G2 φάση-S, που δείχνουν επιδράσεις του τόσο απόπτωση και κυτταρικό κύκλο σύλληψης [24]. Ωστόσο, σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, PDCD4 δεν μεταβάλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ή διεγείρουν απόπτωση [8]. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση έκτοπη PDCD4 που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 και, κατά συνέπεια, κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Είμαστε αξιολόγησε την έκφραση ενός πάνελ των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου που παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάβαση G1-S σε PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα. PDCD4 προκάλεσε την έκφραση των ρ27 και ρ21, αλλά όχι οι εκφράσεις της κυκλίνης Ε αποτελέσματά μας ήταν σύμφωνα με τα ευρήματα ότι knockdown του PDCD4 σε κύτταρα AML οδήγησε σε προς τα κάτω ρύθμιση του p27 [25]? και η επαγωγή ρ21 και ρ27 με PDCD4 [26]. Οι κυτταρικές επιδράσεις του PDCD4 προτάθηκαν να είναι διαφορετικά σε μοντέλα κυττάρου με ή χωρίς έκφραση p53 [10], [27]. Δύο κυτταρικές σειρές των ωοθηκών επιλεγεί σε αυτή τη μελέτη έχουν καθεστώς απόκλιση p53, OVCA433 φέρουν άγριου τύπου ρ53, και SKOV3 είναι null p53. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές είχαν αυξημένα εκφράσεις ρ27 κατά υπερέκφραση PDCD4, και η αυξητική ρύθμιση του p21 δεν διαμεσολαβείται από ρ53 σε OVCA433 κύτταρα. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί ότι η επαγωγή του ρ21 με PDCD4 σε καρκινοειδές κύτταρα ήταν ανεξάρτητη της ρ53 [7]. Τα ευρήματά μας άφησε να εννοηθεί ότι ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς για την επαγωγή της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 από PDCD4 οφειλόταν στην επάνω ρύθμιση του p21 και p27. Έχουμε παρατηρήσει ότι δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση της κυκλίνης Α ή cdc25A μεταξύ σταθερός κλώνος και τα κενά ελέγχου φορέα σε κυτταρικές σειρές SKOV3. Ωστόσο, για OVCA433 κύτταρα, παρατηρήσαμε μια αύξηση της έκφρασης cdc25A στα δύο PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερών κλώνων, και την αύξηση της κυκλίνης Α έκφρασης σε 433 PDCD4 c2 αλλά όχι σε c1. Η διαφορική έκφραση της κυκλίνης Α μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές πολλαπλασιαστικών και κλωνογονική δραστηριότητες του PDCD4 εκφράζουν τον κλώνο C1 και C2. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα της PDCD4 επί κυκλίνης Α και cdc25A θα χρειαστεί περαιτέρω έρευνα.

Εκτός πολλαπλασιασμό, αποδείξαμε επίσης τα ανασταλτικά αποτελέσματα της PDCD4 σχετικά με τη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν επίσης αναφερθεί σε μελέτες που διεξήχθησαν σε κόλον και κύτταρα HCC [8], [20], [28]. PDCD4 βρέθηκε ότι επάγεται από την αγωγή των προ-αποπτωτικών ουσιών [29], [30]. Έρευνες σχετικά με το ρόλο της στην απόπτωση έχουν δημιουργήσει αντιφατικά αποτελέσματα. PDCD4 έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα του μαστού και καρκίνου του πνεύμονα [22], [26] Σε αντίθεση, καμία αποπτωτικό αποτέλεσμα PDCD4 παρατηρήθηκε σε άλλες μελέτες [8], [12]. Επιπλέον, οι υψηλότερες εκφράσεις PDCD4 αναφέρθηκαν να συσχετίζεται με αυξημένη ευαισθησία σε γκελνταναμυκίνη και ταμοξιφένη [31]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη που διεξήχθη σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη αναφέρει αυξημένο σισπλατίνη και paclitacel ευαισθησία από υπερέκφραση του PDCD4 [32]. Στην παρούσα μελέτη, η υπερέκφραση του PDCD4 δεν επάγουν απόπτωση, σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής και δοκιμασία κηλίδος Western μέσω της έκφρασης PARP (Εικόνα S2). Εκτιμήσαμε επίσης τον δυνητικό ρόλο των PDCD4 στην σισπλατίνη ευαισθησία. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ PDCD4 υπερεκφράζουν κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου σε απόκριση σε θεραπεία cisplatin (Σχήμα S2), το οποίο ήταν σύμφωνο με τα προηγούμενα δημοσιευμένα δεδομένα μας ότι δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της έκφρασης PDCD4 με καθεστώς χημειοευαισθησία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [17]. Δεδομένου ότι ο μηχανισμός της σισπλατίνης για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα είναι η έναρξη κυτταρικής απόπτωσης, και PDCD4 δεν έδειξε αποπτωτικό αποτέλεσμα σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, αυτό μπορεί να είναι ένας από τους λόγους που συμβάλλουν στην προαναφερόμενη παρατήρηση.

Όπως σημειώνεται από τα αποτελέσματα μας, το μέγεθος της καταστολής του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, τη μετανάστευση και εισβολή δεν ήταν σε αναλογία με τα επίπεδα υπερ-έκφραση της πρωτεΐνης PDCD4 σε αυτές σταθερών κλώνων. Παρόμοια ευρήματα αναφέρθηκαν επίσης στη μελέτη που διεξήχθη από τον Yang et al. σε επιδερμικά κύτταρα ποντικού JB6 RT101 [21]. Προτείναμε ότι μπορεί να υπάρχει ένα όριο συγκέντρωσης, η υπέρβαση, θα προκύψει η ανασταλτική λειτουργία των PDCD4 για την εξέλιξη του όγκου. Σύμφωνα με ροή κυτταρομετρίας μας εκτίμηση, υπερ-έκφραση του PDCD4 τόσο OVCA433 και SKOV3 κυττάρων που επάγεται κυτταρικό διακοπή κύκλου στο στάδιο G1. Ωστόσο, αν και παρατηρήθηκε μια κατασταλτική επίδραση στο σχηματισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αποικίας σε PDCD4 υπερ-κύτταρα που εκφράζουν SKOV3, η επίδραση δεν ήταν στατιστικά σημαντική κατά τη σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S3). Είτε ήταν λόγω του γενετικού υποβάθρου των κυττάρων SKOV3 ή τη συμμετοχή των άλλων μηχανισμών και των παραγόντων που ήταν επί του παρόντος δεν είναι σαφές και χρειάζεται περαιτέρω έρευνα.

Οι παρατηρήσεις του προς τα κάτω ρύθμιση του p-Akt και p-ERK σε PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα πρότεινε μια πιθανή εμπλοκή των ρ-Akt και ρ-ΕΚΚ μονοπάτια στη ρύθμιση της PDCD4. Για να αντιμετωπιστεί το ζήτημα ότι αν αυτά τα δύο μονοπάτια είναι πραγματικά εμπλέκονται, προχωρήσαμε για να μελετήσει τις ταυτόχρονες εκδηλώσεις p-Akt, π-ERK και PDCD4 κατά τη διάρκεια της απόσυρσης του ορού και την εκ νέου προσθήκη θεραπείας. Υπήρχε μια δραματική αύξηση του PDCD4 αμέσως μετά την απόσυρση του ορού, που ακολουθείται από ταχεία μείωση των PDCD4 μετά επανα-χορηγηθούν στον ορό. Κατά την ίδια διαδικασία, μια αντίστροφη τάση της έκφρασης και των δύο π-Akt και π-ERK, τα δύο σημαντικά ρυθμιστικά μόρια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, παρατηρήθηκε: μία αρχική μειωμένη έκφραση που ακολουθείται από μια σταδιακή επανάληψη. Η αλλοίωση του π-Akt και ρ-ERK μπορεί να είναι απλά οι συνέπειες της στέρησης θεραπεία ορού. Και ακόμα, λόγω των ταυτόχρονων αλλαγών των εκφράσεων του PDCD4 και ρ-Ακί και π-ERK, και αλλοιωμένο επίπεδο έκφρασης των δύο μορίων παρατηρούνται στο PDCD4 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα, υπάρχει μια πιθανότητα ότι το ρ-Ακί και ρ-ERK μονοπάτια συμμετείχε στη ρύθμιση της PDCD4. Για να το επιβεβαιώσετε την περαιτέρω, εφαρμόσαμε αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002 (η οποία στη συνέχεια μπλοκ Akt φωσφορυλίωση) μαζί με ορό, και βρήκε PDCD4 πρωτεΐνη δεν ήταν πλέον υποβαθμισμένη. Εισαγωγή του αναστολέα της ΜΕΚ δεν εμπόδισε την εξάντληση των PDCD4. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το ρ-Ακί αλλά όχι π-ERK απαιτήθηκε για την αποικοδόμηση PDCD4 κατά τη διέγερση του ορού, και ως εκ τούτου ΡΙ3Κ-Akt μονοπατιού θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν άμεσο ρόλο στη διαμόρφωση της αποδόμησης PDCD4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ωστόσο, η συμμετοχή του μονοπατιού p-ΕΚΚ δεν είναι σαφές προς το παρόν και απαιτείται περαιτέρω έρευνα. Υπήρξαν μελέτες που αναφέρουν το p-Akt μονοπατιού για τη ρύθμιση των PDCD4. μελέτη Dorrello του εμπλέκεται το ρόλο του S6K1 στην ρύθμιση της αποδόμησης PDCD4 σε απόκριση σε μιτογόνο [23]. Η θεραπεία με τον ανάδοχο του όγκου 12-O-δεκατετρανοϋλοφορβόλης-13-οξικό (ΤΡΑ) μειωμένη έκφραση PDCD4, η οποία οφείλεται στην υποβάθμιση του πρωτεασώματος διαμεσολαβείται από PI3K-Akt-mTOR-P70

S6K και διευκολύνεται από μονοπάτι σηματοδότησης ΜΕΚ-ΕΚΚ [16] . Μια αντίστροφη συσχέτιση του PDCD4 και ρ-Akt έκφραση έχει αναφερθεί σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου ιστού [33]. shRNA PDCD4 ενεργοποιημένη Akt μονοπάτι, που οδηγεί σε αυξημένες εκφράσεις του ρ-Akt, mTOR και p70S6K στους πνεύμονες των ποντικών [34]. Τα αποτελέσματά μας ήταν σε αντιστοιχία με τα ευρήματα αυτά και συνεπάγεται τη συμμετοχή της σ-Akt μονοπατιού στη ρύθμιση της PDCD4 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Συνδυάζοντας το φαινόμενο που κάτω ρύθμιση παρατηρήθηκε p-Akt έκφραση σε PDCD4 πάνω εκφράζοντα κύτταρα, και το γεγονός ότι το κλείδωμα του ρ-Akt με αναστολέα ΡΙ3Κ εμπόδισε την αποικοδόμηση του PDCD4 κατά τη διαδικασία ασιτία ορού και την εκ νέου προσθήκη, προτείναμε ένα δυναμικό ελέγχου ανάδρασης του PDCD4 μέσω ρ-Akt μονοπάτι: δημιουργία PDCD4 υπερ- εκφράζοντας σταθερά κλώνους θα μπορούσε να επιτευχθεί μόνο όταν η υποβάθμιση του PDCD4 αναστάλθηκε, η οποία απαιτούσε την καταστολή του ρ-Akt έκφρασης (Σχήμα 5). Ωστόσο, οι πιθανοί μηχανισμοί που μεσολαβούν αυτόν τον έλεγχο ανάδρασης και τα μόρια που εμπλέκονται δεν έχουν εντοπιστεί και απαιτούνται περαιτέρω έρευνες.

Αυξημένα PTEN και κατέστειλε p-Akt βρέθηκαν στο PDCD4 υπερεκφράζουν σταθερούς κλώνους. Όταν τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής με μέσο χωρίς ορό, PDCD4 ήταν un-φωσφορυλιωμένο λόγω κατέστειλε ρ-Akt έκφρασης. Un-φωσφορυλιωμένη PDCD4 δεν αναγνωρίστηκε από πρωτεασώματος οδηγώντας έτσι στη συσσώρευση PDCD4. Όταν ορός επανα-χορηγείται στα κύτταρα, τα επάνω ρυθμισμένη ρ-Akt φωσφορυλιώνεται PDCD4, το οποίο στη συνέχεια εξαντλημένο μέσω αποικοδόμησης πρωτεασώματος. Η χορήγηση του αναστολέα της ΡΙ3Κ είτε LY294002, ικανή να αποτρέπει από το να PDCD4 φωσφορυλιώνεται από ρ-Ακί, ή αναστολέα πρωτεασώματος MG132, εμποδίζοντας την εξάντληση του PDCD4, οδηγώντας στη συσσώρευση PDCD4.

Η

τρέχοντα αποτελέσματα μας έδειξε μια μετατόπιση της ενδογενούς PDCD4 από τον πυρήνα προς κυτταρόπλασμα μετά από στέρηση ορού. Υποθέσαμε ότι PDCD4 λεωφορείο δύναμη στο κυτταρόπλασμα να εμφανίζουν ανασταλτική λειτουργία της στη μετάφραση της πρωτεΐνης όταν τα κύτταρα ήταν κάτω από δυσμενείς συνθήκες ανάπτυξης. Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα μας, παρατηρήθηκε απόκλιση εντόπιση της PDCD4 μεταξύ κανονικών και κακοηθών δειγμάτων ωοθηκικού ιστού: περισσότερο κυτταροπλασματική εντόπιση της PDCD4 παρατηρήθηκε σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών ιστού [17]. Όταν όγκος μεγαλώνει, μπορεί να υπάρχουν ορισμένες περιοχές όπου η συγκέντρωση οξυγόνου είναι σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς και κύτταρα του όγκου είναι κάτω από ένα υποξικό στρες. Μια υπόθεση είναι ότι σε αυτά τα κύτταρα, PDCD4 μπορεί μεταφοράς προς το κυτταρόπλασμα για την αναστολή της μετάφρασης και ακολούθως την ανάπτυξη των κυττάρων. Σε γενικές γραμμές, PDCD4 λειτουργεί ως καταστολέας όγκων στον πυρήνα σε φυσιολογικά κύτταρα, ωστόσο, όταν τα κύτταρα ήταν υπό ορισμένες περιβαλλοντικές στρες ή υποβάλλονται σε δυναμικό μετασχηματισμού από το φυσιολογικό σε κακοήθη, ένα από τα κυτταρική απόκριση μπορεί να είναι μεταφορά PDCD4 στο κυτταρόπλασμα. Αυτό καθιστά τον εντοπισμό του PDCD4 ως δείκτης των κυττάρων κάτω από ανώμαλη περιβάλλον ανάπτυξης ή νεοπλασματικών μετασχηματισμού. Παρ ‘όλα αυτά, ο μηχανισμός μετάθεσης του PDCD4 εξακολουθεί να μην είναι ακόμη σαφές και η υπόθεση θα πρέπει να αξιολογηθεί περαιτέρω.

Υλικά και Μέθοδοι

θεραπεία

κυτταρικής καλλιέργειας, ορό θεραπεία πείνα και τα ναρκωτικά

Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρικές σειρές OVCA433 και SKOV3 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν δώρο από τον καθηγητή ΝΔ Τσάο, Τμήμα Ανατομίας, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρικές σειρές C13 και OV2008 ήταν δώρο από τον καθηγητή BK Tsang, Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας του Πανεπιστημίου της Οτάβα, στον Καναδά. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ, με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).

κύτταρα υπό θεραπεία στέρησης ορού καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ χωρίς FBS. -3 της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης κινάσης (ΡΙ3Κ) LY294002 (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, ΜΑ), ΜΕΚ αναστολέα U0126 (Cell Signaling), αναστολέα πρωτεασώματος MG132 (Cell Signaling) διαλύθηκαν σε DMSO (Sigma Co., St. Louis, ΜΟ ) και αραιώνεται περαιτέρω πριν εισαχθούν στα κύτταρα. Medium μόνο με DMSO συμπεριλήφθηκε επίσης ως μάρτυρας.

Αντισώματα και ανάλυση κηλίδος

εκχύλιση δυτική πρωτεϊνών και μέθοδοι κηλιδώσεως Western ήταν οι ίδιες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. PDCD4 αντίσωμα ήταν από Rockland (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, ΡΑ)? αντισώματα του p21, κυκλίνη, κυκλίνη και p53 ήταν από την Santa Cruz? αντισώματα της ΡΤΕΝ, ρ-Ακί, Akt, ρ-ΕΚΚ, ERK, ρ-ΙΝΚ, JNK, cdc25A, mTOR ήταν από κυτταρική σηματοδότηση? αντίσωμα p27 ήταν από τα εργαστήρια Transduction BD.

Κατασκευή PDCD4 cDNA φορέα έκφρασης

PDCD4 cDNA πλήρους μήκους ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας PDCD4 cDNA ανθρώπινου κλώνου (ΟηΟεηε Technologies, Inc., Rockville, MD) (αριθμός πρόσβασης Genebank NM_014456.3) ως μήτρα και τα ακόλουθα ζεύγη εναυσμάτων 5 ‘gaattccATGGATGTAGAAAATGAGCAGA 3’ (νοηματικό) και 5 ‘gtcgacTCAGTAGCTCTCTGGTTTAAGA 3’ (αντινοηματικό), το οποίο περιείχε θέσεις ενζύμων περιορισμού EcoRI και SalI. Ένα PDCD4 προϊόν PCR 1,5 kb, πλήρους μήκους στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε πλαίσιο, σε pEGFP-C1 (εργαστήρια Clontech, Mountain View, CA).

Ίδρυση PDCD4 υπερ- εκφράζουν σταθερά κλώνους

PDCD4 πλασμίδιο ή φορέα GFP-C1 επιμολύνθηκε σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 και OVCA433 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Fugene HD (Roche Molecular Biochemicals, Manniheim, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.